KR101282811B1 - 가스트린 방출 펩티드 전구체에 대한 항체 및 그 용도 - Google Patents

가스트린 방출 펩티드 전구체에 대한 항체 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

측정치의 편차나 검체의 취급 등의 작업상 제약 등의 문제가 없는, 새로운 ProGRP의 측정법을 제공한다. 상세하게는, 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열의 40 - 75 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 인식하는 2종 이상의 상이한 항체를 사용하여, 가스트린 방출 펩티드 전구체 또는 그 분해물을 측정하는 방법이다. 또한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 79번째 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 인식하는 2종 이상의 상이한 항체를 사용하여 가스트린 방출 펩티드 전구체 및/또는 그 분해물을 측정하는 방법도 제공한다. 본 발명의 방법은 종래의 측정법과 동등한 검출 감도가 얻어지는 것에 더하여 채취 후의 검체의 취급이 용이하며, 재현성이 높은 측정치가 얻어지는 등의 이점을 가진다.
암, 폐소세포암, 가스트린 방출 펩티드 전구체, GPR, ProGRP, 샌드위치 면역분석

Description

가스트린 방출 펩티드 전구체에 대한 항체 및 그 용도 {ANTIBODY DIRECTED AGAINST GASTRIN-RELEASING PEPTIDE PRECURSOR AND USE THEREOF}
본 발명은 가스트린 방출 펩티드 전구체에 대한 항체 및 그 사용에 관한 것이고, 폐소세포암을 포함하는 각 질병의 조기 발견 또는 치료의 모니터링, 재발의 모니터링 등에 폭 넓게 이용되는 것이다.
일본에서 사인의 제1위는 악성 신생물이고, 그 중에서도 폐암의 사망율은 남성에서는 위암을 제치고 제1위, 여성에서도 제3위이며, 매년 상승하는 경향을 보인다. 폐암은 병리 조직학적으로 이하의 주된 4 가지의 조직형으로 분류되고 있다. 즉, 폐문부에서 발생하는 폐편평상피암 (squamous-cell carcinoma) 및 폐소세포암 (small-cell lung carcinoma: SCLC)), 폐야부에서 발생하는 폐선암(adenocarcinoma)와 폐대세포암 (large-cell lung carcinoma)이다.
특히 폐소세포암은, 증식이 빠르고 조기에 원격전이를 일으키기 때문에, 초진 시에는 이미 전신성으로 전이한 진행암으로 발견되는 경우가 많다. 이 종류의 암의 치유율에 대해서는 병변이 일측의 폐야에 국한되는 폐소세포암의 국한형 (limited disease: LD) 환자의 치유율은 약 20%이지만, 양 폐 또는 다른 장기에 전이한 진전형 (extensive disease: ED) 환자에서는 치유는 실질적으로 어렵다고 말해지고 있다.
또한, 폐소세포암은 항암제에 감수성이 높기 때문에, 화학요법이 치료법의 제 1 선택인 것에 대하여, 폐비소세포암 (non-small-cell lung carcinoma: non-SCLC)은 화학요법의 반응율(RR; Response Rate)이 낮기 때문에 외과요법이 치료법의 제 1 선택으로 되고 있다.
따라서 폐소세포암은 폐암 중에서도 특히 조기 발견·치료가 필요한 병이고, 그렇기 때문에도 폐소 세포암과 폐비소세포암을 감별 진단하는 것은 치료방침을 결정할 때에 지극히 중요하다.
폐암을 발견하는 방법의 하나로 객담 검사가 있다. 그러나, 객담 검사는 주로 폐편평상피암의 검사에는 적절하지만, 폐소세포암에 대한 양성율은 낮다고 하는 문제가 있다. 또한 X선 촬영법도 폐암의 발견에 넓게 이용되고 있는 방법이지만, 폐문부에서 발생하는 폐편평상피암이나 폐소세포암에 대해서는 폐문부가 심장의 그림자가 되기 때문에 암조직의 음영을 촬영하기가 대단히 어렵다는 문제가 있다. 또한, 폐소세포암에 대해서는 폐야의 이상 음영을 나타내는 환자에 대해서 객담세포진, 흉부 X선 단순 촬영, CT 스캔, 기관지 내시경 등을 이용하여도, 이 유형의 폐암의 조기 발견은 용이하지 않다.
또한, 암을 진단하기 위한 검사방법의 몇 가지를 예를 들면, 방사선 조사나 생검(biopsy), 기관지 내시경 등은 환자에게 고통을 주고, 또한 고가의 기기나 숙 련된 기술자 등을 필요로 한다.
그렇기 때문에, 보다 간편한 혈액 검사에 의해서 치유 가능한 시기에 암을 높은 효율로 진단하는 것을 가능하게 하는, 종양 마커의 연구가 수행되고 있다. 오늘날에는 암질환의 발견, 진단, 병상경과의 모니터링의 지표, 재발진단 등에 30개 이상의 종양 마커가 이용되고 있다.
폐암은 조직형이 다양하기 때문에, 모든 유형의 폐암의 발견 또는 진단에 유효한 종양 마커는 아직 보고되고 있지 않다. 그렇기 때문에 오늘날에는 폐암의 조직형 각각에 유효한 마커가 선택되고, 사용되고 있다.
예를 들면, 폐선암에 대해서는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen: CEA)나 시알릴 LEX-i 항원 (sialyl LEX-i antigen)이, 폐편평상피암에 대해서는 편평상피암관련 항원 (squamous-cell carcinoma related antigen: SCC)이, 폐소세포암에 대해서는 신경 특이적 에놀라아제 (neuron-specific enolase: NSE) 등이 주로 선택, 사용되고 있다.
그러나, NSE는 (1) 치유 가능한 조기암에 대한 양성율이 낮은 점, (2) 치료에 의한 일과성 측정치의 상승이 인정되는 점, (3) 채혈 시의 용혈에 의해 측정치가 상승하는 점, (3) 폐소세포암 환자와 정상인과의 측정치 차이가 적은 점 등의 결점이 있어서, 폐소세포암에 대한 유효한 종양 마커라고는 말할 수 없었다.
가스트린 방출 펩티드 (gastrin-releasing peptide: GRP)는 맥도날드 등이 1978년에 돼지 위조직으로부터 단리한, 가스트린 분비촉진작용을 갖는 27개의 아미노산으로 되는 뇌장(腦腸) 펩티드이다. 사람에 있어서도 GRP의 존재는 확인되고 있고, 사람 GRP를 코딩하는 유전자도 1984년에 클로닝되어 있다.
국립암센터의 야마구찌 등은, 신경 내분비 세포에서 유래한다고 생각되는 폐소세포암의 생물학적 특성의 연구 과정에서 ACTH (adrenocorticotropic hormone)이나 칼시토닌 (calcitonin) 등을 포함한 15 종류 이상의 뇌양 호르몬을 측정하고, GRP가 가장 높은 빈도로 또한 높은 농도로 배양 폐소세포암주에서 적극적으로 분비되는 것을 명확하게 하였다 (비특허문헌 1). 추가로, 혈중 GRP의 농축법을 조합시킨 방사면역측정법 (radioimmunoassay: RIA)을 구축하고, 폐소세포암 환자는 건강한 사람과 비교하여 높은 혈중 GRP 농도를 나타내는 것을 명확하게 하였다. 그러나, GRP는 혈중에서 빠르게 분해되기 때문에 혈중 농도가 낮고, 또한 상기 분석법은 번잡한 농축 조작을 필요로 하기 때문에, 임상 응용이 곤란하였다.
그 후의 연구에 의해 각종 세포에 있어서 선택적 RNA 스프라이싱(alternative RNA splicing)에 의하여 3 종류의 GRP 전구체 (ProGRP)가 산출되는 것이 명확하게 되었다 (비특허문헌 2). 이 들 3종의 ProGRP는, 그 1 - 98번째에 있어서 아미노산 서열이 공통되는 한편, 99번째 이후는 선택적 RNA 스프라이싱에 의하여, 서로 상이한 아미노산 서열로 되어 있다. 이 공통되는 1 - 98번째의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타낸다. 이 후, 특히 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 있어서의 ProGRP, 그 부분 서열, 분해물 등의 아미노산 잔기의 번호 표시는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 나타내는 것으로 한다.
3종의 ProGRP의 1 - 27번째의 아미노산 서열은 가스트린 분비촉진 활성을 가지는 성숙한 GRP의 그것과 동일하다. 이들 3종의 전구체는, 어느 것도 호르몬 전 구체 절단 효소에 의해서, 1 - 27번째의 아미노산 서열로 되는 성숙형 GRP와 31번째 이후의 아미노산 서열로 되는 가스트린 분비촉진 활성을 갖지 않는 ProGRP의 분해물인 C 말단측 절편(fragment) (proGRP-Cfrag)로 분해된다.
홀스트(Holst) 등(비특허문헌 3)은, ProGRP의 42 - 53번째의 아미노산 서열로 되는 펩티드 (이하, proGRP(42-53)이라 한다)에 대한 항혈청을 사용한 방사면역측정법(RIA)에 의하여 폐소세포암 환자의 혈장 중의 ProGRP 또는 ProGRP-Cfrag의 수준이 높은 것을 보고하였다. 그러나, 이 방법에서는 침전 추출 조작이 필요하고, 감도도 충분하지 않았다. 또한, 이와 같은 11 아미노산 잔기로 되는 단쇄의 펩티드로 면역한 경우에는 ProGRP의 입체 구조 에피토프를 인식하는 항체는 유도되지 않는다고 생각된다.
미야케(三宅) 등은 ProGRP가 GRP보다도 혈중에서 안정성이 높다는 것, 또한 3종의 ProGRP의 공통 부분인 31 - 98번째의 아미노산 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열에 대해서 상동성을 나타내지 않는다는 것에 주목하고, 동일 아미노산 서열로 되는 변이체 펩티드 (Modified Peptide) (이하, ProGRP(31-98)이라 한다)를 항원으로 하여 얻어진 고역가의 항혈청을 사용하여, 침전추출조작이 불필요한 고감도 RIA법을 구축하였다 (비특허문헌 1). 이 방법에 의해, ProGRP는 GRP와 동일하게 우수한 종양 마커가 되는 것을 알 수 있었다.
그러나, 이 방법은 추출 조작을 필요로 하지 않은 점에서 유리하지만, 측정에 4일이 필요한 점이나 감도가 10 pM (77.3 pg 항원/mL)으로 충분하지 않기 때문에, 정상인 혈청 중의 ProGRP 값을 측정할 수 없기 때문에, 임상 응용은 가능하지 않다.
또한 전술한 홀스트 등 및 미야케 등의 RIA법은 저해시험법 (inhibition method)이기 때문에, ProGRP의 단편 일부에서도 항원성을 가진다면 측정 가능하지만, 그 감도는 샌드위치법에 비하여 낮고, 고감도화가 필요한 ProGRP 측정법의 임상 응용은 곤란하다. 즉, ProGRP의 검출을 임상적으로 행하기 위해서는 검출의 감도를 높이는 것은 필수적이고, 특히 샌드위치법에서 이용 가능한 항체가 필요하다.
야마구찌, 세이류 (靑柳) 등은, ProGRP의 폐소세포암용 종양 마커로서의 임상 응용을 목적으로서, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 원리로 하는, 샌드위치(sandwich immunoassay)법을 사용한 간편하고 고감도의 ProGRP 측정 시약을 개발하였다 (특허문헌 1). 이 방법은 약 2 시간으로 결과를 얻고, 또한 높은 감도 (2pg/mL)를 가지고 있기 때문에, 현재 폭 넓게 임상응용되고 있고, 폐소세포암에 있어서 NSE보다도 높은 감도, 특이성을 가지는 것이 명확하게 되고 있다.
또한, 이 측정법을 사용하여, 폐소세포암 이외에도, 신경 내분비 종양 (갑상선 수양암 등), 신경내분비종양적 성격을 나타내는 암 (식도 소세포암, 췌소세포암, 전립선 소세포암 등)에서도 혈청 ProGRP값이 상승하는 것이 명확하게 되고, 금후 이들 종양의 조기 발견이나 치료의 모니터링 등에도 응용되어 갈 것으로 생각된다.
그렇지만, ProGRP의 혈중에서의 안정성은 GRP와 비교한 경우에는 높지만, 일반적인 다른 종양 마커와 비교하여, 측정값의 편차(dispersion)가 있다. 그렇기 때문에, ProGRP를 검출 대상으로 한 방법에서는 측정용 검체는 채혈 후 신속하게 측정 시까지 동결 보존되어야 하는 제약이 있다 (비특허문헌 4).
특허문헌 1: 일본 특허 제3210994호 공보
특허문헌 2: 일본 특허 공개 평06-98794호
비특허문헌 1: Cancer research, 1994년, 제54권, 제2136-2140페이지
비특허문헌 2: Eliot 등, Mol. Endo., 1987년, 제1권, 제224-232페이지
비특허문헌 3: Holst J. Clin. Oncol., 제7권, 제1831-1838페이지, 1989년
비특허문헌 4: 임상 검사. 39권: 981-986, 1995
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은, ProGRP를 측정 대상으로 하면서도, 종래 방법에 있어서의 측정값의 편차(dispersion)나 검체의 동결 보전 등의 작업상의 제약 등의 문제를 갖지 않는, 새로운 ProGRP의 측정 방법을 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명은, ProGRP의 분해물 중에 혈액 검체에 있어서 안정하게 유지될 수 있는 것이 있다는 것을 발견한 것에 근거하여, 이와 같은 안정한 분해물에 존재하는 에피토프를 측정 대상으로 하는 것으로, 상기의 과제를 해결한 것이다. 구체적으로는, 이하의 각 발명이 제공된다.
(1) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 75 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 인식하는 2종 이상의 상이한 항체를 사용하여, 가스트린 방출 펩티드 전구체 및/또는 그 분해물을 측정하는 방법.
(2) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 79 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 인식하는 2종 이상의 상이한 항체를 사용하여, 가스트린 방출 펩티드 전구체 및/또는 그 분해물을 측정하는 방법.
(3) 샌드위치 면역 측정법인 (1) 또는 (2)에 기재된 방법.
(4) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 60 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드에는 결합하고, 또한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열상의 임의의 8 연속 아미노산 서열을 갖는 펩티드에는 결합하지 않는 항체.
(5) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 60 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드에는 결합하고, 31 - 53 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드에는 결합하지 않는 항체.
(6) 기탁번호 FERM BP-08669로 기탁된 하이브리도마 3D6-2가 생산하는 (4) 또는 (5)에 기재된 항체.
(7) 기탁번호 FERM BP-08669로 기탁된 하이브리도마 3D6-2.
(8) 2종 이상의 상이한 항체의 적어도 한쪽이 (4) ∼ (6)의 어느 하나에 기재된 항체인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.
(9) 2종 이상의 상이한 항체의 적어도 한쪽이 (4) ∼ (6)의 어느 하나에 기재의 항체이고, 다른 한쪽이 서열번호 1의 아미노산 서열 71 - 75 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 인식하는 항체인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.
(10) (4) ∼ (6)의 어느 하나에 기재된 항체를 포함하는, 가스트린 방출 펩티드 전구체 또는 그 분해물을 측정하기 위한 키트.
(11) 암의 진단을 하기 위한 키트인 (10)에 기재된 키트.
발명의 효과
본 발명의 방법은, 새롭게 확인된 검체 중에서도 안정하게 보존되고 있는 ProGRP의 특정 종류의 분해물 상의 에피토프를 측정 대상으로 함으로써, 종래의 측정법과 동등한 검출감도가 얻어지는 것에 추가로, 채취 후의 검체의 취급 방법에 영향을 받지 않고, 재현성이 높은 측정값이 얻어지는 등의 효과를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 검체 중에 존재하는, ProGRP 또는 ProGRP-Cfrag보다도 혈중에서의 보존 안정성이 높은 ProGRP의 분해물 (ProGRP-Cdel)에 잔존하는 에피토프를, 면역학적 측정법의 대상으로 하는 것이다.
이 ProGRP-Cdel은, 종래 방법의 측정 대상인 ProGRP-Cfrag의 C 말단측의 몇개의 아미노산 잔기가 소실된, 보다 사슬 길이가 짧은 펩티드이고, ProGRP의 40 - 75 번째의 아미노산 잔기 상에 잔존하는 에피토프를 포함하는 펩티드이다. 아마 혈액 중에 존재하는 프로테아제(protease)에 의해서 ProGRP-Cfrag의 75 - 83 번째의 아미노산 잔기의 특정 잔기의 C 말단측이 절단되는 것으로, ProGRP-Cdel이 생기는 것으로 추측된다.
이 ProGRP-Cdel에 대해서 그 구조를 질량분석장치를 사용하여 확인한 결과, 79 번째의 Lys의 C 말단측에서 절단되어 있는 것이 확인되었다. 따라서, ProGRP-Cdel은 서열번호 1의 40 - 79 번째의 아미노산 잔기 상에 잔존하는 에피토프를 포함하는 펩티드에서도 있고, 따라서 이들 에피토프를 인식하는 항체도 또한, 본 발명에서 이용할 수 있다.
ProGRP-Cdel과 ProGRP-Cfrag의 사이의 구조 상의 차이는, C 말단측의 20개 전후의 아미노산 잔기의 유무에 지나지 않으나, ProGRP 또는 그 분해물을 면역학적으로 측정하기 위한 대상 단백질로서의 의의는 크게 다르다. 종래 방법에서는 상기 C 말단측의 20개의 잔기의 부분을 인식하는 항체가 사용되고 있다. 그렇기 때문에, 이 항체는, 이러한 부분을 소실한 ProGRP-Cdel을 이미 인식하고, 포착할 수 없다. 이 C 말단측의 부분 절단의 진행은 검체 자체 또는 검체 채취 후의 보존 상태나 그 기간에 의해서 영향을 받고, 이것이 종래 방법에 있어서 검출 신호가 검체의 보존 상태나 그 기간에 의해서 영향을 받는 것의 원인이라고 추측된다.
한편, 본 발명에서는 ProGRP-Cdel 상에 존재하는 에피토프를 인식하는 항체를 사용하는 것이고, 검체 중에 ProGRP나 ProGRP-Cfrag가 존재하고 있어도, 또한 그 부분 절단이 발생하여도 안정하게 ProGRP 또는 그 분해물을 인식할 수 있기 때문에, 검체의 보존 상태나 그 기간에 의해서 검출 신호는 영향을 받지 않고, 재현성이 높은 측정이 가능하게 되는 것이다.
본 발명은 ProGRP-Cdel 상의 에피토프를 측정 대상으로 하기 때문에, ProGRP의 40 - 75 번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 (ProGRP(40-75)) 상에 존재하는 에피토프를 인식할 수 있는 항체로부터 선택된, ProGRP(40-75) 상에 존재하는 2종 이상의 상이한 에피토프를 각각 별개로 인식하는 상이한 항체를 사용하고, 샌드위치 면역측정법(sandwich immunoassay)에 의해서 ProGRP 또는 그 분해물을 검출하는 방법이다. 또한, 본 발명은 ProGRP의 40-79 번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 (ProGRP(40-79)) 상에 존재하는 에피토프를 인식할 수 있는 항체로부터 선택된, ProGRP(40-79) 상에 존재하는 2종 이상의 상이한 에피토프를 각각 별개로 인식하는 상이한 항체를 사용하여, 샌드위치 면역 측정법에 의해서 ProGRP 또는 그 분해물을 검출하는 방법이다.
특히, 본 발명에서는 ProGRP-Cfrag로부터 절단 제거되는 C 말단측의 부분 서열 상의 에피토프를 인식하는 항체를 포함하지 않고, ProGRP-Cdel 상의 에피토프를 인식하는 항체만을 사용한 샌드위치 면역 측정법의 이용이 바람직하다.
샌드위치 ELISA법의 기본 조작은 「초고감도 면역 측정법」(石川榮治, 1993년, 학회출판 센터) 또는 그 외 각종의 실험 수법의 해설서에 기재되어 있는 방법에 준하여 수행할 수 있고, 본 발명의 실시에 특유의 조작은 특히 필요한 것은 아니지만, 다음과 같은 공정으로 수행할 수 있다.
즉, ProGRP 또는 그 분해물은 (1) ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79)와 결합하는 제 1 항체 및 검체 중의 ProGRP 또는 그 분해물을 반응시키는 공정, (2) 상기 항체에 의해 포착된 ProGRP 또는 그 분해물을 (1)의 항체와는 상이하지만 ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79)와 결합하는 제 2 의 항체와 반응시키는 공정, 및 (3) (2)에 의해 발생하는 면역 복합체를 검출하는 공정을 포함하는 측정 방법에 의해서 검출할 수 있다.
ProGRP 또는 그 분해물과 결합하는 항체는, ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79)와 결합하는 항체만을 선택하여 사용하는 것이 바람직하지만, 재현성이 높은 측정값을 재현할 수 있는 범위 내에서, 이러한 항체 이외의 항체가 측정계에 포함될 수 있다.
본 발명에서 특히 바람직한 항체의 조합은, ProGRP의 40 - 60 번째 아미노산 서열을 인식하는 단일클론 항체 GRP-3D6-2 및 71 - 75 번째의 아미노산 서열을 인식하는 단일클론 항체 GRP-2B10의 조합이다. 단일클론 항체 GRP-3D6-2는 ProGRP의 40 - 60 번째의 아미노산 서열을 인식하지만, 동시에 동일 아미노산 서열 중의 임의의 8 연속 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 인식하지 않는다. 이것으로부터 단일클론 항체 GRP-3D6-2는 ProGRP의 40 - 60 번째의 아미노산 서열을 갖는 구조 에피토프를 인식하는 것으로 생각할 수 있다. 단일클론 항체 GRP-2B10는 71 - 75 아미노산 잔기로 구성되는 서열 에피토프를 인식하고 있다고 추측된다.
상기 두 종류의 단일클론 항체를 사용한 본 발명의 방법의 검출 감도는 4.5 pg/ml이다. 이것은 종래의 단일클론 항체와 다클론 항체(polyclonal antibody)를 사용한 ProGRP(31-98)을 측정하는 방법과 거의 동등한 감도이고, 정상인의 혈 중 ProGRP 측정에 충분히 사용될 수 있는 감도이다.
본 발명에서 사용하는 항체는 마우스, 래트, 모르모트, 토끼, 닭, 염소, 양, 소 등의 실험 동물을 면역하여 얻을 수 있다. 면역에 사용하는 항원은 ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79)의 이용이 바람직하지만, ProGRP(31-98)의 펩티드를 사용할 수 있고, 면역 후에 ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79)를 사용하여 원하는 항체를 선택하는 것으로 얻을 수 있다.
마우스의 예를 들어서 동물을 면역하는 방법을 설명한다. ProGRP(31-98) 등의 펩티드를 FCA (Freund's Complete Adjuvant), TiterMax Gold (CytRx사) 등의 보조약(Adjuvant)과 1:1로 혼합하고, 교류 조인트 (joint)에서 결합한 두 개의 주사관으로 반복하여 조인트를 통과시키거나, 또는 초음파 처리하는 등의 방법에 의해 에멀션(emulsion)을 제작한다. 제작한 항원 함유 에멀션을, 피하, 피내, 근육내, 복강내의 어느 쪽, 또는 복수 부위에 주입한다. 1회째의 면역 종료 후, 1 ∼ 4 주간의 간격을 두고, 2회째의 면역을 동일하게 실시한다. 이 후 동일하게 혈 중의 ProGRP(31-98)에 대한 항체를 항체가(antibody titre)가 상승할때까지 면역을 계속한다.
항체가의 측정은 이하와 같이 행할 수 있다. ProGRP(31-98)을 1 μg/mL의 농도로 PBS에 용해하고, 웰 당 50 μL의 용량으로 96 혈(穴) 마이크로타이터 플레이트 (micro-titer plate)의 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 흡착한다. 0.05% Tween 20 용량 PBS (PBS-T)에서 각 웰을 세정 후 분석에 사용한다. 분석 전에 1% BSA 용량 PBS 등으로 블로킹을 수행하여도 된다. 안와정맥총(眼窩靜脈叢), 미정맥(尾靜脈) 또는 미동맥(尾動脈) 등으로부터 채혈하고, PBS-T로 30배 희석한 후 원심 분리를 행한다. 얻어진 상청을 PBS-T로 희석 계열을 제작하고, ProGRP(31-98)을 코팅하고, 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 50 μL씩 첨가한다. 실온에서 30분 반응 후, PBS-T로 세정하고, PBS-T 등으로 적절하게 희석한 HRP (horseradish peroxidase) 표식 항마우스 IgG 용액을 각 웰에 50 μL 씩 첨가한다. 추가로 실온에서 30분 반응 후, 과산화수소, 오르토페닐렌디아민(orthophenylene diamine: OPD) 기질액을 첨가하여 30분간 반응시키고, 2N H2SO4를 50 μl 첨가하여 반응을 정지시키고, 각 웰의 흡광도를 측정한다.
면역된 마우스로 충분하게 ProGRP에 대한 항체가가 상승하고 있는 것을 확인한 후, 비장을 꺼내고 비장세포를 단리한다. 별도로 배양하여 둔 마우스 골수종 (myeloma) (예를 들면, SP2/0-Ag14 등) 및 폴리에틸렌글리콜 등을 사용함으로써 융합한다. 융합에 성공한 세포를 HAT (hypoxanthine·aminopterin·thymidine) 배지에서 선택 배양한다. 7 ∼ 14 일 정도, 수일 걸러 배지를 반량 교환하면서 배양을 단속(斷續)한 후 배양 상청의 항체가를 측정한다. 포지티브(positive)·웰의 세포를 한계희석법으로 클로닝하고, 목적 항체 생산 하이브리도마를 얻는다. 상기 방법에 의해 얻어진 하이브리도마 클론으로서 3D6-2 (기탁번호 FERM BP-8669), ProGRP-2B10 (기탁번호 FERM BP-4110)을 들 수 있다.
상기 방법으로 얻어진 항체의 에피토프를 해석함으로써, ProGRP(40-75) 상 및/또는 ProGRP(40-79) 상에 존재하는 에피토프를 인식하여 결합하는 항체를 취득할 수 있다. 에피토프 해석은 ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79)에 대한 항체의 반응을 조사함으로서 가능하다. 변이체(modified organism)에서 발현시킨 ProGRP(31-98)이나 ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79) 또는 Fmoc법이나 Boc법으로 화학 합성시킨 ProGRP(40-75) 및/또는 ProGRP(40-79)를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 상술한 면역 측정법으로 각 펩티드에 대한 반응을 조사함으로써 결정된다. 또한, ProGRP의 연속하는 8-12 아미노산 정도의 연속하는 펩티드에 존재하는 에피토프는 멀티플 펩티드(multiple peptide)법에 의해 합성한 펩티드를 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에서는 사용되는 항체를 고상화하거나, 라벨링할 수도 있다. 각 조작은 각종의 실험 수단의 해설서에 기재되어 있는 방법에 준하여 행하면 되고, 본 발명의 실시에 특유의 조작은 특별히 필요한 것은 아니다.
본 발명은 상술한 방법에 추가로 검체 중의 ProGRP 또는 그 분해물을 측정하기 위한 키트, 특별히 ProGRP 또는 그 분해물을 측정함으로써 폐소세포암의 진단이나 화학요법의 모니터링을 행하기 위한 진단약 키트도 제공한다. 이러한 키트는 상술한 ProGRP(40-75) 상 및/또는 ProGRP(40-79) 상에 존재하는 에피토프를 인식하는 항체를 적어도 2종 포함하고, 그 외 임의적으로 반응 완충액이나 2차 항체의 희석액, ProGRP의 표준물질, 설명서 그 외의 구성물을 포함하고 있을 수 있다. 키트에 포함되는 항체의 바람직한 예로서는 ProGRP(40-75) 상 및/또는 ProGRP(40-79) 상에 존재하는 에피토프를 인식하고, 동일 펩티드 상의 8개 연속 아미노산 잔기을 갖는 펩티드는 인식하지 않는 항체 또는 ProGRP의 71 - 75 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체이고, 대표적인 예로서는 단일클론 항체 GRP-3D6-2 또는 단일클론 항체 GRP-2B10이다.
도 1은 멀티플 펩티드로 합성한 8 연속 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대한 단일클론 항체의 반응성을 나타낸다. 가로축은 ProGRP(31-98)의 8 연속 아미노산 서열을 세로축은 흡광도를 나타낸다. (A)는 GRP-3D6-2, (B)는 GRP-3G2, (C)는 GRP-2B10의 반응성을 나타낸다.
도 2는 아미노산 번호 40 - 75 번째의 부분 펩티드에 결합하는 항체인 3D6-2와 2B10을 사용한, 측정 방법의 표준곡선을 나타낸다. 가로축은 ProGRP의 농도를, 세로축은 흡광도를 나타낸다.
이하, 실시예를 들어서 본 발명을 추가로 설명한다.
실시예 1
하이브리도마의 제작
일본 특허 제3210994호의 실시예 1에 기재된 방법에 의해 변이체를 제작하고, 대장균으로 발현시킨 서열번호 4에 표시된 펩티드를 정제하였다. 일본특허 제3210994호의 실시예 1에서는 이 변이체는 GRP(31-98)로 기재되어 있지만, 정확하게는 GRP 전구체 (ProGRP)의 (31-98) 부분이기 때문에, 여기에서는 ProGRP(31-98)로 기재한다. 이어서 동일 특허 제3210994호의 실시예 6에 기재된 방법에 의해, 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다.
얻어진 하이브리도마 3D6-2 (FERM BP-8669)는 2004년 3월 23일자로 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허 미생물 기탁 센터에, ProGRP-2B10 (FERM BP-4110) 및 ProGRP-3G2 (FERM BP-4109)는 1992년 12월 9일자로 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소 (현 독립행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 미생물 기탁 센터)에 각각 기탁되어 있다.
얻어진 하이브리도마를 프리스틴(pristine) 등으로 처리한 마우스 복강에 이식하고, 복수(腹水)를 회수하고, 프로테인 A (protein A)를 결합시킨 세파로스 칼럼 (sepharose column)을 사용하여, 각 단일클론 항체를 복수(腹水) 중으로부터 정제하였다. 하이브리도마 3D6-2 (FERM BP-8669)로부터 얻어진 단일클론 항체를 GRP-3D6-2라고 명명하였다.
실시예 2
단일클론 항체의 에피토프 해석
(1) 펩티드의 합성과 에피토프의 결정
서열번호 3으로 ProGRP(31-98)의 핵산 서열과 아미노산 서열을 표시한다. 이 아미노산 서열에 따라서, ProGRP(31-98)의 부분 펩티드를 Fmoc법으로 합성하였다. Pep 1은 ProGRP의 31 - 52 번째의 펩티드, Pep 70은 40 - 60 번째의 펩티드, Pep 3은 54 - 78 번째의 펩티드, Epi 2는 82 - 96 번째의 펩티드, Pep 5는 82 - 96 번째의 펩티드이다. 합성된 펩티드는 역상 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피와 겔 여과를 조합하여 정제하였다. 정제 순도는 80% 이상이었다.
각각의 펩티드를 1 μg/mL의 농도로 PBS로 희석하고, 96 혈 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, 4℃에서 밤새 흡착시켰다. PBS로 각 웰을 2회 세정 후 1% BSA를 포함하는 PBS를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 인큐베이션을 수행하고, 흡인 제거하였다. 1 μg/mL의 농도로 희석한 단일클론 항체 GRP-3D6-2을 100 μL씩 각 웰에 첨가하고, 실온에서 60분 간 반응시킨 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(PBS-T)로 5회 세정 후, HRP (horseradish peroxidase) 표식 항 마우스 IgG 항체 용액을 100 μL씩 각 웰이 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. PBS-T로 5회 세정 후, 기질 용액 (2 mg/mL의 오르토페닐렌디아민, 30% 과산화 수소수 0.9 μL/mL를 포함하는 0.1 M 구연산 인산 완충액, pH 5.0)을 100 μL씩 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 2N 황산을 100 μL씩 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 즉시 492 nm에 있어서의 흡광도를 측정하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
펩티드 a.a. No OD492/630
Pep 1 31 - 52 0.003
Pep 70 40 - 60 0.822
Pep 3 54 - 78 0.003
Epi 2 70 - 90 0.004
Pep 5 82 - 96 0.002
ProGRP 31 - 98 2.236
단일클론 항체 GRP-3D6-2는, 양성대조인 변이체 ProGRP(31-98)과 ProGRP의 40 - 60 번째의 아미노산 서열인 Pep 70에 반응하였다. 이것에 의해 GRP-3D6-2는 ProGRP의 40 - 60 번의 아미노산 서열을 인식하고 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 동일한 방법으로 GRP-2B10은 Pep 3과 Epi 2의 펩티드에 반응하고, GRP-3G2는 Epi 2와 Pep 5의 펩티드에 반응하는 것을 알 수 있었다.
(2) 멀티플 펩티드의 합성과 에피토프의 결정
ProGRP(31-98)의 아미노산 서열에 기초하여, 1 아미노산씩 오버랩(overlap)시킨 연속한 8개의 아미노산씩의 61개의 펩티드를 멀티플펩티드법으로 합성하였다. 각 펩티드는 말단에 비오틴을 결합시킨 것이고, 합성은 화광순약주식회사 (오사카)에 의뢰하였다.
멀티플펩티드법으로 합성한 각 비오틴화 펩티드를 디메틸포름아미드에 용해하고, 1 μg/mL의 농도로 PBS에 희석하였다. 그 희석된 각 비오틴화 펩티드 용액을 아비딘(avidin) 고상(固相)화된 98혈 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, 4℃에서 밤새 결합시켰다. 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS (PBS-T)로 각 웰을 세정 후, 각 단일클론 상체 GRP-3D6-2, GRP-3G2, GRP-2B10을 1 μg/mL로 희석한 용액을 각 웰에 100 μL씩 첨가하였다. 실온에서 30분간 반응 후, PBS-T로 5회 세정하고, HRP 표식 항 마우스 IgG 항체용액을 각 웰에 100 μL 씩 첨가하였다. 추가로, 실온에서 30분간 반응 후, PBS-T로 5회 세정하고, 기질 용액 (2 mg/mL의 오르토페닐렌디아민, 30% 과산화수소수 0.9 μL/mL를 포함하는 0.1 M 구연산 인산 완충액, pH 5.0)을 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, 실온에서 30분 반응 후, 2 N 황산을 100 μL씩 첨가하고, 즉시 492 nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 각 단일클론 항체 GRP-3D6-2, GRP-3G2, GRP-2B10의 ProGRP(31-98) 내부의 각 펩티드에 대한 반응을 도 1(A), (B), (C)에 표시한다.
도 1의 (A)에 나타난 것과 같이, 단일클론 항체 GRP-3D6-2는 ProGRP(31-98)의 내부의 8개씩의 연속하는 펩티드에는 결합하지 않았다. 이것은 GRP-3D6-2은 ProGRP의 8개의 연속하는 펩티드를 인식할 수 없고, 8개보다 긴 펩티드로 만들어진 구조 에피토프를 인식하기 때문인 것으로 생각된다. 한편, 단일클론 항체 GRP-3G2는 81 - 88, 82 - 89, 83 - 90, 84 - 91의 4 가지의 8개의 연속하는 펩티드에 결합하였다. 단일클론 항체 GRP-3G2의 항체는 이 4 가지의 펩티드에 존재하고 있는 서열인 84 - 88의 펩티드를 인식하고 있는 것이라고 생각된다 (도 1 (B)).
또한, 단일클론 항체 GRP-2B10의 항체는 68 - 75, 69 - 76, 70 - 77, 71 - 78의 4 가지의 8개의 연속하는 펩티드에 결합하였다. 이 때문에, 단일클론 항체 GRP-2B10은, 이 4 가지의 펩티드에 존재하고 있는 서열인, 71 - 75의 펩티드를 인식하고 있다고 생각된다 (도 1 (C)).
이들 펩티드를 사용한 에피토프의 결정의 결과로부터, 단일클론 항체 GRP-3G2 또는 단일클론 항체 GRP-2B10에 인식되는 에피토프는 5 잔기의 아미노산으로부터 형성되는 연속 에피토프이다.
또한, 단일클론 항체 GRP-3D6-2는 ProGRP(31-98)의 적어도 40 - 60 부분의 펩티드를 인식하고, 또한 ProGRP(31-98)의 내부의 8개의 연속하는 펩티드에 반응하지 않는 항체이다. 다시 말하면, GRP-3D6-2에 인식되는 에피토프는 ProGRP(31-98)의 적어도 40 - 60의 아미노산 서열로 형성되지만, 8개씩의 연속하는 펩티드에는 형성될 수 없는 구조 에피토프라고 생각된다.
이상의 단일클론 항체가 인식하는 에피토프의 관계를 정리하면 표 2와 같다.
[표 2]
단일클론 항체 에피토프
(ProGRP의 아미노산 No.)
GRP-3G2 84 - 88
GRP-2B10 71 - 75
GRP-3D6-2 40 - 60
실시예 3
단일클론 항체의 조합에 의한 검체 보존 안정성의 검사
96웰 마이크로 플레이트의 각 웰에, 1종 또는 2종의 단일클론 항체 (2종류의 경우는 동량 혼합)를 4 μg/mL의 농도로 100 μL 가하고, 4℃로 밤새 인큐베이션하여 고상화하였다. 0.15 M NaCl을 포함하는 10 mM 인산완충액 (pH 7.3)으로 2회 세정 후, 블로킹액 (0.5% 카제인 나트륨 (sodium caseinate)을 포함하는 10 mM 인산 완충액, pH 7.1)을 350 μL를 가하고, 2시간 정치하여 블로킹하였다. 블로킹액을 제거한 후, 반응액 100 μL와 측정 검체 50 μL를 각 웰에 가하고, 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 세정액 (0.05% Tween 20을 포함하는 10 mM 인산 완충액, pH 7.3)으로 5회 세정하고, HRP 표식을 한 1종 또는 2종의 단일클론 항체 (2종류의 경우는 동량 혼합) 용액 100 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 5회 세정하고, 기질용액 (2 mg/mL의 오르토페닐렌디아민, 30% 과산화수소수 0.9 μL/mL를 포함하는 0.1 M 구연산인산 완충액, pH 5.0)을 100 μL를 가하고, 30분간 인큐베이션하고, 2N 황산을 100 μL를 가하여 효소 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 리더로, 492 nm (레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다.
이 측정법을 사용하여, 3 검체를 각각 -20℃로 동결 보존하여 둔 것과 실온에서 17 시간 보전한 것으로 나누어 측정하였다. 동결 보존하여 둔 것의 ProGRP값을 100%로 하고, 실온에서 17 시간 보존한 경우의 측정치를 백분율로 표시하였다 (표 3). 고상화 항체와 표식 항체의 조합이, 각각 GRP-3G2와 GRP-2B10, GRP-3G2와 GRP-3D6, GRP-3G2와 GRP-2B10/GRP-3D6-2의 경우, 17 시간 보존 검체 중의 ProGRP 면역 활성은 평균 69.6%, 70.6%, 69.2%로 각각 저하하였다. 또한, 종래 방법인 고상화 항체와 표식 항체의 조합인 GRP-3G2/GRP-2B10과 다클론 항체의 경우도 71.8%로 감소하였다. 한편, 고상화 항체에 GRP-3D6-2, 표식항체에 GRP-2B10을 사용한 경우는 17 시간 실온에서 보존하여도 측정치는 평균으로 89.3%이고, 다른 항체의 조합보다도 약 20%의 ProGRP의 면역 활성이 유지되었다 (표 3). 또한, 다클론 항체는 일본 특허 제3210994호의 실시예 8에 기재된 방법으로 취득한 것을 사용하였다.
[표 3]
sample No. solid phase GRP-3G2 GRP-3G2 GRP-3G2 GRP-3D6-2 GRP-3G2
GRP-2B10
conjugate GRP-2B10 GRP-3D6-2 GRP-2B10/GRP-3D6-2 GRP-2B10 polyclonal antibody
729
857
815		 66.3
71.6
70.7		 66.8
73.7
71.1		 66.5
70.0
71.0		 82.1
92.5
93.3		 71.6
72.9
70.9
Mean recovery(%) 69.6 70.6 69.2 89.3 71.8
실시예 4
ProGRP (40-75)에 결합하는 항체를 사용한 측정법
96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 GRP-3D6-2를 4 μg/mL의 농도로 200 μL 가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하고 고상화하였다. 0.15 M NaCl를 포함하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 2회 세정 후, 블로킹액 (0.5% 카제인 나트륨을 포함하는 10 mM 인산 완충액, pH 7.1)을 350 μL 가하고, 2 시간 정치하여 블로킹한다. 블로킹액을 제거 후, 반응액 100 μL와 측정 검체 100 μL를 각 웰에 가하고, 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 세정액 (0.05% Tween 20을 포함하는 10 mM 인산 완충액, pH 7.3)로 5회 세정하고, HRP 표식한 GRP-2B10 용액 200 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 5회 세정하고, 기질 용액 (2mg/mL의 오르토페닐렌디아민, 30% 과산화수소수 0.9 μL/mL를 포함하는 0.1M 구연산인산 완충액, pH 5.0)을 200 μL를 가하고, 30분간 인큐베이션하고, 5 N 황산을 50 μL를 가하여 효소 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 리더로, 492 nm (레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다. 그 표준곡선을 도 2에 표시하였다.
이 표준 곡선으로부터 약 4.5 pg/mL의 ProGRP를 검출할 수 있다고 생각할 수 있다. 이 감도는 정상인 검체 중의 ProGRP량을 검출할 수 있는 충분한 감도이다.
<시험예 1>
종래 방법과 본 발명의 실시예 4의 측정 방법을 사용하여, 5 검체를 4℃에서 1, 3, 7일간 보존한 후, 검체 중 ProGRP 면역 활성을 측정하고, 보존 전의 측정값과 비교하였다. 종래 방법은 다음과 같이 하여 실시하였다. 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 , GRP-3G2 및 GRP-2B10 (동량 혼합)을 10 μg/mL의 농도로 100 μL 가하여, 4℃로 밤새 인큐베이션하여 고상화하였다. 0.15 M NaCl을 포함하는 10 mM 인산 완충액 (pH 7.3)으로 2회 세정 후, 블로킹액 (0.5% 카제인 나트륨을 포함하는 10 mM 인산 완충액, pH 7.1)을 350 μL 가하여 2 시간 정체하여 블로킹하였다. 블로킹액을 제거 후, 반응액 100 μL과 측정 검체 50 μL를 각 웰에 가하고, 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 세정액 (0.05% Tween 20을 포함하는 10 mM 인산 완충액, pH 7.3)으로 5회 세정하고, HRP 표식을 한 다클론 항체 용액 100 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 5회 세정하고, 기질 용액 (2 mg/mL의 오르토페닐렌디아민, 30% 과산화수소수 0.9 μL/mL를 포함하는 0.1M 구연산인산 완충액, pH 5.0)을 100 μL를 가하고, 30분간 인큐베이션하고, 2N 황산을 100 μL를 가하여서 효소 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 리더로, 492 nm(레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다.
4℃에서 보존하기 전의 ProGRP의 값을 100%로 하고, 각각의 보존 기간 후의 측정치를 백분율로 표시하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.
종래 방법의 경우, 검체 중의 ProGRP 측정값은 4℃에서 1일간 보존에서는 평균 94.5%, 3일간 보존에서는 평균 85.8%, 7일간 보존에서는 평균 67.8%이고, 1일간 평균으로 약 4.93%씩 저하하는 경향을 보였다. 한편, 본 발명의 측정 방법에서는 검체 중의 ProGRP 측정값은, 4℃에서 1일간 보존에서는 평균 96.9%, 3일간 보존에 서는 평균 94.3%, 7일간 보존에서는 평균 86.9%이고, 1일간 평균으로 약 2.29%씩 저하하는 경향을 보였다. 즉, 본 발명의 측정 방법에서는 종래 방법보다도 2.15배 높은 보존 안정성을 나타내고, 특히 7일간 보존에서는 종래 방법보다도 약 19%의 ProGRP의 면역 활성에 유지되었다.
[표 4]
종래 방법 본 발명
solid phase GRP-2B10 & GRP-3G2 GPR-3D6-2
conjugate /polyclonal antibody /GPR-2B10
보존 기간 1 day 3 days 7 days 1 day 3 days 7 days
Sample No. 115
822
215
1029
857		 92.3
92.9
95.8
93.3
98.4		 84.0
85.1
78.8
92.0
89.0		 63.4
65.6
66.0
66.7
77.4		 97.8
98.6
100.0
86.6
101.5		 94.2
95.6
95.5
86.7
99.6		 85.7
91.3
91.0
76.5
89.8
Average, % 94.5 85.8 67.8 96.9 94.3 86.9
<시험예 2>
본 발명에서 이용 가능한 단일클론 항체 GRP-3G2, GRP-2B10, GRP-3D6-2가 각각 인식하는 에피토프의 해석을 수행하였다.
ProGRP의 31 - 53 번째의 펩티드를 Fmoc법으로 합성하였다. 합성한 펩티드는 역상 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피와 겔 여과를 조합하여 정제하였다. 실시예 2에서 이용한 펩티드를 포함하고, 각각의 펩티드를 0.1% TFA에 용해하고, 10 μg/mL의 농도로 PBS로 희석하였다. 96 혈 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 1 웰 당 100 μL씩의 용량으로 96 혈 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 4℃로 밤새 흡착시켰다. PBS로 각 웰을 2회 세척 후, 1% BSA를 포함하는 PBS를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 인큐베이션을 수행하고, 흡인 제거하였다. 5 μg/mL의 농도로 희석한 단일클론 항체 GRP-3G2, GRP-2B10, GRP-3D6-2를 100 μL씩 각 웰에 첨가하고, 실온에서 85분간 반응시킨 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(PBS-T)로 5회 세정하였다. PBS-T로 적절하게 희석한 HRP 표식 항 마우스 IgG 항체 용액을 100 μL씩 각 웰에 첨가하고, 추가로 실온에서 30분간 반응시켰다. PBS-T로 5회 세정 후, 기질 용액 (2 mg/mL의 오르토페닐렌디아민, 30% 과산화 수소수 0.9 μL/mL을 포함하는 0.1 M 구연산인산 완충액, pH 5.0)을 100 μL씩 각 웰에 첨가하고, 실온에서 20분간 반응시킨 후, 2N 황산을 100 μL씩 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고, 즉시 492 nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Peptide GRP-3D6-2 GRP-3G2 GRP-2B10
31 - 53 0.003 0.006 0.006
40 - 60 1.477 0.005 0.004
54 - 78 0.005 0.027 2.052
70 - 90 0.004 1.953 1.830
82 - 96 0.005 1.425 0.060
31 - 98 2.063 2.146 2.145
표 5로부터, GRP-3G2, GRP-2B10, GRP-3D6-2가 반응하는 에피토프는 실시예 2에서 나타난 것과 거의 동일한 결과를 나타내고, GRP-3D6-2는 31 - 53에 완전하게 반응하지 않기 때문에, 42 - 53의 펩티드에도 반응하지 않는 것이 확인되었다.
<시험예 3>
ProGRP-Cdel의 동정을 질량 분석 장치 (LC-MS/MS)를 사용하여 수행하였다. ProGRP(31-98) 영역의 각종 펩티드에 반응성을 나타낸 토끼 다클론 항체를 PBS (pH 7.35)로 12.7 mg/ml이 되도록 용해하고, 3 mL의 NHS-Sepharose (Amersham 사)의 유저 매뉴얼에 따라서 결합시켰다.
2예의 1.5 mL의 사람 혈청 검체에 20 μg의 변이체 ProGRP(31-98)을 첨가하여 실온에서 24 시간 보존하였다. 그 후, 전술한 토끼 다클론 항체 결합 Sepharose를 0.4 mL 첨가하고, 실온에서 60분간 교반하였다. 이 토끼 다클론 항체 결합 sepharose를 세정액 (0.05% Tween 20을 포함하는 10 mM 인산 완충액 pH 7.3)으로 세정하고, 9.5M 요소액 0.5 mL를 첨가하고, 토끼 다클론 항체 결합 sepharose에 결합한 것을 용출하였다. 용출액을 회수하여 그 일부를 취하고, LC-MS/MS를 사용하여 사람 혈청 검체 중에서 보존 후의 ProGRP(31-98) 영역이 보존된 펩티드를 검사하였다.
용출액 100 μL에 250 mM의 메틸-PEO4-NHS 에스테르 (Pierce) 용액/DMSO를 1 μl 첨가하고, 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 1 M tris-HCl, pH 8을 5 μl 첨가하고, 실온에서 30분 인큐베이션하여 반응을 정지한 후, 800 μl의 아세톤을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 원심 분리 후, 펠릿(pellet)을 건조시키고, 거기에 Promega사의 modified trypsin 용액 (20 ng/μl/50 mM 탄산수소 암모늄)을 15 μl 첨가하고, 30℃에서 밤새 소화하였다. 소화 후의 샘플에 0.1% 포름산 15 μl 을 첨가하고, 15000 rpm으로 5분간 원심분리한 상청 5 μl에 대해서 LC-MS/MS 분석{(LC부) Agilent 1100 series capillary LC system, (컬럼) Agilent Zorbax SB-Cl8, 5 μm, 150 × 0.5 mm, (MS/MS) BrukerDaltonics HCT-plus}을 수행하였다. 분리는 0.1% 포름산 존재 하에서 행하고, 유량은 15 μl/분, 아세토니트릴 (acetonitrile) 구배는 0-35% linear/0-120 min, 35-95% linear/120-125 min로 하였다. 컬럼 용출액은 ESI부에 도입하고, MS/MS 데이터를 취득하고, DataAnalysis 소프트웨어로 피크 리스트를 작성하고, Matrix Science사의 MASCOT sever로 해석을 수행하였다.
메틸-PEO4-NHS는, 단백질 분자 내의 N 말단 아미노기 및 리신(lysine)의 측쇄 아미노기를 수식하는 성질을 가진다. 따라서, 발견된 펩티드 단편의 내에서 N 말단이 표식된 것이 있다면, 그것은 소화 전에 N 말단 프리의 상태였던 것이다. 또한, 측쇄 아미노기가 수식된 리신의 부위에서는 트립신에 의한 소화가 일어나지 않기 때문에, C 말단 리신의 측쇄가 수식되어 있다면, 그것은 소화 전에 이미 이 부분에서 절단되어 있는 것이다. 양 혈청 검체에서 C 말단 리신이 표식된 단편으로서는, NHQPPQPK (72-79)가 발견되었다. 따라서, 적어도 Lys-79의 C 말단측에서 절단된 단편이 혈청 처리에 의해 생긴 것으로 생각할 수 있다. 추가로, N 말단측이 표식되어 있지 않지만, 양 혈청 검체에서 SVSER(37-41)이라고 하는 단편이 관찰되고, Ser-36의 C 말단측에서 절단되는 가능성이 시사되었다.
본 발명의 방법은, 새롭게 확인된, 검체 중에서도 안정하게 보존되고 있는 ProGRP의 특정 종류의 분해물 상의 에피토프를 측정 대상으로 함으로써, 종래의 측정법과 동등한 검출 감도가 얻어지는 것에 더하여, 채취 후의 검체의 취급 방법에 영향을 받지 않아, 재현성이 높은 측정값을 얻는 등, 혈중 ProGRP의 검출에 유효하다.
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Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 75 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드(ProGRP(40-75))를 인식하는 2종 이상의 상이한 항체를 사용하여 가스트린 방출 펩티드 전구체; 그의 분해물; 또는 가스트린 방출 펩티드 전구체 및 그의 분해물을 측정하는 방법으로서,
    상기 2종 이상의 다른 항체는 ProGRP(40-75)에 존재하는 2종 이상의 다른 에피토프를 개별적으로 인식하는 것인 방법 .
  2. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 79 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드(ProGRP(40-79))를 인식하는 2종 이상의 상이한 항체를 사용하여 가스트린 방출 펩티드 전구체; 그의 분해물; 또는 가스트린 방출 펩티드 전구체 및 그의 분해물을 측정하는 방법으로서,
    상기 2종 이상의 다른 항체는 ProGRP(40-59)에 존재하는 2종 이상의 다른 에피토프를 개별적으로 인식하는 것인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    샌드위치 면역 측정 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 기탁번호 FERM BP-08669로 기탁된 하이브리도마 3D6-2가 생산하는 항체.
  7. 기탁번호 FERM BP-08669로 기탁된 하이브리도마 3D6-2.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    2종 이상의 상이한 항체 중 적어도 하나가
    i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 60 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 상의 임의의 8 연속 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하지 않는 항체;
    ii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 60 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하고, 31 - 53 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하지 않는 항체; 또는
    iii) 기탁번호 FERM BP-08669로 기탁된 하이브리도마 3D6-2가 생산하는 항체
    로부터 선택되는 항체인 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    2종 이상의 상이한 항체 중 적어도 하나가
    i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 60 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 상의 임의의 8 연속 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하지 않는 항체;
    ii) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 40 - 60 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하고, 31 - 53 번째의 부분 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하지 않는 항체; 또는
    iii) 기탁번호 FERM BP-08669로 기탁된 하이브리도마 3D6-2가 생산하는 항체
    로부터 선택되는 항체이며,
    다른 하나는 서열번호 1의 아미노산 서열 71 - 75 번째의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 인식하는 항체인 방법.
  10. 제 6 항에 따른 항체를 포함하는 가스트린 방출 펩티드 전구체 또는 그 분해물을 측정하기 위한 키트.
  11. 제 10 항에 있어서,
    암의 진단을 수행하기 위한 키트로서,
    상기 암은 폐소세포암, 갑상선수양암, 식도소세포암, 췌소세포암 및 전립선소세포암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
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