JP4950880B2 - ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体およびその使用に関するものであり、肺小細胞がんを含む各疾病の早期発見や治療のモニタリング、再発のモニタリング等に広く利用されるものである。
わが国における死因の第１位は悪性新生物であり、その中でも肺癌の死亡率は、男性では胃癌を抜いて第１位、女性でも第３位となっており、年々上昇する傾向にある。肺癌は病理組織学的に以下の主に４つの組織型に分類されている。すなわち、肺門部に発生する肺扁平上皮癌（squamous-cell carcinoma）と肺小細胞癌（small-cell lung carcinoma： SCLC）、肺野部に発生する肺腺癌（adenocarcinoma）と肺大細胞癌（large-cell lung carcinoma）である。
特に肺小細胞癌は、増殖が速く早期に遠隔転移を起こすため、初診時ではすでに全身性に転移した進行癌で発見されることが多い。この型の癌の治癒率については、病変が一側の肺野に限局している肺小細胞癌の限局型（limited disease：ＬＤ）患者の治癒率は約２０％であるが、両肺や他の臓器に転移した進展型（extensive disease：ＥＤ）の患者では、事実上治癒は難しいと言われている。
また、肺小細胞癌は抗癌剤に感受性が高いため、化学療法が治療法の第一選択とされるのに対して、肺非小細胞癌（non-small-cell lung carcinoma：non−ＳＣＬＣ）は、化学療法の奏功率が低いために外科療法が治療法の第一選択とされている。
そのため、肺小細胞癌は肺癌の中でも特に早期発見・治療が必要な癌であり、そのためにも肺小細胞癌と肺非小細胞癌を鑑別診断することは、治療方針を決定する上で極めて重要である。
肺癌を発見する方法のひとつに喀痰検査がある。しかし、喀痰検査は主に肺扁平上皮癌の検査には好適であるが、肺小細胞癌に対する陽性率は低いという問題がある。また、Ｘ線撮影法も肺癌の発見に広く用いられている方法であるが、肺門部に生じる肺扁平上皮癌や肺小細胞癌に対しては、肺門部が心臓の影となるので癌組織の陰影が非常に撮影され難いという問題がある。また、肺小細胞癌については、肺野の異常陰影を呈する患者に対して喀痰細胞診、胸部Ｘ線単純撮影、ＣＴスキャン、気管支内視鏡等を用いても、この型の肺癌の早期発見は容易ではないとされている。
また、癌を診断するための検査方法の幾つか、例えば放射線照射やバイオプシー、気管支内視鏡などは、患者に対して苦痛を与え、また高価な機器や熟練した技術などを必要とする。
そのため、より簡便な血液検査によって治癒可能な時期に癌を高率に診断することを可能とする、腫瘍マーカーの研究が行われている。今日では、癌疾患の発見、診断、病状経過のモニタリングの指標、再発診断等に３０以上の腫瘍マーカーが利用されている。
肺癌は組織型が多彩であるため、全ての型の肺癌の発見あるいは診断に有効な腫瘍マーカーはいまだ報告されていない。そのため今日では、肺癌の組織型ごとに有効なマーカーが選択され、使用されている。
例えば、肺腺癌に対しては癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen：ＣＥＡ）やシアリルLex-i抗原が、肺扁平上皮癌に対しては扁平上皮癌関連抗原（squamous-cell carcinoma related antigen：ＳＣＣ）が、肺小細胞癌に対しては神経特異エノラーゼ（neuron-specific enolase：ＮＳＥ）などが、主に選択、使用されている。
しかしＮＳＥは、（１）治癒可能な早期癌に対する陽性率が低いこと、（２）治療による一過性の測定値の上昇が認められること、（３）採血時の溶血により測定値が上昇すること、（４）肺小細胞癌患者と健常人との測定値差が小さいこと、などの欠点があり、肺小細胞癌に対する有効な腫瘍マーカーであるとは必ずしも言えなかった。
ガストリン放出ペプチド（gastrin-releasing peptide：ＧＲＰ）は、McDonaldらが1978年にブタ胃組織から単離した、ガストリン分泌促進作用を有する２７個のアミノ酸よりなる脳腸ペプチドである。ヒトにおいてもＧＲＰの存在は確認されており、ヒトＧＲＰをコードする遺伝子も1984年にクローニングされている。
国立がんセンターの山口らは、神経内分泌細胞に由来すると考えられている肺小細胞癌の生物学的特性の研究過程で、ＡＣＴＨ（adrenocorticotropic hormone）やカルシトニンなどを含む１５種類以上の脳腸ホルモンを測定し、ＧＲＰが最も高頻度にかつ高濃度に培養肺小細胞癌株で積極的に分泌されることを明らかにした（非特許文献１）。さらに、血中ＧＲＰの濃縮法を組み合わせたラジオイムノアッセイ (ＲＩＡ) を構築し、肺小細胞癌患者は健康な人に較べ高い血中ＧＲＰ濃度を呈することを明らかにした。しかし、ＧＲＰは血中で速やかに分解されるため血中濃度が低く、また上記アッセイは煩雑な濃縮操作を必要としたため、臨床応用が困難であった。
その後の研究により、各種の細胞においてalternative RNA splicingによって３種のＧＲＰ前駆体（ProGRP）が産生されることが明らかにされた（非特許文献２）。これら３種のProGRPは、その１−９８番目においてアミノ酸配列が共通している一方、９９番目以降はalternative RNA splicing によって、互いに異なるアミノ酸配列となっている。この共通する１〜９８番目のアミノ酸配列を配列番号１に示す。以後、特に断らない限り、本発明におけるProGRP、その部分配列、分解物等のアミノ酸残基の番号表示は、配列番号１のアミノ酸配列のそれをもって表すこととする。
３種の ProGRPの１−２７番目のアミノ酸配列は、ガストリン分泌促進活性をもつ成熟ＧＲＰのそれと同一である。これら３種の前駆体は、いずれもホルモン前駆体切断酵素によって、１−２７番目のアミノ酸配列からなる成熟型ＧＲＰと、３１番目以降のアミノ酸配列からなるガストリン分泌促進活性をもたないProGRPの分解物であるＣ末端側フラグメント（ProGRP-Cfrag)とに分解される。
Holstら（非特許文献３）は、ProGRPの４２−５３番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ProGRP (42-53)とする）に対する抗血清を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法によって、肺小細胞癌患者の血漿中のProGRPまたはProGRP-Cfragの レベルが高いことを報告した。しかし、この方法では沈殿抽出操作が必要であり、感度も十分ではなかった。また、この様な１１アミノ酸残基からなる短鎖のペプチドで免疫した場合には、ProGRPの立体構造エピトープを認識する抗体は誘導されないと考えられる。
三宅らは、ProGRPがＧＲＰよりも血中で安定性が高いこと、ならびに３種のProGRPの共通部分である ３１−９８番目のアミノ酸配列が他の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性を示さないことに着目し、同アミノ酸配列からなる組換え体ペプチド（以下、ProGRP (31-98)とする）を抗原として得た高力価の抗血清を用いて、沈殿抽出操作が不要の高感度ＲＩＡ法を構築した（非特許文献１）。この方法により、ProGRPはＧＲＰと同様に優れた腫瘍マーカーになることが示された。
しかし、この方法は抽出操作を必要としない点で有利であるが、測定に４日間を必要とすることや感度が１０ｐＭ（７７．３ｐｇ抗原／ｍＬ）と十分でないため、健常人血清中のProGRP値を測定することはできず、臨床応用には至っていない。
また、前述したHolstら及び三宅らのＲＩＡ法はインヒビション法であるため、ProGRPの断片の一部でも抗原性を有していれば測定可能であるが、その感度はサンドイッチ法に比べて低く、高感度化が必要なProGRP測定法の臨床応用は困難である。すなわち、ProGRPの検出を臨床的に行うためには、検出の感度を高めることは必須であり、特にサンドイッチ法で利用可能な抗体が必要となる。
山口、青柳らは、ProGRPの肺小細胞癌用腫瘍マーカーとしての 臨床応用を目的として、enzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）を原理とする、サンドイッチ法を用いた簡便で高感度な ProGRP測定試薬を開発した（特許文献１）。この方法は約２時間で結果を与え、また高い感度（２ｐｇ／ｍＬ）を有していることから、現在幅広く臨床応用されており、肺小細胞癌においてＮＳＥよりも高い感度、特異性を有していることが明らかとなっている。
また、この測定法を用いて、肺小細胞癌以外にも、神経内分泌腫瘍（甲状腺髄様癌など）、神経内分泌腫瘍的性格を示す癌（食道小細胞癌、膵小細胞癌、前立腺小細胞癌など）でも血清 ProGRP値が上昇することが明らかとなり、今後これらの腫瘍の早期発見や治療のモニタリングなどにも応用されていくと思われる。
しかしながら、ProGRPの血中での安定性は、ＧＲＰのそれと比較した場合には高いが、一般的な他の腫瘍マーカーに比べて、測定値のばらつきが認められる。そのため、ProGRPを検出対象とした方法では、測定用検体は、採血後すみやかに測定時まで凍結保存されなければならないという制約がある（非特許文献４）。
本発明は、ProGRPを測定対象としながらも、従来法における測定値のばらつきや検体の凍結保存という作業上の制約などの問題を持たない、新しいProGRPの測定法を提供するものである。
本発明は、ProGRPの分解物の中に血液検体において安定に保たれているものがあることを見出したことに基づき、かかる安定な分解物に存するエピトープを測定対象とすることで、上記の課題を解決するものである。具体的には、以下の各発明が提供される。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０−７５番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する２種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び／又はその分解物を測定する方法。
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０−７９番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する２種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び／又はその分解物を測定する方法。
（３）サンドイッチ免疫測定法である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０−６０番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合し、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列上の任意の８連続アミノ酸配列からなるペプチドには結合しない抗体。
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列の４０−６０番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合し、３１−５３番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合しない抗体。
（６）寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６６９で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ６−２が産生する、（４）または（５）に記載の抗体。
（７）寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６６９で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ６−２。
（８）２種以上の異なる抗体の少なくとも一方が（４）〜（６）のいずれかに記載の抗体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（９）２種以上の異なる抗体の少なくとも一方が（４）〜（６）のいずれかに記載の抗体であり、他方が配列番号１のアミノ酸配列７１−７５番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体である、（1）又は（２）に記載の方法。
（１０）（４）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含む、ガストリン放出ペプチド前駆体もしくはその分解物を測定するためのキット。
（１１）癌の診断を行うためのキットである、（１０）に記載のキット。
（１１）癌の診断を行うためのキットである、（１０）に記載のキット。
本発明の方法は、新たに確認された、検体中でも安定に保存されているProGRPのある種の分解物上のエピトープを測定対象とすることによって、従来の測定法と同等の検出感度が得られることに加え、採取後の検体の取扱い方に影響を受けにくくなり、再現性の高い測定値が得られる、などの効果を奏する。
本発明は、検体中に存在する、ProGRPあるいはProGRP-Cfragよりも血中での保存安定性が高いProGRPの分解物（ProGRP-Cdel)に残存するエピトープを、免疫学的測定法の対象とするものである。
このProGRP-Cdelは、従来法の測定対象であるProGRP-CfragのＣ末端側の幾つかのアミノ酸残基が失われた、より鎖長の短いペプチドであり、ProGRPの４０−７５番目のアミノ酸残基上に残存するエピトープを含むペプチドである。おそらくは、血液中に存在するプロテアーゼによってProGRP-Cfragの７５〜８３番目のアミノ酸残基のいずれかの残基のＣ末端側が切断されることで、ProGRP-Cdelが生じるものと推察される。
このProGRP-Cdelについてその構造を質量分析装置を用いて確認を行ったところ、７９番目のＬｙｓのＣ末端側で切断されていることが確認された。従って、ProGRP-Cdelは配列番号１の４０−７９番目のアミノ酸残基上に残存するエピトープを含むペプチドでもあり、従ってこれらのエピトープを認識する抗体もまた、本発明で利用することができる。
ProGRP-CdelとProGRP-Cfragの間の構造上の相違は、Ｃ末端側の２０前後のアミノ酸残基の有無に過ぎないが、ProGRPもしくはその分解物を免疫学的に測定するための対象蛋白質としての意義は大きく異なる。従来法の方法では、前記Ｃ末端側の２０数残基の部分を認識する抗体が使用されている。そのため、この抗体は、かかる部分を失ったProGRP-Cdelをもはや認識し、捕捉することができない。このＣ末端側の部分切断の進行は、検体自体あるいは検体採取後の保存状態やその期間によって影響を受け、このことが、従来法における検出シグナルが検体の保存状態やその期間によって影響を受けることの原因であると推察される。
一方、本発明では、ProGRP-Cdel上に存在するエピトープを認識する抗体を使用するものであり、検体中にProGRPやProGRP-Cfragが存在していても、またその部分切断が生じても、安定してProGRPもしくはその分解物を認識することができるので、検体の保存状態やその期間によって検出シグナルは影響を受けることが少なく、再現性の高い測定が可能となるのである。
本発明は、ProGRP-Cdel上のエピトープを測定対象とするために、ProGRPの４０−７５番目のアミノ酸配列からなるペプチド（ProGRP(40-75)）上に存在するエピトープを認識することができる抗体から選択された、ProGRP(40-75)上に存在する２種以上の異なるエピトープをそれぞれ別個に認識する異なる抗体を使用し、サンドイッチ免疫測定法によってProGRPもしくはその分解物を検出する方法である。また本発明は、ProGRPの４０−７９番目のアミノ酸配列からなるペプチド（ProGRP(40-79)）上に存在するエピトープを認識することができる抗体から選択された、ProGRP(40-79)上に存在する２種以上の異なるエピトープをそれぞれ別個に認識する異なる抗体を使用し、サンドイッチ免疫測定法によってProGRPもしくはその分解物を検出する方法である。
特に、本発明では、ProGRP-Cfragから切断除去されるＣ末端側の部分配列上のエピトープを認識する抗体を含まず、ProGRP-Cdel上のエピトープを認識する抗体のみを使用したサンドイッチ免疫測定法の利用が好ましい。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の基本操作は、「超高感度免疫測定法」（石川栄治、1993年、学会出版センター）あるいはその他種々の実験手法の解説書に記載されている方法に準じて行えばよく、本発明の実施に特有の操作は特に必要とはされないが、次のような工程で行うことができる。
すなわち、ProGRPもしくはその分解物は、（１）ProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)と結合する第一の抗体及び検体中のProGRPもしくはその分解物とを反応させる工程、（２）該抗体により捕捉されたProGRPもしくはその分解物を、（１）の抗体とは異なるがProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)と結合する第二の抗体と反応させる工程、及び（３）（２）により生ずる免疫複合体を検出する工程を含む測定法によって検出することができる。
ProGRPもしくはその分解物と結合する抗体は、ProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)と結合する抗体のみを選択して使用することが好ましいが、再現性の高い測定値を再現することができる範囲内で、かかる抗体以外の抗体が測定系に含まれていてもよい。
本発明で特に好ましい抗体の組み合わせは、ProGRPの４０−６０番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２と７１−７５番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０の組み合わせである。モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２は、ProGRPの４０−６０番目のアミノ酸配列を認識するが、同時に同アミノ酸配列中の任意の８連続アミノ酸配列からなるペプチドは認識しない。このことから、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２は、ProGRPの４０−６０番目のアミノ酸配列からなる構造エピトープを認識するものと考えられる。モノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０は、７１−７５アミノ酸残基から構成される配列エピトープを認識していると推察される。
上記の２種類のモノクローナル抗体を用いた本発明の方法の検出感度は４．５pg/mlである。これは従来のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いたProGRP(31-98)を測定する方法とほぼ同等の感度であり、健常人の血中ProGRPの測定に十分に使用することのできる感度である。
本発明で使用する抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの実験動物を免疫して得ることができる。免疫に用いる抗原は、ProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)の利用が好ましいが、ProGRP(31−98)のペプチドを用いることもでき、免疫後にProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)を使って所望の抗体を選択することで得ることができる。
マウスを例に取って、動物を免疫する方法を説明する。ProGRP(31-98)などのペプチドをフロインド完全アジュバント、TiterMax Gold（CytRx社）等のアジュバンドと１：１に混ぜ、交流ジョイントで結合した二本の注射筒で繰り返しジョイントを通過させる、あるいは超音波処理する等の方法によりエマルジョンを作製する。作製した抗原含有エマルジョンを、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内のいずれか、または複数部位に注入する。一回目の免疫終了の後、１〜４週間の間隔を開け、二回目の免疫を同様に実施する。以後同様に、血中のProGRP(31-98)に対する抗体の抗体価が上昇するまで、免疫を続ける。
抗体価の測定は以下の様に行うことができる。ProGRP (31-98) を１μg/mLの濃度にＰＢＳに溶解し、ウエルあたり５０μLの容量で９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩吸着する。０．０５％Tween２０入りＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で各ウエルを洗浄後アッセイに用いる。アッセイの前に、１％ＢＳＡ入りＰＢＳ等でブロッキングを行っても良い。眼窩静脈叢、尾静脈または尾動脈等から採血し、ＰＢＳ−Ｔで３０倍に希釈した後遠心を行う。得られた上清をＰＢＳ−Ｔで希釈系列を作成し、ProGRP(31-98)をコートしマイクロタイタープレートの各ウエルに５０μLずつ添加する。室温で３０分反応後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔなどで適切に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスIgG溶液を各ウエルに５０μLずつ添加する。更に室温で３０分反応後、過酸化水素、オルトフェニレンジアミン基質液を添加して３０分間反応させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ添加して反応を停止させ、各ウェルの吸光度を測定する。
免疫したマウスで、十分にProGRPに対する抗体価が上昇していることを確認した後、脾臓を取り出し、脾臓細胞を単離する。別に培養しておいたマウスミエローマ（例えばSP2/0-Ag14等）と、ポリエチレングリコール等を用いることにより融合する。融合に成功した細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）培地で選択培養する。７〜１４日程度、数日おきに培地を半量交換しながら培養を継続した後、培養上清の抗体価を測定する。ポジティブ・ウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングし、目的の抗体産生ハイブリドーマを得る。上記方法により得られたハイブリドーマクローンとして３Ｄ６−２（寄託番号FERM BP-8669）、ProGRP-2B10（寄託番号FERM BP-4110）を挙げることができる。
上記方法で得られた抗体のエピトープを解析することによって、ProGRP(40-75)上及び／又はProGRP(40-79)上に存在するエピトープを認識し結合する抗体を、取得することができる。エピトープ解析はProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)に対する抗体の反応を調べることによって可能である。組換え体で発現させたProGRP(31-98)やProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)あるいはFmoc法やBoc法で化学合成させたProGRP(40-75)及び／又はProGRP(40-79)をマイクロタイタープレートにコートし、上述した免疫測定法で各ペプチドに対する反応を調べることにより決定される。また、ProGRPの連続する８−１２アミノ酸程度の連続するペプチドに存在するエピトープは、マルチピンペプチド法により合成したペプチドを用いて決定することができる。
本発明では、使用される抗体を固相化したり、ラベリングしたりすることも可能である。各操作は種々の実験手法の解説書に記載されている方法に準じて行えばよく、本発明の実施に特有の操作は特に必要とはされない。
本発明は、上述の方法に加え、検体中のProGRPもしくはその分解物を測定するためのキット、特にProGRPもしくはその分解物を測定することによって肺小細胞癌の診断や化学療法のモニタリングを行うための診断薬キットも提供する。かかるキットは、上述したProGRP(40-75)上及び／又はProGRP(40-79)上に存在するエピトープを認識する抗体を少なくとも２種含み、その他任意に反応緩衝液や２次抗体の希釈液、ProGRPの標準物質、説明書その他の構成物を含んでいてもよい。キットに含まれる抗体の好ましい例としては、ProGRP(40-75)上及び／又はProGRP(40-79)上に存在するエピトープを認識し、同ペプチド上の８個連続アミノ酸残基からなるペプチドは認識しない抗体あるいはPrpGRPの７１−７５番目のアミノ酸配列を認識する抗体であり、代表例としてはモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２やモノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０である。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明する。
ハイブリドーマの作製
特許第３２１０９９４号の実施例１に記載した方法により組換え体を作成し、大腸菌で発現させた配列番号４に示されたペプチドを精製した。特許第３２１０９９４号の実施例１では、この組換え体はGRP(31-98)と記載されているが、正しくはＧＲＰ前駆体（ProGRP）の（３１−９８）部分であるので、ProGRP(31-98)とここでは記載する。次に、同特許第３２１０９９４号の実施例６に記載した方法により、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
特許第３２１０９９４号の実施例１に記載した方法により組換え体を作成し、大腸菌で発現させた配列番号４に示されたペプチドを精製した。特許第３２１０９９４号の実施例１では、この組換え体はGRP(31-98)と記載されているが、正しくはＧＲＰ前駆体（ProGRP）の（３１−９８）部分であるので、ProGRP(31-98)とここでは記載する。次に、同特許第３２１０９９４号の実施例６に記載した方法により、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
得られたハイブリドーマ３Ｄ６−２（FERM BP-8669）は、２００４年３月２３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに、ProGRP-2B10（FERM BP-4110）およびProGRP-3G2（FERM BP-4109）は１９９２年１２月９日付で工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター）に、それぞれ寄託している。
得られたハイブリドーマをプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水を回収し、プロテインＡを結合させたセファロースカラムを用いて、各モノクローナル抗体を腹水中から精製した。ハイブリドーマ３Ｄ６−２（FERM BP-8669）から得られたモノクローナル抗体をＧＲＰ−３Ｄ６−２と命名した。
得られたハイブリドーマをプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水を回収し、プロテインＡを結合させたセファロースカラムを用いて、各モノクローナル抗体を腹水中から精製した。ハイブリドーマ３Ｄ６−２（FERM BP-8669）から得られたモノクローナル抗体をＧＲＰ−３Ｄ６−２と命名した。
モノクローナル抗体のエピトープ解析
（１）ペプチドの合成とエピトープの決定
配列番号３にProGRP(31-98)の核酸配列とアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列に従い、ProGRP (31-98) の部分ペプチドをFmoc法にて合成した。Pep１は ProGRPの３１−５２番目のペプチド、Pep７０は４０−６０番目のペプチド、Pep３は５４−７８番目のペプチド、Epi２は８２−９６番目のペプチド、Pep５は８２−９６番目のペプチドである。合成したペプチドは逆相クロマトグラフィーあるいは逆相クロマトグラフィーとゲルろ過を組み合わせて精製した。精製純度は８０％以上であった。
（１）ペプチドの合成とエピトープの決定
配列番号３にProGRP(31-98)の核酸配列とアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列に従い、ProGRP (31-98) の部分ペプチドをFmoc法にて合成した。Pep１は ProGRPの３１−５２番目のペプチド、Pep７０は４０−６０番目のペプチド、Pep３は５４−７８番目のペプチド、Epi２は８２−９６番目のペプチド、Pep５は８２−９６番目のペプチドである。合成したペプチドは逆相クロマトグラフィーあるいは逆相クロマトグラフィーとゲルろ過を組み合わせて精製した。精製純度は８０％以上であった。
それぞれのペプチドを１μg/mLの濃度にＰＢＳで希釈し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μLずつ添加し、４℃で一晩吸着させた。ＰＢＳで各ウェルを２回洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションを行い、吸引除去した。１μg/mLの濃度に希釈したモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２を１００μLずつ各ウエルに添加し、室温で６０分間反応させた後、０．０５％Tween２０を含むＰＢＳ(PBS-T)で５回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスIgG抗体溶液を１００μLずつ各ウエルに添加し、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、pＨ５．０）を１００μLずつ各ウェルに添加し、室温で３０分間反応させた後、２Ｎ硫酸を１００μLずつ各ウェルに添加して反応を停止させた。ただちに、４９２nmにおける吸光度を測定し、その結果を表1に示す。
モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２は、陽性対照である組換え体ProGRP（31-98）とProGRPの４０−６０番目のアミノ酸配列であるPep７０に反応した。このことより、ＧＲＰ−３Ｄ６−２はProGRPの４０−６０番のアミノ酸配列を認識していることがわかった。また同様の方法で、ＧＲＰ−２Ｂ１０はPep３とEpi２のペプチドに反応し、ＧＲＰ−３Ｇ２はEpi２とPep５のペプチドに反応することがわかった。
（２）マルチピンペプチドの合成とエピトープの決定
ProGRP(31-98)のアミノ酸配列に基づき、１アミノ酸ずつオーバーラップさせた連続した８個のアミノ酸ずつの６１個のペプチドを、マルチピンペプチド法で合成した。各ペプチドは末端にビオチンを結合させたものであり、合成は和光純薬株式会社（大阪）に依頼した。
ProGRP(31-98)のアミノ酸配列に基づき、１アミノ酸ずつオーバーラップさせた連続した８個のアミノ酸ずつの６１個のペプチドを、マルチピンペプチド法で合成した。各ペプチドは末端にビオチンを結合させたものであり、合成は和光純薬株式会社（大阪）に依頼した。
マルチピンペプチド法で合成した各ビオチン化ペプチドをジメチルホルムアミドに溶解し、１μg/mL の濃度にＰＢＳで希釈した。その希釈された各ビオチン化ペプチド溶液を、アビジン固相された９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μL ずつ添加し、４℃で一晩結合させた。０．０５％Tween２０を含むＰＢＳ（PBS-T）で各ウェルを洗浄後、各モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２、ＧＲＰ−３Ｇ２、ＧＲＰ−２Ｂ１０を１μg/mLに希釈した溶液を、各ウェルに１００μL ずつ添加した。室温で３０分間反応後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスIgG抗体溶液を各ウエルに１００μL ずつ添加した。更に室温で３０分間反応後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を各ウェルに１００μL ずつ添加し、室温で３０分間反応後、２Ｎ硫酸を１００μL ずつ添加し、ただちに４９２nmにおける吸光度を測定した。各モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２、ＧＲＰ−３Ｇ２、ＧＲＰ−２Ｂ１０のProGRP(31-98)内部の各ペプチドに対する反応を図１（Ａ）、(Ｂ）、（Ｃ）に示す。
図１の（Ａ）に示すように、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２はProGRP(31-98) の内部の８個ずつの連続するペプチドには結合しなかった。これは、ＧＲＰ−３Ｄ６−２はProGRPの８個の連続するペプチドを認識することができず、８個より長いペプチドで作られる構造エピトープを認識するためと考えられる。一方、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２は８１−８８、８２−８９、８３−９０、８４−９１の４つの８個の連続するペプチドに結合した。モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２の抗体はこの４つのペプチドに存在している配列である、８４−８８のペプチドを認識しているものと考えられる （図１（Ｂ））。またモノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０の抗体は６８−７５、６９−７６、７０−７７、７１−７８の４つの８個の連続するペプチドに結合した。このため、モノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０は、この４つのペプチドに存在している配列である、７１−７５のペプチドを認識していると考えられる（図１(Ｃ)）。
これらのペプチドを用いたエピトープの決定の結果より、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２やモノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０に認識されるエピトープは、５残基のアミノ酸から形成される連続エピトープである。
また、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２はProGRP(31-98)の少なくとも４０−６０部分のペプチドを認識し、かつProGRP(31-98)の内部の８個の連続するペプチドに反応しない抗体である。言い換えると、ＧＲＰ−３Ｄ６−２に認識されるエピトープは、ProGRP(31-98)の少なくとも４０−６０のアミノ酸配列で形成されるが、８個ずつの連続するペプチドでは形成できない構造エピトープであると考えられる。
以上のモノクローナル抗体が認識するエピトープの関係をまとめると表２のようになる。
モノクローナル抗体の組み合わせによる検体保存安定性の検討
９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに、１種又は２種のモノクローナル抗体（２種類の場合は等量混合）を４μg/mLの濃度で１００μL 加え、４℃で一晩インキュベートし固相化した。０．１５Ｍ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．３)で２回洗浄後、ブロッキング液(０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１)を３５０μL 加え２時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液１００μL と測定検体５０μL を各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％ Tween２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識をした１種又は２種のモノクローナル抗体（２種類の場合は等量混合）溶液１００μL を添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μL を加え、３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を１００μL を加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、４９２nm (リファレンス波長６３０nm) の吸光度を測定した。
９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに、１種又は２種のモノクローナル抗体（２種類の場合は等量混合）を４μg/mLの濃度で１００μL 加え、４℃で一晩インキュベートし固相化した。０．１５Ｍ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．３)で２回洗浄後、ブロッキング液(０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１)を３５０μL 加え２時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液１００μL と測定検体５０μL を各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％ Tween２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識をした１種又は２種のモノクローナル抗体（２種類の場合は等量混合）溶液１００μL を添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μL を加え、３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を１００μL を加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、４９２nm (リファレンス波長６３０nm) の吸光度を測定した。
この測定法を用いて、３検体を、各々−２０℃で凍結保存しておいたものと、室温で１７時間保存したものに分けて測定した。凍結保存しておいたもののProGRP値を１００％として、室温で１７時間保存した場合の測定値をパーセントで表した（表３）。固相化抗体と標識抗体の組み合わせが、それぞれＧＲＰ−３Ｇ２とＧＲＰ−２Ｂ１０、ＧＲＰ−３Ｇ２とＧＲＰ−３Ｄ６−２、ＧＲＰ−３Ｇ２とＧＲＰ−２Ｂ１０／ＧＲＰ−３Ｄ６−２の場合、１７時間保存検体中のProGRP免疫活性は、平均６９．６％、７０．６％、６９．２％にそれぞれ低下していた。また、従来法である固相化抗体と標識抗体の組み合わせである、ＧＲＰ−３Ｇ２／ＧＲＰ−２Ｂ１０とポリクローナル抗体の場合も７１．８％に減少していた。一方、固相化抗体にＧＲＰ−３Ｄ６−２、標識抗体にＧＲＰ−２Ｂ１０を用いた場合は、１７時間室温で保存しても測定値は平均で８９．３％であり、他の抗体の組合せよりも、約２０％のProGRPの免疫活性が維持されていた（表３）。なお、ポリクローナル抗体は、特許第３２１０９９４号の実施例８に記載の方法で取得したものを用いた。
ProGRP(40-75)に結合する抗体を用いた測定法
96ウエルマイクロプレートの各ウエルに、ＧＲＰ−３Ｄ６−２を４μg/mLの濃度で２００μL 加え、４℃で一晩インキュベートし固相化した。０．１５Ｍ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．３)で２回洗浄後、ブロッキング液(０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１)を３５０μL 加え２時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液１００μLと測定検体１００μL を各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％ Tween２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識したＧＲＰ−２Ｂ１０溶液２００μL を添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を２００μLを加え、３０分間インキュベートし、５Ｎ硫酸を５０μLを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、４９２nm (リファレンス波長６３０nm) の吸光度を測定した。その標準曲線を図２に示した。
96ウエルマイクロプレートの各ウエルに、ＧＲＰ−３Ｄ６−２を４μg/mLの濃度で２００μL 加え、４℃で一晩インキュベートし固相化した。０．１５Ｍ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．３)で２回洗浄後、ブロッキング液(０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１)を３５０μL 加え２時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液１００μLと測定検体１００μL を各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％ Tween２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識したＧＲＰ−２Ｂ１０溶液２００μL を添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を２００μLを加え、３０分間インキュベートし、５Ｎ硫酸を５０μLを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、４９２nm (リファレンス波長６３０nm) の吸光度を測定した。その標準曲線を図２に示した。
この標準曲線から、約４．５pg/mLのProGRPを検出できると考えられた。この感度は、健常人検体中のProGRP量を検出するうえで十分な感度である。
＜試験例１＞
従来法と本発明の実施例４の測定法を用いて、５検体を４℃で１、３、７日間保存した後、検体中ProGRP免疫活性を測定し、保存前の測定値と比較した。従来法は次のようにして実施した。９６ウエルマイクロプレートの各ウェルに、ＧＲＰ−３Ｇ２およびＧＲＰ−２Ｂ１０（等量混合）を１０μg/mLの濃度で１００μL 加え、４℃で一晩インキュベートし固相化した。０．１５Ｍ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．３)で２回洗浄後、ブロッキング液(０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ ７．１)を３５０μL 加え２時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液１００μL と 測定検体５０μL を各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％ Tween２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識をしたポリクローナル抗体溶液１００μL を添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μL を加え、３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を１００μLを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、４９２nm (リファレンス波長６３０nm) の吸光度を測定した。
従来法と本発明の実施例４の測定法を用いて、５検体を４℃で１、３、７日間保存した後、検体中ProGRP免疫活性を測定し、保存前の測定値と比較した。従来法は次のようにして実施した。９６ウエルマイクロプレートの各ウェルに、ＧＲＰ−３Ｇ２およびＧＲＰ−２Ｂ１０（等量混合）を１０μg/mLの濃度で１００μL 加え、４℃で一晩インキュベートし固相化した。０．１５Ｍ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．３)で２回洗浄後、ブロッキング液(０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ ７．１)を３５０μL 加え２時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液１００μL と 測定検体５０μL を各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％ Tween２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識をしたポリクローナル抗体溶液１００μL を添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２mg/mLのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μL/mLを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μL を加え、３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を１００μLを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、４９２nm (リファレンス波長６３０nm) の吸光度を測定した。
４℃で保存する前のProGRPの値を１００％として、各々の保存期間後の測定値をパーセントで表した。結果を表４に示す。
従来法の場合、検体中のProGRP測定値は、４℃で１日間保存では平均９４．５％、３日間保存では平均８５．８％、７日間保存では平均６７．８％であり、１日間平均で約４．９３％ずつ低下する傾向であった。一方、本発明の測定法では、検体中の ProGRP測定値は、４℃で１日間保存では平均９６．９％、３日間保存では平均９４．３％、７日間保存では平均８６．９％であり、１日間平均で約２．２９％ずつ低下する傾向であった。すなわち、本発明の測定法では、従来法よりも２．１５倍高い保存安定性を示し、特に７日間保存では、従来法よりも、約１９％のProGRPの免疫活性が維持されていた。
＜試験例２＞
本発明で利用可能な モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２、ＧＲＰ−２Ｂ１０、ＧＲＰ−３Ｄ６−２がそれぞれ認識するエピトープの解析を行った。
ProGRPの３１−５３番目のペプチドをＦｍｏｃ法にて合成した。合成したペプチドは逆相クロマトグラフィーあるいは逆相クロマトグラフィーとゲルろ過を組み合わせて精製した。実施例２で用いたペプチドを含めそれぞれのペプチドを０．１％ＴＦＡに溶解し、１０μg／ｍＬの濃度にＰＢＳで希釈した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに１ウェルあたり１００μＬずつの容量で９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩吸着させた。ＰＢＳで各ウエルを２回洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに添加し、室温で２時間インキュベーションを行い、吸引除去した。５μｇ／ｍＬの濃度に希釈したモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２、ＧＲＰ−２Ｂ１０、ＧＲＰ−３Ｄ６−２を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で８５分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ (ＰＢＳ−Ｔ) で５回洗浄した。ＰＢＳ−Ｔで適切に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液を１００μＬずつ各ウエルに添加し、更に室温で３０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、基質溶液 （２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で２０分間反応させた後、２Ｎ硫酸を１００μＬずつ各ウエルに添加して反応を停止させ、ただちに４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表５に示す。
本発明で利用可能な モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２、ＧＲＰ−２Ｂ１０、ＧＲＰ−３Ｄ６−２がそれぞれ認識するエピトープの解析を行った。
ProGRPの３１−５３番目のペプチドをＦｍｏｃ法にて合成した。合成したペプチドは逆相クロマトグラフィーあるいは逆相クロマトグラフィーとゲルろ過を組み合わせて精製した。実施例２で用いたペプチドを含めそれぞれのペプチドを０．１％ＴＦＡに溶解し、１０μg／ｍＬの濃度にＰＢＳで希釈した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに１ウェルあたり１００μＬずつの容量で９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩吸着させた。ＰＢＳで各ウエルを２回洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに添加し、室温で２時間インキュベーションを行い、吸引除去した。５μｇ／ｍＬの濃度に希釈したモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２、ＧＲＰ−２Ｂ１０、ＧＲＰ−３Ｄ６−２を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で８５分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ (ＰＢＳ−Ｔ) で５回洗浄した。ＰＢＳ−Ｔで適切に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液を１００μＬずつ各ウエルに添加し、更に室温で３０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、基質溶液 （２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で２０分間反応させた後、２Ｎ硫酸を１００μＬずつ各ウエルに添加して反応を停止させ、ただちに４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表５に示す。
表５より、ＧＲＰ−３Ｇ２、ＧＲＰ−２Ｂ１０、ＧＲＰ−３Ｄ６−２の反応するエピトープは実施例２で示したものとほぼ同じ結果を示し、ＧＲＰ−３Ｄ６−２は３１−５３に全く反応しないことから、４２−５３のペプチドにも反応しないことが確認された。
＜試験例３＞
ProGRP-Cdelの同定を質量分析装置（LC-MS/MS）を用いて行った。ProGRP (31-98)領域の各種ペプチドに反応性を示したウサギポリクローナル抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．３５) に１２．７ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、３ｍｌのNHS-Sepharose (Amersham社) にユーザーマニュアルに従い結合させた。
２例の１．５ｍｌのヒト血清検体に、２０μｇの組換えProGRP (31-98)を添加して室温で２４時間保存した。その後、前述したウサギポリクローナル抗体結合Sepharoseを０．４ｍｌ添加し、室温で６０分間攪拌した。このウサギポリクローナル抗体結合Sepharoseを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）で洗浄し、９．５Ｍ尿素液０．５ｍｌを添加し、ウサギポリクローナル抗体結合Sepharoseに結合したものを溶出した。 溶出液を回収してその一部をとり、LC-MS/MSを用いてヒト血清検体中で保存後の ProGRP (31-98) 領域の保存されたペプチドを検討した。
溶出液１００μｌに２５０ｍＭのMethyl-PEO4-NHSエステル（Pierce）溶液／ＤＭＳＯを１μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。１Ｍ Tris-HCl、ｐＨ８を５μｌ添加し、室温で３０分インキュベートして反応を止めた後、８００μｌのアセトンを添加してタンパク質を沈澱させた。遠心後、ペレットを乾燥させ、そこにPromega社のmodified trypsin溶液（２０ｎｇ／μｌ／５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム）を１５μｌ添加し、３０℃で一晩消化した。消化後のサンプルに０．１％ギ酸１５μｌを添加し、１５０００rpm で５分間遠心した上清５μｌについて、LC-MS/MS 分析｛（LC部）Agilent 1100 series capillary LC system、（カラム）Agilent Zorbax SB-C18, 5μm, 150 x 0.5 mm、（MS/MS）BrukerDaltonics HCT-plus｝を行った。分離は０．１％ギ酸存在下で行い、流量は１５μｌ／分、アセトニトリル勾配は0-35% linear／0-120 min、35-95% linear／120-125 minとした。カラム溶出液はＥＳＩ部に導入し、ＭＳ／ＭＳデータを取得し、DataAnalysisソフトウェアでピークリストを作成し、Matrix Science社のMASCOT serverで解析を行った。
ProGRP-Cdelの同定を質量分析装置（LC-MS/MS）を用いて行った。ProGRP (31-98)領域の各種ペプチドに反応性を示したウサギポリクローナル抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．３５) に１２．７ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、３ｍｌのNHS-Sepharose (Amersham社) にユーザーマニュアルに従い結合させた。
２例の１．５ｍｌのヒト血清検体に、２０μｇの組換えProGRP (31-98)を添加して室温で２４時間保存した。その後、前述したウサギポリクローナル抗体結合Sepharoseを０．４ｍｌ添加し、室温で６０分間攪拌した。このウサギポリクローナル抗体結合Sepharoseを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）で洗浄し、９．５Ｍ尿素液０．５ｍｌを添加し、ウサギポリクローナル抗体結合Sepharoseに結合したものを溶出した。 溶出液を回収してその一部をとり、LC-MS/MSを用いてヒト血清検体中で保存後の ProGRP (31-98) 領域の保存されたペプチドを検討した。
溶出液１００μｌに２５０ｍＭのMethyl-PEO4-NHSエステル（Pierce）溶液／ＤＭＳＯを１μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。１Ｍ Tris-HCl、ｐＨ８を５μｌ添加し、室温で３０分インキュベートして反応を止めた後、８００μｌのアセトンを添加してタンパク質を沈澱させた。遠心後、ペレットを乾燥させ、そこにPromega社のmodified trypsin溶液（２０ｎｇ／μｌ／５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム）を１５μｌ添加し、３０℃で一晩消化した。消化後のサンプルに０．１％ギ酸１５μｌを添加し、１５０００rpm で５分間遠心した上清５μｌについて、LC-MS/MS 分析｛（LC部）Agilent 1100 series capillary LC system、（カラム）Agilent Zorbax SB-C18, 5μm, 150 x 0.5 mm、（MS/MS）BrukerDaltonics HCT-plus｝を行った。分離は０．１％ギ酸存在下で行い、流量は１５μｌ／分、アセトニトリル勾配は0-35% linear／0-120 min、35-95% linear／120-125 minとした。カラム溶出液はＥＳＩ部に導入し、ＭＳ／ＭＳデータを取得し、DataAnalysisソフトウェアでピークリストを作成し、Matrix Science社のMASCOT serverで解析を行った。
Methyl-PEO4-NHSは、蛋白質分子内のＮ末アミノ基及びリジンの側鎖アミノ基を修飾する性質を有する。従って、見出されたペプチド断片の内でＮ末が標識されたものがあれば、それは消化前にＮ末フリーの状態であったものである。また、側鎖アミノ基が修飾されたリジンの部位ではトリプシンによる消化が起こらないので、Ｃ末リジンの側鎖が修飾されていれば、それは消化前に既にこの部分で切断されていたものである。両血清検体でＣ末リジンが標識された断片としては、NHQPPQPK（72-79）が見出された。従って、少なくとも Lys-79 のＣ末側で切断された断片が血清処理により生じたものと考えられる。更に、Ｎ末側が標識されていないが、両血清検体でSVSER（37-41）という断片が観察され、Ser-36 のＣ末側で切断される可能性が示唆された。
本発明の方法は、新たに確認された、検体中でも安定に保存されているProGRPのある種の分解物上のエピトープを測定対象とすることによって、従来の測定法と同等の検出感度が得られることに加え、採取後の検体の取扱い方に影響を受けにくくなり、再現性の高い測定値が得られるなど、血中ProGRPの検出に有効である。
Claims (11)
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０−７５番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する２種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び／又はその分解物を測定する方法。
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０−７９番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する２種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び／又はその分解物を測定する方法。
- サンドイッチ免疫測定法である、請求項１又は２に記載の方法。
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０−６０番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合し、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列上の任意の８連続アミノ酸配列からなるペプチドには結合しない抗体。
- 配列番号１で表されるアミノ酸配列の４０−６０番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合し、３１−５３番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合しない抗体。
- 寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６６９で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ６−２が産生する、請求項４又は５に記載の抗体。
- 寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６６９で寄託されたハイブリドーマ３Ｄ６−２。
- ２種以上の異なる抗体の少なくとも一方が請求項４〜６のいずれかに記載の抗体である、請求項１または２に記載の方法。
- ２種以上の異なる抗体の少なくとも一方が請求項４〜６のいずれかに記載の抗体であり、他方が配列番号１のアミノ酸配列７１−７５番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
- 請求項４〜６のいずれかに記載の抗体を含む、ガストリン放出ペプチド前駆体もしくはその分解物を測定するためのキット。
- 癌の診断を行うためのキットである、請求項１０に記載のキット。
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