JP5941615B2 - ヒトcxcl1タンパク質の免疫学的測定方法 - Google Patents
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Description
本明細書で使用する用語「ヒトCXCL1」とは、Genbank NM_001511に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその天然変異体を意味する。ここでいう「天然変異体」とは、自然界に存在する変異体であって、例えば、前記アミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたもの、前記アミノ酸配列と95%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するものなどをいう。ここで「同一性」とは、二つのアミノ酸配列にギャップを導入して、又は導入しないで最も高い一致度となるように整列(アラインメント)させたときに、前記ギャップの数を含めた、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合(%)をいう。また、「数個」とは、2〜10の整数、例えば、2〜7、2〜5、2〜4、2〜3の整数をいう。天然変異体の具体例としては、SNP(一塩基多型)等の多型に基づく変異体やスプライス変異体などが挙げられる。前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、前記アミノ酸配列を有するヒトCXCL1と実質的に同等な構造又は性質を有しうるからである。保存的アミノ酸とは、互いに、非極性アミノ酸(グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン)及び極性アミノ酸(非極性アミノ酸以外のアミノ酸)、荷電アミノ酸(酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)及び塩基性アミノ酸(アルギニン、ヒスチジン、リジン))及び非荷電アミノ酸(荷電アミノ酸以外のアミノ酸)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン)、分岐状アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、バリン)、ならびに脂肪族アミノ酸(グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン)などが知られている。
本発明の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその抗体を産生するハイブリドーマは、以下に記載する方法によって作製することができる。ただし、本方法に限定されるものではなく、当該分野で公知の他のあらゆる方法で作製することもできる。
ヒトCXCL1を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸部分配列領域と特異的に結合する抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体を作製するには、ヒトCXCL1の全長を免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、その後、配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸部分配列領域と特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法と、予め配列番号1、2、又は3で示されるヒトCXCL1の部分配列を免疫原としてモノクローナル抗体を作製する方法がある。
まず、免疫原(抗原)として用いるヒトCXCL1を調製する。ヒトCXCL1は、天然型、組換え型、又はペプチド合成のようにアミノ酸配列の全部又は一部を化学的に合成したヒトCXCL1のいずれであってもよい。
本ポリヌクレオチドの調製方法については、下記実施例1において詳述しているため、ここでは省略する。
得られたヒトCXCL1部分配列発現ベクターを、ヒトCXCL1タンパク質を発現し得る宿主中に導入して、ヒトCXCL1部分配列発現形質転換体を得る。使用する宿主については、使用したベクターに適する宿主であって、ヒトCXCL1を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌(大腸菌(例えば、エシェリヒア・コリ:Escherichia coli)、枯草菌(例えば、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)等)、酵母、昆虫細胞、動物細胞(COS細胞、CHO細胞(Journal of immunology、1998、Vol.160、3393−3402)などが好適に用いられる。細菌への前記ベクターの導入方法は、細菌に該ベクターを導入する公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Sambrook、J. et.al、1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New Yorkを参照されたい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法(PNAS、1989、Vol.86、6077)、(PNAS、1987、Vol.84、7413)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(Virology、1973、Vol.52、456−467)、DEAE−Dextran法等が好適に用いられる。
続いて、上記作製した形質転換体を培養する。形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、微生物を宿主とする場合、培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、特に限定はしない。天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。より具体的な例としては、LB培地が挙げられるが、もちろんこれに限定はされない。また、形質転換体の培養を選択的に行うために、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常、通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で6〜24時間行う。培養期間中、pHは中性付近に保持することが好ましい。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。形質転換体がCHO細胞等の動物細胞である場合には、Gibco社製DMEM培地に1×105細胞/mLとなるように宿主細胞を接種し、37℃の5%CO2インキュベータにて培養すればよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、ヒトCXCL1部分配列が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を回収して破砕することによりタンパク質を抽出することができる。また、ヒトCXCL1部分配列が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を使用すればよい。その後、一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中からヒトCXCL1を単離精製することができる。ヒトCXCL1部分配列が得られたか否かは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認すればよい。
A1で得られた免疫原を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント(FCA)、不完全フロイントアジュバント(FIA)等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いてもよい。
B1.免疫動物からの抗体産生細胞の回収と細胞融合
免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことで、抗ヒトCXCL1部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、一般に入手可能なマウスなど由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、BALB/cマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HGPRT)欠損細胞株である、P3X62−Ag.8株(ATCCTIB9)、P3X63−Ag.8.U1株(JCRB9085)、P3/NSI/1−Ag4−1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)又はSp2/0−Ag14株(JCRB0029)などが挙げられる。
細胞融合処理後の細胞から目的とする抗ヒトCXCL1部分配列モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する方法としては、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有RPMI1640培地などで適当に希釈後、96ウェルマイクロタイタープレート上に2×106個/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は20〜40℃、好ましくは約37℃である。ミエローマ細胞がHGPRT欠損株又はチミジンキナーゼ(TK)欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地(HAT培地)を用いることにより、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
本発明におけるハイブリドーマは、マウスを用いて腹水化することにより抗体生産に用いることが出来る。具体的には、ハイブリドーマを作製する際に用いた融合パートナーに用いた細胞の由来のマウスや、ヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、Sp/0細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後10日間を経たBALB/cマウスの腹腔中に接種することにより、抗体を含む腹水液を回収できる。
本発明の抗体又はその断片は、本発明で開示されたヒトCXCL1部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするcDNA配列を利用して、組換えDNA操作によって得ることもできる。
得られた抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体が認識するヒトCXCL1上のエピトープは、次のような方法によって確認することもできる。
本発明では、このようにして得られたモノクローナル抗体、あるいはその断片を用いることにより、ヒトCXCL1の免疫学的測定方法を実現できる。本発明の測定方法はヒトCXCL1に対する特異性に優れ、ヒトCXCL1の理想的な免疫学的測定方法を提供することができる。
また、本発明は、これら免疫学的な測定方法を実施するためのキットとして使用することができる。すなわち、本発明による抗体やその断片をはじめとして、標識二次抗体、さらには標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組合せてキットとすることができる。
(ヒトCXCL1遺伝子の調製)
抗体の免疫原として用いる組換え型ヒトCXCL1を調製するために、まず、HEK293細胞より、ヒトCXCL1 mRNAの調製を行った。mRNAの調製は、Qiashredder及びRNeasy mini kit(Qiagen社製)を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。
組換え型ヒトCXCL1を調製するために、pET16b_CXCL1を用いて、大腸菌株Rosetta−Gami 2(Novagen社製)の形質転換を行った。得られた形質転換体を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むLB培地30mLで37℃にて一晩前培養を行った。次に、3Lの同培地に前培養を接種し、37℃にて3時間培養し、終濃度1mMのIPTGを添加して32℃にて6時間培養を行い、目的の組換え型ヒトCXCL1の発現を誘導させた後、遠心分離により菌体を回収した。
(抗ヒトCXCL1抗体産生マウスの作製)
実施例1で得られた100μLの0.3mg/mLヒトCXCL1溶液を100μLのMPL+TDM Emulsion(Corixa社製)と混合し、全量を7週齢のBALB/cマウスに腹腔投与した。2週間後、及び4週間後に同様に調製したヒトCXCL1溶液を同量投与した。続いて、マウス尾部静脈より血液を100μL採取し、一晩清置した後、5000×gで5分遠心して上清を血漿として回収した。
ヒトCXCL1に対する抗体の産生が確認されたマウスについて、上記と同様に調製したヒトCXCL1溶液を腹腔投与し、3日後に脾臓の摘出を行った。摘出した脾臓にシリンジで穴を開け、RPMI1640培地(GIBCO社製)を注入して脾臓細胞を押し出し、脾臓細胞液を得た。得られた脾臓細胞液を1200rpmで7分間遠心した後に上清を除去し、RPMI1640培地にて洗浄した。再びRPMI1640培地に懸濁して細胞数をカウントし、脾臓細胞数の1/10量のSP2/0ミエローマ細胞液を調製した。両細胞液を混合し、2200rpmで10分遠心し、上清を廃棄した。細胞をタッピングしてほぐし、PEG(ROCHE社製)とHBSS(GIBCO社製)を5:1で混合した溶液を1mL添加して攪拌した。以降の作業では、特に断りがない限り、溶液や培地は全て37℃で保温したものを用いた。
前記75種類の精製抗体について、次のような手法でヒトCXCL1と親和性の高い抗体を選抜した。まず、それぞれの精製抗体について10μg/mL溶液を調製し、それぞれ100μLずつ96ウェルポリスチレンプレート(グライナー社製)のウェルに入れ、一晩固相化した。ウェル内の精製抗体溶液を廃棄後、4倍に希釈したBlockAce溶液(大日本住友製薬社製)を200μL注ぎ、1時間、室温で静置した。その後、溶液を廃棄し、PBS‐Tにて洗浄したものを精製抗体固相化プレートとした。次に、組換え型ヒトCXCL1を1000pg/mLから15pg/mLまで段階希釈した抗原溶液を前記精製抗体固相化プレートの各ウェルに100μLずつ添加し、1時間、室温で反応させた。続いて、抗原溶液を廃棄してPBS−Tで洗浄した後、100μLの50μg/mLビオチン標識抗ヒトCXCL1ポリクローナル抗体(R&DSYSTEMS社製)をウェルに入れ、1時間、室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄してPBS‐Tで洗浄後、100μLのavidin‐HRP溶液(R&DSYSTEMS社製)を30分間室温で反応させた。さらに、avidin−HRP溶液を廃棄し、PBS−Tにて洗浄後、TMB溶液100μLを入れて15分反応させた。反応の停止は、100μLの2N硫酸溶液の添加によって行った。発色は、450nmの吸光度の測定により確認した。発色反応が強かったウェルの精製抗体をヒトCXCL1との親和性が高い抗体と判断した。この結果、IgG1−1、IgG1−3、IgG1−10、IgG1−14、IgG2b−1の5種類の抗体を選抜した。
選抜した5種類の抗体について、軽鎖及び重鎖のcDNA配列とアミノ酸配列を決定した。まず、それぞれの抗体を産生するハイブリドーマを、15%FCSを添加したRPMI1640培地を用いて、37℃、5%CO2下で1×106細胞/mLになるまで培養した。その後、培養液を1200rpm、5分間遠心分離し、細胞を回収した。回収したハイブリドーマよりmRNAを調製した。調製は、Qiashredder及びRNeazy mini kit(Qiagen社製))を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。次に、逆転写酵素SuperscriptII(invitrogen社製))を用いて、得られたTotal mRNAを鋳型にOligo dTプライマーを用いてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製した。
実施例2にて選抜した5つの抗体について、認識するヒトCXCL1アミノ酸配列上のエピトープの解析を行った。
市販のヒトCXCL1検出キットであるHuman CXCL1/GRO alpha DuoSet(R&DSYSTEMS社製)に固相化用抗体として添付されているモノクローナル抗体について、実施例3と同様に認識するヒトCXCL1アミノ酸配列上のエピトープの解析を行った。
実施例3より、配列番号1で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG2b−1と、配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−10のビオチン標識体を用いたサンドイッチELISA法によるヒトCXCL1の測定を行った。IgG1−10のビオチン化はSulfo−NHS Biotin(PIERCE社製)を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、IgG2b−1の10μg/mLのPBS溶液を調製した後、96ウェルポリスチレンプレート(グライナー社製)のウェルに100μLずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、1%BSA‐PBS溶液(SIGMA社製)を200μL注ぎ1時間室温で静置した。その後、PBS‐Tにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトCXCL1を500pg/mL〜7.8pg/mLまで1%BSA‐PBSを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、1時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してPBS‐Tにて洗浄した後、1%BSA−PBSを用いて希釈した1μg/mLビオチン標識IgG1−10 100μLを1時間室温で反応させた。洗浄後、avidin−HRP溶液(R&DSYSTEMS社製)100μLを30分間室温で反応させた。Avidin−HRPの希釈も1%BSA‐PBSを用いて行った。PBS−Tにて洗浄後、TMB溶液100μLを入れて15分反応させた後、2N硫酸溶液100μLを添加して反応を停止させ、450nmの吸光度を測定した。結果を図1に示す。
実施例3より、配列番号1で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明したモノクローナル抗体IgG2b−1と、配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明したモノクローナル抗体IgG1−14のビオチン標識体を用いたサンドイッチELISA法によるヒトCXCL1の測定を行った。IgG1−14のビオチン化及びサンドイッチELISAについては実施例4と同様に実施した。結果を図1に示す。
実施例3より、配列番号2で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−3と、配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−14のビオチン標識体を用いたサンドイッチELISA法によるヒトCXCL1の測定を行った。IgG1−14のビオチン化及びサンドイッチELISAについては実施例4と同様に実施した。結果を図1に示す。
市販のヒトCXCL1検出キットであるHuman CXCL1/GRO alpha DuoSet(R&DSYSTEMS社製)を用いて組換え型ヒトCXCL1の測定を行った。当該キットは、抗ヒトCXCL1マウスモノクローナル抗体(配列番号2で示されるアミノ酸配列を認識する。)を固相化し、検出はビオチン化標識ヤギポリクローナル抗体を用いるものである。固相化は、グライナー社製の96ウェルポリスチレンプレートに行い、詳細な実験操作は付属のプロトコールに従った。結果を図1、図4及び図5に示す。
実施例3より、配列番号1で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG2b−1と、配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−10のビオチン標識体、又はIgG−10とIgG1−14をそれぞれビオチン標識したビオチン標識体の混合液を用いたサンドイッチELISA法によるヒトCXCL1の測定を行った。抗体のビオチン化及びサンドイッチELISAについては実施例4と同様に実施した。その結果を図2に示す。
実施例3より、配列番号1で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG2b−1と、配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−10のビオチン標識体、又はIgG1−14のビオチン標識体を用いたサンドイッチELISA法による尿中に添加したヒトCXCL1の測定を行った。IgG1−10及びIgG1−14のビオチン化はSulfo−NHS Biotin(PIERCE社製)を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、IgG2b−1の10μg/mLのPBS溶液を調製した後、96ウェルポリスチレンプレート(グライナー社製)のウェルに100μLずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、1%BSA−PBS溶液(SIGMA社製)を200μL注ぎ1時間室温で静置した。その後、PBS−Tにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトCXCL1を当日採取したヒト尿に250pg/mLとなるように添加し、3.9pg/mLまで同ヒト尿を用いて段階希釈した抗原添加尿を各ウェルに100μLずつ添加し、1時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してPBS‐Tにて洗浄した後、1%BSA−PBSを用いて希釈した1μg/mLビオチン標識IgG1−10 100μLを1時間室温で反応させた。洗浄後、avidin−HRP溶液(R&DSYSTEMS社製)100μLを30分間室温で反応させた。Avidin−HRPの希釈も1%BSA−PBSを用いて行った。PBS−Tにて洗浄後、TMB溶液100μLを入れて15分反応させた後、2N硫酸溶液100μLを添加して反応を停止させ、450nmの吸光度を測定した。結果を図3に示す。
実施例3より、配列番号2で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−3と、配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−14のビオチン標識体を用いたサンドイッチELISA法による尿中に添加したヒトCXCL1の測定を行った。抗体のビオチン化及びサンドイッチELISAについては実施例8と同様に実施した。結果を図3に示す。
市販のヒトCXCL1検出キットであるHuman CXCL1/GRO alpha DuoSet(R&DSYSTEMS社製)を用いて尿中に添加した組換え型ヒトCXCL1の測定を行った。詳細な実験操作は付属のプロトコールに従い、ヒト尿に添加したCXCL1溶液は実施例8と同様に調製した。結果を図3に示す。
実施例3において配列番号2で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した市販キットHuman CXCL1/GRO alpha DuoSet(R&DSYSTEMS社製)付属のマウスモノクローナル抗体と、配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体IgG1−10のビオチン標識体を用いて、サンドイッチELISA法による緩衝液に添加したヒトCXCL1の測定を行った。IgG1−10のビオチン化はSulfo−NHS Biotin(PIERCE社製)を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、市販キット付属のマウスモノクローナル抗体の4μg/mLのPBS溶液を調製した後、96ウェルポリスチレンプレート(グライナー社製)のウェルに100μLずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、1%BSA−PBS溶液(SIGMA社製)を200μL注ぎ1時間室温で静置した。その後、PBS−Tにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトCXCL1を500pg/mL〜7.8pg/mLまで1%BSA‐PBSを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、1時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してPBS‐Tにて洗浄した後、1%BSA−PBSを用いて希釈した1μg/mLビオチン標識IgG1−10 100μLを1時間室温で反応させた。洗浄後、avidin−HRP溶液(R&DSYSTEMS社製)100μLを30分間室温で反応させた。Avidin−HRPの希釈も1%BSA−PBSを用いて行った。PBS−Tにて洗浄後、TMB溶液100μLを入れて15分反応させた後、2N硫酸溶液100μLを添加して反応を停止させ、450nmの吸光度を測定した。結果を図4に示す。
実施例2にて選抜した5種類の抗体IgG1−1、IgG1−3、IgG1−10、IgG1−14、IgG2b−1について、それぞれ10μg/mLのPBS溶液を調製した後、96ウェルポリスチレンプレート(グライナー社製)のウェルに100μLずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、1%BSA−PBS溶液(SIGMA社製)を200μL注ぎ1時間室温で静置した。その後、PBS−Tにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトCXCL1タンパク質を125pg/mLから15pg/mLまで1%BSA−PBSを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、1時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してPBS−Tにて洗浄した後、1%BSA−PBSを用いて希釈した50ng/mLビオチン標識抗ヒトCXCL1ポリクローナル抗体(R&DSYSTEMS社製)100μLを1時間室温で反応させた。洗浄後、avidin‐HRP溶液(R&DSYSTEMS社製)100μLを30分間室温で反応させた。Avidin‐HRPの希釈も1%BSA−PBSを用いて行った。PBS−Tにて洗浄後、TMB溶液100μLを入れて15分反応させた後、2N硫酸溶液100μLを添加して反応を停止させ、450nmの吸光度を測定した。結果を図5に示す。
実施例2にて選抜した5種類の抗体IgG1‐1、IgG1‐3、IgG1‐10、IgG1‐14、IgG2b‐1を用いて、血漿に溶解したヒトCXCL1の検出を行った。
市販の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体であるMAB275(R&DSYSTEMS社製)を用いて、血漿に溶解したヒトCXCL1の検出を行った。PBSで希釈した10μg/mLのMAB275溶液を調製し、それぞれ100μLずつ96ウェルポリスチレンプレート(グライナー社製)のウェルに入れ、一晩固相化した。以降は実施例6と同様の方法で行った。結果を図6に示す。
実施例2にて選抜した5種類の抗体IgG1‐1、IgG1‐3、IgG1‐10、IgG1‐14、IgG2b‐1を用いて、尿に溶解したヒトCXCL1の検出を行った。
市販の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体であるMAB275(R&DSYSTEMS社製)を用いて、尿に溶解したヒトCXCL1の検出を行った。PBSで希釈した10μg/mLのMAB275溶液を調製し、それぞれ100μLずつ96ウェルポリスチレンプレート(グライナー社製)のウェルに入れ、一晩固相化した。以降は実施例13と同様の方法で行った。結果を図7に示す。
実施例2にて選抜した5種類の抗体IgG1−1、IgG1−3、IgG1−10、IgG1−14、IgG2b−1について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。
市販の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体であるMAB275(R&DSYSTEMS社製)について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。方法は実施例14と同様に行った。結果を図8に示す。
実施例2にて選抜した5種類の抗体のうち、IgG1−3、IgG1−10、IgG1−14、IgG2b−1の4種類について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。なお実施例14とは異なり、抗体を浸潤能測定の直前ではなく、前培養の段階から混合した。
市販の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体であるMAB275(R&DSYSTEMS社製)について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。比較例5とは異なり、抗体を浸潤能測定の直前ではなく、前培養の段階から混合した。方法は実施例15と同様に行った。結果を図9に示す。
Claims (15)
- ヒトCXCL1タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号1〜3で示されるアミノ酸配列のいずれか1つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ異なる配列領域を特異的に認識する2種類以上の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトCXCL1又はその断片を測定することを特徴とする、ヒトCXCL1タンパク質の免疫学的測定方法。
- 配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトCXCL1タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項1に記載のヒトCXCL1タンパク質の免疫学的測定方法。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトCXCL1タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項1又は2に記載のヒトCXCL1タンパク質の免疫学的測定方法。
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトCXCL1タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項1又は2に記載のヒトCXCL1タンパク質の免疫学的測定方法。
- 前記試料が術後採取組織、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、涙液又は精液である、請求項1〜4のいずれかに記載のヒトCXCL1タンパク質の免疫学的測定方法。
- 配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
CDR1が配列番号4で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号5で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号6で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
CDR1が配列番号7で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号8で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。 - 軽鎖可変領域に配列番号10で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号11で示されるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
CDR1が配列番号12で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号13で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号14で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
CDR1が配列番号15で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。 - 軽鎖可変領域に配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。
- 配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
CDR1が配列番号20で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号22で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
CDR1が配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号24で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。 - 軽鎖可変領域に配列番号26で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
CDR1が配列番号28で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号29で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号30で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
CDR1が配列番号31で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号32で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号33で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。 - 軽鎖可変領域に配列番号34で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号35で示されるアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。
- 配列番号3で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
CDR1が配列番号36で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号37で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3が配列番号38で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
CDR1が配列番号39で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR2が配列番号40で示されるアミノ酸配列を含み、及び
CDR3、が配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。 - 軽鎖可変領域に配列番号42で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の抗ヒトCXCL1モノクローナル抗体又はその断片。
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