CN117063070A - 恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法和判定辅助用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于辅助胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定的、简便且非侵袭的检测方法,以及用于该方法的检测用试剂盒。即,包括体外测定患有胰腺囊性肿瘤的受检体的体液试样中存在的APOA2‑AT蛋白质或/和APOA2‑ATQ蛋白质的量,基于其量辅助胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定的工序的恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法;能够在该方法中使用的、用于测定APOA2‑AT蛋白质或/和APOA2‑ATQ蛋白质的量的恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助用试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及包括测定患有胰腺囊性肿瘤的受检体的体液试样中的APOA2蛋白质的变异体的量的恶性胰腺囊性肿瘤的检测方法和包含抗APOA2抗体的恶性胰腺囊性肿瘤的检测用试剂盒。
背景技术
胰腺囊性肿瘤是具有液体在肿瘤组织内部潴留而成的袋状的结构物(囊泡)的病变,近年随着影像学检查技术的进步,在日常诊疗中偶然发现的频率增加。胰腺囊性肿瘤缓慢进展,大多数情况下无症状,但可能随着时间经过恶性化而发展为胰癌,因此需要通过经过观察而定期地检查胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性。
胰腺囊性肿瘤的挑选使用CT(computerized tomography)、MRI(magneticresonance imaging)、MRCP(Magnetic Resonance Cholangiopancreatography)、EUS(Endoscopic Ultrasound)等各种影像学检查技术,但胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定即使使用最新的检查技术也是困难的(非专利文献1、2)。EUS被认为对恶性病变的检测有效,但具有结果依赖于检查技师的技能、侵袭性比较大这样的问题。另外,也尝试了通过EUS-FNA(Endoscopic Ultrasound-Fine Needle Aspiration)来检测囊泡液中的肿瘤标志物CEA的检查方法,但CEA高值被认为对于非粘液性与粘液性的判定有效,但被认为不能在恶性病变与良性病变的判定中利用。同样地,使用EUS-FNA检测囊泡液中的癌细胞的细胞诊断可以说是作为恶性病变能够获得确定诊断的检查法,但由于有由囊泡液的漏出引起的腹膜转移的危险性这样的原因等,在日本不被推荐。此外,还有使用在经内镜逆行胰胆管造影(ERCP/endoscopic retrograde cholangiopancreatography)时采集的胰液的细胞诊断,但虽然对恶性病变的挑选有效,但诊断时伴有胰腺炎发病等的危险性(非专利文献1、2)。现在,要求开发能够在医疗现场通过非侵袭的方法高准确度地判断胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的新的检查技术。
APOA2(Apolipoprotein A2(载脂蛋白A2)或Apolipoprotein A-II(载脂蛋白A-II))蛋白质(GenBank登录号NP_001634.1)是构成血清脂蛋白的载脂蛋白家族的一种。载脂蛋白迄今为止已知10种以上,它们的主要功能是脂蛋白的结构的稳定化、与脂蛋白代谢相关的酶的活化、作为针对细胞表面存在的脂蛋白受体的配体的作用等。APOA2蛋白质在肝脏组织中作为包含信号肽的100个氨基酸的前体被合成,存在于血液中的成熟型由77个氨基酸组成。成熟型APOA2蛋白质是在其氨基末端(N末端)具有谷氨酰胺残基(Q)、N末端起第76位具有苏氨酸残基(T)、其第77位的羧基末端(C末端)具有谷氨酰胺残基(Q)的、构成高密度脂蛋白(HDL)的载脂蛋白的之一。此外,报告了APOA2蛋白质中存在作为全长APOA2蛋白质的APOA2-ATQ蛋白质、作为缺失了C末端的谷氨酰胺残基(Q)的APOA2蛋白质的APOA2-AT蛋白质、作为缺失了C末端的谷氨酰胺/苏氨酸残基(QT)的APOA2蛋白质的APOA2-A蛋白质等质量不同的变异体(非专利文献3)。
根据基于登载在蛋白质结构数据库(PDB、Protein Data Bank;http://www.rcsb.org/pdb/home.do)的APOA2蛋白质的立体结构数据(PDB ID:1L6L)的分析,认为APOA2蛋白质通过介由N末端侧的半胱氨酸残基的二硫键(SS键)而形成二聚体。因此,已知APOA2蛋白质在血液中作为由上述3种变异体的组合产生的各种分子量的二聚体而存在。二聚体已知由全长的APOA2-ATQ蛋白质组成的二聚体(APOA2-ATQ/ATQ蛋白质二聚体)、APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的二聚体(APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体)、由APOA2-AT蛋白质组成的二聚体(APOA2-AT/AT蛋白质二聚体)、APOA2-AT蛋白质和APOA2-A蛋白质的二聚体(APOA2-AT/A蛋白质二聚体)、由APOA2-A蛋白质组成的二聚体(APOA2-A/A蛋白质二聚体)等。
已知上述各种APOA2蛋白质二聚体与健常者比较,在胰癌患者的血中显示量的变化。特别是对于APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体进行质量分析的结果,作为具有分子量17253±9(m/z)的质量值的蛋白质被发现,已经明确与健常者相比在胰癌患者中有意义地减少,以及通过利用该蛋白质二聚体作为胰癌标志物,能够以AUC(area under the curve:曲线下面积)值为0.85以上的高准确度检测胰癌(专利文献1、非专利文献3)。另外已知,通过用ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法测定构成上述各种APOA2蛋白质二聚体的2种变异体的量,将其测定结果组合,从而能够以与质量分析同等以上的准确度检测包括胰癌、胰腺囊性肿瘤在内的各种胰肿瘤(专利文献2、非专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2006/098087号
专利文献2:国际公开第2015/050107号
非专利文献
非专利文献1:国际胰脏学会工作组(代表、田中雅夫)、IPMN国际诊疗指南2017年度版
非专利文献2:国际胰脏学会工作组(代表、田中雅夫)、IPMN/MCN国际诊疗指南2012年度版
非专利文献3:Honda K.等、2012年、PLoS One、第7卷、e46908非专利文献4:HondaK.等、2015年、Sci Rep.第5卷、15921
发明内容
发明要解决的课题
到目前为止,在恶性胰腺囊性肿瘤的判定中使用的检查法存在高侵袭性、检查技术掌握难等问题。
本发明的课题是提供以胰腺囊性肿瘤患者的血液作为对象的简便且非侵袭的恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法、和恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助用试剂盒。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题,本发明者们首先研究了一直以来被认为对胰癌、胰腺囊性肿瘤的判定辅助有效的2种APOA2蛋白质变异体(APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质)对良性的胰腺囊性肿瘤与恶性的胰腺囊性肿瘤的判别是否有效。其结果发现,在恶性胰腺囊性肿瘤中,与良性胰腺囊性肿瘤相比,APOA2-AT蛋白质的血中浓度低,和APOA2-ATQ蛋白质的血中浓度高。由此发现,通过体液试样中的上述2种APOA2蛋白质变异体能够判定胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性,从而完成了本发明。
本发明包含以下的发明。
(1)辅助患有胰腺囊性肿瘤的受检体中的恶性胰腺囊性肿瘤的判定的方法,该方法包括体外测定存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的量,基于其量来辅助受检体的胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定的工序,
所述APOA2-AT蛋白质是在羧基末端包含序列号30所示的氨基酸序列的多肽,
所述APOA2-ATQ蛋白质是在羧基末端包含序列号31所示的氨基酸序列的多肽。
(2)根据(1)所述的方法,所述胰腺囊性肿瘤是胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)或粘液性囊性肿瘤(MCN)。
(3)根据(1)或(2)所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量,少于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定。
(4)根据(3)所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量,少于基于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量或存在于由已知的恶性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的试样中的APOA2-AT蛋白质的量设定的截止值时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定。
(5)根据(1)~(4)的任一项所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量,多于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定。
(6)根据(5)所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量,多于基于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量或存在于由已知的恶性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量设定的截止值时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定。
(7)根据(1)~(6)的任一项所述的方法,所述体液试样是血液、血浆、或血清。
(8)根据(1)~(7)的任一项所述的方法,所述受检体患有胰腺囊性肿瘤是通过影像学检查和/或下述工序(A)~(C)预先确定的:
(A)使用与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域特异性地结合的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与该羧基末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,测定试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量的第1工序;
(B)使用与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与该羧基末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体,测定试样中的APOA2-AT蛋白质的量的第2工序;
(C)对于将第1工序所得的APOA2-ATQ蛋白质的量的测定值和第2工序所得的APOA2-AT蛋白质的量的测定值输入预先设定好的判别式而得的判别值,与已知的健常体的判别值进行比较的、用于确定是否患有胰腺囊性肿瘤的第3工序。
(9)用于体外测定由受检体得到的体液试样中所包含的APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的量的、恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助用试剂盒,
所述APOA2-AT蛋白质是在羧基末端包含序列号30所示的氨基酸序列的多肽,
所述APOA2-ATQ蛋白质是在羧基末端包含序列号31所示的氨基酸序列的多肽。
(10)根据(9)所述的试剂盒,包含抗APOA2-AT末端抗体或其结合性片段、或/和抗APOA2-ATQ末端抗体或其结合性片段。
(11)根据(10)所述的试剂盒,所述抗APOA2-ATQ末端抗体或其结合性片段是与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号4、5和6所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号10、11和12所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号7、8和9所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号13、14和15所示的氨基酸序列组成的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体或其结合性片段。
(12)根据(10)所述的试剂盒,所述抗APOA2-AT末端抗体或其结合性片段是与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号33、34和35所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号39、40和41所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号45、46和47所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号36、37和38所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号42、43和44所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号48、49和50所示的氨基酸序列组成的抗APOA2-AT末端单克隆抗体或其结合性片段。
(13)根据(10)~(12)的任一项所述的试剂盒,进一步包含抗APOA2非末端单克隆抗体,该抗APOA2非末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质或由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域以外的氨基酸序列特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号16、17和18所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号22、23和24所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号19、20和21所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号25、26和27所示的氨基酸序列组成。
(14)抗APOA2-AT末端单克隆抗体或其结合性片段,与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号33、34和35所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号39、40和41所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号45、46和47所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号36、37和38所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号42、43和44所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号48、49和50所示的氨基酸序列组成。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2021-049931号的公开内容。
发明的效果
通过本发明,仅通过测定由患有胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中所包含的APOA2蛋白质的变异体的浓度,就能够通过简便且非侵袭的方法来辅助该受检体具有良性的胰腺囊性肿瘤还是具有恶性的胰腺囊性肿瘤的判定。
附图说明
图1:该图是测定了作为抗APOA2-AT末端单克隆抗体的克隆4C6-1、5D9-3和6B4-2对APOA2蛋白质的各种变异体的结合活性而得的。
图2:该图是通过使用了3种抗APOA2-AT末端单克隆抗体(4C6-1、5D9-3或6B4-2)或抗APOA2-AT末端多克隆抗体、以及抗APOA2非末端单克隆抗体的夹心ELISA法测定APOA2-AT蛋白质而得的。
图3:该图是测定良性的胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)15病例和恶性的IPMN 7病例的血浆中包含的胰肿瘤标志物CA19-9的浓度,作图而得的。
图4:该图是通过使用了特异性地识别APOA2-AT蛋白质的羧基(C)末端区域的氨基酸序列的多克隆抗体(抗APOA2-AT末端多克隆抗体)和特异性地识别C末端区域以外的氨基酸序列的抗体(抗APOA2蛋白质非末端抗体)的夹心ELISA法,测定良性的IPMN 15病例和恶性的IPMN 7病例的血浆中包含的APOA2-AT蛋白质的浓度,作图而得的。
图5:该图是通过使用了特异性地识别APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的氨基酸序列的单克隆抗体(抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体)和特异性地识别C末端区域以外的氨基酸序列的抗体(抗APOA2蛋白质非末端抗体)的夹心ELISA法,测定IPMN 15病例和恶性的IPMN7病例的血浆中包含的APOA2-ATQ蛋白质的浓度,作图而得的。
图6:该图是显示使用了胰肿瘤标志物CA19-9的良性的IPMN 15病例与恶性的IPMN7病例的判别性能的ROC曲线。
图7:(A)该图是显示使用了APOA2-AT蛋白质的良性的IPMN 15病例与恶性的IPMN7病例的判别性能的ROC曲线。(B)该图是显示使用了APOA2-ATQ蛋白质的良性的IPMN 15病例与恶性的IPMN 7病例的判别性能的ROC曲线。
具体实施方式
成为本发明的测定对象的是患有胰腺囊性肿瘤的受检体。在本说明书中,所谓“胰腺囊性肿瘤”是指在胰脏中形成、且潴留液体、粘液等的显示囊泡的形态的全部的肿瘤。具体地,其中包括胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)、胰粘液性囊性肿瘤(MCN)、胰浆液性囊泡肿瘤(SCN)。
在本说明书中,所谓“恶性的胰腺囊性肿瘤”,表示来自胰腺囊性肿瘤的预后不良的肿瘤,可以通过高度分化不良(HGD/high-grade dysplasia)、浸润癌的存在、附壁结节的存在来判断。另外,本说明书中“恶性的胰腺囊性肿瘤”在胰腺囊性肿瘤患者的胰脏形成,也包括在与胰腺囊性肿瘤不同的部位形成的通常型的浸润性胰管癌(并发癌)。
这样的恶性的胰腺囊性肿瘤的预测中报告了血中的肿瘤标志物(CA19-9)的有效性,但确定诊断需要利用ERCP下胰液细胞诊断、超声内镜下的针活检(EUS-FNA)等的精密检查(非专利文献1)。在判断为“恶性的胰腺囊性肿瘤”的情况下,研究与病变的部位、扩散对应的利用切除术的治疗。
本说明书中所谓“良性的胰腺囊性肿瘤”,是指低度分化不良且局限于肿瘤发生的部位、无向周围组织的浸润的肿瘤,或者即使有浸润其范围也限于局部的肿瘤。
1.使用抗APOA2蛋白质末端抗体的恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法
本发明的方法的目的是检测受检体中的恶性胰腺囊性肿瘤。本发明的方法是辅助患有胰腺囊性肿瘤的受检体中的恶性胰腺囊性肿瘤的判定的方法,该方法包括体外测定存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的量,基于其量来辅助受检体的胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定的工序,所述APOA2-AT蛋白质是在羧基末端包含序列号30所示的氨基酸序列的多肽,所述APOA2-ATQ蛋白质是在羧基末端包含序列号31所示的氨基酸序列的多肽。用于测定APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的手段不特别限定,但本发明的方法的第一方案是在APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的测定中使用抗APOA2蛋白质末端抗体的方法。以下,对于能够在本发明的第一方案中使用的抗APOA2蛋白质末端抗体进行说明。
1-1.抗APOA2蛋白质末端抗体
本说明书中,“APOA2蛋白质”,是指各物种的APOA2蛋白质,但优选来自人的APOA2蛋白质(GenBank登录号No.NP_001634.1),具体地,包含序列号1、2或3所示的来自人的野生型APOA2蛋白质变异体,进一步包含它们的天然突变体、和它们的片段。另外,本说明书中,APOA2蛋白质是指其羧基末端的6个氨基酸具有序列号30~32的任一项所示的氨基序列的蛋白质。
本说明书中所述“变异体”,是指能够存在于人或动物的血浆、血清、或其他体液试样中的APOA2蛋白质的不同的分子形态。例如,是在APOA2蛋白质中C末端区域的结构不同的APOA2蛋白质或它们的天然突变体。具体地,例如,序列号1所示的C末端区域的氨基酸序列以AT结束的APOA2-AT蛋白质、序列号2所示的C末端区域的氨基酸序列以ATQ结束的APOA2-ATQ蛋白质、或序列号3所示的C末端区域的氨基酸序列以A结束的APOA2-A蛋白质相当于APOA2蛋白质的变异体。
本说明书中所谓“羧基末端区域(在本说明书中,有时表述为“C末端区域”)”,是指在氨基酸序列中包含羧基末端(C末端)的氨基酸和其周围的连续数氨基酸的由6~25个氨基酸、优选为8~20个氨基酸或10~17个氨基酸组成的区域。本发明中,C末端区域具体是指包含序列号30~32任意氨基酸序列的区域。
本说明书中,“天然突变体”是指自然界中存在的突变体,例如,是指在上述序列号1、2或3所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或数个的氨基酸的突变体,与上述氨基酸序列具有90%以上、92%以上或94%以上、优选为95%以上、更优选为97%以上、更优选为98%以上或99%以上的同一性的突变体。所谓“同一性”是指两段氨基酸序列以获得最大的一致度的方式导入或不导入间隙而进行排列(比对)时,相对于一段氨基酸序列的全部氨基酸残基数(也包含间隙数),另一段氨基酸序列的相同氨基酸残基数的比例(%)。“数个”是指2~10的整数,例如,2~7、2~5、2~4、2~3的整数。作为天然突变体的具体例,可举出基于SNP(单碱基多态性)等多态性的突变体、剪接突变体(剪接变异体)等。上述替换优选为保守的氨基酸替换。这是因为如果是保守的氨基酸替换,则能够具有与具有上述氨基酸序列的APOA2蛋白质实质上同等的结构或性质。所谓保守的氨基酸是指分类在相同的氨基酸组的氨基酸彼此的关系。上述氨基酸组已知非极性氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨酸)、极性氨基酸组(除了非极性氨基酸以外的氨基酸)、带电氨基酸组(酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和碱性氨基酸组(精氨酸、组氨酸、赖氨酸))、非带电氨基酸组(除了带电氨基酸以外的氨基酸)、芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)、支链氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)以及脂肪族氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)等。
上述“它们的片段”是指包含APOA2蛋白质的各种变异体及它们的天然突变体的C末端区域的APOA2蛋白质变异体及其突变体的片段。具体地,是指APOA2蛋白质的各种变异体及其突变体的蛋白酶消化物等。
本发明的方法可以使用包括抗APOA2-AT末端抗体或/和抗APOA2-ATQ末端抗体的抗APOA2蛋白质末端抗体。另外,本发明的方法除了抗APOA2蛋白质末端抗体之外,还可以使用不与APOA2的C末端结合的抗APOA2蛋白质非末端。
“抗APOA2-AT末端抗体”是指能够特异性地识别并结合存在于APOA2-AT蛋白质的C末端区域的表位、具体地为包含序列号30所示的氨基酸序列的区域的抗体或其结合性片段。所谓“特异性地识别并结合”,是指与其他APOA2蛋白质变异体没有交差反应性或者交差反应性极弱,因而不能识别也不能结合、或者几乎不能识别也不能结合其他APOA2蛋白质变异体。具体地,是指与APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合,但与APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域、和APOA2-A蛋白质的C末端区域不显示结合的抗体。另一方面,“抗APOA2-ATQ末端抗体”是指能够特异性地识别并结合存在于APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的表位、具体地为包含序列号31所示的氨基酸序列的区域的抗体或其片段。具体地,是指与APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合,但与APOA2-AT蛋白质的C末端区域、和APOA2-A蛋白质的C末端区域不显示结合的抗体。这样的末端抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体或其结合性片段的任意者。为了能够大量生产、和为了获得均质的效果,优选为单克隆抗体。
所谓“抗APOA2蛋白质非末端抗体”,是指识别并结合在APOA2蛋白质的变异体中的全长氨基酸序列中除了上述C末端区域以外的区域中存在的表位的抗APOA2抗体。即,抗APOA2蛋白质非末端抗体与抗APOA2蛋白质末端抗体各自识别的表位完全不同。抗APOA2蛋白质非末端抗体虽然称为“非末端”抗体,但这是相对于抗APOA2蛋白质末端抗体的方便的名称。因此,只要是C末端区域以外的区域所存在的表位就无特别限定,也可以包含识别、结合N末端中存在的表位的抗体。此外,本说明书中,仅仅称为“抗APOA2抗体”的抗体是指将抗APOA2蛋白质末端抗体和抗APOA2蛋白质非末端抗体的任意者都包含在内的抗体。
本发明的方法可以使用抗APOA2蛋白质非末端抗体。抗APOA2蛋白质非末端抗体优选为针对具有某特定的C末端序列的APOA2蛋白质(例如,APOA2-AT)的结合活性、与针对具有与其不同的C末端序列的APOA2蛋白质(例如,APOA2-ATQ)的结合活性基本同等,且不阻碍所述抗APOA2蛋白质末端抗体对C末端区域的结合的抗体。具体地,例如,与序列号1所示的APOA2-AT蛋白质的C末端区域以外的氨基酸序列结合的“抗APOA2-AT非末端抗体”、和与序列号2所示的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域以外的氨基酸序列结合的“抗APOA2-ATQ非末端抗体”可列举针对APOA2蛋白质具有同等的结合活性,另外任意抗体都不阻碍抗APOA2-AT末端抗体、抗APOA2-ATQ末端抗体与APOA2蛋白质的C末端区域结合的抗体。抗APOA2蛋白质非末端抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体或其结合性片段任意者。为了能够大量生产、和为了获得均质的效果,优选为单克隆抗体。
本说明书中使用的“单克隆抗体”是指单一的免疫球蛋白、或包含其框架区(Framework region:以下称为“FR”)和互补决定区(Complementarity determining region:以下称为“CDR”)、且能够特异性地识别并结合特定的抗原(表位)的抗体。
典型的免疫球蛋白分子是作为被称为重链和轻链的2条多肽链的组通过二硫键2组相互连接而成的四聚体而构成的。重链包含N末端侧的重链可变区(H链V区:以下称为“VH”)和C末端侧的重链恒定区(H链C区:以下称为“CH”),轻链包含N末端侧的轻链可变区(L链V区:以下称为“VL”)和C末端侧的轻链恒定区(L链C区:以下称为“CL”)。其中,VH和VL在与抗体的结合特异性相关方面特别重要。该VH和VL均由约110个的氨基酸残基组成,其内部具有与抗原的结合特异性直接相关的3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)、和作为可变区的骨架结构发挥功能的4个FR(FR1、FR2、FR3、FR4)。已知CDR形成与抗原分子互补的立体结构、决定抗体的特异性(E.A.Kabat et al,1991,Sequences of proteins of immunological interest,Vol.1,eds.5,NIH publication)。恒定区的氨基酸序列在种内抗体间几乎恒定,与此相对,CDR的氨基酸序列在各抗体间变异性高,因此,也称为超可变区(Hyper variable region)。在可变区中,上述CDR和FR从N末端至C末端方向以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排列。在免疫球蛋白分子内,VL和VH通过相对地形成二聚体而形成抗原结合部位。免疫球蛋白已知有IgG、IgM、IgA、IgE和IgD各类,在本发明的方法中使用的抗体可以是任意类。优选为IgG。
本发明的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体与序列号2所示的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合,但与序列号1所示的APOA2-AT蛋白质、和序列号3所示的APOA2-A蛋白质不显示结合性。作为这样的抗体的具体例子,可列举例如,用抗体克隆名7F2和6G2表示的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体克隆等。7F2克隆的重链中的CDR1由序列号4所示的序列组成、CDR2由序列号5所示的序列组成、并且CDR3由序列号6所示的序列组成,且轻链中的CDR1由序列号7所示的序列组成、CDR2由序列号8所示的序列组成、并且CDR3由序列号9所示的序列组成。另外,6G2克隆的重链中的CDR1由序列号10所示的序列组成、CDR2由序列号11所示的序列组成、并且CDR3由序列号12所示的序列组成,且轻链中的CDR1由序列号13所示的序列组成、CDR2由序列号14所示的序列组成、并且CDR3由序列号15所示的序列组成。
本发明的抗APOA2-AT末端单克隆抗体与序列号1所示的APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合,但与序列号2所示的APOA2-ATQ蛋白质、和序列号3所示的APOA2-A蛋白质不显示结合性。作为这样的抗体的具体例子,可列举例如,用抗体克隆名4C6-1、5D9-3、和6B4-2表示的抗APOA2-AT末端单克隆抗体克隆等。4C6-1克隆的重链中的CDR1由序列号33所示的序列组成、CDR2由序列号34所示的序列组成、并且CDR3由序列号35所示的序列组成,且轻链中的CDR1由序列号36所示的序列组成、CDR2由序列号37所示的序列组成、并且CDR3由序列号38所示的序列组成。另外,5D9-3克隆的重链中的CDR1由序列号39所示的序列组成、CDR2由序列号40所示的序列组成、并且CDR3由序列号41所示的序列组成,且轻链中的CDR1由序列号42所示的序列组成、CDR2由序列号43所示的序列组成、并且CDR3由序列号44所示的序列组成。另外,6B4-2克隆的重链中的CDR1由序列号45所示的序列组成、CDR2由序列号46所示的序列组成、并且CDR3由序列号47所示的序列组成,且轻链中的CDR1由序列号48所示的序列组成、CDR2由序列号49所示的序列组成、并且CDR3由序列号50所示的序列组成。
本发明的抗APOA2蛋白质非末端抗体优选在比较针对序列号1~3的任一项所示的APOA2蛋白质的变异体的结合活性的情况下,结合活性为同等。作为具体例子,可列举例如,用抗体克隆名MAB1和MAB2表示的抗APOA2抗体克隆等。MAB1克隆的重链中的CDR1由序列号16所示的氨基酸序列、CDR2由序列号17所示的氨基酸序列组成、并且CDR3由序列号18所示的氨基酸序列组成,且轻链中的CDR1由序列号19所示的氨基酸序列、CDR2由序列号20所示的氨基酸序列组成、并且CDR3由序列号21所示的氨基酸序列组成。另外,MAB2克隆的重链中的CDR1由序列号22所示的氨基酸序列、CDR2由序列号23所示的氨基酸序列组成、并且CDR3由序列号24所示的氨基酸序列组成,且轻链中的CDR1由序列号25所示的氨基酸序列、CDR2由序列号26所示的氨基酸序列组成、并且CDR3由序列号27所示的氨基酸序列组成。另外,作为抗APOA2蛋白质非末端抗体,可以使用所述抗APOA2-ATQ非末端抗体、所述抗APOA2-AT非末端抗体。
所述“多克隆抗体和单克隆抗体或其结合性片段”中的所谓“其结合性片段”,是在APOA2蛋白质的C末端区域或C末端以外的区域具有表位的多克隆抗体或单克隆抗体的部分片段,是指具有与该抗体所具有的抗原特异性地结合活性实质上同等的活性的多肽链或其复合物。例如,是指包含至少1个抗原结合部位的抗体部分,即,具有至少1组的VL和VH的多肽链或其复合物。作为具体例,可举出将免疫球蛋白用各种肽酶切断而产生的众多带有充分特征的抗体片段等。作为更具体的例子,可举出Fab、F(ab’)2、Fab’等。Fab是利用木瓜蛋白酶将IgG分子在铰链部的二硫键的N末端侧切断而产生的片段,由包含构成VH和CH的3个结构域(CH1、CH2、CH3)中邻近VH的CH1的多肽、和轻链构成。F(ab’)2是利用胃蛋白酶将IgG分子在铰链部的二硫键的C末端侧切断而产生的Fab’的二聚体。Fab’比Fab H链长出了相当于包含铰链部的部分,但实质上与Fab具有同等的结构(Fundamental Immunology,Pauled.,3rd ed.,1993)。Fab’可以通过在温和的条件下将F(ab’)2还原,切断铰链区域的二硫键而获得。这些抗体片段均包含抗原结合部位,具有与抗原(即在本发明中为APOA2蛋白质的特定的变异体)特异性地结合的能力。
在本发明的方法中使用的抗体的结合性片段可以化学合成,或通过利用重组DNA法来合成。可举出例如,利用重组DNA法新合成的抗体片段。具体地,虽不限定,但可以是经由具有适当长度和序列的连接肽等使本发明的方法中使用的抗体的一个以上的VL和一个以上的VH人工连接而成的单体多肽分子或其多聚体多肽。作为这样的多肽的例子,可举出单链Fv(scFv:single chain Fragment of variable region,可变区的单链片段)(参照Pierce catalog and Handbook,1994-1995,Pierce Chemical co.,Rockford,IL)、双价抗体(diabody),三价抗体(triabody)或四价抗体(tetrabody)等合成抗体等。在免疫球蛋白分子中,VL和VH通常位于不同的多肽链(L链和H链)上。单链Fv是将这些可变区通过充分长度的柔软性接头连接,在1条多肽链中具有包含了VL和VH的结构的合成抗体片段。在单链Fv内,两可变区可以相互自组装而形成1个功能性的抗原结合部位。单链Fv可以通过将编码它的重组DNA利用公知技术插入到噬菌体基因组中使其表达而获得。双价抗体是具有以单链Fv的二聚体结构为基础的结构的分子(Holliger et al,1993,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:6444-6448)。例如,在上述接头的长度短于约12个氨基酸残基的情况下,单链Fv内的2个可变部位不能自组装,但通过形成双价抗体,即,通过使2条单链Fv相互作用,从而一条Fv链的VL能够与另一条Fv链的VH组装,能够形成2个功能性的抗原结合部位(Marvin et al,2005,Acta Pharmacol.Sin.,26:649-658)。进而,通过在单链Fv的C末端添加半胱氨酸残基,从而2条Fv链能够彼此形成二硫键,也能够形成稳定的双价抗体(Alafsen et al,2004,Prot.Engr.Des.Sel.,17:21-27)。这样,双价抗体是二价的抗体片段,但各个抗原结合部位不需要与同一表位结合,可以分别识别不同的表位,具有特异性地结合的双特异性。三价抗体和四价抗体与双价抗体同样,具有以单链Fv结构为基础的其三聚体、和四聚体结构。分别是三价和四价的抗体片段,也可以是多特异性抗体。进而,本发明的方法中使用する抗体片段包含利用噬菌体展示库鉴定的(例如,参照McCafferty et al.,1990,Nature,Vol.348,522-554)、具有抗原结合能力的抗体片段。另外,还可以参照例如Kuby,J.,Immunology,3rdEd.,1998,W.H.Freeman&Co.,New York。
本发明中,抗APOA2抗体可以进行修饰。这里所说的修饰包括在抗APOA2-ATQ末端抗体具有与APOA2蛋白质的特定的变异体特异性地结合的活性方面必要的功能上的修饰(例如,糖基化)、和在检测本发明的方法中使用的抗体方面必要的标记中的任一种。上述抗体标记可举出例如,荧光色素(FITC、罗丹明、德州红(Texas Red)、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如,PE、APC、GFP)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或利用生物素或(链霉)亲和素的标记。此外,上述抗体的糖基化可以为了调节抗体对抗原的亲和性而改变。这样的改变可以通过例如,改变抗体序列内的一个以上糖基化部位而实现。如果更具体地说明,则例如,通过向构成FR内一个以上糖基化部位的氨基酸序列中导入一个以上的氨基酸替换而除去该糖基化部位,从而可以使该部位的糖基化丧失。这样的脱糖基化在增加抗体对抗原的亲和性方面是有效的(美国专利第5714350号和美国专利第6350861号)。
1-2.免疫原的制备
在本发明中制作抗APOA2蛋白质末端抗体时,制备作为免疫原(抗原)的APOA2蛋白质的变异体。能够在本发明中作为免疫原使用的APOA2蛋白质的变异体可列举例如,具有序列号1~3所示的氨基酸序列的APOA2蛋白质或其突变体或它们的多肽片段、或者它们与其他肽(例如,信号肽、标记肽等)的融合多肽。作为免疫原的APOA2蛋白质的变异体例如,可以利用序列号1~3的氨基酸序列信息,通过本技术领域中公知的方法、例如固相肽合成法等来合成。例如,可以通过以下的方法制备。
APOA2蛋白质的变异体可以利用天然型APOA2蛋白质、重组型APOA2蛋白质、和其全部或一部分被化学合成的合成APOA2蛋白质的任意者。例如,为了获得与APOA2蛋白质的C末端结合的抗体(抗APOA2蛋白质末端抗体)而制备的抗原用APOA2蛋白质的变异体只要包含C末端区域的连续6个氨基酸以上的氨基酸序列,就可以使用天然型APOA2蛋白质、重组型APOA2蛋白质、或合成APOA2蛋白质的任意APOA2蛋白质来源的变异体。
天然型APOA2蛋白质可以从以血液(包含血浆、和血清)这样的体液试样为代表的试样、或从培养细胞的培养上清中,利用公知的蛋白质分离/纯化技术,例如,凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析来回收。
重组型APOA2蛋白质可以在导入了编码该蛋白质的DNA的微生物、昆虫细胞、或动物细胞中使其表达,然后从该细胞中利用公知的蛋白质分离/纯化技术来回收。
合成APOA2蛋白质,例如,可以利用公开的APOA2蛋白质的氨基酸序列信息,通过本技术领域中公知的方法、例如固相肽合成法等来合成。可以将该合成APOA2蛋白质连接于KLH(钥孔血蓝蛋白)、OVA(卵清白蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)等载体蛋白质。
在抗APOA2蛋白质末端抗体的制作中,即使在以APOA2蛋白质变异体的片段作为免疫原的情况下,也可以使用天然型APOA2蛋白质片段、重组型APOA2蛋白质片段或合成APOA2蛋白质片段中的任意者。例如,作为APOA2蛋白质片段,可以使用在序列号1~3的任一项所示的氨基酸序列中包含包括C末端在内的6个以上、优选为10个氨基酸以上、优选为18个氨基酸以上、更优选为30个氨基酸以上的连续氨基酸残基的寡肽或多肽作为抗原。例如,可以使用包含序列号28或29所示的氨基酸序列的肽。
在使用天然型APOA2蛋白质的片段作为免疫原的情况下,例如,如果是制作抗APOA2蛋白质末端抗体,则首先对纯化的APOA2蛋白质用胰蛋白酶等适当的蛋白酶进行处理,然后用反相柱将峰进行分离分级。接着,利用质量分析器确定各峰所含的肽的氨基酸序列,在包含序列号1~3的任一项所示的APOA2蛋白质的C末端区域的连续6个氨基酸以上的序列作为部分序列的情况下,可以使用该肽作为免疫原。
在使用重组型APOA2蛋白质的氨基酸部分序列作为免疫原的情况下,例如,如果是制作抗APOA2蛋白质末端抗体,则首先将编码在序列号1~3的任一项所示的APOA2蛋白质中由包含C末端氨基酸残基在内的连续6个氨基酸以上的部分序列组成的肽(C末端片段)的DNA序列插入到表达用载体中。接着,将该表达用载体导入各种细胞中,使所编码的C末端片段表达。最后,从表达后的细胞中按照常规方法提取C末端片段。使用所得的C末端片段作为免疫原即可。
另外,本发明中制作抗APOA2蛋白质非末端抗体的情况下,基本的制备方法也与所述抗APOA2蛋白质末端抗体的制作方法相同即可。但是,APOA2蛋白质的能够作为免疫原使用的区域,使用与作为在抗APOA2蛋白质末端抗体的制作中使用的免疫原的区域不同的区域。即,只要使用APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的区域的全部或一部分作为免疫原即可。与制作抗APOA2蛋白质末端抗体的情况同样地,在制作抗APOA2蛋白质非末端抗体的情况下,也可以使用包含APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的区域的氨基酸残基的寡肽或多肽作为抗原。
(重组型APOA2蛋白质的制备)
以下对于序列号1~3的任一项所示的重组型APOA2蛋白质(重组型APOA2蛋白质的变异体)的制备进行详述。
(a)编码重组型APOA2蛋白质的变异体的多核苷酸的制备
用于APOA2蛋白质的各种变异体的表达的载体,可以使用能够在宿主微生物中自主增殖的噬菌体或质粒。例如,作为质粒,可举出源自大肠菌的质粒(pET30a、pGEX6p、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、源自枯草菌的质粒(pUB110、pTP5等)、源自酵母的质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)。此外,作为噬菌体,可举出λ噬菌体(λgt11、λZAP等)。进而,可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。
为了对上述载体插入编码APOA2蛋白质的变异体的多核苷酸,例如有,将纯化了的该多核苷酸用适当的限制酶切断,利用DNA连接酶等连接在已经用与其对应的限制酶切断的载体内部的方法。
(b)APOA2蛋白质的变异体表达载体向宿主内的导入
将所得的表达APOA2蛋白质的变异体的载体导入能够表达该表达载体的宿主中,获得表达APOA2蛋白质变异体的转化体(变异体表达转化体)。关于使用的宿主,只要是适合所使用的载体、能够表达APOA2蛋白质的变异体的宿主,就不特别限定。优选使用例如,细菌(大肠菌(例如,:Escherichia coli)、枯草菌(例如,枯草芽孢杆菌:Bacillus subtilis)等)、酵母、昆虫细胞、动物细胞(COS细胞、CHO细胞(Journal of immunology,1998,Vol.160,3393-3402))等。关于将上述载体导入细菌的方法,只要是对细菌导入该载体的公知的方法就不特别限定。可举出例如,热激法、使用钙离子的方法、电穿孔法等。这些技术均是在该领域公知的技术,被各种文献所记载。例如,可参照Green&Sambrook,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Fourth Ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York。此外,动物细胞的转化优选使用脂质体转染法(PNAS,1989,Vol.86,6077;PNAS,1987,Vol.84,7413)、电穿孔法、磷酸钙法(Virology,1973,Vol.52,456-467)、DEAE-葡聚糖法等。
在以细菌作为宿主的情况下,优选表达APOA2蛋白质变异体的载体在该细菌中能够自主复制,同时由启动子序列、核糖体结合序列、编码APOA2蛋白质变异体的DNA序列和转录终止序列构成。此外,可以包含编码控制启动子的调节因子的基因。启动子只要是在大肠菌等宿主中能够发挥功能的就可以任意使用。
在以酵母、动物细胞、昆虫细胞等真核细胞作为宿主的情况下,同样可以按照该技术领域中公知的方法而获得表达APOA2蛋白质变异体的转化体。在真核细胞中使用的APOA2蛋白质变异体表达载体中,除了启动子序列、编码APOA2蛋白质变异体的DNA序列以外,还可以根据所需连接增强子等顺式作用元件、剪接信号(供体部位、接受体部位、分支点等)、多聚腺苷酸添加信号、选择标志物序列、核糖体结合序列(SD序列)等。
(c)表达变异体的转化体的培养和重组型APOA2蛋白质变异体的表达
接着,培养上述制作的表达变异体的转化体。在培养基中培养表达变异体的转化体的方法按照可用于宿主培养的通常方法进行。例如,在以细菌作为宿主的情况下,培养基只要含有细菌能够同化的碳源、氮源、无机盐类等,且能够使其生长、增殖,就不特别限定。可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。作为更具体的例子,可举出LB培养基,但当然并不限定于此。此外,为了选择性地培养表达变异体的转化体,可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。通常,培养在通气搅拌培养等好氧条件下、在37℃下进行6~24小时。在培养期间,优选pH值保持在中性附近。pH值的调节利用无机或有机酸、碱性溶液等进行。在表达变异体的转化体为CHO细胞等动物细胞的情况下,在LifeTechnologies社(现Thermo Fisher Scientific社)制DMEM培养基中以1×105细胞/mL接种宿主细胞,在37℃的5%CO2孵育箱中进行培养即可。培养中可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。
在上述表达APOA2蛋白质的变异体的载体为包含蛋白质表达控制系统(例如,在宿主为细菌的情况下是阻遏物基因和操纵基因等)的蛋白质表达诱导型载体的情况下,需要对上述表达变异体的转化体进行规定的处理、诱导APOA2蛋白质的变异体的表达。表达诱导的方法根据载体中包含的蛋白质表达控制系统不同而不同,因此只要进行适合该系统的诱导处理即可。例如,在以细菌作为宿主的蛋白质表达诱导型载体中最常利用的蛋白质表达控制系统是包含lac阻遏物基因和lac操纵基因的系统。本系统可以通过IPTG(isopropyl-1-tio-β-D-Galactoside,异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)处理来诱导表达。在具有包含该系统的表达APOA2蛋白质的载体的转化体中,为了使目标APOA2蛋白质变异体表达,在培养基中添加适当量(例如,终浓度为1mM)的IPTG即可。
(d)重组型APOA2蛋白质的变异体的提取和/或回收
培养后,在APOA2蛋白质的变异体产生于菌体内或细胞内的情况下,可以通过回收菌体或细胞并进行破碎来提取目的蛋白质。此外,在APOA2蛋白质的变异体非分泌到菌体外或细胞外的情况下,直接使用培养液、或者通过离心分离等除去菌体或细胞而使用上清即可。然后,通过单独或者适当组合使用通常的蛋白质纯化方法,例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等,可以从上述培养物中分离纯化APOA2蛋白质变异体。关于是否获得了APOA2蛋白质变异体,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行确认即可。
1-3.抗APOA2单克隆抗体的制作
1-3-1.抗APOA2单克隆抗体和杂交瘤制作方法
产生本发明的抗APOA2单克隆抗体的杂交瘤可以通过以下记载的方法来制作。但是,并不限于本方法,也可以通过该领域公知的其他所有方法来制作。
(1)抗APOA2单克隆抗体制作方法
为了制作与构成APOA2蛋白质的氨基酸序列中的序列号1、2或3所示的APOA2蛋白质的任一C末端区域特异性地结合的抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体,以包含APOA2蛋白质的变异体或APOA2蛋白质的变异体的C末端区域的肽作为免疫原制作单克隆抗体,然后使用序列号1~3的任一项所示的APOA2蛋白质自身或包含APOA2蛋白质的变异体的C末端区域的肽筛选仅与APOA2蛋白质的特定的变异体结合的抗体。例如,对于抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体,可以以与序列号2所示的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域(包含序列号31的氨基酸序列的区域)特异性地结合、不与或者基本不与序列号1或3所示的APOA2蛋白质的变异体结合作为指标进行筛选。另外,对于抗APOA2-AT末端单克隆抗体,可以以与序列号1所示的APOA2-AT蛋白质的C末端区域(包含序列号30的氨基酸序列的区域)特异性地结合、不与或者基本不与序列号2或3所示的APOA2蛋白质的变异体结合作为指标进行筛选。
另外,为了制作识别APOA2蛋白质的C末端区域以外的氨基酸的抗APOA2蛋白质非末端抗体,以包含APOA2蛋白质的变异体或部分序列的肽作为免疫原制作单克隆抗体,然后,以在比较针对序列号1~3的任一项所示的APOA2蛋白质的变异体或C末端的不同肽的结合活性的情况下结合活性为同程度作为指标,通过筛选抗体而获得。
(2)抗APOA2蛋白质末端抗体的产生细胞的制作
将所述1-2中得到的作为免疫原的重组型APOA2蛋白质溶解在缓冲液中来制备免疫原溶液。此时,为了有效地进行免疫,如果需要,可以添加佐剂。作为佐剂的例子,可举出市售的弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等,可以单独使用或混合使用这些佐剂。
接着,将上述制备的免疫原溶液施与哺乳动物,例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠BALB/c)、兔等,进行免疫。作为免疫原的施与方法,可举出例如,使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射或使用0.15M氯化钠的静脉注射,但是不限于此。免疫原1次的施与量是根据免疫动物的种类、施与途径等适当确定的,每只动物约50~200μg。此外,对免疫的间隔不特别限定,初次免疫后,以数日至数周的间隔、优选为1~4周的间隔,进行2~6次、优选为3~4次追加免疫。在初次免疫之后,通过ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,酶联免疫吸附测定)法等测定免疫动物的血清中的抗体效价,如果观察到抗体效价充分上升,则将免疫原注射到静脉内或腹腔内,作为最终免疫。然后,最终免疫之日起2~5天后,优选为3天后,采集产生抗体的细胞。
1-3-2.产生抗APOA2单克隆抗体的杂交瘤制作方法
(1)来自免疫动物的产生抗体的细胞的回收和细胞融合
通过进行从免疫动物获得的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合,能够制作生产特异性地识别APOA2蛋白质的特定区域的单克隆抗体的杂交瘤。作为产生抗体的细胞,可举出脾脏细胞、淋巴节细胞、末梢血细胞等,优选脾脏细胞或局部淋巴节细胞。作为与产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞,可以使用通常能够获得的来自小鼠等的株化细胞。作为使用的细胞株,优选为具有药剂选择性,并具有在未融合的状态下不能在HAT选择培养基(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)中生存、仅在与产生抗体的细胞融合的状态下能够生长的性质的细胞株。此外,株化细胞优选为来自与免疫动物同种系的动物的细胞。作为骨髓瘤细胞的具体例,可举出作为来自BALB/c小鼠的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺损细胞株的P3X62-Ag.8株(ATCCTIB9)、P3X63-Ag.8.U1株(JCRB9085)、P3/NSI/1-Ag4-1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)或SP2/0-Ag14株(JCRB0029)等。
为了使上述骨髓瘤细胞和产生抗体的细胞进行细胞融合,在不含血清的DMEM、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基中,将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞以约1:1~20:1的比例混合,在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂,可以以约10~80%的浓度使用平均分子量1,500~4,000Da的聚乙二醇等。此外,为了提高融合效率,可以根据情况并用二甲基亚砜等辅助剂。进而,可以使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售细胞融合装置来使产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞融合(Nature,1977,Vol.266,550-552)。
(2)目标杂交瘤的筛选
作为从细胞融合处理后的细胞的产生抗APOA2单克隆抗体的目标杂交瘤的分选方法,可列举例如以下的方法。将细胞悬浮液用例如含有胎牛血清的RPMI1640培养基等进行适当稀释后,以2×106个/孔左右接种在96孔微量酶标板上,向各孔添加选择培养基,之后适当地交换选择培养基而进行培养。培养温度为20~40℃,优选为约37℃。在骨髓瘤细胞为HGPRT缺损株或胸苷激酶(TK)缺损株的情况下,通过使用包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的选择培养基(HAT培养基),可以选择性地仅仅使产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞的杂交瘤生长、增殖,因此可以从在选择培养基中培养开始后约10天前后选择生长起来的细胞作为杂交瘤。
对于用HAT培养基选择出的杂交瘤,首先,以针对序列号1~3的任一项所示的APOA2蛋白质的各种变异体的结合活性作为指标,进行所产生的抗体的筛选。接着对于具有结合活性的抗体进行交差反应性试验,选择能够允许的杂交瘤。所谓“能够允许的(交差反应性)”,是指在目标抗体的用途中能够忽略的程度的交差反应性。例如,对于用于免疫学测定的单克隆抗体,如果在最终的测定体系中由交差反应引起的信号强度能够抑制在小于从背景水平开始由特异性反应引起的信号强度的1%,则可以解释为事实上不发生交差反应。
为了确认对APOA2蛋白质的特定变异体的反应特异性,例如,可以利用ELISA法。在ELISA法中,准备将成为抗原的APOA2蛋白质的各种变异体或其片段分别固相化在不同孔而得的微孔板,向其中添加将上述杂交瘤的培养上清进行适当稀释而得的样品,使其反应。在充分反应后,清洗孔,添加针对免疫球蛋白的二抗的标记体使其进一步反应。再次清洗孔,如果最终利用已结合于孔的二抗的标记进行测定,则可以定量地得知培养上清中存在的抗体对抗原的结合活性。例如,为了制作抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体,可以以仅对特定的APOA2蛋白质的变异体中的C末端区域显示结合活性、对APOA2蛋白质的其他变异体不显示交差反应性作为指标,进行特异性的判断。另外,为了制作抗APOA2蛋白质非末端单克隆抗体,可以以针对APOA2蛋白质的C末端不同的任何变异体都显示相同程度的结合性、且制作出的抗体不阻碍抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体对C末端区域的结合作为指标,进行抗体的筛选。
杂交瘤也可以利用重组DNA技术进行分选。首先,从按照上述方法获取的杂交瘤组提取mRNA。mRNA的提取使用该技术领域中公知的方法即可。接着,使用Oligo dT引物、随机引物来获取上述mRNA的cDNA。以该cDNA为模板,利用包含位于编码可变区的基因上游的信号序列的碱基序列、和恒定区侧的碱基序列的引物组来进行PCR。将所得扩增产物插入到适当的克隆载体而进行克隆化,可以获得由该杂交瘤生产的抗体的可变区基因的文库。作为更具体的例子,虽不限定,但可以使用Merck Millipore社提供的Mouse Ig Primer进行PCR,将扩增产物(小鼠免疫球蛋白可变区cDNA)插入到Life Technologies社(现ThermoFisher Scientific社)提供的ZERO BLUNT PCR TOPO载体的EcoRI位点而进行克隆化,将所得载体组作为编码可变区氨基酸序列的基因文库。接着,通过以上述本发明公开的可变区或各CDR的氨基酸序列为基础设计探针,从上述文库中筛选阳性克隆,可以筛选生产本发明的方法中使用的抗体的杂交瘤。
(3)使用杂交瘤的抗体产生
本发明中的杂交瘤通过使用小鼠进行腹水化,从而可以用于抗体生产。具体地,向制作杂交瘤时用作融合伴侣的细胞所来源的小鼠、裸鼠的腹腔内接种杂交瘤,适当采集腹水,从而可以回收包含抗体的腹水液。更具体地,通过将以SP2/0细胞作为融合伴侣的杂交瘤接种在接种降植烷后经过了10天的BALB/c小鼠的腹腔中,可以回收包含抗体的腹水液。
另外,本发明中的杂交瘤通过使用适当的培养基进行培养,从而可以用于抗体生产。具体地,通过在Life Technologies社(现Thermo Fisher Scientific社)制的杂交瘤SFM培养基中以1×105细胞/mL接种杂交瘤,在37℃的5%CO2孵育箱中进行培养直到杂交瘤死亡为止,可以获得包含抗体的培养上清,但是不限于此。
(4)通过重组DNA操作制作重组抗APOA2单克隆抗体或其片段的制作方法
本发明中使用的抗体也可以利用编码该抗体的氨基酸序列的cDNA序列,通过重组DNA操作而获得。
可以使用编码来自产生抗APOA2单克隆抗体的杂交瘤、例如来自由上述“1-3-2(2)”的方法获取的产生抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体的杂交瘤来源的抗体中的可变区的氨基酸序列的碱基序列,将VH和VL的碱基序列分别与编码任意的人CL和人CH的碱基序列连接,将各个多核苷酸插入适当的表达载体中,在导入宿主细胞之后,作为完整的免疫球蛋白分子而使其表达。此外,也可以利用CDR移植抗体技术,将编码由上述“1-3-2(2)”的方法获取的产生抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体的杂交瘤来源的抗体中的可变区的氨基酸序列中的各CDR序列的氨基酸序列的多核苷酸与编码人FR序列的氨基酸序列的多核苷酸以规定的顺序连接,插入适当的表达载体中,在导入宿主细胞之后,作为完整的免疫球蛋白分子使其表达。此时,使得重链和轻链在同一宿主细胞内表达、能够作为包含重链/轻链的二聚体而产生,则是便利的。具体地,例如,可以通过轻链表达载体和重链表达载体将细胞共转化,从该转化细胞获得本发明的抗体。或者,也可以将编码上述可变区的氨基酸序列的多核苷酸直接插入适当的表达载体中,在导入宿主细胞之后,作为免疫球蛋白分子的片段使其表达。或者,如上所述,可以将分别编码包含上述氨基酸序列的VL和VH、或轻链和重链的多核苷酸用适当的接头进行连接并插入噬菌体,制成单链Fv使其表达,或者制成双价抗体等合成抗体片段使其表达。另外,通过近年开发的、灵活运用基因工程技术而使重组抗体在噬菌体表面表达的噬菌体展示抗体技术(Brinkmann et al,1995,J Immunol Methods,182,41-50,国际公开WO97/13844号,国际公开WO90-02809号),可以人工使将编码重链、轻链的基因改组(shuffling)而多样化后的单链Fv抗体作为噬菌体融合蛋白表达,从而获得特异抗体。
关于编码重组抗APOA2抗体或其片段的多核苷酸的制备、插入了该多核苷酸的载体、该载体的宿主导入法,使用该领域公知的重组DNA技术来进行即可。目标重组抗APOA2蛋白质抗体或其片段可以从转化细胞的培养液中或从该细胞内获得。
作为免疫球蛋白的表达载体,可以使用例如,质粒、噬菌粒、粘粒、病毒载体(例如,基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV的载体)等,但不限定于这些。例如,作为基于BPV的载体的1种的BCMGS Neo载体是通过转化COS7细胞等而高效地表达外来基因的理想的载体(乌山一“ウシパピローマウイルスベクター(牛乳头瘤病毒载体)”,村松正实和冈山博人编,实验医学别册:遺伝子工学ハンドブック(基因工程手册),1991,羊土社,297-299)。
除了编码抗体或其片段的多核苷酸以外,上述载体可以包含在表达上述抗体或其片段方面必要的控制元件(例如,启动子、增强子、终止子、聚腺苷酸化部位、剪接部位),或者如果需要可以包含选择标志物。
作为转化的宿主,除了上述“1-2.免疫原的制备”记载的宿主以外,优选使用SP2/0(小鼠骨髓瘤)细胞(European Journal of Cancer Resarch Preview(1996)Vol.5,512-519;Cancer Resarch(1990)Vol.50,1495-1502)。
本发明中,含有表达本说明书中的抗体或其片段的载体的宿主细胞通过按照常规方法进行培养,可以在其培养上清或宿主细胞内产生抗体。具体地,在以CHO细胞作为宿主的情况下,通过在Life Technologies社(现Thermo Fisher Scientific社)制DMEM培养基中以1×105细胞/mL接种宿主细胞,在37℃的5%CO2孵育箱进行培养,从而可以获得包含抗体的培养上清。此外,例如,在以大肠杆菌作为宿主细胞的情况下,可以通过接种在LB培养基等可用于大肠杆菌的培养的通常培养基中进行培养、诱导蛋白质的表达,从而可以在培养上清或宿主细胞内产生抗体。
在作为表达产物的抗体或其片段包含恒定区的情况下,可以使用蛋白A柱、蛋白G柱、抗免疫球蛋白抗体亲和柱等从培养上清、细胞破碎液纯化、回收。另一方面,在以仅由可变区构成、不包含恒定区的状态表达的情况下,不能应用上述纯化方法,因此应用其他适当的纯化方法。例如,如果作为在C末端融合了组氨酸标签等对纯化有利的标签序列的结构使其表达,则可以通过利用了对应的配体的亲和层析来纯化。在不是与标签的融合蛋白质的情况下,可以按照硫酸铵沉淀、离子交换层析、反相层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析等蛋白质纯化的常规方法进行纯化。
此外,为了确认本发明中使用的单克隆抗体或其片段对APOA2蛋白质的特定的变异体或其片段的特异性,优选如前所述在使用之前预先验证与其他变异体的交差反应性。例如,对于本发明的抗APOA2-ATQ蛋白质末端单克隆抗体或其片段,应确认交差反应性的抗原是APOA2-AT蛋白质和APOA2-A蛋白质。
另外,更优选除了上述蛋白质以外,对于部分结构与APOA2蛋白质变异体相同的其他蛋白质,也确认本发明中使用的抗体或其片段的交差反应性。对于交差反应的确认,例如,可以使用以APOA2-ATQ蛋白质作为抗原的ELISA法。在应试验反应特异性的抗体、即抗APOA2蛋白质末端抗体及其片段与APOA2蛋白质变异体的反应的情况下,只要使应确认交差反应性的其他抗原蛋白质共存,就能够通过观察两者的竞争状态来确认交差反应性。利用了竞争抑制原理的这样的交差反应性的确认方法,不需要对于所有的抗原制备反应体系,因此可以迅速地进行筛选。
1-3-3.由所得的抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体识别的APOA2蛋白质的区域结构的确认
关于由抗APOA2单克隆抗体特异性地识别的APOA2蛋白质的变异体的种类,可以基于该蛋白质的基因使用PCR反应等制作各种APOA2蛋白质的变异体基因,通过分析由该基因得到的APOA2蛋白质的各种变异体与单克隆抗体的结合性来确定。
在抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体的情况下,具体地通过如下方法进行。首先制备APOA2基因全长、或从APOA2基因的终止密码子到5’末端侧包含终止密码子在内的6个碱基、或9个碱基缺失了的各种长度的片段,制作插入了这些片段的表达载体。伴有这样的缺失变异的基因片段的制备法记载于“续生化学实验讲座、第1卷、基因研究法II、289-305页、日本生化学会编”中。接着,由导入了各个APOA2蛋白质的变异体表达载体的宿主细胞,通过前述的方法制备APOA2蛋白质的各种变异体。接着,以这些蛋白质作为抗原,通过ELISA法进行抗APOA2蛋白质单克隆抗体对各种APOA2蛋白质的变异体的结合性的评价。在仅对特定的变异体观察到结合性、观察不到或基本观察不到对其他变异体的结合性的情况下,可以判断该单克隆抗体是仅与特定的APOA2蛋白质的变异体特异性地结合的末端单克隆抗体。
由所得的抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体识别的APOA2蛋白质的变异体也可以通过如下方法确认。
首先,通过公知的方法分别固相合成各种APOA2蛋白质的变异体的C末端区域的序列肽。接着,以这些肽作为抗原通过ELISA法进行抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体对各种肽的结合性的评价。在仅对特定的C末端区域的序列肽发现了抗APOA2蛋白质单克隆抗体的结合性的情况下,可以判定该单克隆抗体是仅与特定的APOA2蛋白质的变异体特异性地结合的抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体。
1-4.抗APOA2多克隆抗体的制作
抗APOA2多克隆抗体可以通过该技术领域公知的方法制作。以下,作为例子,具体显示仅与APOA2蛋白质的特定的变异体特异性地结合的抗APOA2蛋白质末端抗体的获得法。
1-4-1.抗血清的获得
抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体的制作可以与1-3-1(2)中记载的抗APOA2抗体的产生细胞的制作方法同样地进行。抗原可以使用具有特定的APOA2蛋白质的变异体序列上的至少6个氨基酸以上的长度的C末端片段、例如序列号28或29所示的肽。可以在最终免疫日2~5天后、优选为3天后从免疫动物的血液回收包含识别APOA2蛋白质的多克隆抗体的抗血清。
1-4-2.抗APOA2末端多克隆抗体的纯化
(1)肽固定化柱的制作
制作固定化了APOA2蛋白质的C末端区域肽的亲和柱、和固定化了在APOA2蛋白质的C末端区域肽的C末端添加了酰胺基的肽的亲和柱。详细的方法记载在“抗ペプチド抗体実験プロトコール(抗肽抗体实验方案)”,第2版,秀润社中。用于亲和柱的担载体可以使用像Formyl Cellulofine、CNBr琼脂糖这样,载体上的官能团能够与肽的氨基结合的担载体,或者能够经由共价键合在担载体上的马来酰亚胺基而与肽序列上的半胱氨酸残基结合的担载体等。此外,对于固定化的肽的长度,只要包含APOA2蛋白质的C末端即可,为6个氨基酸以上,优选为10个氨基酸以上,优选为18个氨基酸以上,更优选为30个氨基酸以上。
(2)抗体纯化
抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体可以使用肽固定化亲和柱从所述抗血清纯化。例如,用适当的缓冲液稀释上述抗血清,使抗血清中包含的IgG抗体吸附在固定化了APOA2蛋白质的C末端区域肽的亲和柱上,回收该吸附级分。接着,使用固相化有C末端酰胺化了的APOA2蛋白质肽的亲和柱,吸附除去对肽的除了C末端区域以外的区域显示结合性的免疫球蛋白。最终,获取该非吸附级分作为特异性地识别特定的APOA2蛋白质变异体的抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体。
2.恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法的各工序
本发明的方法的第二方案涉及体外确定是否患有恶性胰腺囊性肿瘤的诊断辅助方法的各工序。本发明的特征在于,测定由患有胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中存在的APOA2-AT蛋白质或APOA2-ATQ蛋白质的量,基于该量辅助胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定。
本发明的方法包括恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助用标志物测定工序、和辅助胰腺囊性肿瘤是恶性还是良性的判定的工序。以下对于各个工序详细进行说明。
2-1.恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助用标志物测定工序
所谓“恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助用标志物的测定工序”,是体外测定受检体来源的体液试样中存在的本发明的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助用标志物、即APOA2-AT蛋白质或APOA2-ATQ蛋白质或其片段的量的工序。
本说明书中,所谓“受检体”,是指需要判定胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的、确定了患有胰腺囊性肿瘤的个体。患有胰腺囊性肿瘤,可以使用CT、MRI、MRCP、EUS等影像学检查来判断。另外,已知组合了APOA2-AT蛋白质与APOA2-ATQ蛋白质的血中浓度的胰肿瘤的检测方法也能够高灵敏度地检测胰癌、包含胰腺囊性肿瘤在内的胰良性肿瘤(专利文献2、非专利文献4),也可以将这样的已有的肿瘤标志物单独使用或与影像学检查组合使用。作为使用标志物的胰肿瘤的检测方法的例子,具体可列举包含以下工序的方法。
测定受检体的体液试样中的APOA2蛋白质的变异体的量来检测胰癌或胰良性肿瘤的方法,该方法包括工序(A)~(C):
(A)使用与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域特异性地结合的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与该羧基末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,测定试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量的第1工序;
(B)使用与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与该羧基末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体,测定试样中的APOA2-AT蛋白质的量的第2工序;和
(C)对于将第1工序所得的APOA2-ATQ蛋白质的量的测定值和第2工序所得的APOA2-AT蛋白质的量的测定值输入预先设定好的判别式而得的判别值,与已知的健常体的判别值进行比较,用于确定是否患有胰腺囊性肿瘤的第3工序。
患有胰腺囊性肿瘤的受检体的确定可以通过将影像学检查和上述检测方法分别单独或组合来实施。
作为这里所说的个体的例子,可举出脊椎动物。优选为哺乳动物,例如灵长类(人、猴、黑猩猩、红猩猩、大猩猩等)、啮齿类(小鼠、大鼠、豚鼠等)、有蹄类(牛、马、绵羊、山羊等)等,更优选为人。在本说明书中,在受检体是人的情况下,以下将受检体特别称为“受检者”。
本说明书中所谓“体液试样”,是指被提供用于恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助的试样,是生物学的液体。体液试样只要是有可能包含本发明的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助用标志物的生物学的液体即可,不特别限定。包含例如,血液、尿、淋巴细胞培养上清、脑脊液、消化液(包含例如,胰液、大肠液、食道腺分泌液、唾液)、汗、腹水、鼻涕、泪、阴道液、精液等。优选为血液或尿。本说明书中,“血液”包含血浆和血清,也可以优选使用全血。全血不论静脉血、动脉血或脐带血等种类。体液试样也可以是从同一个体获得的两种以上不同的液体的组合。本发明的恶性胰腺囊性肿瘤的检测方法能够从侵袭性低的血液、尿检测,因此作为简便的检测法是非常有用的。
所谓“受检体来源的体液试样”是指已经从受检体采集的体液试样,采集体液试样的行为自身不包含在本发明的方法的方式中。受检体来源的体液试样可以将从受检体采集的体液立即供给本发明的方法,也可以将采集后直接或进行了适当的处理后冷藏或冷冻的体液在供给本发明的方法之前恢复到室温来使用。作为冷藏或冷冻前的适当的处理,在体液试样为血液的情况下,包括在采集的全血中添加肝素等进行抗凝处理后,作为血浆分离,或者在全血中添加凝固促进剂等而实施凝固处理之后作为血清分离等。这些处理可以基于该领域公知的技术进行。
本说明书中所谓“APOA2蛋白质变异体的量”是指受检体来源的体液试样中存在的所述2种APOA2蛋白质变异体各自的分量。该分量可以是绝对量或相对量的任一种。在该分量是绝对量的情况下,是指规定的体液试样中所包含的所述2种APOA2蛋白质变异体的质量或体积。在该分量是相对量的情况下,是指例如,使用标准物质,来自受检体的2种APOA2蛋白质变异体的测定值相对于该标准物质的测定值的相对值。可举出例如,浓度、荧光强度、吸光度等。
APOA2蛋白质变异体的量可以在体外使用公知的方法进行测定。可举出例如,使用能够分别与2种APOA2蛋白质变异体特异性地结合的物质来测定的方法。或者可列举使用氨基酸测序、质量分析、电泳法等直接测定目标蛋白质变异体的量的方法。以下,对于使用作为蛋白质的定量方法被广泛使用的特异性结合物质的方法例示性地进行说明,但不限定本发明的范围。
本说明书中,“能特异性地结合”是指某种物质实质上仅能够与作为本发明的目标的APOA2蛋白质的特定变异体结合。在该情况下,也可以存在对特定的APOA2蛋白质变异体的检测不产生影响的程度的非特异性结合。
作为“能特异性地结合的物质”,可列举例如,APOA2结合蛋白质。更具体地,例如,以APOA2蛋白质变异体作为抗原、识别并结合不同的C末端区域的结构的“抗APOA2蛋白质末端抗体”,优选为在以包含序列号1、2或3的氨基酸序列的人APOA2蛋白质变异体作为抗原时,仅识别并结合APOA2蛋白质变异体的任1种的“抗人APOA2蛋白质末端抗体”或它们的结合性片段。或者,可以是它们的化学修饰衍生物。这里所谓“化学修饰衍生物”包含例如,在所述抗APOA2蛋白质末端抗体或其抗体片段中,在与APOA2蛋白质的特定变异体获得或保持特异性结合活性方面必要的功能上的修饰,或在检测所述抗APOA2蛋白质末端抗体或其结合性片段方面必要的用于标记的修饰中的任一种。功能上的修饰如前所述。
用于APOA2蛋白质变异体的测定的抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体中的任一种。为了能够特异性检测,优选为单克隆抗体。例如,与APOA2蛋白质末端特异性地结合的抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体等可以通过上述方法制作。
2种APOA2蛋白质变异体可以通过利用了仅与APOA2蛋白质的特定的变异体结合的抗APOA2抗体的免疫学方法来测定。免疫学方法只要使用抗APOA2抗体,就可以是任意方法,但优选为使用抗APOA2蛋白质末端抗体作为固相化抗体或标记抗体,组合与APOA2蛋白质的C末端以外的区域结合的另一抗体(抗APOA2蛋白质非末端抗体)而进行的ELISA法。例如,APOA2-AT蛋白质的量使用抗APOA2-AT末端抗体作为标记抗体,通过使用抗APOA2-AT非末端抗体作为固相化抗体的夹心ELISA法来测定。另外,APOA2-ATQ蛋白质的量可以通过使用抗APOA2-ATQ末端抗体作为固相化抗体、使用抗APOA2-ATQ非末端抗体作为标记抗体的夹心ELISA法来测定。抗APOA2蛋白质非末端抗体由Abcam社、Fitzgerald社等市售,可以利用它们。
2-2.罹患确定工序
“罹患确定工序”是基于通过所述恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助标志物测定工序测定的蛋白质的量,辅助体外胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定的工序。测定所测定的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助标志物、即患有胰腺囊性肿瘤的受检体的体液试样中的APOA2蛋白质变异体的量(APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的量),进行恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助,能够确定胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性。根据本确定工序,仅使用APOA2-AT蛋白质的量、或APOA2-ATQ蛋白质的量的任一方就能够确定,但通过将两者组合能够高准确度地确定胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性。以下对于各自的确定工序进行详细说明。
胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的确定可以基于APOA2-AT蛋白质的量来进行。具体地,使用与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体,测定受检体的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量,在患有胰腺囊性肿瘤的受检体的体液试样中的APOA2-AT的量与良性胰腺囊性肿瘤患者相比较少的情况下,可以辅助受检体具有恶性胰腺囊性肿瘤的判断。这里,如果可以判断受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤,则通过追加利用CT、EUS、MRI等的精密影像学检查、利用EUS-FNA的囊泡液的细胞诊断、或使用ERCP利用胰液细胞诊断等的精查,从而可以确定诊断受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤,可以确定为需要利用外科手术的肿瘤切除等的治疗的胰腺囊性肿瘤患者。
胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的确定也可以基于APOA2-ATQ蛋白质的量来进行。具体地,使用与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,测定APOA2-ATQ蛋白质的量,在患有胰腺囊性肿瘤的受检体体液试样中的APOA2-ATQ的量比良性胰腺囊性肿瘤患者多的情况下,可以辅助受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤的判断。这里,如果能够判断受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤,则通过追加利用CT、EUS、MRI等的精密影像学检查、利用EUS-FNA的囊泡液的细胞诊断、或利用ERCP的精查,从而可以确定针对受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤,可以确定是需要利用外科手术的肿瘤切除等的治疗的胰腺囊性肿瘤患者。
仅通过上述APOA2-AT蛋白质的量确定恶性胰腺囊性肿瘤,进而基于APOA2-ATQ蛋白质的量确定恶性胰腺囊性肿瘤,也可以通过将各自的结果组合,从而准确度更高地确定胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性。具体地,通过压缩患有胰腺囊性肿瘤的受检体体液试样中的APOA2-AT蛋白质比良性胰腺囊性患者少、且APOA2-ATQ蛋白质的量与良性胰腺囊性患者的该量相比多的受检体,能够提高受检者患有恶性胰腺囊性肿瘤的判断的准确度。另一方面,患有胰腺囊性肿瘤的受检体体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量与良性胰腺囊性患者相比为同等以下,且APOA2-ATQ蛋白质的量与良性胰腺囊性患者的该量相比为同等以上的情况下,能够提高受检者具有良性胰腺囊性肿瘤的判断的准确度。
本发明中,受检体的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量与良性胰腺囊性肿瘤患者的该量的比较中,可以基于已知的良性胰腺囊性肿瘤患者组或恶性胰腺囊性肿瘤患者组的APOA2-AT蛋白质的量使用预先设定好的截止值。例如,在受检体的APOA2-AT蛋白质的测定值为基于已知的良性胰腺囊性肿瘤患者组的APOA2-AT蛋白质的量设定的截止值以下时,可以判定受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤。截止值的设定可以使用标准偏差,可以为良性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的“平均值-0.5x标准偏差(SD)”的值、更优选为“平均值-1.0×SD”的值、进一步优选为“平均值-2.0×SD”的值、特别优选为“平均值-3.0×SD”的值。或者可以使用百分位数法设定,优选为良性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的30百分位数值、更优选为10百分位数值、进一步优选为5百分位数值、特别优选为1百分位数值。
另外,在受检体的APOA2-AT蛋白质的测定值为基于已知的恶性胰腺囊性肿瘤患者组的APOA2-AT蛋白质的量设定的截止值以下时,也可以判定受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤。截止值的设定可以使用标准偏差,恶性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的“平均值+0.5×SD”的值、更优选为“平均值+1.0×SD”的值、进一步优选为“平均值+2.0×SD”的值、特别优选为“平均值+3.0×SD”的值。或者可以使用百分位数法设定,为恶性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的70百分位数值、更优选为90百分位数值、进一步优选为95百分位数值、特别优选为99百分位数值。
同样地,本发明中,在APOA2-ATQ蛋白质的量与良性胰腺囊性肿瘤患者的该量的比较中,可以使用基于已知的良性胰腺囊性肿瘤患者或恶性胰腺囊性肿瘤患者组的APOA2-ATQ蛋白质的量设定的截止值。例如,受检体的APOA2-ATQ蛋白质的测定值为基于已知的良性胰腺囊性肿瘤患者组的APOA2-ATQ蛋白质的量设定的截止值以上时,可以判定受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤。截止值的设定可以使用标准偏差,为良性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的“平均值+0.5x标准偏差(SD)”的值、更优选为“平均值+1.0×SD”的值、进一步优选为“平均值+2.0×SD”的值、特别优选为“平均值+3.0×SD”的值。或者,可以使用百分位数法来设定,为良性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的70百分位数值、更优选为90百分位数值、进一步优选为95百分位数值、特别优选为99百分位数值。
另外,在受检体的APOA2-ATQ蛋白质的测定值为基于已知的恶性胰腺囊性肿瘤患者组的APOA2-ATQ蛋白质的量设定的截止值以上时,判定受检体患有恶性胰腺囊性肿瘤。截止值的设定可以使用标准偏差,为恶性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的“平均值-0.5x标准偏差(SD)”的值、更优选为“平均值-1.0×SD”的值、进一步优选为“平均值-2.0×SD”的值、特别优选为“平均值-3.0×SD”的值。或者,可以使用百分位数法来设定,为恶性胰腺囊性肿瘤患者组的测定值的30百分位数值、更优选为10百分位数值、进一步优选为5百分位数值、特别优选为1百分位数值。
除了上述方法之外,在判断受检体的APOA2-AT蛋白质的量与良性胰腺囊性肿瘤患者的该量相比少时,也可以使用统计学处理,仅将被分析为与良性胰腺囊性肿瘤患者的值相比统计学上显著地“少”的受检体判断为“与良性胰腺囊性患者的值相比少”。同样地,判断受检体的APOA2-ATQ蛋白质的量与良性胰腺囊性肿瘤患者的该量相比多时,也可以使用统计学处理,仅将被分析为与良性胰腺囊性肿瘤患者的值相比统计学上显著地“多”的受检体,判断为“与良性胰腺囊性肿瘤患者的值相比多”。所谓统计学上显著,例如,在所得的值的危险率(显著性水平)小的情况下,具体可列举p<0.05、p<0.01或p<0.001的情况。其中,所谓“p”或“p值”,表示在统计学检验中,在统计量假定的分布中假定偶然正确的概率。因此,“p”或“p值”越小,假定越接近真。所谓“统计学上有显著性差异”,是指由受检体和良性胰腺囊性肿瘤患者分别得到的恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助标志物的量在统计学上处理时两者之间有显著性差异。在于良性胰腺囊性肿瘤患者的比较中,在统计学上有显著性差异的情况下,可以评价该受检体具有恶性胰腺囊性肿瘤。统计学处理的检验方法可以适宜使用能够判断显著性的有无的公知的检验方法,不特别限定。例如,可以使用学生检验法、多重比较检验法。
良性胰腺囊性肿瘤患者或恶性胰腺囊性肿瘤患者的体液试样中的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助标志物的浓度,可以在每次测定患有胰腺囊性肿瘤的受检体的体液试样中的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助标志物的浓度时测定,也可以利用预先测定好的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助标志物的浓度。特别是如果预先测定良性胰腺囊性肿瘤患者和恶性胰腺囊性肿瘤患者的各种身体的条件下的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助标志物的浓度,将其值输入计算机而数据库化,则可以通过将受检体的身体的条件输入该计算机,从而即时地利用具有最适合与该受检体比较的身体条件的良性胰腺囊性肿瘤患者或恶性胰腺囊性肿瘤患者的恶性胰腺囊性肿瘤判定辅助标志物的浓度。
本说明书中,所谓“AUC(area under the curve:曲线下面积)值”,是指受试者工作特征曲线(ROC曲线)下的面积,成为测量用于将患者分为阳性组和阴性组的预测、判定、检测或诊断的方法的准确度的指标。在这些曲线中,对于从1减去使标志物的截止值从小的值向大的值变化时的、阳性患者中出现阳性的结果的概率(灵敏度)、和阴性患者中出现阴性的结果的概率(特异度)而得的值(假阳性率)进行作图。可以说AUC的值越高,诊断方法的准确度越高。
本说明书中,所谓“灵敏度”,是指(真阳性的数)/(真阳性的数+假阴性的数)的值。灵敏度越高,则越能够减少从胰腺囊性肿瘤患者遗漏恶性病况,有助于全面的恶性胰腺囊性肿瘤患者的筛选。
本说明书中,所谓“特异度”,是指(真阴性的数)/(真阴性的数+假阳性的数)。特异度越高,越能够防止由将良性胰腺囊性肿瘤患者误判为恶性胰腺囊性肿瘤患者造成的浪费的追加技术、治疗的实施,有助于患者的负担的减轻、医疗费的削减。
3.恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助用试剂盒
本发明中使用的所谓“恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助用试剂盒”,是指为了辅助胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定而直接或间接地利用的物质。本发明的试剂盒是用于在本发明的方法中使用的试剂盒,只要没有在下述特别记载、或者没有特别矛盾,则测定原理等的详细条件就与上述的1.和2.项中说明的条件同样。本发明的恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助用试剂盒,具体地是用于体外测定由受检体得到的体液试样中所包含的、作为在羧基末端包含序列号30所示的氨基酸序列的多肽的APOA2-AT蛋白质或/和作为在羧基末端包含序列号31所示的氨基酸序列的多肽的APOA2-ATQ蛋白质的量的试剂盒。
本发明的试剂盒只要能够检测由受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质,其方式就不特别限定,但例如,可以是包含APOA2蛋白质的变异体的抗体作为构成物的免疫测定用的试剂盒。作为免疫测定,可列举酶联免疫测定法(EIA)(例如,直接竞争ELISA、间接竞争ELISA、和夹心ELISA)、放射免疫测定(RIA)、胶乳凝集反应法、荧光免疫测定(FIA)、化学发光酶联免疫测定法(CLEIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、免疫比浊法(TIA)、和免疫层析法等。本发明的试剂盒特别优选制成夹心ELISA用试剂盒。
所述APOA2蛋白质的变异体的抗体具体为包含抗APOA2-AT末端抗体或/和抗APOA2-ATQ末端抗体或/和它们的结合性片段的抗体。在ELISA用试剂盒的方式中,抗APOA2-AT末端抗体或抗APOA2-ATQ末端抗体可以分别单独制成溶解于缓冲液中的状态的抗体溶液的状态,另外也可以制成溶解于缓冲液而冷冻或冷冻干燥的状态。另外,所述抗体可以制成固定化于微孔板、珠等固相表面的状态。或者,所述抗体可以被标记化。这种情况下,在包含抗APOA2-AT末端和抗APOA2-ATQ末端抗体两者的试剂盒中,两抗体优选进行各自不同的标记。包含所述抗体的缓冲液、固相表面优选进一步包含稳定剂(例如,白蛋白、糖类等)、保存剂(例如,叠氮化钠等)。
所述抗APOA2-ATQ末端抗体与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,优选为重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号4、5和6所示的氨基酸序列组成、或分别由序列号10、11和12所示的氨基酸序列组成,且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号7、8和9所示的氨基酸序列组成、或分别由序列号13、14和15所示的氨基酸序列的单克隆抗体。
所述抗APOA2-AT末端抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,优选为重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号33、34和35所示的氨基酸序列组成、分别由序列号39、40和41所示的氨基酸序列组成、或分别由序列号45、46和47所示的氨基酸序列组成,且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号36、37和38所示的氨基酸序列组成、分别由序列号42、43和44所示的氨基酸序列组成、或分别由序列号48、49和50所示的氨基酸序列的单克隆抗体。
作为ELISA用试剂盒的其他构成物,可以进一步包含为了检测由受检体得到的体液试样中的APOA2-AT或/和APOA2-ATQ所需的抗体、试剂、工具等。作为具体例,可列举包含抗APOA2非末端抗体的试液、洗涤液、使用酶标记的情况下包含酶底物的试液等。例如,在将所述抗APOA2-AT末端抗体或/和抗APOA2-ATQ末端抗体固定化于固相的情况下,抗APOA2非末端抗体优选进行标记化,另外,标记化抗APOA2非末端抗体优选以溶解于缓冲液的抗体溶液作为状态。
所述抗APOA2非末端抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质或由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域以外的氨基酸序列特异性地结合,优选为重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号16、17和18所示的氨基酸序列组成、或分别由序列号22、23和24所示的氨基酸序列组成,且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号19、20和21所示的氨基酸序列组成、或分别由序列号25、26和27所示的氨基酸序列组成的单克隆抗体。
本发明的试剂盒不限于ELISA用试剂盒,如上所述,也可以是其他方式。在ELISA和其他方式中,试剂盒所需的构成物对于本领域技术人员来说都是公知的。
实施例
通过以下的实施例更具体地说明本发明。但本发明不受该实施例限制。
(实施例1)特异性地识别APOA2-AT蛋白质的C末端区域的单克隆抗体的制作
(a)产生识别APOA2-AT蛋白质的C末端区域的抗体的细胞的制作
由作为APOA2-AT蛋白质的C末端区域的序列的序列号28所示的氨基酸序列组成的肽对水为难溶性,抗原性也低,因此合成了通过在N末端侧添加3个精氨酸残基而赋予亲水性、进一步在其N末端添加了半胱氨酸残基的AT肽。作为特异性评价用,合成了在由作为APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的序列的序列号29所示的氨基酸序列组成的肽的N末端侧添加了3个精氨酸残基的ATQ肽。
接着,以在所述AT肽的半胱氨酸残基上结合了KLH蛋白质的产物作为免疫原,以每1只50至100μg免疫原的方式与Sigma Adjuvant System(シグマ社制)混合,对小鼠(BALB/c)以2周间隔进行5次腹腔内施与。
在免疫期间从尾静脉经时地进行采血,使用所得的血浆,确认了小鼠血中抗体效价。将使所述肽结合于牛血清白蛋白而得的蛋白质用PBS溶液制备成3μg/mL,然后在免疫板MaxiSoap(Thermo-Fisher Scientific社制)的孔中各加入50μL,固相化一晚。丢弃所述溶液,添加Blocking One(ナカライテスク社制)250μL在室温进行孵育1小时以上。丢弃孔内的溶液之后,添加PBS-T(0.05%TWEEN(注册商标)20、PBS)进行洗涤,添加用PBS-T稀释的所述小鼠血清50μL并在室温反应2小时。将孔内的溶液丢弃之后,利用PBS-T进行洗涤,添加用PBS-T稀释了5000倍的Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP(GEHealthcare社(现Cytiva社)制)50μL,在室温使其反应1小时。用PBS-T洗涤之后,添加TMB溶液(KPL社制)50μL进行酶反应。然后,添加2N硫酸溶液50μL使反应停止,测定450nm的吸光度。其结果能够确认抗体效价的上升,因此摘下淋巴结,进行向免疫缺陷小鼠(C.B.17/SCID)的肾皮下的移植。实施3次加强(boost),确认了血中抗体效价的上升之后,摘下脾脏并分离产生抗体的细胞。
(b)由小鼠的产生抗体的细胞的回收和细胞融合
在RPMI1640培养基中将产生抗体的细胞洗涤2次之后,与Sp2/0(小鼠骨髓瘤)细胞混合,使用PEG1500(Roche Diagnostics社制)进行融合反应。接着,用HAT培养基培养约1周,进行克隆化。
(c)产生识别APOA2-AT蛋白质的C末端区域的抗体的杂交瘤的筛选
接着,使用经HAT培养基选择的杂交瘤的培养上清,以针对所述AT肽的结合活性和针对所述ATQ肽的结合活性的差异作为指标,进行特异性地识别APOA2-AT蛋白质的C末端区域的抗体的筛选。将结合了AT肽的牛血清白蛋白、或结合了ATQ肽的牛血清白蛋白用PBS溶液制备成3μg/mL,然后在免疫板MaxiSoap的孔添加各50μL,固相化一晚。然后与所述(a)同样地用ELISA法进行筛选,结果获得了仅与AT肽特异性地反应的克隆4C6-1、5D9-3、和6B4-2的3种杂交瘤。图1中显示克隆4C6-1、5D9-3、和6B4-2对APOA2-AT肽和APOA2-ATQ肽的结合活性。
编码单克隆抗体的基因的序列分析的结果表明,4C6-1的CDR序列是序列号33~38所示的氨基酸序列,5D9-3的CDR序列是序列号39~44所示的氨基酸序列,6B4-2的CDR序列是序列号45~50所示的氨基酸序列。
(实施例2)利用夹心ELISA法的APOA2-AT蛋白质的检测
使用实施例1中获得的单克隆抗体4C6-1、5D9-3、6B4-2、抗APOA2-AT末端多克隆抗体和抗APOA2非末端单克隆抗体MAB1,进行利用夹心ELISA的APOA2-AT蛋白质的检测。
本研究中,抗APOA2-AT末端抗体的POD标记化使用PEROXIDASE LABELING KIT-SH(同仁化学社制)进行,详细按照附带的方案。将抗APOA2非末端抗体用PBS溶液制备成4μg/mL,然后在免疫板MaxiSoap的孔中各添加100μL,固相化一晚。第二天,丢弃所述溶液,添加PBS-T400μL进行洗涤,添加孵育缓冲液溶液(1%BSA、0.05%TWEEN20、PBS)400μL在4℃静置一晚。然后,丢弃所述溶液,制成抗体固相化板。接着使用稀释液进行了连续稀释的APOA2-AT蛋白质在各孔各添加100μL,使其在室温反应1小时。然后,丢弃孔内的溶液之后,利用PBS-T进行洗涤,添加经稀释液稀释后的抗APOA2-AT末端抗体的POD标记体100μL,使其在室温反应1小时。利用PBS-T进行洗涤之后,添加TMB溶液100μL进行酶反应。最后添加2N硫酸溶液100μL使反应停止,测定450nm的吸光度。
图2显示通过使用了抗APOA2非末端单克隆抗体MAB1和抗APOA2-AT末端单克隆抗体或抗APOA2-AT末端多克隆抗体的夹心ELISA得到的各浓度的APOA2-AT蛋白质的检测结果。如图2所示,吸光度APOA2-AT蛋白质的浓度依赖性地增加。由此显示,能够使用ELISA来检测APOA2AT蛋白质的浓度变化。
在以下的实施例、比较例中,使用由作为胰腺囊性肿瘤的一种的胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)患者得到的血浆,对于利用APOA2-AT蛋白质、APOA2-ATQ蛋白质和CA19-9的恶性胰腺囊性肿瘤组与良性胰腺囊性肿瘤组的判定方法的性能进行验证。
(实施例3)使用了2种APOA2变异体的恶性胰腺囊性肿瘤组的判定
(i)IPMN患者的血浆样本
以获得知情同意而收集得良性IPMN患者15名、恶性IPMN患者7名的血浆为对象,通过ELISA法测定APOA2-AT蛋白质、APOA2-ATQ蛋白质的浓度。
(ii)APOA2-AT蛋白质的量的测定
血浆中APOA2-AT蛋白质的量的测定以所述血浆为对象,通过使用抗APOA2-AT末端多克隆抗体和所述抗APOA2非末端单克隆抗体MAB1的POD标记体的夹心ELISA法来进行。抗APOA2非末端单克隆抗体的POD标记化使用PEROXIDASE LABELING KIT-SH进行,详细按照附带的方案。将抗APOA2-AT末端多克隆抗体用PBS溶液制备成2μg/mL之后,在免疫板MaxiSoap(NUNC社制)的孔中加入各100μL,固相化一晚。第二天,丢弃所述溶液,添加PBS-T(0.05%TWEEN20、PBS)400μL并洗涤,添加孵育缓冲液(1%BSA、0.05%TWEEN20、PBS)溶液400μL在室温静置1小时。然后,丢弃所述溶液,制成抗体固相化板。接着,将使用稀释液稀释后的血浆在各孔中添加各100μL,使其在室温反应1小时。此时,血浆的稀释倍率为10000倍。丢弃孔内的抗原溶液之后,利用PBS-T进行洗涤,添加经稀释液稀释为0.2μg/mL的所述抗APOA2非末端多克隆抗体的POD标记体100μL,使其在室温反应1小时。利用PBS-T(ピアス社制(现Thermo-Fisher Scientific社))进行洗涤之后,添加TMB溶液100μL进行酶反应,添加0.5N硫酸溶液100μL使反应停止,测定450nm的吸光度。对所得的测定值,以重组型人来源蛋白质APOA2-AT蛋白质的抗原溶液作为标准品,计算出血中的蛋白质浓度。
(iii)APOA2-ATQ蛋白质的量的测定
血浆中APOA2-ATQ蛋白质的量的测定以与所述相同的血浆为对象,与所述APOA2-AT蛋白质的量的测定同样地,通过利用抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体7F2的POD标记体和所述抗APOA2非末端多克隆抗体的夹心ELISA法来进行。对于7F2抗体的POD标记化、和夹心ELISA也与所述同样地进行。对所得的测定值,以重组型人来源蛋白质APOA2-ATQ蛋白质的抗原溶液作为标准品,计算出血中的蛋白质浓度。
(iv)恶性胰腺囊性肿瘤组的判定
图4、图5是分别将各样本的APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质的测定值作为箱线图作图而得的结果,可知APOA2-AT蛋白质浓度的平均值与良性组相比在恶性组较低,APOA2-ATQ蛋白质浓度的平均值与良性组在恶性组较高。
表1中对于APOA2-AT蛋白质、和APOA2-ATQ蛋白质,显示由恶性IPMN患者7病例的各样本中的血浆中的浓度、和良性IPMN患者15病例或恶性IPMN患者7病例的血浆中浓度计算出的2种截止值。由良性IPMN患者15病例的血浆中浓度计算出的APOA2-AT蛋白质的截止值A,是设定成由良性IPMN患者血浆15样本的血浆中浓度的平均值减去0.5×SD后的值(39.7μg/ml)的。由恶性IPMN患者7病例的血浆中浓度计算出的APOA2-AT蛋白质的截止值B,是设定成由恶性IPMN患者血浆7样本的血浆中浓度的平均值加上0.5×SD后的值(57.9μg/ml)的。另外,由良性IPMN患者15病例的血浆中浓度计算出的APOA2-ATQ蛋白质的截止值A,是设定成在良性IPMN患者的平均值加上0.5×SD后的值(162.2μg/ml)的。由恶性IPMN患者7病例的血浆中浓度计算出的APOA2-ATQ蛋白质的截止值B,是设定成由恶性IPMN患者血浆7样本的血浆中浓度的平均值减去0.5×SD后的值(120.7μg/ml)的。
在使用由良性IPMN患者15病例的血浆中浓度计算出的截止值A的情况下,在利用APOA2-AT蛋白质的判定中,恶性IPMN 7病例之中6病例(恶性A、恶性C、恶性D、恶性E、恶性F、恶性G)低于截止值,正确地被判定为恶性,在利用APOA2-ATQ蛋白质的判定中,3病例(恶性A、恶性C、恶性D)超过截止值,被正确地判定为恶性。另外,在使用由恶性IPMN患者7病例的血浆中浓度计算出的截止值B的情况下,在利用APOA2-AT蛋白质的判定中,恶性IPMN 7病例之中6病例(恶性A、恶性C、恶性D、恶性E、恶性F、恶性G)低于截止值,正确地被判定为恶性,在利用APOA2-ATQ蛋白质的判定中,5病例(恶性A、恶性C、恶性D、恶性E、恶性F)超过截止值,正确地被判定为恶性。
(比较例1)利用了CA19-9的恶性胰腺囊性肿瘤组与良性胰腺囊性肿瘤组的判别
(i)IPMN患者的血浆样本
以实施例3中使用的良性IPMN患者15病例、恶性IPMN患者7病例为对象,通过ELISA法测定CA19-9的血浆中浓度。
(ii)利用了CA19-9的恶性胰腺囊性肿瘤组的判定
图3是将各样本的测定值作为箱线图作图的结果,可知CA19-9浓度的平均值在良性组与恶性组是同等的。表1中对于CA19-9,显示由恶性IPMN患者7病例的各样本中的血浆中的浓度、和良性IPMN患者15病例或恶性IPMN患者7病例的血浆中浓度计算出的2种截止值。截止值A是作为在良性IPMN患者的平均值加上0.5×SD后的值(25.3U/ml)设定的,截止值B是作为由恶性IPMN患者的平均值减去0.5×SD后的值(11.1U/ml)而设定的。
在使用由良性IPMN患者15病例的血浆中浓度计算出得截止值A的情况下,恶性IPMN 7例之中超过截止值、被判定为恶性的病例仅为2例(恶性C、恶性G)。另外,在使用由恶性IPMN患者7病例的血浆中浓度计算出的截止值B的情况下,恶性IPMN 7例之中超过截止值、被喷定位恶性的病例为4例(恶性B、恶性C、恶性F、恶性G)。
由以上的实施例3、比较例1的结果表明,APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质的任一者均能够比CA19-9高灵敏度地检测恶性胰腺囊性肿瘤。
表1
(比较例2)利用了CA19-9的恶性胰腺囊性肿瘤组与良性胰腺囊性肿瘤组的判别
按照比较例1,评价通过CA19-9得到的良性IPMN患者15病例与恶性IPMN患者7病例的判别性能。ROC分析的结果为AUC值=0.58,确认了判别性能低。
(实施例4)利用了血中的APOA2蛋白质变异体的恶性胰腺囊性肿瘤组与良性胰腺囊性肿瘤组的判别
按照实施例3,评价了通过血中的APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质的各自标志物得到的良性IPMN患者15病例与恶性IPMN患者7病例的判别性能。ROC分析的结果是,APOA2-AT蛋白质的判别性能为AUC值=0.762,APOA2-ATQ蛋白质的判别性能为AUC值=0.648,确认了与利用了所述CA19-9的判别法相比,能够实现高准确度的判别。
由以上的实施例和比较例的结果判明,利用了本发明的APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质的恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法在到目前为止困难的利用非侵袭的方法的良性胰腺囊性肿瘤与恶性胰腺囊性肿瘤的判别中是有用的。
产业可利用性
根据本发明,能够通过简易且非侵袭的方法辅助胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定,能够实现成为精查、治疗的对象的恶性胰腺囊性肿瘤的发现。本发明是能够在医疗领域、制药领域等广泛利用的发明。
本说明书中引用的所有出版物、专利以及专利申请直接通过引用而纳入本说明书。
序列表
<110> 东丽株式会社
国立研究开发法人国立癌症研究中心
<120> 恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法和判定辅助用试剂盒
<130> PH-9285-PCT
<150> JP 2021-049931
<151> 2021-03-24
<160> 50
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu Met Glu Lys Val Lys Ser Pro
20 25 30
Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln
35 40 45
Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu
50 55 60
Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala Thr
65 70 75
<210> 2
<211> 77
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu Met Glu Lys Val Lys Ser Pro
20 25 30
Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln
35 40 45
Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu
50 55 60
Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala Thr Gln
65 70 75
<210> 3
<211> 75
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu Met Glu Lys Val Lys Ser Pro
20 25 30
Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln
35 40 45
Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu
50 55 60
Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala
65 70 75
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 5
Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 6
Arg Tyr Gly Tyr Val Asp Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 7
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 8
Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 9
Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 10
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 11
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1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 12
Arg Asp Gly Ser Lys Tyr Lys Ile Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 13
Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 14
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 15
Gln Gln Phe Ser Val Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 16
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 17
Phe Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Arg Phe Asn
1 5 10 15
Asp
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 18
Arg Pro Tyr Asn Pro Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 19
Arg Ala Ser Gln Asp Thr Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 20
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 21
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 22
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 23
Phe Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Glu
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 24
Arg Thr Tyr Asn Pro Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 26
Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 27
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 28
Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala Thr
1 5 10 15
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 29
Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala Thr
1 5 10 15
Gln
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 30
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1 5
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 31
Thr Gln Pro Ala Thr Gln
1 5
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 32
Leu Gly Thr Gln Pro Ala
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 33
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 34
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asn Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 35
Gly Arg Gly Tyr Asp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 36
Thr Ala Ser Ser Ser Met Ser Ser Thr Tyr Leu His
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 37
Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 38
Gln Gln Gly Ser Arg Lys Pro Tyr Thr
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 39
Asn Phe Gly Met Asn
1 5
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 40
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Thr Ser Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 41
Gly Arg Gly Tyr Asp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 42
Thr Ala Ser Ser Ser Met Ser Ser Thr Tyr Leu His
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 43
Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 44
Gln Gln Gly Ser Arg Lys Pro Tyr Thr
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 45
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 46
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 47
Gly Arg Gly Tyr Asp Glu Gly Trp Leu Val Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 48
Ser Ser Ser Ser Ser Met Ser Ser Thr Tyr Leu His
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 49
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 50
Gln Gln Gly Ser Arg Lys Pro Phe Thr
1 5
Claims (14)
1.辅助患有胰腺囊性肿瘤的受检体中的恶性胰腺囊性肿瘤的判定的方法,该方法包括体外测定存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的量,基于其量来辅助受检体的胰腺囊性肿瘤是良性还是恶性的判定的工序,
所述APOA2-AT蛋白质是在羧基末端包含序列号30所示的氨基酸序列的多肽,
所述APOA2-ATQ蛋白质是在羧基末端包含序列号31所示的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1所述的方法,所述胰腺囊性肿瘤是胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)或粘液性囊性肿瘤(MCN)。
3.根据权利要求1或2所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量,少于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定。
4.根据权利要求3所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量少于截止值时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定,所述截止值基于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-AT蛋白质的量或存在于由已知的恶性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的试样中的APOA2-AT蛋白质的量设定的。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量,多于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定。
6.根据权利要求5所述的方法,在存在于由所述受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量多于截止值时,辅助胰腺囊性肿瘤为恶性的判定,所述截止值是基于存在于由已知的良性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量或存在于由已知的恶性的胰腺囊性肿瘤的受检体得到的试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量设定的。
7.根据权利要求1~6的任一项所述的方法,所述体液试样是血液、血浆或血清。
8.根据权利要求1~7的任一项所述的方法,所述受检体患有胰腺囊性肿瘤是通过影像学检查和/或下述工序(A)~(C)预先确定的:
(A)使用与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域特异性地结合的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与该羧基末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,测定试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量的第1工序;
(B)使用与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与该羧基末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体,测定试样中的APOA2-AT蛋白质的量的第2工序;
(C)对于将第1工序所得的APOA2-ATQ蛋白质的量的测定值和第2工序所得的APOA2-AT蛋白质的量的测定值输入预先设定好的判别式而得的判别值,与已知的健常体的判别值进行比较,从而用于确定是否患有胰腺囊性肿瘤的第3工序。
9.恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助用试剂盒,用于体外测定由受检体得到的体液试样中所包含的APOA2-AT蛋白质或/和APOA2-ATQ蛋白质的量,
所述APOA2-AT蛋白质是在羧基末端包含序列号30所示的氨基酸序列的多肽,
所述APOA2-ATQ蛋白质是在羧基末端包含序列号31所示的氨基酸序列的多肽。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,包含抗APOA2-AT末端抗体或其结合性片段、或/和抗APOA2-ATQ末端抗体或其结合性片段。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,所述抗APOA2-ATQ末端抗体或其结合性片段,是与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号4、5和6所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号10、11和12所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号7、8和9所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号13、14和15所示的氨基酸序列组成的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体或其结合性片段。
12.根据权利要求10或11所述的试剂盒,所述抗APOA2-AT末端抗体或其结合性片段是与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号33、34和35所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号39、40和41所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号45、46和47所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号36、37和38所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号42、43和44所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号48、49和50所示的氨基酸序列组成的抗APOA2-AT末端单克隆抗体或其结合性片段。
13.根据权利要求10~12的任一项所述的试剂盒,进一步包含抗APOA2非末端单克隆抗体或其结合性片段,该抗APOA2非末端单克隆抗体或其结合性片段是与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质或由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的羧基末端区域以外的氨基酸序列特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号16、17和18所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号22、23和24所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号19、20和21所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号25、26和27所示的氨基酸序列组成的抗APOA2非末端单克隆抗体或其结合性片段。
14.抗APOA2-AT末端单克隆抗体或其结合性片段,与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的羧基末端区域特异性地结合,重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号33、34和35所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号39、40和41所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号45、46和47所示的氨基酸序列组成,并且,轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号36、37和38所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号42、43和44所示的氨基酸序列组成,或分别由序列号48、49和50所示的氨基酸序列组成。
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