CN107407681B - 胰功能异常的检测方法和检测用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供对受试者的侵袭性低、且简便、精度高的胰外分泌功能异常的检测方法。提供包括体外测定来源于受试者的体液试样中的APOA2蛋白质的2种变异体、它们的突变体和/或它们的片段，基于其量来检测有无胰外分泌功能异常的方法，以及包含能与该蛋白质特异性地结合的抗体的胰外分泌功能异常的检测用试剂盒。

Description

胰功能异常的检测方法和检测用试剂盒

技术领域

本发明涉及以APOA2的2种同种型(APOA2-AT或APOA2-ATQ)作为胰外分泌功能异常的检测用标志物，通过测定其体液中的浓度来检测胰外分泌功能异常的方法。

本发明还涉及包含用于检测胰外分泌功能异常的能与上述蛋白质结合的物质的用于检测胰外分泌功能异常的试剂盒。

背景技术

胰是存在于胃的后部的长度15cm左右的器官，具有分泌包含用于将食物在肠道内消化所需的消化酶的胰液的作用(外分泌功能)、和分泌像胰岛素、胰高血糖素那样的糖代谢所需的激素的作用(内分泌功能)。

作为外分泌部分，胰中通有将胰液输送到十二指肠的多条胰管，这些胰管随着靠近十二指肠侧而逐渐合流，形成主胰管。主胰管在连接到十二指肠之前与总胆管合流，然后贯穿十二指肠壁，在称为十二指肠乳头的部分开口。

由胰所分泌的消化酶大多在腺泡细胞中作为不具有活性的前体产生，该前体通过像胃液中的胃蛋白酶、存在于小肠上皮的刷状缘中的肠激酶那样的肽酶的作用而被分解，从而变成活性型酶。例如，由胰分泌的前体酶糜蛋白酶原被胰蛋白酶、肠激酶转换为活性型酶糜蛋白酶。即，为了避免胰组织本身被作为强分解酶的胰酶消化，胰酶在胰中以不具有活性的状态存在。但是，如果由于胰管堵塞等而胰液在胰管内滞留，则有时胰酶在胰内从前体被转换为活性型。如果通过这样的机制而胰酶在胰内异常地活化，则胰自身受到自消化，引发胰腺炎。

胰外分泌功能检查是为了诊断慢性胰腺炎等胰疾病患者有无手术后的外分泌功能障碍和/或其程度而进行的，大致分为有管法和无管法。

有管法是经口插入管而回收十二指肠液来测定胰酶的活性的灵敏度、特异性高的胰外分泌功能检查法。但是，有检查是侵袭性的，需要复杂的技术，而且需要特别的检查装置，花费检查时间和成本的缺点。进而，在日本国内难以获得能施与人的检查用试剂，处于难以施行的状况。

另一方面，无管法是在饭后或经口施与胰酶底物后测定粪便、尿、血液、或呼气中存在的胰酶自身的活性、胰酶的代谢产物的量的检查法。例如，作为现在一般实施的胰功能检查法，已知经口施与由胰分泌的糜蛋白酶的合成底物BT-PABA(N-苯甲酰-L-酪氨酰对氨基苯甲酸，N-benzoyl L-tyrosyl P-aminobenzoic acid)，测定作为糜蛋白酶的分解产物的PABA (对氨基苯甲酸，P-aminobenzoic acid)的尿中浓度的PFD试验；经口施与由胰分泌的弹性蛋白酶的合成底物FDL(双月桂酸荧光素，Fluorescein dilaurate)，测定作为分解产物的荧光素(Fluorescein)的尿中排泄率或血中浓度的PLT试验；测定粪便中的糜蛋白酶量的粪便中糜蛋白酶试验；和进行粪便中的弹性蛋白酶的定量的粪便中弹性蛋白酶试验等。但是，由于任一方法灵敏度均低，因而不能检测到轻度的异常。此外还有需要饭后限制等检查前的处置，因此需要入院、需要较长的检查时间这样的缺点。其他无管法有对从胰脱离到血中的弹性蛋白酶1、胰淀粉酶等胰外分泌性酶进行定量的检查法。但是，利用胰淀粉酶的检查法虽然对鉴别急性胰腺炎等重度胰疾病有用，但由于发病后的异常值持续时间短至几天左右，而且灵敏度低，因此对胰外分泌功能异常的筛选无效。与此相对弹性蛋白酶1与胰淀粉酶相比血中半衰期比较长，异常值持续时间也持续2～4周左右，但已知在像慢性胰腺炎的失代偿期那样胰外分泌功能显著降低的胰外分泌功能不全中停留在健常者的基准值范围内，不是能够全面地检测胰外分泌功能异常的标志物(非专利文献1～3)。因此，现在期望开发对受试者的费用负担小、能得到高精度的结果的灵敏度高的胰外分泌功能的检查法。

APOA2(Apolipoprotein A2(载脂蛋白A2)或Apolipoprotein A-II(载脂蛋白A-II))蛋白质(GenBank登录号NP_001634.1)是构成血浆脂蛋白的载脂蛋白家族的一种。载脂蛋白迄今为止已知10种以上，它们的主要功能是脂蛋白的结构的稳定化、与脂蛋白代谢相关的酶的活化、作为针对细胞表面存在的脂蛋白受体的配体的作用等。APOA2蛋白质是在肝脏组织中作为包含信号肽的由100个氨基酸构成的前体合成的构成高密度脂蛋白 (HDL)的载脂蛋白的一种。存在于血液中的已被加工的成熟型APOA2蛋白质由77个氨基酸组成，氨基末端(N末端)具有谷氨酰胺残基(Q)，N末端起第76位具有苏氨酸残基(T)，并且第77位的羧基末端(C末端)具有谷氨酰胺残基(Q)。此外，报告了APOA2蛋白质中存在作为全长APOA2蛋白质的APOA2-ATQ蛋白质、作为缺失了C末端的谷氨酰胺残基(Q)的 APOA2蛋白质的APOA2-AT蛋白质、作为缺失了C末端的苏氨酸和谷氨酰胺残基(TQ)的APOA2蛋白质的APOA2-A蛋白质等质量不同的变异体 (非专利文献2)。

根据基于登录在蛋白质结构数据库(PDB；Protein Data Bank；http： //www.rcsb.org/pdb/home.do)的APOA2蛋白质的立体结构数据(PDB ID： 1L6L)的分析，认为APOA2蛋白质通过介由存在于N末端侧的半胱氨酸残基的二硫键(SS键)而形成二聚体。因此，已知APOA2蛋白质在血液中作为由上述3种变异体的组合产生的各种分子量的二聚体而存在。具体而言，已知由全长的APOA2-ATQ蛋白质组成的二聚体(APOA2-ATQ/ATQ 蛋白质二聚体)、APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的二聚体 (APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体)、由APOA2-AT蛋白质组成的二聚体 (APOA2-AT/AT蛋白质二聚体)、APOA2-AT蛋白质和APOA2-A蛋白质的二聚体(APOA2-AT/A蛋白质二聚体)、由APOA2-A蛋白质组成的二聚体(APOA2-A/A蛋白质二聚体)等。此外，除此以外，还已知APOA2蛋白质通过二硫键与APOD蛋白质、APOE蛋白质、APOA1-M蛋白质等其他蛋白质形成二聚体，或者作为单体而存在(非专利文献4、5)。

已知将胰癌患者与健常者相比较，上述各种APOA2蛋白质二聚体的血中浓度显著不同。特别是APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体，质量分析的结果作为具有分子量17253±9(m/z)的质量值的蛋白质被发现，已经明确与健常者相比在胰癌患者中减少，以及通过利用该蛋白质二聚体作为胰癌标志物，能够以高精度检测出胰癌(专利文献1和2、非专利文献6)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2006/098087号

专利文献2：日本特开2010-175452号公报

非专利文献

非专利文献1：丹藤等，2008年、临床消化器内科、第23卷、p513-517

非专利文献2：出居等、2008年、モダンメディア(现代传媒)、第54 卷、p180-185

非专利文献3：医学书院、2013年、臨床检查データブック(临床检查数据手册)、p147-149

非专利文献4：Blanco-Vaca F.等，2001年，J Lipid Res，第42卷， p.1727-1739

非专利文献5：Rocco AG.等，2006年，Biophys J，第91卷，p.3043-3049

非专利文献6：Honda K.等，2012年，PLoS One，第7卷，e46908

发明内容

发明所要解决的课题

利用有管法的胰外分泌功能的检查虽然灵敏度、特异性高，但侵袭性高，不适合诊查等中的筛选检查。此外，作为无管法的测定粪便、尿中的胰消化酶的活性的胰外分泌功能检查有易受其他消化器疾病的影响、灵敏度也低这样的问题。进而，还存在检测淀粉酶等血液中存在的胰酶的简便方法，但淀粉酶的浓度上升是伴随炎症等的一过性现象，灵敏度低，因此不能高精度地评价胰外分泌功能异常。

因此，本发明的课题是提供通过受试者的负担少、侵袭性低的测定血中的蛋白质的浓度的简便检查法来检查胰外分泌功能的异常的高精度的方法。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题，本发明者们首先对于APOA2蛋白质变异体的中的APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质2种进行了定量检测。并且，在具有胰外分泌功能异常的受试体与健常体中比较了它们的量。其结果发现，在健常体与具有胰外分泌功能异常的受试体之间，血中的两蛋白质的量不同。进而发现，在胰外分泌功能异常中显示胰管内的胰液流通障碍的受试体中，与健常体相比APOA2-ATQ的血中浓度低；以及在胰外分泌功能异常中显示胰组织中的胰液产生障碍的受试体中，APOA2-ATQ的血中浓度为健常体的同程度以上，另一方面，APOA2-AT的血中浓度与健常体相比较低。

本发明基于上述见解，包含以下的发明。

(1)胰外分泌功能异常的检测方法，对受试体的体液中存在的 APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-AT蛋白质的量进行体外(in vitro)测定，基于该量来确定有无胰外分泌功能异常。

(2)根据(1)所述的胰外分泌功能异常的检测方法，所述APOA2-ATQ 蛋白质是由序列号1所示的氨基酸序列组成的多肽。

(3)根据(1)所述的胰外分泌功能异常的检测方法，所述APOA2-AT蛋白质是由序列号2所示的氨基酸序列组成的多肽。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的胰外分泌功能异常的检测方法，在受试体的APOA2-ATQ蛋白质的量与健常体的该量相比较少时，评价为受试体的胰有胰液流通障碍。

(5)根据(4)所述的胰外分泌功能异常的检测方法，所述受试体的 APOA2-ATQ蛋白质的量为健常体的二分之一以下。

(6)根据(1)～(3)的任一项所述的胰外分泌功能异常的检测方法，在受试体的APOA2-ATQ蛋白质的量与健常体的该量相比为同等以上、且受试体的APOA2-AT蛋白质的量与健常体的该量相比较少时，评价为受试体的胰有胰液产生障碍。

(7)根据(6)所述的胰外分泌功能异常的检测方法，所述受试体的 APOA2-AT蛋白质的量为健常体的二分之一以下。

(8)根据(1)～(7)的任一项所述的胰外分泌功能异常的检测方法，所述体液试样为血液。

(9)根据(1)～(8)的任一项所述的胰外分泌功能异常的检测方法，包括：

使用与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C 末端区域特异性地结合的APOA2-ATQ末端结合分子、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的APOA2非末端结合分子，来测定试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量的工序，或者

使用与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的C 末端区域特异性地结合的APOA2-AT末端结合分子、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的APOA2非末端结合分子，来测定试样中的 APOA2-AT蛋白质的量的工序。

(10)根据权利要求9所述的检测方法，所述APOA2-ATQ末端结合分子和APOA2-AT末端结合分子是抗体或核酸适配体。

(11)根据(10)所述的检测方法，所述APOA2-ATQ末端结合分子和 APOA2-AT末端结合分子分别为抗APOA2-ATQ末端抗体和抗 APOA2-AT末端抗体。

(12)胰外分泌功能异常的检测用试剂盒，包含抗APOA2-ATQ末端抗体、抗APOA2-AT末端抗体、和/或它们的化学修饰体。

(13)胰外分泌功能异常的检测用试剂盒，包含选自抗APOA2末端单克隆抗体或其片段、和抗APOA2非末端单克隆抗体或其片段中的1种以上单克隆抗体或其片段，

所述抗APOA2末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合，并且

重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号3、4和5、或9、10 和11所示的氨基酸序列组成，且

轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号6、7和8、或12、13 和14所示的氨基酸序列组成，

所述抗APOA2非末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质或由序列号2所示的氨基酸序列组成的 APOA2-AT蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸序列特异性地结合，并且

重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号15、16和17、或21、 22和23所示的氨基酸序列组成，且

轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号18、19和20、或24、 25和26所示的氨基酸序列组成。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2015-040580 号的公开内容。

发明的效果

根据本发明，能够容易且高可靠性地检测胰外分泌功能异常。仅通过测定受试体的体液试样中所含的APOA2蛋白质的2种同种型的浓度，就能够容易地判断该受试体是否有胰外分泌功能异常，并且如果有胰外分泌功能异常，也能够容易地判断该异常是胰液流通障碍还是产生障碍。

具体实施方式

1.胰外分泌功能异常检测用标志物

(概要)

本发明基于：在胰外分泌功能异常中，伴随胰液产生障碍的胰疾病患者血中的APOA2-AT蛋白质的量少于健常者，APOA2-ATQ蛋白质的量与健常者为同等或者多于健常者这样的新见解，以及伴随胰液流通障碍的胰疾病患者血中的APOA2-ATQ蛋白质的量少于健常者这样的新见解。

(构成)

本说明书中，“胰外分泌功能异常检测用标志物”是用于检测胰外分泌功能异常的生物学标志物(所谓生物标志物)，是指成为受试体的胰中有无外分泌功能异常的指标的物质。测定受试体的血液中的胰外分泌功能异常检测用标志物的量，以该测定值多于或少于健常体的测定值为指标，能够检测受试体的胰外分泌功能异常。

胰外分泌功能异常检测用标志物由APOA2蛋白质的2种变异体、即 APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质、或它们的片段构成。

本说明书中，“胰外分泌功能”是指包含胰的腺泡细胞所生产的消化酶的胰液从胰分泌到十二指肠的功能。“胰液”是从胰分泌到十二指肠的碱性消化液。胰液包含由导管部分泌的碳酸氢盐、和由腺泡细胞产生的碳水化合物分解酶、蛋白质分解酶等消化食物的多种消化酶(淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、羧肽酶等)。

此外，本说明书中“胰外分泌功能异常”是指从胰向十二指肠的胰液分泌降低的状态。胰外分泌功能异常包含由于胰管堵塞而胰液滞留在胰管内的“胰液流通障碍”、和腺泡细胞的胰液生产量降低的“胰液产生障碍”。

已知胰外分泌功能异常由慢性胰腺炎、胰肿瘤和胰石症等各种胰疾病的发病引起。

例如，慢性胰腺炎根据进展度分为代偿期、失代偿期、作为其中途过程的3个过渡期，但根据进展度发生不同的胰外分泌功能异常。在发病初期的代偿期，由于胰管狭窄、胰石而胰管堵塞，由此胰液的流动被阻碍。其结果胰管的内压上升，胰消化酶脱离到血中。这时期的胰外分泌功能异常显示伴随腹痛、背部痛的轻度症状。但是，由于胰依然保持相当的产生胰液的能力，因此能够通过用内窥镜治疗法除去狭窄、胰石来治疗恢复。另一方面，在失代偿期，胰管内滞留的胰酶被活化，其结果由于自消化而胰实质的毁坏进展。因此，胰液产生能力显著受到障碍，呈现胰外分泌功能不全。这时期的主要症状是食物消化不良，也有由于胰内分泌功能异常而合并胰性糖尿病(1型糖尿病)的症例。

慢性胰腺炎通过回声、CT、MRI等图像检查来诊断。如果有胰管内的胰石等特征性图像所见、胰实质的脱落和纤维化等特征性组织所见，则确定为慢性胰腺炎。在不能确认特征性组织所见的情况下，以反复的上腹部痛发作、血中/尿中胰酶值、BT-PABA检查值等作为指标进行诊断。

此外，从胰管上皮细胞发生的胰管癌也会造成胰外分泌功能异常。认为这是因为，由胰管癌造成的胰管狭窄引起随伴性胰腺炎。

进而，胰外分泌功能异常通过对胰疾病患者的治疗而被促进或者消解。作为对胰疾病患者的治疗，可列举饮食疗法等生活习惯改善、胰切除手术、放射线治疗、和化学疗法等。例如，轻度到中度的慢性胰腺炎的一般治疗法是戒酒、低脂肪饮食、和限制蛋白质摄取等饮食疗法、精神压力改善。根据情况，实施针对胰石的体外冲击波碎石疗法、内窥镜治疗、和针对胰管狭窄、胰假性囊肿的引流疗法。针对进一步进展的急剧恶化的慢性胰腺炎、急性胰腺炎，除了上述饮食疗法之外，还要在初期充分输液、以及施与抑制腹痛的镇痛剂和抑制胰酶的活性的蛋白质分解酶抑制剂。另一方面，在治疗包含胰管癌的胰肿瘤时，首先讨论通过胰切除进行治疗。特别是对于胰管癌，认为外科胰切除是唯一的根治疗法。但是，对于由于动脉浸润等的影响而不能切除的胰管癌，进行使用吉西他滨等的化学疗法、放射线疗法。根据这些治疗的结果，有的症例由于胰液产生细胞受损而引起胰液生产障碍，也有的症例相反由于胰管的堵塞被解除而胰液流通障碍恢复。胰疾病治疗后，评价治疗后的胰是否发生胰液产生障碍，确定施与胰消化酶补充药的必要性以及施与量。

本说明书中、“受试体”是成为胰外分泌功能异常的检测对象的样本，是脊椎动物、优选为哺乳动物、特别优选为人。本说明书中，在受试体是人的情况下，以后特别称为“受试者”。

本说明书中，“健常体”是至少没有胰外分泌功能异常的个体，优选为健康的个体。健常体要求与受试体是同一物种。例如，在提供给检测的受试体是人(受试者)的情况下，健常体也必须是人(在本说明书中，以下称为“健常者”)。健常体的身体条件优选与受试体相同或近似。所谓身体条件，例如在人的情况下，是人种、性别、年龄、身高、体重等。

本说明书中，“APOA2蛋白质”，是指各物种APOA2蛋白质，但优选来自人的APOA2蛋白质(GenBank登录号No.NP_001634.1)。具体而言，包含由序列号1或2所示的氨基酸序列组成的来自人的野生型APOA2蛋白质变异体、它们的天然突变体及它们的片段。

本说明书中，上述“APOA2蛋白质(的)变异体”是指能够存在于人或动物的血液(包含血浆、血清)、或其他体液中的APOA2蛋白质的不同的分子形态。例如，是在APOA2蛋白质中C末端区域的结构不同的APOA2 蛋白质或它们的天然突变体。具体而言，APOA2蛋白质变异体例如，例如，由上述序列号1所示的氨基酸序列组成的C末端区域的氨基酸序列以 ATQ终止的APOA2-ATQ蛋白质、由上述序列号2所示的氨基酸序列组成的C末端区域的氨基酸序列以AT终止的APOA2-AT蛋白质、和C末端区域的氨基酸序列以A终止的APOA2-A蛋白质等APOA2蛋白质变异体。

本说明书中，“天然突变体”是指自然界中存在的突变体，例如，是指在上述序列号1、2或3所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或多个的氨基酸的突变体，与上述氨基酸序列具有90％以上、92％以上或 94％以上、优选为95％以上或96％以上、更优选为97％以上、更优选为 98％以上或99％以上的氨基酸同一性的突变体。“氨基酸同一性”是指将两段氨基酸序列以获得最大的一致度的方式根据需要导入间隙而进行排列 (比对)时，相对于一段氨基酸序列的全部氨基酸残基数(也包含间隙数)，另一段氨基酸序列的相同氨基酸残基数的比例(％)。“多个”是指2～10的整数，例如，2～7、2～6、2～5、2～4、2～3的整数。作为天然突变体的具体例，可举出基于SNP(单核苷酸多态性，Single NucleotidePolymorphism)等多态性的突变体、剪接突变体(剪接变异体)等。此外，上述替换优选为保守的氨基酸替换。这是因为如果是保守的氨基酸替换，则能够具有与具有上述氨基酸序列的APOA2蛋白质实质上同等的结构或性质。保守的氨基酸是指分类在相同的氨基酸组的氨基酸彼此的关系。对于上述氨基酸组，已知非极性氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨酸)、极性氨基酸组(除了非极性氨基酸以外的氨基酸)、带电氨基酸组(酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸) 和碱性氨基酸组(精氨酸、组氨酸、赖氨酸))、非带电氨基酸组(除了带电氨基酸以外的氨基酸)、芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)、支链氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)以及脂肪族氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)等。

上述“它们的片段”是指包含APOA2蛋白质的各种变异体及它们的天然突变体的C末端区域的APOA2蛋白质变异体及其突变体的片段。具体而言，是指APOA2蛋白质的各种变异体及其突变体的蛋白酶消化物等。

2.抗APOA2抗体及其片段

2-1.抗APOA2抗体

本发明中使用的抗APOA2抗体包含抗APOA2末端抗体(包含抗 APOA2-ATQ末端抗体和抗APOA2-AT末端抗体)、和抗APOA2非末端抗体。以下对于各抗体进行说明。

(1)抗APOA2-ATQ末端抗体

“抗APOA2-ATQ末端抗体”是抗APOA2末端抗体的一种，是指能够特异性地识别并结合APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域中存在的表位的抗体或其片段。

本说明书中，“C末端区域(羧基末端区域)”是指氨基酸序列中包含C 末端的氨基酸及其周围连续的几个氨基酸的由6～25个氨基酸、优选为8～ 20个氨基酸或10～17个氨基酸组成的区域。

本说明书中，“特异性地识别并结合”是指与其他APOA2蛋白质变异体没有交差反应性或者交差反应性极弱，因而对其他APOA2蛋白质变异体不能识别也不能结合、或者几乎不能识别也不能结合。具体而言，是指对APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合，但是对APOA2-AT 蛋白质的C末端区域和APOA2-A蛋白质的C末端区域不显示结合的抗体。

(2)抗APOA2-AT末端抗体

“抗APOA2-AT末端抗体”是指能够特异性地识别并结合APOA2-AT 蛋白质的C末端区域中存在的表位的抗体或其片段。具体而言，是指对 APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合，但是对APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域和APOA2-A蛋白质等的C末端区域不显示结合的抗体。

(3)抗APOA2非末端抗体

“抗APOA2非末端抗体”是指识别并结合在APOA2蛋白质变异体的全长氨基酸序列中除了上述C末端区域以外的区域中存在的表位的抗 APOA2抗体。即，抗APOA2非末端抗体、与抗APOA2-ATQ末端抗体或抗APOA2-AT末端抗体各自识别的表位完全不同。

另外，抗APOA2非末端抗体虽然称为“非末端”抗体，但这是相对于抗APOA2末端抗体的方便的名称。因此，只要是除了C末端区域以外的区域所存在的表位就无特别限定，抗APOA2非末端抗体也可以包含识别、结合N末端中存在的表位的抗体。

本发明中使用的抗APOA2非末端抗体优选为，在比较针对具有某个特定的C末端序列的APOA2蛋白质的结合活性、和针对具有与该APOA2 蛋白质不同的C末端序列的APOA2蛋白质的结合活性的情况下，两者的结合活性大致相同，且不阻碍上述抗APOA2末端抗体对C末端区域的结合的抗体。即，本发明中使用的抗APOA2非末端抗体优选为无变异体特异性的抗体。具体而言，可举出例如，与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸序列结合的“抗 APOA2-ATQ非末端抗体”、和与由序列号2所示的氨基酸序列组成的 APOA2-AT蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸序列结合的“抗APOA2-AT非末端抗体”对APOA2蛋白质具有同等的结合活性，而且两种非末端抗体均不阻碍抗APOA2-ATQ末端抗体、抗APOA2-AT末端抗体与APOA2蛋白质的C末端区域结合。

2-2.抗体的种类

(1)单克隆抗体

抗APOA2-ATQ末端抗体、抗APOA2-AT末端抗体、和抗APOA2 非末端抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体或其片段中的任一种。为了能够大量生产、以及为了获得均质的效果，优选单克隆抗体。

本说明书中使用的“单克隆抗体”是指由单一的免疫球蛋白组成的抗体、或包含其框架区(Frame work region：以下称为“FR”)和互补决定区 (Complementaritydetermining region：以下称为“CDR”)、且能够特异性地识别并结合特定的抗原(表位)的抗体。

典型的免疫球蛋白分子是作为被称为重链和轻链的2条多肽链一组通过二硫键2组相互连接而成的四聚体而构成的。重链包含N末端侧的重链可变区(H链V区：以下称为“VH”)和C末端侧的重链恒定区(H链C区：以下称为“CH”)，轻链包含N末端侧的轻链可变区(L链V区：以下称为“VL”)和C末端侧的轻链恒定区(L链C区：以下称为“CL”)。其中， VH和VL在与抗体的结合特异性相关方面特别重要。该VH和VL均由约110个的氨基酸残基组成，其内部具有与抗原的结合特异性直接相关的 3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)、和作为可变区的骨架结构发挥功能的 4个FR(FR1、FR2、FR3、FR4)。已知CDR形成与抗原分子互补的立体结构、决定抗体的特异性(E.A.Kabat et al，1991，Sequences of proteins of immunologicalinterest，Vol.1，eds.5，NIH publication)。恒定区的氨基酸序列在种内抗体间几乎恒定，与此相对，CDR的氨基酸序列在各抗体间变异性高，因此，也称为超可变区(Hyper variableregion)。在可变区中，上述CDR和FR从N末端至C末端方向以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排列。在免疫球蛋白分子内，VL和VH通过相对地形成二聚体而形成抗原结合部位。免疫球蛋白已知有IgG、IgM、IgA、IgE 和IgD各类，本发明中使用的抗体可以是任一类。优选为IgG。

本发明中使用的抗APOA2-ATQ末端抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合，但与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质不显示结合性。作为这样的抗体的具体例子，可举出例如，后述实施例1所记载的用抗体克隆名“7F2”和“6G2”表示的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体克隆等。对于7F2克隆，重链中的CDR1由序列号3所示的氨基酸序列组成、CDR2 由序列号4所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号5所示的氨基酸序列组成，并且轻链中的CDR1由序列号6所示的氨基酸序列组成、CDR2 由序列号7所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号8所示的氨基酸序列组成。此外，对于6G2克隆，重链中的CDR1由序列号9所示的氨基酸序列组成、CDR2由序列号10所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号11所示的氨基酸序列组成，并且轻链中的CDR1由序列号12所示的氨基酸序列组成、CDR2由序列号13所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号14所示的氨基酸序列组成。除此以外，也可以是显示同样的结合性的抗APOA2-ATQ末端多克隆抗体。抗APOA2-ATQ末端抗体也可以利用市售的抗体。

本发明中使用的抗APOA2-AT末端抗体与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合，但与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质不显示结合性。可列举例如，后述的实施例中使用的抗APOA2-AT末端多克隆抗体、显示与其同样的结合性的抗APOA2-AT末端单克隆抗体。抗APOA2-AT末端抗体也可以利用市售的抗体。

本发明中使用的抗APOA2非末端抗体，优选在比较针对由序列号1 或2所示的氨基酸序列组成的APOA2蛋白质变异体(即，APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)的结合活性的情况下，结合活性为同等的抗体。作为具体的例子，可举出用抗体克隆名“MAB1”和“MAB2”表示的抗 APOA2单克隆抗体克隆等。对于MAB1克隆，重链中的CDR1由序列号 15所示的氨基酸序列组成、CDR2由序列号16所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号17所示的氨基酸序列组成，并且轻链中的CDR1由序列号18所示的氨基酸序列组成、CDR2由序列号19所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号20所示的氨基酸序列组成。此外，对于MAB2克隆，重链中的CDR1由序列号21所示的氨基酸序列组成、CDR2由序列号22所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号23所示的氨基酸序列组成，并且轻链中的CDR1由序列号24所示的氨基酸序列组成、CDR2由序列号25所示的氨基酸序列组成、且CDR3由序列号26所示的氨基酸序列组成。除此以外，可列举后述的实施例中使用的抗APOA2非末端多克隆抗体。抗APOA2非末端抗体也可以利用市售的抗体。

(2)抗体片段

上述“多克隆抗体和单克隆抗体或其片段”中的“其片段”是多克隆抗体和单克隆抗体的部分片段(抗体片段)，是指具有与该抗体所具有的抗原特异性地结合活性实质上同等的活性的多肽链或其复合物。例如，是指包含至少1个抗原结合部位的抗体部分，即，具有至少1组的VL和VH 的多肽链或其复合物。作为具体例，可举出将免疫球蛋白用各种肽酶切断而产生的众多带有充分特征的抗体片段等。作为更具体的例子，可举出Fab、 F(ab’)₂、Fab’等。Fab是利用木瓜蛋白酶将IgG分子在铰链部的二硫键的 N末端侧切断而产生的片段，由包含构成VH和CH的3个结构域(CH1、 CH2、CH3)中邻近VH的CH1的多肽、和轻链构成。F(ab’)₂是利用胃蛋白酶将IgG分子在铰链部的二硫键的C末端侧切断而产生的Fab’的二聚体。Fab’比Fab H链长出了相当于包含铰链部的部分，但实质上与Fab具有同等的结构(Fundamental Immunology，Paul ed.，3d ed.，1993)。Fab’可以通过在温和的条件下将F(ab’)₂还原，切断铰链区域的二硫键而获得。这些抗体片段均包含抗原结合部位，具有与抗原(即在本说明书中为 APOA2蛋白质的特定的变异体)特异性地结合的能力。进而，本发明的抗体片段包含利用噬菌体展示库鉴定的(例如，参照McCafferty et al.，1990， Nature，Vol.348，552-554)、具有抗原结合能力的抗体片段。另外，还可以参照例如Kuby，J.，Immunology，3rd Ed.，1998，W.H.Freeman&Co.， New York。

(3)合成抗体

本发明中使用的抗体可以化学合成，或通过利用重组DNA法来合成。可举出例如，利用重组DNA法新合成的合成抗体。具体而言，虽不限定，但可以是经由具有适当长度和序列的连接肽等使本发明中使用的单克隆抗体的一个以上的VL和一个以上的VH人工连接而成的单体多肽分子或其多聚体多肽。作为这样的多肽的例子，可举出单链Fv(scFv：singlechain Fragment of variable region，可变区的单链片段)(参照Pierce catalog andHandbook，1994-1995，Pierce Chemical co.，Rockford，IL)、双价抗体，三价抗体(triabody)或四价抗体(tetrabody)等。在免疫球蛋白分子中，VL和VH通常位于不同的多肽链(L链和H链)上。单链Fv是将这些可变区通过充分长度的柔软性接头连接，在1条多肽链中具有包含了VL 和VH的结构的合成抗体。在单链Fv内，两可变区可以相互自组装而形成1个功能性的抗原结合部位。单链Fv可以通过将编码它的重组DNA利用公知技术插入到噬菌体基因组、质粒等载体中使其表达而获得。双价抗体是具有以单链Fv的二聚体结构为基础的结构的合成抗体(Holliger et al， 1993，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：6444-6448)。例如，在上述接头的长度短于约12个氨基酸残基的情况下，单链Fv内的2个可变部位在立体结构上不能自组装，因而不能形成功能性的抗原结合部位。但是，通过形成双价抗体，即，通过使2条单链Fv相互作用，从而一条Fv链的VL能够与另一条Fv链的VH组装，能够在整体上形成2个功能性的抗原结合部位(Marvin et al，2005，ActaPharmacol.Sin.，26：649-658)。进而，通过在单链Fv的C末端添加半胱氨酸残基，从而2条Fv链能够彼此形成二硫键，也能够形成稳定的双价抗体(Alafsen et al，2004，Prot.Engr.Des.Sel.， 17：21-27)。这样，双价抗体是二价的抗体片段，但各个抗原结合部位不需要与同一表位结合，可以识别不同的表位，具有特异性地结合的双特异性。三价抗体和四价抗体与双价抗体同样，具有以单链Fv结构为基础的其三聚体结构和四聚体结构。分别是三价和四价的抗体片段，也可以是多特异性抗体。

(4)修饰抗体

本发明中使用的抗APOA2抗体或其片段可以修饰。这里所说的修饰包括在抗APOA2抗体或其片段具有与APOA2蛋白质特异性地结合的活性方面必要的功能上的修饰(例如，糖基化)、和在检测本发明的抗体或其片段方面必要的标记中的任一种。上述抗体标记可举出例如，荧光色素 (FITC、罗丹明、德州红(Texas Red)、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如，PE、APC、GFP)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或利用生物素或(链霉)亲和素的标记。此外，上述抗体的糖基化可以为了调节抗体对抗原的亲和性而改变。这样的改变可以通过例如，改变抗体序列内的一个以上糖基化部位而实现。如果更具体地说明，则例如，通过向构成FR内一个以上糖基化部位的氨基酸序列中导入一个以上的氨基酸替换而除去该糖基化部位，从而可以使该部位的糖基化丧失。这样的脱糖基化在增加抗体对抗原的亲和性方面是有效的(美国专利第5714350号和美国专利第6350861号)。

2-3.抗APOA2抗体的制作

2-3-1.免疫原的制备

在制作本发明中使用的抗APOA2抗体时，首先制备作为免疫原(抗原) 的APOA2蛋白质或其片段。

(抗APOA2末端抗体用免疫原的制作)

在制作抗APOA2末端抗体时，作为免疫原需要各APOA2蛋白质的变异体。

抗原用APOA2蛋白质变异体只要包含具有序列号1或2的任一项所示的氨基酸序列的APOA2蛋白质的C末端区域的连续6个氨基酸以上的氨基酸序列，就不特别限定。还可以使用例如来源于天然型APOA2蛋白质、重组型APOA2蛋白质、或合成APOA2蛋白质的任一APOA2蛋白质的变异体。APOA2蛋白质的变异体可以利用序列号1或2的氨基酸序列信息，通过本技术领域中公知的方法，例如固相肽合成法等来合成。例如，可以通过以下的方法制备。

天然型APOA2蛋白质可以从以血液(包含血清和血浆)这样的体液为代表的生物试样、或从培养细胞的培养上清中，利用公知的蛋白质分离/ 纯化技术，例如，凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析来回收，从而获得。

重组型APOA2蛋白质可以在导入了编码该蛋白质的DNA的微生物内、昆虫细胞内或动物细胞内表达，然后从该细胞中利用公知的蛋白质分离/ 纯化技术来回收，从而获得。另外，关于重组型APOA2蛋白质的具体的制备方法在后面叙述。

合成APOA2蛋白质，例如，可以利用公开的APOA2蛋白质的氨基酸序列信息，通过本技术领域中公知的方法，例如，固相肽合成法等来合成，从而获得。可以将该合成APOA2蛋白质可以连接于KLH(钥孔血蓝蛋白)、OVA(卵清白蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)等载体蛋白质。

在以APOA2蛋白质变异体的片段作为免疫原的情况下，也可以使用天然型APOA2蛋白质片段、重组型APOA2蛋白质片段或合成APOA2 蛋白质片段中的任一种。例如，作为APOA2蛋白质片段，可以使用在序列号1或2所示的氨基酸序列中，包含包括C末端在内的6个以上、优选为10个氨基酸以上、优选为18个氨基酸以上、更优选为30个氨基酸以上的连续氨基酸残基的寡肽或多肽作为抗原。例如，可以使用包含序列号27 或28所示的氨基酸序列的肽。

在使用天然型APOA2蛋白质的片段作为免疫原的情况下，对纯化的 APOA2蛋白质用胰蛋白酶等适当的蛋白酶进行处理，然后用反相柱将峰进行分离分级。接着，利用质量分析器确定各峰所含的肽的氨基酸序列，在包含由序列号1或2所示的氨基酸序列组成的APOA2蛋白质的C末端区域的连续6个氨基酸以上的序列作为部分序列的情况下，使用该肽作为免疫原即可。

在使用重组型APOA2蛋白质的片段作为免疫原的情况下，将编码在由序列号1或2所示的氨基酸序列组成的APOA2蛋白质中由包含C末端氨基酸残基在内的连续6个氨基酸以上的部分序列组成的肽(C末端片段) 的DNA序列插入到表达用载体中。接着，将该表达用载体导入各种细胞中，使所编码的C末端片段表达。最后，从表达后的细胞中按照常规方法提取C末端片段。使用所得的C末端片段作为免疫原即可。

(抗APOA2非末端抗体用免疫原的制作)

制作抗APOA2非末端抗体时，作为免疫原也需要各APOA2蛋白质的任一变异体。基本的制备方法可以与上述抗APOA2末端抗体的制作方法相同。但是，APOA2蛋白质的能够作为免疫原使用的区域，使用与作为在抗APOA2末端抗体的制作中使用的免疫原的区域不同的区域。即，只要使用APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的区域的全部或一部分作为免疫原即可。制作抗APOA2非末端抗体时，也可以使用包含APOA2 蛋白质的除了C末端区域以外的区域的氨基酸残基的寡肽或多肽作为抗原。制作抗APOA2非末端抗体按照与制作抗APOA2末端抗体时同样的步骤进行即可。

(重组型APOA2蛋白质的制备)

以下对于包含序列号1或2所示的氨基酸序列的重组型APOA2蛋白质(重组型APOA2蛋白质变异体)的制备进行详述。

(a)编码重组型APOA2蛋白质变异体的多核苷酸的制备

用于APOA2蛋白质的各种变异体的表达的载体，可以使用能够在宿主微生物中自主增殖的噬菌体或质粒。例如，作为质粒，可举出源自大肠菌的质粒(pET30a、pGEX6p、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、源自枯草菌的质粒(pUB110、pTP5等)、源自酵母的质粒(YEp13、YEp24、 YCp50等)。此外，作为噬菌体，可举出λ噬菌体(λgt11、λZAP等)。进而，可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。

为了对上述载体插入编码APOA2蛋白质变异体的多核苷酸，例如，存在将纯化了的该多核苷酸用适当的限制酶切断，利用DNA连接酶等连接在已经用与其对应的限制酶切断的载体内部的方法。

(b)APOA2蛋白质变异体表达载体向宿主内的导入

将所得的表达APOA2蛋白质变异体的载体导入宿主中，获得表达 APOA2蛋白质变异体的转化体(变异体表达转化体)。关于使用的宿主，只要是适合所使用的载体、能够表达APOA2蛋白质变异体的宿主，就不特别限定。优选使用例如，细菌(大肠菌(例如，：Escherichia coli)、枯草菌(例如，枯草芽孢杆菌：Bacillus subtilis)等)、酵母、昆虫细胞、动物细胞(COS 细胞、CHO细胞(Journal of immunology，1998，Vol.160，3393-3402))等。关于将上述载体导入细菌的方法，只要是对细菌导入该载体的公知的方法就不特别限定。可举出例如，热激法、使用钙离子的方法、电穿孔法等。这些技术均是在该领域公知的技术，被各种文献所记载。例如，可参照 Green&Sambrook，2012，Molecular Cloning：ALaboratory Manual Fourth Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor， New York。此外，动物细胞的转化优选使用脂质体转染法(PNAS，1989， Vol.86，6077；PNAS，1987，Vol.84，7413)、电穿孔法、磷酸钙法(Virology， 1973，Vol.52，456-467)、DEAE-葡聚糖法等。

在以细菌作为宿主的情况下，优选表达APOA2蛋白质变异体的载体在该细菌中能够自主复制，同时由启动子序列、核糖体结合序列、编码 APOA2蛋白质变异体的DNA序列和转录终止序列构成。此外，可以包含编码控制启动子的调节因子的基因。启动子只要是在大肠菌等宿主中能够发挥功能的就可以任意使用。

在以酵母、动物细胞、昆虫细胞等真核细胞作为宿主的情况下，同样可以按照该技术领域中公知的方法而获得表达APOA2蛋白质变异体的转化体。在真核细胞中使用的APOA2蛋白质变异体表达载体中，除了启动子序列、编码APOA2蛋白质变异体的DNA序列以外，还可以根据所需连接增强子等顺势作用元件、剪接信号(供体部位、接受体部位、分支点等)、多聚腺苷酸添加信号、选择标志物序列、核糖体结合序列(SD序列)等。

(c)表达变异体的转化体的培养和重组型APOA2蛋白质变异体的表达

接着，培养上述制作的表达变异体的转化体。在培养基中培养表达变异体的转化体的方法按照可用于宿主培养的通常方法进行。例如，在以细菌作为宿主的情况下，培养基只要含有细菌能够同化的碳源、氮源、无机盐类等，且能够使其生长、增殖，就不特别限定。可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。作为更具体的例子，可举出LB培养基，但当然并不限定于此。此外，为了选择性地培养表达变异体的转化体，可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。通常，培养在通气搅拌培养等好氧条件下、在37℃下进行6～24小时。在培养期间，优选pH 值保持在中性附近。pH值的调节利用无机或有机酸、碱性溶液等进行。在表达变异体的转化体为CHO细胞等动物细胞的情况下，在Thermo FiserScientific社制DMEM培养基中以1×10⁵细胞/mL接种宿主细胞，在37℃的5％CO₂孵育箱中进行培养即可。培养中可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。

在上述表达APOA2蛋白质变异体的载体为包含蛋白质表达控制系统 (例如，在宿主为细菌的情况下是阻遏物基因和操纵基因等)的蛋白质表达诱导型载体的情况下，需要对上述表达变异体的转化体进行规定的处理、诱导APOA2蛋白质变异体的表达。表达诱导的方法根据载体中包含的蛋白质表达控制系统不同而不同，因此只要适宜进行适合该系统的诱导处理即可。例如，在以细菌作为宿主的蛋白质表达诱导型载体中最常利用的蛋白质表达控制系统是包含lac阻遏物基因和lac操纵基因的系统。本系统可以通过IPTG(isopropyl-1-tio-β-D-Galactoside，异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)处理来诱导表达。在具有包含该系统的表达APOA2蛋白质的载体的转化体中，为了使目标APOA2蛋白质变异体表达，在培养基中添加适当量(例如，终浓度为1mM)的IPTG即可。

(d)重组型APOA2蛋白质变异体的提取和/或回收

培养后，在APOA2蛋白质变异体产生于菌体内或细胞内的情况下，可以通过回收菌体或细胞并进行破碎来提取目的蛋白质。此外，在APOA2 蛋白质变异体产生于菌体外或细胞外的情况下，直接使用培养液、或者通过离心分离等除去菌体或细胞而使用上清即可。然后，通过单独或者适当组合使用通常的蛋白质纯化方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等，可以从上述培养物中分离纯化APOA2蛋白质变异体。关于是否获得了APOA2蛋白质变异体，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行确认即可。

2-3-2.抗APOA2单克隆抗体和杂交瘤制作方法

本发明中使用的抗APOA2单克隆抗体、和产生该抗体的杂交瘤可以通过以下记载的方法来制作。但是，其制作方法并不受本方法限定，也可以通过该领域公知的其他所有方法来制作。

(1)用免疫原免疫哺乳动物

将上述2-3-1中获得的免疫原溶解在缓冲液中来制备免疫原溶液。此时，为了有效地进行免疫，如果需要，可以添加佐剂。作为佐剂的例子，可举出市售的弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等，可以单独或混合使用这些佐剂。

接着，将上述制备的免疫原溶液施与哺乳动物，例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠BALB/c)、兔等，进行免疫。作为免疫原的施与方法，可举出例如，使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射或使用0.15mol 氯化钠的静脉注射，但是不限于此。免疫原1次的施与量是根据免疫动物的种类、施与途径等适当确定的，每只动物约50～200μg。此外，对免疫的间隔不特别限定，初次免疫后，以数日至数周的间隔、优选为1～4周的间隔，进行2～6次、优选为3～4次追加免疫。在初次免疫之后，通过 ELISA(Enzyme-Linked Immuno SorbentAssay，酶联免疫吸附测定)法等测定免疫动物的血清中的抗体效价，如果观察到抗体效价充分上升，则将免疫原注射到静脉内或腹腔内，作为最终免疫。然后，最终免疫之日起2～ 5天后，优选为3天后，采集产生抗体的细胞。

(2)来自免疫动物的产生抗体的细胞的回收和细胞融合

通过进行从免疫动物获得的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合，能够制作生产特异性地识别APOA2蛋白质的特定区域的单克隆抗体的杂交瘤。作为产生抗体的细胞，可举出脾脏细胞、局部淋巴节细胞、末梢血细胞等，优选脾脏细胞或局部淋巴节细胞。作为与产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用通常能够获得的来自小鼠等的株化细胞。作为使用的细胞株，优选为具有药剂选择性，并具有在未融合的状态下不能在HAT 选择培养基(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)中生存、仅在与产生抗体的细胞融合的状态下能够生长的性质的细胞株。此外，株化细胞优选为来自与免疫动物同种系的动物的细胞。作为骨髓瘤细胞的具体例，可举出作为来自BALB/c小鼠的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺损细胞株的P3X62-Ag.8株(ATCCTIB9)、P3X63-Ag.8.U1株(JCRB9085)、 P3/NSI/1-Ag4-1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)或 SP2/0-Ag14株(JCRB0029)等。

为了使上述骨髓瘤细胞和产生抗体的细胞进行细胞融合，在不含血清的DMEM、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基中，将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞以约1:1～20:1的比例混合，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，可以以约10～80％的浓度使用平均分子量1,500～4,000Da的聚乙二醇等。此外，为了提高融合效率，可以根据情况并用二甲基亚砜等辅助剂。进而，可以使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售细胞融合装置来使产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞融合(Nature， 1977，Vol.266，550-552)。

(3)目标杂交瘤的筛选

作为从细胞融合处理后的细胞分选产生抗APOA2单克隆抗体的目标杂交瘤的方法，将细胞悬浮液用例如含有胎牛血清的RPMI1640培养基等进行适当稀释后，以2×10⁶个/孔左右接种在96孔微量酶标板上，向各孔添加选择培养基，之后适当地交换选择培养基而进行培养。培养温度为 20～40℃，优选为约37℃。在骨髓瘤细胞为HGPRT缺损株或胸苷激酶(TK) 缺损株的情况下，通过使用包含次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶的选择培养基(HAT培养基)，可以选择性地仅仅使产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞的杂交瘤生长、增殖，因此可以从在选择培养基中培养开始后约10天前后选择生长起来的细胞作为杂交瘤。

对用HAT培养基选择出的杂交瘤，首先，以针对包含序列号1或2 所示的氨基酸序列的APOA2蛋白质的各种变异体的结合活性为指标进行筛选。接着，对于产生对APOA2蛋白质变异体具有结合活性的抗体的杂交瘤进行交差反应性试验，选择能够允许的杂交瘤。所谓能够允许的交差反应性，是指在目标抗体的用途中能够忽略的程度的交差反应性。例如，对于用于免疫学测定的单克隆抗体，如果在最终的测定体系中由交差反应引起的信号强度能够抑制在小于从背景水平开始由特异性反应引起的信号强度的1％，则可以说事实上不发生交差反应。

为了确认对APOA2蛋白质的特定变异体的反应特异性，例如，可以利用ELISA法。在ELISA法中，准备将成为抗原的APOA2蛋白质的各种变异体或其片段分别固相化在不同孔而得的微孔板，向其中添加将上述杂交瘤的培养液上清进行适当稀释而得的样品，使其反应。在充分反应后，清洗孔，添加针对免疫球蛋白的二抗的标记体使其进一步反应。再次清洗孔，如果最终利用已结合于孔的二抗的标记进行测定，则可以定量地得知培养液上清中存在的抗体对抗原的结合活性。

例如，为了获得与构成APOA2蛋白质的氨基酸序列中由序列号1或 2所示的氨基酸序列组成的APOA2蛋白质的任一C末端区域特异性地结合的抗APOA2末端单克隆抗体，使用由序列号1或2所示的氨基酸序列组成的APOA2蛋白质本身或者包含APOA2蛋白质变异体的C末端区域的肽、和由除了序列号1或2以外的氨基酸序列组成的APOA2蛋白质(例如，APOA2-A蛋白质)，筛选仅与APOA2蛋白质的特定变异体结合的抗体即可。

例如，抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合，与由序列号2 所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质、APOA2-AT蛋白质的C末端的氨基酸缺失了的APOA2-A蛋白质不结合或基本不结合。因此，可以以此为指标进行筛选。

此外，抗APOA2-AT末端单克隆抗体与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合，与由序列号1 所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质、APOA2-AT蛋白质的C 末端的氨基酸缺失了的APOA2-A蛋白质不结合或基本不结合。因此，可以以此为指标进行筛选。

进而，对于识别APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸的抗 APOA2非末端抗体，可以以在比较相对于由序列号1或2的任一者所示的APOA2蛋白质变异体或者C末端不同的肽的结合活性时，结合活性为同程度为指标，筛选抗体。

杂交瘤也可以利用重组DNA技术进行分选。首先，从按照上述方法获取的杂交瘤组提取mRNA。mRNA的提取使用该技术领域中公知的方法即可。接着，使用Oligo dT引物、随机引物来获取上述mRNA的cDNA。以该cDNA为模板，利用包含位于编码可变区的基因上游的信号序列的碱基序列、和恒定区侧的碱基序列的引物组来进行PCR。将所得扩增产物插入到适当的克隆载体而进行克隆化，可以获得由该杂交瘤生产的抗体的可变区基因的文库。作为更具体的例子，虽不限定，但可以使用Novagen社提供的Mouse Ig Primer进行PCR，将扩增产物(小鼠免疫球蛋白可变区 cDNA)插入到Thermo Fisher Scientific社提供的ZEROBLUNT PCR TOPO载体的EcoRI位点而进行克隆化，将所得载体组作为编码可变区氨基酸序列的基因文库。接着，通过以上述本发明公开的可变区或各CDR 的氨基酸序列为基础设计探针，从上述文库中筛选阳性克隆，可以筛选生产本发明中使用的单克隆抗体的杂交瘤。

(4)利用杂交瘤产生单克隆抗体

杂交瘤通过使用小鼠进行腹水化，从而可以用于单克隆抗体生产。具体而言，向制作杂交瘤时用作融合伴侣的细胞所来源的小鼠、裸鼠的腹腔内接种杂交瘤，适当采集腹水，从而可以回收包含单克隆抗体的腹水液。更具体而言，通过将以SP2/0细胞作为融合伴侣的杂交瘤接种在接种降植烷后经过了10天的BALB/c小鼠的腹腔中，可以回收包含单克隆抗体的腹水液。

此外，杂交瘤通过使用适当的培养基进行培养，从而可以用于单克隆抗体生产。具体而言，通过在Thermo Fiser Scientific社制的杂交瘤SFM 培养基中以1×10⁵细胞/mL接种杂交瘤，在37℃的5％CO₂孵育箱中进行培养直到杂交瘤死亡为止，可以获得包含单克隆抗体的培养液上清，但是不限于此。

(5)通过重组DNA操作制作重组抗APOA2单克隆抗体或其片段的制作方法

本发明中使用的抗体或其片段也可以利用编码该抗体的氨基酸序列的 cDNA序列信息，通过重组DNA操作而获得。

可以使用编码来自产生抗APOA2单克隆抗体的杂交瘤、例如来自由上述方法获取的产生抗APOA2末端单克隆抗体的杂交瘤的抗体中的可变区的氨基酸序列的碱基序列，将VH和VL的碱基序列分别与编码任意的 CH和CL的碱基序列连接，将各个多核苷酸插入适当的表达载体中，在导入宿主细胞之后，作为完整的免疫球蛋白分子而使其表达。此外，也可以利用CDR移植抗体技术，将编码由上述方法获取的来自产生抗APOA2 末端单克隆抗体的杂交瘤的抗体中的可变区的氨基酸序列中的各CDR序列的氨基酸序列的多核苷酸与编码人FR序列的氨基酸序列的多核苷酸以规定的顺序连接，插入适当的表达载体中，在导入宿主细胞之后，作为完整的免疫球蛋白分子使其表达。此时，使得重链和轻链在同一宿主细胞内表达、能够作为包含重链/轻链的二聚体而产生，则是便利的。具体而言，例如，可以通过轻链表达载体和重链表达载体将细胞共转化，从该转化细胞获得本发明中使用的抗体。或者，也可以将编码上述可变区的氨基酸序列的多核苷酸直接插入适当的表达载体中，在导入宿主细胞之后，作为免疫球蛋白分子的片段使其表达。或者，如上所述，可以将分别编码包含上述氨基酸序列的VL和VH、或轻链和重链的多核苷酸用适当的接头进行连接并插入噬菌体，制成单链Fv使其表达，或者制成双价抗体等合成抗体片段使其表达。另外，通过近年开发的、灵活运用基因工程技术而使重组抗体在噬菌体表面表达的噬菌体展示抗体技术(Brinkmann et al，1995， J Immunol Methods，182，41-50，国际公开WO97/13844号，国际公开 WO 90/02809号)，可以人工使将编码重链、轻链的基因改组(shuffling)而多样化后的单链Fv抗体作为噬菌体融合蛋白表达，从而获得特异抗体。

关于编码重组抗APOA2抗体或其片段的多核苷酸的制备、插入了该多核苷酸的载体、该载体的宿主导入法，使用该领域公知的重组DNA技术来进行即可。目标重组抗APOA2蛋白质抗体或其片段可以从转化细胞的培养液中或从该细胞内获得。

作为免疫球蛋白的表达载体，可以使用例如，质粒、噬菌粒、粘粒、病毒载体(例如，基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV 的载体)等，但不限定于这些。例如，作为基于BPV的载体的1种的BCMGS Neo载体是通过转化COS7细胞等而高效地表达外来基因的理想的载体(乌山一“ウシパピローマウイルスベクター(牛乳头瘤病毒载体)”，村松正实和冈山博人编，实验医学别册：遺伝子工学ハンドブック(基因工程手册)， 1991，羊土社，297-299)。

除了编码抗体或其片段的多核苷酸以外，上述载体可以包含在表达上述抗体或其片段方面必要的控制元件(例如，启动子、增强子、终止子、聚腺苷酸化部位、剪接部位)，或者如果需要可以包含选择标志物。

作为转化的宿主，除了上述“2-3-1.免疫原的制备”记载的宿主以外，优选使用SP2/0(小鼠骨髓瘤)细胞(Europian Journal of Cancer Prevention (1996)Vol.5，512-519；Cancer Resarch(1990)Vol.50，1495-1502)。

含有表达本说明书中的抗体或其片段的载体的宿主细胞通过按照常规方法进行培养，可以在其培养液上清或宿主细胞内产生抗体。具体而言，在以CHO细胞作为宿主的情况下，通过在Thermo Fiser Scientific社制 DMEM培养基中以1×10⁵细胞/mL接种宿主细胞，在37℃的5％CO₂孵育箱进行培养，从而可以获得包含抗体的培养液上清。此外，例如，在以大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可以通过接种在LB培养基等可用于大肠杆菌的培养的通常培养基中进行培养、诱导蛋白质的表达，从而可以在培养液上清或宿主细胞内产生抗体。

在作为表达产物的抗体或其片段包含恒定区的情况下，可以使用蛋白 A柱、蛋白G柱、抗免疫球蛋白抗体亲和柱等从培养液上清、细胞破碎液纯化、回收。另一方面，在以仅由可变区构成、不包含恒定区的状态表达的情况下，不能应用上述纯化方法，因此应用其他适当的纯化方法。例如，如果作为在C末端融合了组氨酸标签等对纯化有利的标签序列的结构使其表达，则可以通过利用了对应的配体的亲和层析来纯化。在不是与标签的融合蛋白质的情况下，可以按照硫酸铵沉淀、离子交换层析、反相层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析等蛋白质纯化的常规方法进行纯化。

为了确认本发明中使用的单克隆抗体或其片段对APOA2蛋白质的特定的变异体或其片段的特异性，优选如前所述在使用之前预先验证与其他变异体的交差反应性。例如，对于本发明中使用的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体或其片段，应确认交差反应性的抗原是APOA2-AT蛋白质和 APOA2-A蛋白质。

此外，更优选除了上述蛋白质以外，对于部分结构与APOA2蛋白质变异体相同的其他蛋白质，也确认本发明中使用的抗体或其片段的交差反应性。对于交差反应的确认，例如，可以使用以APOA2-ATQ蛋白质作为抗原的ELISA法。在应试验反应特异性的抗体、即抗APOA2末端抗体及其片段与APOA2蛋白质变异体的反应的情况下，只要使应确认交差反应性的其他抗原蛋白质共存，就能够通过观察两者的竞争状态来确认交差反应性。利用了竞争抑制原理的这样的交差反应性的确认方法，不需要对于所有的抗原制备反应体系，因此可以迅速地进行筛选。

2-3-3.抗APOA2多克隆抗体的制作

抗APOA2多克隆抗体可以通过该技术领域中公知的方法制作。关于免疫原和哺乳动物的免疫，依据上述“2-3-2.抗APOA2单克隆抗体和杂交瘤制作方法”中记载的方法进行即可。以下，以与抗APOA2单克隆抗体的制作方法不同的点为中心显示抗APOA2末端多克隆抗体的获得法。

为了制作抗APOA2末端多克隆抗体，首先，将特定的APOA2蛋白质变异体序列上具有至少6个氨基酸以上长度的C末端片段、例如由序列号27或28所示的氨基酸序列组成的肽溶解于缓冲液来制备免疫原溶液。如果需要的话，为了有效地进行免疫，可以添加佐剂。作为佐剂的例子，可举出市售的弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等，可以单独或混合使用这些佐剂。接着，将上述制备的免疫原溶液施与哺乳动物，例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、兔等，进行免疫。免疫原溶液1次的施与量是根据免疫动物的种类、施与途径等适当确定的，每只动物包含约50～200μg的免疫原即可。作为免疫原溶液的施与方法，可举出例如，使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射或使用150mM的氯化钠的静脉注射，但不限于此。此外，对免疫的间隔不特别限定，在初次免疫后，以数天至数周的间隔、优选为以1～4周的间隔，进行2～10 次、优选为3～4次追加免疫。在初次免疫之后，利用ELISA(酶联免疫吸附测定，Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)法等反复测定免疫动物的血清中的抗体效价，在充分观察到抗体效价上升时，将免疫原溶液注射到静脉内或腹腔内，作为最终免疫。免疫后，可以从血液回收包含识别APOA2 蛋白质的多克隆抗体的抗血清。

2-3-4.抗APOA2抗体的纯化

(1)肽固定化柱的制作

制作固定化了APOA2蛋白质的C末端区域肽的亲和柱、和固定化了在APOA2蛋白质的C末端区域肽的C末端添加了酰胺基的肽的亲和柱。详细的方法记载在“抗ペプチド抗体実験规程(抗肽抗体实验方案)”，第2 版，秀润社中。用于亲和柱的担载体可以使用像Formyl Cellulofine、CNBr 琼脂糖这样，载体上的官能团能够与肽的氨基结合的担载体，或者能够经由共价键合在担载体上的马来酰亚胺基而与肽序列上的半胱氨酸残基结合的担载体等。此外，对于固定化的肽的长度，只要包含APOA2蛋白质的 C末端即可，为6个氨基酸以上，优选为10个氨基酸以上，优选为18个氨基酸以上，更优选为30个氨基酸以上。

(2)抗体纯化

抗APOA2抗体可以使用肽固定化亲和柱从上述腹水液、细胞液上清、或抗血清纯化。例如，用适当的缓冲液稀释上述抗血清，使抗血清中包含的IgG抗体吸附在固定化了APOA2蛋白质的C末端区域肽的亲和柱上，回收该吸附级分。接着，使用固相化有C末端酰胺化了的APOA2蛋白质肽的亲和柱，吸附除去对肽的除了C末端区域以外的区域显示结合性的免疫球蛋白。最终，获取该非吸附级分作为特异性地识别特定的APOA2蛋白质变异体的抗APOA2抗体。

3.胰外分泌功能异常的检测方法

本发明的方式涉及体外检测胰外分泌功能异常的方法。本发明的特征在于，测定受试体的体液中存在的APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-AT蛋白质的量，基于该量确定受试者有无胰外分泌功能异常。

本发明的方法包括：(1)胰外分泌功能异常检测用标志物的测定工序、和(2)胰外分泌功能异常的确定工序。以下对于各工序进行详细说明。

3-1.胰外分泌功能异常检测用标志物的测定工序

“胰外分泌功能异常检测用标志物的测定工序”是体外测定来自受试体的体液中存在的本发明的胰外分泌功能异常检测用标志物、即 APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-AT蛋白质、或其片段的量的工序。

本说明书中“体液”是指供于胰外分泌功能异常的检测的试样，是生物学的液体。体液只要是可能包含本发明中使用的胰外分泌功能异常检测用标志物的生物学的液体即可，不特别限定。包含例如，血液、尿、淋巴细胞培养上清、脑脊液、消化液(包含例如，胰液、大肠液、食道腺分泌液、唾液)、汗、腹水、胸水、关节液、鼻涕、泪、阴道液、精液等。优选为血液或尿。本说明书中，“血液”包含血浆和血清，也可以优选使用全血。全血不论静脉血、动脉血或脐带血等种类。体液也可以是从同一个体获得的两种以上不同的液体的组合。本发明的胰外分泌功能异常的检测方法能够从侵袭性低的血液、尿检测，因此作为简便的检测法是非常有用的。

“来自受试体的体液”是从受试体采集的体液。对于来自受试体的体液，可以将从受试体采集的体液立即供给本发明的方法，也可以将采集后直接或进行了适当的处理后冷藏或冷冻的体液在供给本发明的方法之前恢复到室温来使用。作为冷藏或冷冻前的适当的处理，包含例如，在体液为血液的情况下，在采集的全血中添加肝素等进行抗凝处理后，作为血浆或血清进行分离等。这些处理只要基于该领域中公知的技术进行即可。

在本说明书中，“APOA2蛋白质变异体的量”是指来自受试体的体液中存在的上述2种APOA2蛋白质变异体各自的分量。该分量可以是绝对量或相对量的任一种。在该分量是绝对量的情况下，是指规定的体液量中包含的上述2种APOA2蛋白质变异体的质量或体积。在该分量是相对量的情况下，是指例如，使用标准物质，来自受试体的2种APOA2蛋白质变异体的测定值相对于该标准物质的测定值的相对值。可举出例如，浓度、荧光强度、吸光度等。

APOA2蛋白质变异体的量可以在体外使用公知的方法进行测定。可举出例如，使用能够分别与2种APOA2蛋白质变异体特异性地结合的物质、即APOA2末端结合分子进行测定的方法。APOA2末端结合分子包含能与APOA2-ATQ的C末端区域特异性地结合的APOA2-ATQ末端结合分子、和能与APOA2-AT的C末端区域特异性地结合的APOA2-AT末端结合分子。

本说明书中，“能特异性地结合”是指某种物质实质上仅能够与作为本发明的目标的APOA2蛋白质的特定变异体结合。在该情况下，也可以存在对特定的APOA2蛋白质变异体的检测不产生影响的程度的非特异性结合。

“APOA2末端结合分子”可列举例如，APOA2结合蛋白质、APOA2 结合核酸。

“APOA2结合蛋白质”可列举例如，抗APOA2抗体。更具体而言，可以是以APOA2蛋白质变异体作为抗原、识别C末端区域的结构差异而结合的“抗APOA2末端抗体”，优选为在以包含序列号1或2的氨基酸序列的人APOA2蛋白质的变异体作为抗原时，仅识别APOA2蛋白质变异体中的任一种而结合的“抗人APOA2末端抗体”或它们的抗体片段。或者，也可以是它们的化学修饰衍生物。在这里，“化学修饰衍生物”包含例如，在上述抗APOA2末端抗体或其抗体片段中，在获得或保持与 APOA2蛋白质的特定变异体的特异性结合活性方面必要的功能上的修饰，或在检测上述抗APOA2末端抗体或其抗体片段方面必要的用于标记的修饰中的任一种。

用于APOA2蛋白质变异体的测定的抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体中的任一种。为了能够特异性检测，优选为单克隆抗体。例如，与 APOA2末端特异性地结合的抗APOA2末端多克隆抗体等可以通过上述方法制作。

“APOA2结合核酸”可列举例如APOA2核酸适配体。“核酸适配体”是指由核酸构成的适配体，是指介由氢键等通过基于单链核酸分子的二级结构和三级结构形成的立体结构而与靶标物质牢固且特异性地结合，从而具有特异性地阻碍或抑制靶标物质的生理活性等功能的能力的配体分子。具体为识别APOA2蛋白质变异体中的C末端区域的结构差异而结合的“APOA2末端适配体”，优选为在以包含序列号1或2的氨基酸序列的人APOA2蛋白质变异体作为靶标分子时，仅识别APOA2蛋白质变异体的任1种而结合的“人APOA2末端适配体”或它们的片段，或者识别 APOA2蛋白质变异体中的除了C末端以外的区域而结合的“APOA2非末端适配体”。

本工序中使用的核酸适配体可以通过本领域公知的方法制作。可列举例如，使用SELEX(指数富集配基的系统进化，systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)法的试验管内筛选法。SELEX法例如，如果分离RNA适配体，则是通过将“从由具有随机序列区域和在其两端具有引物结合区域的多个RNA分子构成的RNA池选择与靶标分子结合的 RNA分子。将回收的RNA分子通过RT-PCR反应扩增后，以所得的cDNA 分子作为模板进行转录，得到所选择的RNA分子的扩增产物，以此作为下一轮的RNA池”这样一系列的循环重复几～几十轮，选择对靶标分子结合力更强的RNA分子的方法。另一方面，通过SELEX法分离DNA适配体时基本步骤也相同，不过扩增回收的DNA分子时不需要经过RT-PCR 反应。对随机序列区域和引物结合区域的碱基序列长不特别限定。一般随机序列区域优选为20～80个碱基，引物结合区域优选分别为15～40个碱基的范围。为了提高对靶标分子的特异性，可以预先将与靶标分子类似的分子与RNA池或DNA池混合，使用由与靶标分子不结合的RNA分子或 DNA分子组成的池。可以通过使靶标分子为APOA2蛋白质或APOA2蛋白质变异体实行上述方法，利用最终得到的核酸分子作为APOA2核酸适配体。另外，SELEX法是公知的方法，具体方法可以依据例如Pan等(Proc. Natl.Acad.Sci.1995,U.S.A.92:11509-11513)进行。

核酸适配体一般已知RNA适配体和DNA适配体，对构成本说明书中的核酸适配体的核酸不特别限定。包含例如，DNA适配体、RNA适配体、DNA与RNA组合而构成的适配体等。一般多用RNA适配体，但在稳定性、化学合成中的制造成本、和适配体制造中的工序数的方面，DNA适配体是优异的。

本工序中使用的核酸适配体在不阻碍对靶标分子的结合能力的范围内，可以用荧光物质(例如，FITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、 Cyanine7、FAM、HEX、VIC、荧光胺及其衍生物、和罗丹明及其衍生物等)、放射性同位元素(例如，³²P、³³P、³⁵S)、或生物素或者(链霉)抗生物素蛋白等标记物质标记。

2种APOA2蛋白质变异体可以通过利用仅与APOA2蛋白质的特定变异体结合的抗APOA2抗体的免疫学方法，或通过利用仅与APOA2蛋白质的特定变异体结合的APOA2末端适配体的结合方法，从而测定。

免疫学方法只要使用抗APOA2抗体，任一方法均可，优选为使用抗 APOA2末端抗体作为固相化抗体或标记抗体、组合与APOA2蛋白质的除了C末端以外的区域结合的另一抗体(抗APOA2非末端抗体)来进行的 ELISA法。例如，APOA2-ATQ蛋白质的量可以通过使用抗APOA2-ATQ 末端抗体作为标记抗体、使用抗APOA2-ATQ非末端抗体作为固相化抗体的夹心ELISA法测定。此外，APOA2-AT蛋白质可以通过使用抗 APOA2-AT末端抗体作为固相化抗体、使用抗APOA2-AT非末端抗体作为标记抗体的夹心ELISA法测定。抗APOA2非末端抗体由Abcam社、 FITZGERALD社等市售，也可以利用这些市售的抗APOA2蛋白质非末端抗体。

使用APOA2适配体的结合方法也可以基本上通过与免疫学方法同样的途径测定。例如，使用APOA2末端适配体作为固相化适配体或标记适配体，与APOA2非末端适配体组合进行的方法。

3-2.胰外分泌功能异常的确定工序

“胰外分泌功能异常的确定工序”是基于上述胰外分泌功能异常的检测用标志物测定工序中测定的蛋白质的量体外确定或评价有无上述胰外分泌功能异常的工序。测定的胰外分泌功能异常的检测用标志物、即受试体的体液试样中的APOA2蛋白质变异体的量(APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-AT蛋白质的量)，确定有无胰外分泌功能异常。根据本确定工序，仅使用APOA2-ATQ蛋白质的量、或APOA2-AT蛋白质的量任一方也可以确定，但通过将两者组合，能够更高精度地确定有无胰外分泌功能异常。以下对于各个确定工序进行详细说明。

确定有无胰外分泌功能异常可以基于APOA2-ATQ蛋白质的量来进行。具体地，使用与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合的APOA2-ATQ末端结合分子、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的APOA2-ATQ非末端结合分子，测定受试体的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质的量，在受试体体液试样中的APOA2-ATQ的量比健常者少的情况下，可以判断受试体的胰有胰外分泌功能异常，而且胰外分泌功能异常是流通障碍。

确定有无胰外分泌功能异常可以基于APOA2-AT蛋白质的量进行。具体地，使用与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体，测定 APOA2-AT蛋白质的量，在受试体体液试样中的APOA2-AT的量与健常体相比少的情况下，可以判断受试体的胰有胰外分泌功能的异常。此外，当受试体体液试样中的APOA2-AT的量与健常体相比为同等以上时，可以判断受试体的胰至少不具有胰液产生障碍的异常。其中，如果能够判断受试体至少不是产生障碍，则作为确定施与胰消化酶补充药的必要性、施与量的判断材料是有用的。

仅用上述APOA2-AT蛋白质的量检测有无胰外分泌功能异常之后，测定APOA2-ATQ蛋白质的量，通过组合它们的结果能够确定胰外分泌功能异常是胰液流通障碍，还是胰液产生障碍。具体地，在受试体体液试样中的APOA2-AT蛋白质比健常体少、且APOA2-ATQ蛋白质的量与健常体的该量相比少的情况下，可以判断是胰液流通障碍。另一方面，当受试体体液试样中的APOA2-AT蛋白质比健常体少、且APOA2-ATQ蛋白质的量与健常体相比为同等以上时，可以判断是胰液产生障碍。

本发明中，受试体的体液试样中的APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ 蛋白质的量与健常体的该量的比较通过APOA2-AT蛋白质和 APOA2-ATQ蛋白质的量的值的大小来进行。

在受试体的体液试样中的APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质的量为健常体的总体中的APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质各自的量的最低值以上的情况下，可以判断为与健常体相比为“同等以上”，在低于最低值的情况下，可以判断“少”。在上述判断为“少”的情况下，更优选受试体的体液试样中的APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质各自的量与健常体的总体中的各自的量相比为最低值的二分之一以下的值。

除了上述方法之外，在判断受试体的APOA2-ATQ蛋白质或 APOA2-AT蛋白质的量与健常体的该量相比少时，还可以使用统计学处理，仅将经分析与健常体的值相比统计学上显著“少”的受试体判断为“比健常体的值少”。统计学上显著可列举例如，所得值的风险率(显著性水平) 小的情况，具体为p＜0.05、p＜0.01或p＜0.001的情况。在这里，“p”或“p值”表示在统计学检验中，统计量在假定的分布中，假定偶然正确的概率。因此，“p”或“p值”越小，表示假定越接近真实。“统计学上有显著性差异”是指分别从受试体和健常体获得的胰外分泌功能异常的检测用标志物的量在进行统计学处理时，两者间有显著性差异。在与健常体的比较中，在统计学上有显著性差异情况下，可以评价为该受试体呈现胰外分泌功能异常。对于统计学处理的检验方法，只要适当使用能够判断有无显著性的公知的检验方法即可，不特别限定。例如，可以使用学生检验法、多重比较检验法。

健常体的体液中的胰外分泌功能异常的检测用标志物的浓度，可以在每次测定受试体的体液中的胰外分泌功能异常的检测用标志物的浓度时进行测定，也可以利用预先测定好的胰外分泌功能异常的检测用标志物的浓度。特别是，如果预先测定好健常体在各种身体条件下的胰外分泌功能异常的检测用标志物的浓度，将其值输入计算机进行数据库化，则通过将受试体的身体条件输入该计算机，就可以立即利用与该受试体相比具有最适合的身体条件的健常体的胰外分泌功能异常的检测用标志物的浓度，因此是便利的。

4.胰外分泌功能异常的检测用试剂盒

本发明中使用的“胰外分泌功能异常的检测用试剂盒”是为了评价有无胰外分泌功能的异常而直接或间接地利用的试剂盒。

本发明的试剂盒作为其构成物，包含能与APOA2蛋白质变异体特异性地结合的APOA2结合分子，例如，抗APOA2末端抗体、和/或APOA2 末端适配体。具体地，是包含抗APOA2-ATQ末端抗体、抗APOA2-AT 末端抗体、和/或它们的化学修饰体的抗体，和/或APOA2-ATQ末端适配体、APOA2-AT末端适配体。

抗APOA2-ATQ末端抗体的具体例可列举与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合，重链的 CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号3、4和5、或9、10和11所示的氨基酸序列组成，且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号6、7和8、或12、13和14所示的氨基酸序列组成的抗APOA2末端单克隆抗体或其片段。

进而，可列举识别用序列号1表示的APOA2-ATQ蛋白质或由序列号 2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸序列，重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号15、16和17、或21、22和23所示的氨基酸序列组成，且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号18、19和20、或24、25和26所示的氨基酸序列组成的抗 APOA2非末端单克隆抗体或其片段，可以从这些片段中选择1种以上单克隆抗体或其片段用于胰外分泌功能异常的检测用试剂盒。

上述APOA2结合分子也可以结合在固相担载体上，此时，优选可以结合在检查用条上。另外，可以包含例如，标记二抗或者标记探针、以及检测标记所需要的底物、担载体、清洗缓冲液、样品稀释液、酶底物、反应停止液、作为纯化的标准物质的APOA2蛋白质、使用说明书等。

实施例

通过以下的实施例更具体地说明本发明。但本发明不受该实施例限制。

＜实施例1：利用血中APOA2-ATQ蛋白质或血中APOA2-AT蛋白质作为生物标志物的胰外分泌功能异常的检测(1)＞

对于从胰管癌患者得到的血清中的标题的2种APOA2蛋白质变异体的量、与胰淀粉酶浓度的相关性进行验证。

以获得知情同意而收集的6名胰管癌患者的血清(样本A～F)和10名健常者的血清为对象，通过ELISA法测定APOA2-ATQ蛋白质和 APOA2-AT蛋白质的浓度，与基于胰淀粉酶浓度的胰外分泌功能的检测方法进行比较。

(APOA2-ATQ蛋白质的量的测定)

使用抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体7F2的POD标记体、和识别 APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的部位的抗APOA2非末端多克隆抗体(FITZGERALD社)通过夹心ELISA法测定血清中的APOA2-ATQ蛋白质的量。抗体7F2的POD标记化使用PEROXIDASE LABELING KIT-SH进行，详细按照附带的规程。将抗APOA2非末端多克隆抗体用 PBS溶液调制成2μg/mL后，在酶标板(NUNC社制)的孔中加入各100μL，固相化过夜。第二天，丢弃上述溶液，添加PBS-T(0.05％TWEEN20、PBS) 400μL并清洗，添加封闭缓冲液(1％BSA、0.05％TWEEN20、PBS)溶液400μL室温静置1小时。然后，丢弃上述溶液，作为抗体固相化板。接着，将使用稀释液稀释后的血浆在各孔添加各100μL室温使其反应1小时。此时，血浆的稀释倍率为10000倍。丢弃孔内的抗原溶液后，用PBS-T进行清洗，添加用稀释液稀释至0.2μg/mL的抗体7F2的POD标记体100μL，室温使其反应1小时。用PBS-T进行清洗后，添加TMB溶液(ピアス社制)100μL进行酶反应，添加0.5N硫酸溶液100μL使反应停止，测定450nm 的吸光度。对得到的测定值，以重组型人来源蛋白质APOA2-ATQ蛋白质的抗原溶液作为标准样品，计算出血中的蛋白质浓度。

(APOA2-AT蛋白质的量的测定)

以与上述相同的血清为对象，与上述APOA2-ATQ蛋白质的量的测定同样地，使用抗APOA2-AT末端多克隆抗体和上述抗APOA2非末端多克隆抗体的POD标记体通过夹心ELISA法测定血清中APOA2-AT蛋白质的量。对于抗APOA2非末端多克隆抗体的POD标记化、和夹心ELISA，也与上述同样地进行。对得到的测定值，以重组型人来源蛋白质 APOA2-AT蛋白质的抗原溶液作为标准样品，计算出血中的蛋白质浓度。

(胰淀粉酶量的测定)

以与上述相同的血清为对象，使用Pancreatic Amylase Human ELISA Kit(Abcam社)测定血清中的胰淀粉酶量。抗体固相化96孔板、清洗液、生物素标记抗胰淀粉酶抗体和POD-链霉抗生物素蛋白结合物、标准曲线制成用胰淀粉酶标准样品全部使用试剂盒附带的。血清样本用试剂盒附带的稀释液稀释20倍后，在抗体固相化板的孔中加入各50μL，使其反应1 小时。接着，丢弃上述稀释样本，用清洗液进行清洗，将用稀释液稀释后的生物素标记抗胰淀粉酶抗体在各孔中加入各50μL，再反应1小时。进而，丢弃生物素标记抗胰淀粉酶抗体溶液，用清洗液进行清洗。将用稀释液稀释后的POD-链霉抗生物素蛋白结合物在各孔中加入各50μL，使其反应30 分钟。然后，丢弃POD-链霉抗生物素蛋白结合物溶液用清洗液清洗后，将色原底物溶液在各孔中加入各50μL。反应15分钟后，在各孔中加入停止溶液各50μL使反应停止，测定450nm的吸光度。从标准曲线制成用胰淀粉酶标准样品的测定值制成标准曲线，从对各样本分别得到的测定值计算出血清中的胰淀粉酶浓度。

表1显示关于APOA2-ATQ蛋白质、APOA2-AT蛋白质、和胰淀粉酶的样本A～F的各胰管癌患者中的血清中的浓度和健常者10个样本的浓度范围。健常者的浓度范围是以健常者血清10个样本为对象，测定 APOA2-ATQ蛋白质、APOA2-AT蛋白质、和胰淀粉酶，将其平均值±1SD 作为健常者的范围显示而得的。

胰淀粉酶的浓度在胰外分泌功能异常的样本中有从健常者的范围脱离的倾向。并且在与健常者的范围相比，胰淀粉酶浓度较低的情况下，可以判定胰外分泌异常为胰液产生障碍，在胰淀粉酶浓度较高的情况下，可以判定胰外分泌异常为胰液流通障碍。

由以健常者为对象的测定，健常者的范围为65.7～177.4(U/L)。与此相对，在胰管癌的样本患者中，可知样本A、B、C从健常者的范围降低，样本D上升。该结果可知根据胰淀粉酶的浓度，可以检测样本A、B、C 为胰液产生降低，样本D为胰液流通障碍。但是，样本E和F的测定值处于健常者的基准值范围，不能由胰淀粉酶的测定值检测胰外分泌功能异常。

另一方面，APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的健常者的范围分别为26.8～76.4μg/mL、22.7～158.3μg/mL。

在使用胰管癌样本的测定中，对于胰管癌样本D，APOA2-ATQ蛋白质的浓度为健常者的范围以下。由此可以确定，本样本的受试者有胰外分泌功能异常，其原因为胰液流通障碍。进而，对于胰管癌样本A～C、E 和F，APOA2-ATQ蛋白质的浓度与健常者相比为同等或其以上，但 APOA2-AT蛋白质的浓度为健常者的范围以下。由此可以确定，这些样本的受试者有胰外分泌功能异常，其原因为胰液产生障碍。

由以上结果，通过使用APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质，即使对于在使用胰淀粉酶的方法中不能检测的样本E，F的样本也能够显示胰外分泌功能异常的可能性。这说明本申请发明的检测方法能够容易地筛选能够医学辨别胰外分泌功能异常的有管法的检查对象。

表1

＜实施例2：利用血中APOA2-ATQ蛋白质或血中APOA2-AT蛋白 质作为生物标志物的胰外分泌功能异常的检测(2)＞

对于从慢性胰腺炎患者得到的血清中的标题的2种APOA2蛋白质变 异体的量、与胰淀粉酶浓度的相关性进行验证。

以获得知情同意而收集的8名经图像检查诊断为慢性胰腺炎的患者的 血浆(样本G～N)和60名健常者的血清为对象，通过ELISA法测定 APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的浓度，与基于胰淀粉酶浓度 的胰外分泌功能的检测方法进行比较。通过与上述实施例1同样的方法测 定各APOA2蛋白质或酶的量。

表2显示APOA2-ATQ蛋白质、APOA2-AT蛋白质、和胰淀粉酶在 样本G～N的各慢性胰腺炎患者中的血浆中的浓度。健常者的浓度范围是 以健常者血浆60个样本为对象，测定APOA2-ATQ蛋白质、APOA2-AT 蛋白质、和胰淀粉酶，将其平均值±1SD作为健常者的范围显示而得的。

胰淀粉酶的健常者的范围为38.7～85.9(U/L)。与此相对，在慢性胰腺 炎的样本患者中，可知样本L从健常者的范围降低，此外样本H、J和M 上升。由该结果可知，通过胰淀粉酶的浓度，可以检测样本L为胰液产生 降低，样本H、J和M为胰液流通障碍。但是，样本G、I、K和N的测 定值处于健常者的基准值范围，不能由胰淀粉酶的测定值检测胰外分泌功 能异常。

另一方面，APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的健常者的范 围分别为32.9～85.8μg/mL、28.9～151.5μg/mL。

在使用慢性胰腺炎样本的测定中，对于慢性胰腺炎样本H、J和M， APOA2-ATQ蛋白质的浓度为健常者的范围以下。由此可以确定，本样本 的受试者有胰外分泌功能异常，其原因为胰液流通障碍。进而，对于慢性 胰腺炎样本G、I、K、L和N，APOA2-ATQ蛋白质的浓度与健常者相比 为同等或其以上，但APOA2-AT蛋白质的浓度为健常者的范围以下。由 此可以确定，这些样本的受试者有胰外分泌功能异常，其原因为胰液产生 障碍。

由以上结果，通过使用APOA2-AT蛋白质和APOA2-ATQ蛋白质，即使对于在使用胰淀粉酶的方法中不能检测的样本G、I、K和N的样本也能够显示胰外分泌功能异常的可能性。这说明本申请发明的检测方法能够容易地筛选能够医学辨别胰外分泌功能异常的有管法的检查对象。

表2

产业可利用性

根据本发明，能够通过受试者的负担少、且简便的检查法有效地检测胰外分泌功能异常，因此能够发现、诊断和治疗胰外分泌功能的微弱异常。此外，通过本发明的方法，能够使用血液非侵袭地检测胰外分泌功能异常，因此能够简便且迅速地检测胰外分泌功能异常。

本说明书中引用的所有出版物、专利以及专利申请直接通过引用而纳入本说明书。

Claims (21)

1.与APOA2-ATQ蛋白质特异性地结合的物质、和与APOA2-AT蛋白质特异性地结合的物质用于制造胰液产生障碍的检测用试剂盒的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，所述APOA2-ATQ蛋白质是由序列号1所示的氨基酸序列组成的多肽。

3.根据权利要求1所述的用途，所述APOA2-AT蛋白质是由序列号2所示的氨基酸序列组成的多肽。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的用途，在所述检测用试剂盒中，在受试体的体液中存在的APOA2-ATQ蛋白质的量与健常体的该量相比为同等以上、且受试体的体液中存在的APOA2-AT蛋白质的量与健常体的该量相比较少时，评价为受试体的胰有胰液产生障碍。

5.根据权利要求4所述的用途，所述受试体的APOA2-AT蛋白质的量为健常体的二分之一以下。

6.根据权利要求4所述的用途，所述体液试样为血液。

7.根据权利要求1所述的用途，是

与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合的APOA2-ATQ末端结合分子、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的APOA2非末端结合分子的用途，和

与由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性地结合的APOA2-AT末端结合分子、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的APOA2非末端结合分子的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，所述APOA2-ATQ末端结合分子和APOA2-AT末端结合分子是抗体或核酸适配体。

9.根据权利要求8所述的用途，所述APOA2-ATQ末端结合分子和APOA2-AT末端结合分子分别为抗APOA2-ATQ末端抗体和抗APOA2-AT末端抗体。

10.抗APOA2-ATQ末端抗体或其化学修饰体、和抗APOA2-AT末端抗体或其化学修饰体用于制造胰液产生障碍的检测用试剂盒的用途。

11.抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体或其片段、抗APOA2-AT末端单克隆抗体或其片段、和抗APOA2非末端单克隆抗体或其片段用于制造胰液产生障碍的检测用试剂盒的用途，

所述抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合，并且

重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号3、4和5、或9、10和11所示的氨基酸序列组成，且

轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号6、7和8、或12、13和14所示的氨基酸序列组成，

所述抗APOA2非末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质或由序列号2所示的氨基酸序列组成的APOA2-AT蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸序列特异性地结合，并且

重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号15、16和17、或21、22和23所示的氨基酸序列组成，且

轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号18、19和20、或24、25和26所示的氨基酸序列组成。

12.与APOA2-ATQ蛋白质特异性地结合的物质用于制造胰液流通障碍的检测用试剂盒的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，所述APOA2-ATQ蛋白质是由序列号1所示的氨基酸序列组成的多肽。

14.根据权利要求12或13所述的用途，在所述检测用试剂盒中，在受试体的体液中存在的APOA2-ATQ蛋白质的量与健常体的该量相比较少时，评价为受试体的胰有胰液流通障碍。

15.根据权利要求14所述的用途，所述受试体的APOA2-ATQ蛋白质的量为健常体的二分之一以下。

16.根据权利要求14所述的用途，所述体液试样为血液。

17.根据权利要求12所述的用途，是

与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合的APOA2-ATQ末端结合分子、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的APOA2非末端结合分子的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，所述APOA2-ATQ末端结合分子是抗体或核酸适配体。

19.根据权利要求18所述的用途，所述APOA2-ATQ末端结合分子为抗APOA2-ATQ末端抗体。

20.抗APOA2-ATQ末端抗体和/或其化学修饰体用于制造胰液流通障碍的检测用试剂盒的用途。

21.抗APOA2末端单克隆抗体或其片段、和抗APOA2非末端单克隆抗体或其片段用于制造胰液流通障碍的检测用试剂盒的用途，

所述抗APOA2末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性地结合，并且

重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号3、4和5、或9、10和11所示的氨基酸序列组成，且

轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号6、7和8、或12、13和14所示的氨基酸序列组成，

所述抗APOA2非末端单克隆抗体与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸序列特异性地结合，并且

重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号15、16和17、或21、22和23所示的氨基酸序列组成，且

轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号18、19和20、或24、25和26所示的氨基酸序列组成。