FR2723741A1 - Peptides inhibiteurs de la proteine de transfert des esters de cholesterol et leur utilisation en therapeutique - Google Patents

Abstract

La présente invention a trait à un peptide, fragment de l'apoprotéine AII, caractérisé en ce qu'il répond à la formule : DELTANx Pep DELTACy dans laquelle : - Pep est le fragment 27-77 de l'apoprotéine AII (forme monomère) et correspond à la séquence : EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY FVELGTQPAT Q DELTANx correspond à une délétion des x acides aminés N-terminaux du peptide Pep défini ci-dessus, DELTACy correspond à une délétion des y acides aminés C-terminaux du peptide Pep défini ci-dessus, - x est un nombre entier compris entre 0 et 31 (ces valeurs étant incluses), - y est un nombre entier compris entre 0 et 4 (ces valeurs étant incluses). Ce peptide est utile en thérapeutique, notamment vis-à-vis des dyslipidémies.

Description

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PEPTIDES INHIBITEURS DE LA PROTEINE DE TRANSFERT DES ESTERS

DE CHOLESTEROL ET LEUR UTILISATION EN THERAPEUTIQUE.

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne en tant que produits nouveaux des peptides, fragments de l'apoprotéine AII (apoAII), et leur utilisation en thérapeutique, notamment pour le traitement des dyslipidémies et la prévention des

maladies cardio-vasculaires.

1.0 ART ANTERIEUR

Dans les pays industrialisés, les maladies cardio-vasculaires repré-

sentent la principale cause de mortalité et constituent un problème majeur, à la fois

clinique et économique, en santé publique.

Plusieurs études épidémiologiques montrent que l'un des principaux facteurs de risque est une concentration sérique élevée en cholestérol associé aux lipoprotéines de faible densité (LDL-chol). Elles indiquent aussi que le risque de

développer une maladie cardio-vasculaire est inversement proportionnel à la con-

centration sérique en lipoprotéines de forte densité (les HDL). Cependant, il est difficile de déterminer si les concentrations élevées de HDL sont la conséquence d'une activité métabolique anti-athérogène ou si les HDL sont directement

impliquées dans la prévention de l'athérome.

Les HDL joueraient un rôle important dans le "Reverse Cholesterol Transport" (RCT), c'est à dire, dans l'excrétion du cholestérol cellulaire

périphérique en favorisant le transfert de celui-ci vers le foie pour élimination.

Les cellules intestinales et hépatiques sécrètent dans le flux sanguin des HDL naissantes. L'apoprotéine AI (apoAI) est la protéine majoritaire des HDL, elle s'associe aux phospholipides pour former un complexe soluble susceptible d'accueillir des lipides et en particulier du cholestérol. La majeure partie des apoprotéines (dont l'apoAI) et des phospholipides constituant les HDL est issue des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Durant leur séjour dans le compartiment plasmatique, les HDL vont incorporer des apoprotéines (apoAI, apoAII, apo

C's,...) provenant du métabolisme des lipoprotéines riches en TG et des phos-

pholipides (PL) résultant de la lipolyse des VLDL (lipoprotéines de très faible densité) et des chylomicrons. Elles vont aussi acquérir du cholestérol provenant des cellules des tissus extrahépatiques et d'autres lipoprotéines. L'efflux du cholestérol

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des cellules périphériques (non hépatiques) vers les HDL est la première étape du RCT. C'est une étape critique dans l'homéostasie du cholestérol puisque la plupart

des cellules ne peuvent pas cataboliser le cholestérol exogène qu'elles accumulent.

Au sein des HDL, la "Lecithin Cholesterol Acyl Transferase" (LCAT) catalyse l'estérification du cholestérol. Cette réaction génère un potentiel de gra- dient de concentration en cholestérol entre les cellules extrahépatiques et les HDL qui favorise l'efflux cellulaire du cholestérol. La LCAT est responsable de la formation de la majorité des esters de cholestérol présents dans le plasma. Ces esters constituent la forme principale sous laquelle le cholestérol est transporté dans

le plasma.

Ceci va conduire à la formation de HDL matures, sphériques et ayant une taille accrue. Les HDL subissent alors l'action de différentes protéines comme la lipase hépatique et la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). La CETP est une glycoprotéine de 74000 Da responsable du transfert des esters de cholestérol (CE), formés par la LCAT au sein des HDL, vers les lipoprotéines contenant l'apoprotéine B, comme les lipoprotéines riches en TG, les VLDL et les chylomicrons. Comme le transfert des CE se fait en échange du transfert des TG, les HDL se retrouvent enrichies en TG. Elles deviennent un substrat pour des enzymes lipolytiques comme la lipase hépatique qui métabolise les TG en acide

gras.

Alors que les lipides des HDL sont catabolisés, la particule restante peut être recyclée pour favoriser l'efflux du cholestérol cellulaire ou bien être dégradée via un site de fixation au niveau du foie (l'hypothétique récepteur des

HDL n'ayant à ce jour pas été caractérisé).

Sous l'action de la CETP et des lipases, les VLDL sont métabolisées en

particules plus petites, les "VLDL remnants" dont la composition en phospho-

lipides (PL), en TG et en apoprotéines est modifiée suite aux différents échanges entre les lipoprotéines. Soit ces particules sont éliminées après interaction avec des récepteurs spécifiques, soit elles continuent à accumuler du CE, à s'appauvrir en TG et deviennent des particules plus denses: les lipoprotéines de faible densité (les LDL). Les LDL se caractérisent par la présence majoritaire d'une seule apoprotéine, (l'apo B) et d'un noyau riche en CE entouré par une couche de phospholipides et de cholestérol. Les LDL sont éliminées du plasma par deux

voies, l'une régulée par un récepteur, l'autre indépendante d'un récepteur.

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Chez un sujet normal, chaque jour, un tiers des LDL est éliminé par

l'intermédiaire d'un récepteur à haute affinité, tandis que 10 % environ sont élimi-

nés par des mécanismes non-spécifiques. Après avoir interagi avec un récepteur spécifique reconnaissant l'apo B, les LDL sont intemrnalisées et dégradées au niveau du foie ou d'autres tissus. Les LDL sont susceptibles d'être oxydées. Ces LDL oxydées (ox-LDL) sont alors reconnues par un récepteur à la surface des cellules endothéliales et des macrophages. L'internalisation de ces LDL oxydées conduit à la formation de cellules riches en CE, les cellules spumeuses qui participent à la formation des

plaques d'athérome.

Les modifications du profil lipoprotéique résultant de l'activité de la CETP suggèrent que celle-ci pourrait être impliquée dans l'athérogénèse. Cette analyse est renforcée par plusieurs observations: A l'exception du cochon, les animaux ayant une activité CETP faible sont

résistants à l'athérosclérose induite par un régime alimentaire gras.

L'injection d'anticorps neutralisants dirigés contre la CETP chez le lapin

augmente les CE dans les HDL et diminue les TG dans les HDL.

Les souris transgéniques exprimant la CETP ont un profil lipoprotéique

modifié, associé avec le développement de plaques d'athérome.

Plusieurs observations cliniques tendent à montrer que, chez l'homme, une

activité CETP élevée est corrélée avec un risque athérogène accru.

Enfin, les personnes déficientes en CETP sont caractérisées par un profil peu athérogène, c'est à dire des concentrations faibles en LDL et élevées en HDL. Pour plus de détails concernant le rôle de la CETP, on pourra se reporter à des articles tels que Swenson (Current. Opin. Lipid., 1992, 3, 67-74)

ou Tall (J. Lipid Res., 1993, 34, 1255-1274).

L'identification des facteurs régulant l'activité de la CETP présente un grand intérêt afin de développer des médicaments pour lutter contre les maladies

cardio-vasculaires et l'athérosclérose.

En particulier, l'inhibition de l'activité de la CETP semble être un élément favorable au traitement ou à la prévention de l'athérosclérose. Par exemple il a été suggéré dans le brevet US-A-5279540 d'éliminer la CETP du flux sanguin afin de réduire le risque athéromateux. Une autre voie d'approche est proposée dans la demande PCT WO 93/11782 qui préconise l'administration de peptides

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dérivés de la fraction N-terminale de l'apolipoprotéine CI de babouin pour inhiber l'activité de la CETP et ainsi diminuer le risque d'athérosclérose, ou dans la demande PCT WO 93/15198 qui utilise des polypeptides dérivés de l'apoprotéine AIV pour le traitement des hypercholestérolémies ou pour diminuer les risques d'accidents coronariens, sans toutefois préciser un mode d'action lié à la CETP. Le rôle des apoAI et apoAII a fait l'objet de diverses publications comme par exemple Ohnishi (Biochemistry, 1993, 32, 5029-5035) qui attribue un caractère activateur aux apoAI et apoAII dans le transfert des lipides plasmatiques, alors que Rye (J. Lipid Res., 1992, 33, 215-224) et Lagrost (J. Biol. Chem., 1994, 269, 3189-3197) semblent démontrer un rôle inhibiteur de l'apoAII sur l'activité de la CETP. La détermination du rôle de l'apoAII a été tentée à l'aide de souris transgéniques qui expriment l'apoAII humaine en quantité importante et qui développent des plaques d'athérosclérose quand elles sont soumises à un régime

gras ou riche en cholestérol (Nature, 1993, 365. 762-764).

La demande de brevet JP-A-63-237 795, qui décrit un procédé de fabrication de l'apoAII suggère également son utilisation dans l'étude et la thérapie des hyperlipidémies. D'une façon générale, la demande de brevet PCT WO 87/02062 suggère d'utiliser les portions amphiphyles d'apoprotéines pour favoriser

le transport reverse du cholestérol.

Par ailleurs, l'étude de l'apoAII a conduit certains auteurs comme

S.J.T. Mao (Biochemistry, 1977, 16, 4150-4156; Biochemistry, 1981, 20, 1676-

1680 et Peptides, 1983, 4, 343-349) à préparer des fragments de l'apoAII afin

d'identifier les sites d'interaction de l'apoAII avec les phospholipides.

OBJET DE L'INVENTION

La présente invention propose en tant que produits nouveaux, des fragments de l'apoprotéine AII (apoAII) qui ont la propriété d'inhiber l'activité de la CETP et qui, du fait de cette propriété, peuvent être utilisés pour fabriquer des médicaments permettant de lutter contre les dyslipidémies et les conséquences qui y sont liées, telles que l'athérosclérose et ses complications vasculaires notamment

coronariennes.

La présente invention concerne les peptides dont la structure répond à la formule générale: ANx Pep ACy (1)

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dans laquelle: - Pep représente le fragment 27-77, de l'apoprotéine All (obtenu par action du bromure de cyanogene sur l'apoprotéine AII) et correspond à la séquence (SEQ ID No. 1):

EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY

FVELGTQPAT Q

- ANx représente une délétion des x acides aminés N-terminaux

- ACy représente une délétion des y acides aminés C-terminaux.

- x représente un nombre entier compris entre 0 et 31 (ces valeurs étant incluses),

- y représente un nombre entier compris entre 0 et 4 (ces valeurs étant incluses).

Dans la suite du texte, un produit noté par exemple "ANO10 Pep" signifie qu'il s'agit du fragment correspondant à une délétion des 10 acides aminés N-terminaux de la séquence SEQ ID No. 1, l'extrémité C-terminale n'ayant pas été modifiée; ce peptide correspond donc au fragment 37- 77 de la structure primaire

de l'apo AIl.

Les peptides selon l'invention sont des inhibiteurs de la CETP. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'un au moins de ces peptides pour la

fabrication d'un médicament utile pour le traitement ou la prévention des hyper-

cholestérolémies et des effets qui y sont liés comme par exemple l'athérosclérose et

ses complications, notamment les accidents cardio-vasculaires.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Les peptides selon l'invention peuvent être synthétisés en utilisant la plupart des techniques de synthèse peptidique aujourd'hui disponibles. D'une

manière générale ces techniques impliquent une synthèse, étape par étape, permet-

tant l'addition successive de chaque acide aminé à la chaîne polypeptidique qui

croit progressivement. La synthèse peptidique peut aussi être réalisée par con-

densation de plusieurs fragments peptidiques ou bien en utilisant des enzymes dans

des conditions particulières (comme les protéases en milieu organique).

Les acides aminés sont liés entre eux par condensation entre le groupement carbonyle d'un acide aminé et le groupement amine de l'autre acide aminé, pour former la liaison peptidique. Les groupements protecteurs sont choisis afin d'être éliminés facilement et pour ne pas influer négativement sur la synthèse des polypeptides soit par racémisation, soit par hydrolyse des liaisons peptidiques formées. Certains acides aminés ont d'autres groupements fonctionnels sur une

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chaîne latérale, comme par exemple le groupement hydroxyle de la tyrosine. Il est

d'habitude nécessaire de bloquer ces groupements fonctionnels avec des grou-

pements de protection, faciles à éliminer une fois la synthèse du polypeptide terminée, de telle manière qu'ils n'interfèerent pas lors de la formation des liaisons peptidiques.

Plusieurs méthodes ont été développées pour la synthèse peptidique.

Elles sont caractérisées par différents protocoles d'activation, de coupure, etc. ce

qui implique différents groupements de protection. Un grand nombre de groupe-

ments de protection ont été créés et optimisés en fonction des protocoles de

synthèse.

La plupart des techniques de synthèse peptidique sont applicables à cette

invention. La méthode préférée dans cette invention est celle de la synthèse pep-

tidique en phase solide décrite par R.B. Merrifield adaptée de manière à utiliser des

acides aminés protégés en position N.ac. par un groupement 9-fluorènyl-

méthyloxycarbonyle (Fmoc).

Le concept fondamental de la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) est basé sur l'addition séquentielle d'acides aminés N.a protégés, ayant si nécessaire les chaînes latérales protégées par des groupements appropriés, sur un support polymérique insoluble (la résine) afin d'obtenir un peptide ayant son

extrémité C-terminale attachée au support par l'intermédiaire d'un bras.

La stratégie Fmoc emploie un système orthogonal o le groupement

protecteur de l'amine en ca est labile en conditions basiques et la liaison peptide -

résine, ainsi que les groupements protecteurs des chaînes latérales, sont labiles en

conditions acides.

La synthèse Fmoc commence de l'extrémité C-terminale vers

l'extrémité N-terminale.

Les acides aminés ont leur groupement at-aminé protégé par un groupement 9-fluorènylméthyloxycarbonyle (Fmoc) et les chaînes latérales par un

autre groupement comme par exemple dans le cas de la tyrosine un groupement t-

butyle. Comme tous les peptides de cette invention ont un groupement carboxy-

lique terminal libre, une résine de Wang est utilisée comme support solide pour chaque synthèse. La résine de Wang, qui porte au départ un acide aminé fixé par sa fonction acide, permet d'obtenir, après coupure en milieu acide, le peptide avec un groupement carboxylique terminal libre. De plus, elle est disponible dans le

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disponible dans le commerce (Novabiochem ou Saxon Biochemicals) avec le

premier acide aminé en position C-terminale déjà attaché.

Durant la synthèse, l'addition des acides aminés subséquents s'effectue selon un protocole répétitif en deux étapes. La première étape est la déprotection du groupement protecteur de l'amine en ce par une solution diluée (20 %) de piperidine dans de la N-méthyl-pyrrolidone (NMP). Ceci résulte dans l'obtention d'un groupement (x-aminé qui est déprotégé. La deuxième étape est la réaction de couplage qui permet d'introduire un acide aminé dont la fonction amine a est protégée par un groupement Fmoc. Différentes méthodes de couplage sont possibles, parmi lesquelles on préfètre l'utilisation de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) en présence de l-hydroxybenzotriazole (HOBT) afin de former l'ester

activé de l'acide aminé à coupler.

La synthèse s'effectue en répétant ce cycle pour l'addition de chaque

acide aminé au peptide.

La séparation finale du peptide de la résine et l'élimination des grou-

pements protecteurs des chaînes latérales (déprotection) sont réalisées à température

ambiante pendant trois heures dans une solution contenant 90 % d'acide trifluoro-

acétique et des molécules protectrices ou scavengers, (5 % d'anisol, 2 % d'eau, 3 % de dodecanethiol), afin par exemple d'empêcher la tertbutylation causée par la génération de cations tert-butyle. Le protocole détaillé est donné dans la partie

expérimentale qui suit.

PARTIE EXPERIMENTALE

Toutes les synthèses de peptides sont conduites à l'aide d'un système automatisé Modèle 430 de Applied Biosystems, en utilisant la méthodologie de protection "Fmoc" pour l'amine en position ax des acides aminés. Pour plus de détails on peut se reporter au manuel utilisateur de ce type d'appareil qui décrit les

protocoles de synthèse.

Les synthèses réalisées sur le synthétiseur automatique sont en général

conduites à partir de 0,25.10-3 mole d'acide aminé supporté.

a) Libération de l'amine de la résine de Wang Pour la synthèse des peptidles selon l'invention pour lesquels, dans la formule I, y = o, l'acide aminé C-terminal sera une glutamine. On choisit donc comme produit de départ une résine selon Wang (JACS, 1973, 95,.1328) à base de polystyrène réticulé avec I % de divinylbenzène, fonctionnalisée avec un bras de liaison du type alcool 4-alcoxy-benzylique, portant déjà une glutamine protégée

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estérifiée sur le bras de liaison. Cette résine, ainsi substituée, est disponible dans le commerce (Novabiochem). La fonction amine, protégée par un groupement Fmoc,

est libérée par action d'une solution de pipéridine à 20% dans la Nméthyl-

pyrrolidone. La résine est ensuite lavée avec de la N-méthylpyrrolidone.

b) Condensation du second acide aminé Le second acide aminé est une thréonine. On utilise ici une L-thréonine protégée sur la fonction amine par un groupement Fmoc et sur la fonction alcool par un groupement tbutyle. La condensation de la fonction acide libre sur la fonction amine libre de la glutamine portée par la résine de Wang est faite après activation de la fonction acide en présence de DCC (dicyclohexycarbodiimide) et

de HOBT (l-hydroxy-benzotriazole).

Après traitement avec le mélange réactionnel la résine est lavée avec de la N-méthylpyrrolidone. Afin d'assurer un bon rendement de condensation, la résine est mise une nouvelle fois en contact avec le mélange réactif puis à nouveau

lavée.

On ajoute ensuite une solution de pipéridine à 20% dans la N-méthyl-

pyrrolidone, afin d'éliminer le groupement Fmoc protégeant la fonction amine de

la thréonine, puis on lave la résine avec de la N-méthylpyrrolidone.

De façon analogue, on condense les acides aminés suivants par une suite de réactions semblables, en utilisant chaque fois 4 équivalents d'acide aminé à

greffer pour 1 équivalent de peptide supporté par la résine.

Dans le cas de la synthèse de peptides comportant plus de 25 acides

aminés, le couplage de la plupart des acides aminés est réalisé deux fois de suite.

Le mélange de couplage est renouvelé par un mélange frais. Cette méthode permet d'obtenir des rendements de couplage très élevés, ce qui est nécessaire lors de la

synthèse de longs peptides.

Les diftférents acides aminés utilisés sont tous protégés par un groupement Fmoc sur l'amine en cE de l'acide. Les chaînes latérales sont protégées par des groupements résistants aux agents basiques: t-butyl éther pour les fonctions alcool de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine, t-butyl ester pour les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique, Boc (t-butyloxycarbonyl) pour la fonction amine latérale de la lysine, et trityle pour les fonctions amide de

l'asparagine et de la glutamine.

Après la réaction de condensation d'un nouvel acide aminé protégé par un groupement Fmoc, le contrôle de la réaction est fait sur un échantillon de résine

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avant la réaction de déprotection: pour effectuer ce contrôle, on lave l'échantillon avec du dichlorométhane, on le sèche et on le pèse, puis on fait agir un mélange composé de 50% de pipéridine et 50% de dichlorométhane pendant 20 mn. On filtre la résine et on concentre le filtrat pour le reprendre avec un volume précis de dichlorométhane. On détermine sur cette solution la teneur en dibenzofulvène par dosage par spectrométrie d'absorption U.V à 301 nm. On détermine ainsi le taux

de substitution de la résine.

En variante, avant le stade b), quand il est nécessaire de fixer le premier acide aminé sur le bras de liaison de la résine, la fixation dudit premier acide aminé sur la résine de type WANG peut être réalisée comme suit: a) le couplage du premier acide aminé sur la résine de type WANG est réalisé en présence d'un catalyseur d'esterification, la diméthylaminopyridine (DMAP) de l'agent de condensation dclicyclohexylcarbodiimide (DCC) et de l'hydroxybenzotriazole HOBT ou encore,

3) un mélange de 1 équivalent en acide aminé, I équivalent en 2-(1H-

benzotriazole- 1 -yl)-I, 1,3,3-tétraméthyl uronium hexafluorophosphate (HBTU), et 2,2 équivalents de diisopropyléthylamine et 0, 1 à 0,2 équivalent

de 4-diméthylaminopyridine.

c) Libération du peptide Lorsque tous les acides aminés ont été condensés en répétant autant de fois que nécessaire des réactions analogues à l'exemple b), la résine est mise en présence d'un mélange composé de 90% d'acide trifluoroacétique, 5% d'anisole, 3% de dodécanethiol et 2% d'eau pendant 3 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est filtré et le filtrat est miélangé à de l'éther diéthylique pour précipiter le peptide. Celui-ci est séparé par centrifilgation et on obtient ainsi après

séchage le peptide brut.

d) Purification Le peptide brut est dissous dans un mélange d'acétonitrile et d'une solution aqueuse de chlorohydrate de guanidine 8M puis purifié par chromatographie en phase inverse sous pression sur gel de silice greffée de type RP18 en éluant avec un gradient composé d'eau à 0,1% d'acide trifluoroacétique (A) et d'acétonitrile contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique (B), la composition

variant de 20 à 70% de B sur une durée de 50 mn.

Les fractions contenant le peptide pur sont lyophilisées et on obtient le

produit sous forme d'un solide blanc floconneux.

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Les produits obtenus après la purification du stade d) sont contrôlés par analyse séquentielle (sur un analyseur automatique utilisant la dégradation d'EDMAN), par HPLC analytique et par spectrométrie de masse (appareil MAT

FINNIGAN TSQ 700. triple quadrupole avec système d'ionisation ESI).

Les valeurs obtenues par spectrométrie de masse sont regroupées dans le tableau I, dans lequel figurent également des peptides connus qui ont été testés en comparaison avec les produits selon l'invention. Dans ce tableau, les peptides selon l'invention sont les exemples, identifiés par les valeurs x et y correspondant à la formule I et les produits indiqués "fragment 17-30", fragment "51-60" et fragment "1-38 apoCl1" sont des produits connus, décrits dans les demandes de brevet ou publication de l'art antérieur: - "fragment 17-30" et "fragment 51-60" sont des fragments de l'apoAII décrits dans W087-02062 comme étant des agents

favorables au transport reverse du cholestérol.

- "fragment 1-38 apoCl est un fragment de l'apo CI de babouin, décrit comme inhibiteur (le la CETP par R.S. Kushwaha (J. Lipid

Res., 1993, 34 1285-1297).

En bref, les peptides selon SEQ ID No. 1 sont tous nouveaux, à l'exception de ceux pour lesquels le couple (x, y) a les valeurs suivantes (0,0)

(13,0); (20,0); (23,0); (25,0); (27,0); (28,0); (29,0); (30,0) et (31,0).

En revanche, l'utilisation thérapeutique selon l'invention de tous les

peptides selon SEQ ID No. 1, qu'ils soient connus ou nouveaux, est nouvelle.

Les peptides selon l'invention peuvent aussi être préparés par d'autres techniques connues de la chimie ou par les méthodes de génie génétique. Les peptides peuvent être synthétisés et produits par des cultures de bactéries, de levures ou de cellules animales contenant un fragment d'ADN codant pour le

pepfide et les séquences d'ADN nécessaires à son expression.

ACTIVITE BIOLOGIQUE

Les peptides selon l'invention ont été évalués quant à leur potentiel thérapeutique pour le traitement des hypercholestérolémnies, par une mesure de leur

pouvoir inhibiteur vis-à-vis de l'activité de la CETP.

On sait que pour auglmenter l'élimination du cholestérol par les cellules hépatiques, il est important de favoriser le transport des esters de cholestérol par

les HDL, et de limiter le transfert des esters de cholestérol des HDL vers le LDL.

il 2723741 Les produits selon l'invention ont été évalués en mesurant leur capacité à inhiber le transfert des esters de cholestérol des HDL vers les LDL résultant de

l'activité CETP.

Pour effectuer ces mesures, on utilise des HDL associées à des esters de cholestérol marqués au tritium (3H-CE-HDL) que l'on incube en présence de LDL, de CETP et des peptides selon l'invention. Après séparation des HDL et des LDL par précipitation des LDL puis centrifugation, le transfert des esters de cholestérol des HDL vers les LDL est mesuré par comptage de la radioactivité dans le surnageant. Cette méthode permet d'évaluer le pouvoir inhibiteur des différents peptides vis-à-vis de l'activité de la CETP. Des mesures identiques ont été faites

avec l'apoAII et les produits connus de l'art antérieur.

A fin de comparaison, le pouvoir inhibiteur a d'abord été évalué pour l'apoAII à différentes concentrations: la mesure montre que l'inhibition augmente avec la concentration et que l'on atteint une inhibition presque totale au delà d'un concentration de 20 gM. Les valeurs obtenues sont reportées sur la figure 1 dans laquelle on a représenté l'inhibition en ordonnée (0% représente une absence d'inhibition, c'est- à-dire que l'activité de la CETP n'est pas perturbée et 100% représente une inhibition totale de la CETP c'est-à-dire que l'on retrouve les valeurs obtenues en l'absence de CETP), en fonction de la concentration en apoAII dans le milieu d'incubation. Les peptides selon l'invention ont été évalués à une concentration de 20 jiM, soit la concentration à laquelle l'apoAII atteint son

activité maximale.

PARTIE EXPERIMENTALE

a) Préparation des solutions de peptides Après purification par HPLC (partie expérimentale de la synthèse), les peptides sont lyophilisés et conservés à -20 C. Préalablement aux essais, les peptides sont dissous dans une solution de chlorure de guanidine 6 M pour obtenir une solution contenant 10 mg de peptide par ml. La solution est ensuite diluée deux fois avec du tampon 10 mM Tris, 150 mM NaCl à pH = 7,4 et chromatographiée par FPLC ("Fast Protein Liquid Chromatography") en utilisant une phase Superdex 30 (Pharmacia) et une solution

de chlorure de guadinine 1 M, 10 mM Tris, pH = 7,4 comme éluant. Si néces-

saire, les fractions obtenues sont concentrées sur membrane YM3 (Amicon) pour

obtenir une concentration supérieure à 300 gM. Enfin, les sels résiduels de gua-

dinine sont éliminés par chromatographie en utilisant une phase Sephadex 25

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Superfine, en éluant avec une solution contenant 500 mM NaCI, 10 mM Tris, 0,2% d'azoture de sodium, pH = 7,4. Les fractions contenant le peptide sont

rassemblées et utilisées directement.

La concentration de chacun des peptides est déterminée par spectro- métrie d'absorption à 276 nm en utilisant les coefficients d'extinction

molaire de 1450 M-Icm-1 pour les peptides comportant une tyrosine, 2900 M-lcm 1 pour les peptides comportant 2 restes tyrosine, 5945 M-lcm-1 pour l'apoAII d'origine humaine, et 5400 M-lcm-1 pour le fragment d'apoC1 de babouin connu de l'art antérieur. La concentration des fragments 17-30 et 51-60 de l'apoAII (produits

connus) est déterminée par pesée.

b) Préparation de la CETP Du sérum humain dépourvu en lipoprotéine (LPDS) est obtenu par centrifugation (70 heures) de plasma frais (250 ml) dont la densité est ajustée à d =

1.25 par addition de KBr solide.

Une fraction enrichie en CETP est obtenue à partir du LPDS par

différentes chromatographies successives: chromatographie d'interactions hydro-

phobes (PHENYL SEPHAROSE , Pharmacia), chromatographie d'adsorption (HYDROXYLAPATITE , HA, Biorad) et chromatographie échangeuse d'ions

(MONO Q ION EXCHANGE , Pharmacia).

Le LPDS est saturé par du NaCI solide, puis déposé sur une colonne de 900 ml de PHENYL SEPHAROSE HS (Pharmacia) équilibrée par une solution de NaCI 4M. La colonne est éluée par environ deux litres d'un tampon Tris 10

mM, NaCI 150 mM à pH = 7,4, puis la CETP retenue est éluée par de l'eau pure.

La fraction aqueuse après chromatographie sur PHENYL SEPHAROSE est concentrée sur membrane YM 30 (Amicon) pour obtenir un volume de 250 ml puis on ajoute du NaCI de façon à obtenir une concentration de 2 M. Cette fraction est chromatographiée sur une colonne de 50 ml de PHENYL SUPEROSE (Pharmacia) à un débit de 5 ml/minute. La colonne est éluée par 50 ml d'une solution aqueuse de NaCI à 2 M, puis par un gradient linéaire de 500 ml allant de 2 M en NaCI à du tampon Tris 10 mM, 150 mM NaCI pH = 7,4 et pour terminer par 200 ml du même tampon Tris. La CETP retenue est ensuite éluée par de l'eau pure (comme précédemment). La fraction contenant la CETP, ajustée à 50 mM en NaCI, 10 mM Tris, 0,2% en azoture de sodium et pH = 7,4, est ensuite

concentrée sur membrane YM30 (Amicon) pour obtenir environ 16 ml de solution.

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L'activité spécifique de la CETP est de 3,0 à 3,4.10-7 mole de CE

transférée par milligramme de protéine et par heure.

c) Préparation de I'apoprotéine AII L'apoprotéine AII est purifiée à partir d'une préparation contenant les protéines extraites des HDL. Les HDL sont isolées à partir de 1 litre de plasma humain frais par deux ultracentrifugations consécutives (rotor 45 Ti, 40.000 rpm, C), l'une à une densité de 1,07 pendant au moins 24 heures, l'autre à une densité de 1,25 pendant 48 heures (les densités sont ajustées par addition de KBr solide). La fraction contenant les HDL est ensuite chromatographiée sur une colonne de 40 ml de Concanavalin A (Pharmacia) afin d'éliminer l'Apoprotéine E et les traces contaminantes d'apoprotéine B. La fraction contenant les HDL (environ 50 ml) est ensuite dialysée trois fois contre 1 litre de tampon Tris 10 mM, NaCI 150 mM à pH = 7,4 pendant une heure. Les protéines en solution dans environ 50 ml d'eau sont extraites des HDL par trois délipidations successives à l'aide de mélanges ethanol/ether (à raison de deux litres de mélange pour les HDL issues d'un litre de plasma pour les deux premières et un litre de mélange pour les HDL issues d'un litre de plasma dans la dernière) dont la concentration en éther augmente (3/1, 1/1, 1/3, V/V). Lors de la 2 o première délipidation la phase organique est éliminée par décantation; lors des deux autres elle est éliminée par centrifugation. Pour terminer, les protéines sont lavées

avec de l'éther pur.

Les protéines (apo HDL) extraites des HDL sont dissoutes dans 20 ml

d'une solution 6 M en chlorure de guadinine sous agitation pendant une nuit.

Après dilution par 20 ml de tampon Tris 10 mM, NaCl 150 mM à

pH = 7,4, la fraction protéique est centrifugée pour éliminer les agrégats inso-

lubles puis chromatographiée (gel filtration) sur une colonne de 300 ml de Superdex 75 (Pharmacia) avec un Tampon Tris 10 mM, 1 M en chlorure de

guadinine, pH = 7,4 comme solvant d'élution. Dans ces conditions non réduc-

trices, l'apoAII est éluée après le pic correspondant à l'apoprotéine AI. Les fractions contenant l'apoAII sont rassemblées et incubées pendant une heure en

présence de DTT (dithiothréitol) à 6,5 mM. La solution est finalement chroma-

tographiée à nouveau sur colonne de Sephadex 75. Dans ces conditions, l'apoAII, présente en solution sous sa forme monomère, est séparée de l'apoAI; les fractions

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sont rassemblées et stockées à 4 C pour une utilisation ultérieure (la teneur en

apoAlI est déterminée par dosage en spectrométrie U.V.).

d) Préparation des lipoprotéines marquées aux esters de cholestérol tritiés Les HDL marquées aux esters de cholestérol tritiés (3H-CE) sont préparées en incubant les HDL purifiées en présence de vésicules de phospha- tidylcholine de jaune d'oeuf (EPC) contenant du 3H-CE. Pour préparer les vésicules d'EPC - 3H-CE, 8 mg d'EPC sont dissous dans 20 ml de p.xylène auquel

on rajoute 9,25 MBq de 3H-CE (Amersham-Buchler) dans 250 li de toluène.

Après congélation le mélange est lyophilisé.

Le mélange EPC - 3H-CE est dispersé dans 4 ml de tampon 10 mM Tris, 150 mM NaCI à pH = 7,4 puis traité par une sonde à ultrasons pendant 5 minutes à 10 C. Le traitement aux ultrasons est répété 6 fois jusqu'à obtenir un

éclaircissement du mélange.

Les HDL sont purifiées par ultracentrifugation dans un rotor 45 Ti (Beckman) à 40.000 tr/mn pendant 24 heures à partir de 250 ml de plasma frais,

auxquels sont ajoutés des conservateurs (1 mM pCMB (acide pchloromercuro-

benzoique), 10 mM DTNB (acide 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoique)), 10 mM EDTA (acide éthylènediaminetétracétique), 0,02% NaN3), dont le pH est ajusté à pH = 7,4 et la densité est ajustée à 1,07 par du KBr solide. Le surnageant contenant les lipoprotéines autres que les HDL est éliminé. Les 4 ml de vésicules d'EPC marquées au 3H-CE (vés. 3H-CE-EPC) sont rajoutés à la fraction contenant les HDL puis celle-ci est incubée 70 heures à 37 C. La fraction est centrifugée dans un rotor 70 Ti à 50.000 tr/mn pendant 24 heures, le surnageant contenant les lipides est éliminé. La densité est ajustée à 1,25 par du KBr solide, puis la fraction est centrifugée dans un rotor 70 Ti 50.000 tr/mn pendant 48 heures. La fraction

contenant les HDL marquées purifiées est stockée à 4 C.

e) Essais d'inhibition de l'activité CETP: Comme indiqué précédemment, l'activité de la CETP est déterminée en mesurant le transfert des esters de cholestérol tritiés portés par les HDL vers les LDL. Pour effectuer cette mesure, 35 à 40 gl de la fraction enrichie en CETP sont

incubés en présence de HDL associées au 3H-CE (équivalent à 10 Ig de choles-

térol) et de LDL (équivalent à 100 gg de cholestérol), en présence ou non du peptide dont on veut déterminer l'activité. Le mélange est complété à 500 Il par une solution 25 mM de phosphate de sodium 150 mM NaCI, 1,4 mM EDTA,

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2,5 mM DTNB, 1% d'albumine de sérum de bovin et pH = 7,4. L'incubation

dure 3 heures à 37 C.

A la fin de l'incubation, la réaction de transfert des esters de cholestérol

entre les lipoprotéines est arrêtée par addition de 500 Ktl d'une solution de phospho-

tungstate de magnésium (PTA) (concentration finale: 0,048 % PTA, 12 mM Mg2+). Les LDL précipitées sont éliminées par centrifugation et la radioactivité du surnageant est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide (on ajoute ml de liquide à scintillation au surnageant et le comptage s'effectue pendant 10 mn). Dans ces conditions, l'activité de la CETP seule correspond à 1,89.10-3 mole

de CE transféré des HDL vers les LDL par heure.

* Pour évaluer le pouvoir inhibiteur d'un peptide sur l'activité de la CETP, on effectue simultanément 4 mesures dans les conditions suivantes: - la première mesure S1 représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant les lipoprotéines, la CETP et

le peptide (activité modifiée de la CETP).

- la second mesure St représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant les lipoprotéines et la CETP

(activité normale de la CETP).

- la troisième mesure B1 représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant seulement les lipoprotéines

(contrôle "à blanc").

- la quatrième mesure Bi représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant les lipoprotéines et le peptide

(contrôle à blanc en présence du peptide).

L'activité normale de la CETP est représentée par la différence Bi-St

(cette valeur est directement proportionnelle à l'activité de la CETP).

L'activité modifiée de la CETP en présence du peptide est représentée par la différence B2-S1 (cette valeur est directement proportionnelle à l'activité modifiée de la CETP et supprime une éventuelle activité qui pourrait être due au

peptide seul).

On peut exprimer l'activité inhibitrice du peptide en fonction de la quantité relative des esters de cholestérol transférés en 3 heures en l'absence ou en présence du peptide par la valeur:

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B2-S 1

% CE= x 100 BI-St Ainsi, un peptide non inhibiteur autorisera un transfert de CE identique à celui qui est observé en présence de la CETP seule et la valeur relative sera de %. Inversement, un peptide très inhibiteur supprime totalement le transfert (toute la radioactivité est conservée dans le surnageant) et on obtient une valeur

relative de 0%.

Pour obtenir une valeur représentative de l'inhibition IN proportion-

nelle au pouvoir inhibiteur du peptide vis-à-vis de la CETP on utilise la formule: (BI-St) - (B2-S1) IN= x 100 Bi-St (exprimé en %) Suivant cette expression, un peptide totalement inhibiteur de l'activité CETP conduit à une valeur IN = 100%. Inversement, un peptide inactif conduit à une valeur IN = 0% et un peptide possédant une action stimulatrice de la CETP

fera apparaître une valeur IN négative.

Les essais décrits ci-dessus ont été conduits avec l'apoprotéine AII à différentes concentrations afin de déterminer une concentration minimale

permettant une inhibition importante de l'activité de la CETP.

Les résultats de ces mesures sont représentés sous forme de graphe dans la figure 1 qui indique en ordonnée l'activité inhibitrice obtenue en fonction de la concentration de l'apoAII. Compte tenu des valeurs obtenues pour l'apoAII, les essais faits avec les peptides selon l'invention ont été conduits à une concentration lM. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau II dans lequel figurent les peptides selon l'invention indiqués en exemples et les trois produits de l'art antérieur mentionnés précédemment. Pour chaque produit testé, on a indiqué la valeur IN (pouvoir inhibiteur de l'activité de la CETP) et la valeur INR qui exprime le pouvoir inhibiteur des peptides par rapport au pouvoir inhibiteur de

l'apoAII à une concentration 20!iM.

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Les peptides selon l'invention sont des inhibiteurs de la CETP et de ce fait, leur aptitude à ralentir ou inhiber le transfert du cholestérol, des triglycérides, des esters de rétinol ou des phospholipides peut être mise à profit pour en faire des

principes actifs de médicaments.

s Conviennent notamment les peptides de formule I ci-dessus o x est

compris entre 8 et 15, d'une part, et entre 20 et 23, d'autre part.

Un autre objet de l'invention concerne donc des compositions phar-

maceutiques contenant un ou plusieurs peptides selon l'invention en quantité théra-

peutiquement efficace et en association avec un excipient physiologiquement

acceptable.

De telles compositions pharmaceutiques sont, de préférence, destinées

au traitement préventif ou curatif des affections liées aux hypercholestérolémies.

En particulier ces compositions pharmaceutiques trouvent leur utilisation préférée dans la prophylaxie des plaques d'athérome, la régression des plaques d'athérome

et la diminution des risques d'accidents cardio-vasculaires.

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TABLEAU I

Exemple (SEQ. ID) x y Masse Masse théorique expérimentale mesuree 1(SEQ.ID No. 1) 0 0 5745,6 5743,6 + 1,0 2 (SEQ. ID No. 2) 8 0 3 (SEQ. ID No. 3) 9 0 4(SEQ.ID No.4) 10 0 4635,3 4633,7+0,8 (SEQ.ID No.5) 1 1 0 6 (SEQ. ID No. 6) 12 0 4435,1 4435,6+1,7 7(SEQ.ID No.7) 14 0 4216,90 4217,0 + 0,7 8 (SEQ. ID No. 8) 16 0 3909,50 3908,2 + 0,1 9 (SEQ. ID No. 9) 18 0 3652,20 3650,8 0,9 (SEQ. ID No. 10) 20 0 3437,00 3437,6 0,5 11 (SEQ.ID No. 11) 22 0 3179,70 3177,8+0,6 12 (SEQ. ID No. 12) 24 0 2965,40 2965,7 0,3 13 (SEQ. ID No. 13) 26 0 2755,20 2754,0+0,4 14(SEQ.IDNo. 14) 28 0 2513,80 2513,1+0,4 (SEQ. ID No. 15) 30 0 16 (SEQ. ID No. 16) 9 4 4308,90 4309,1 + 0,3 17(SEQ.ID No. 17) 11 4 4108,80 4107,7 + 0,4 18 (SEQ. ID No. 18) 13 4 3909,50 3908,2+ 0,2 19 (SEQ. ID No. 19) 15 4 3659,20 3658,5 + 0,0 (SEQ. ID No. 20) 0 4 apo AHI 8690,9 8691 frag 1-38 apo Clbabouin 4276,80 4276,7+ 0,3 frag. 51-60 1069,30 1069,60 frag. 17-30 _ _ 1626,90 1626,7+0,5

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TABLEAU II

EXEMPLE x y IN INR

1 0 0 36,70 42,3

2 9 0 39,62 45,7

3 10 0 39,01 45,0

4 11 0 51,10 59,0

-j '12 0 71,02 81,9

6 14 0 32,78 37,8

7 16 0 15,77 18,2

8 18 0 11,19 12,9

9 20 0 23,55 27,2

22 0 40,45 46,7

il 24 0 12,60 14,5

12 26 0 12,02 13,9

13 28 0 6,84 7,9

14 30 0 1,95 2,2

9 4 39,84 46,0

16 11 4 38,75 44,7

17 13 4 38,22 44,1

18 15 4 13,10 15,1

apoAII lOgM 58,87 67,9 apoAlI 20pM 86,67 100 frag 51-60 -2,59 -3,0 frag 17-30 1,01 1,2 1-38 apo C1 babouin 0,42 0,5

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Claims (6)

REVENDICATIONS

1. Peptide, fragment de l'apoprotéine AII, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: ANx Pep ACy (I) dans laquelle: - Pep est le fragment 27-77 de l'apoprotéine AII (forme monomère) et correspond à la séquence:

EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY

FVELGTQPAT Q

- ANx correspond à une délétion des x acides aminés N-terminaux du peptide Pep défini ci-dessus, - ACy correspond à une délétion des y acides aminés C-terminaux du peptide Pep défini ci-dessus, - x est un nombre entier compris entre 0 et 31 (ces valeurs étant incluses), - y est un nombre entier compris entre 0 et 4 (ces valeurs étant incluses), à l'exclusion des peptides pour lesquels les valeurs du couple (x, y) sont respectivement: (0,0); (13,0); (20,0); (23,0); (25,0); (27,0); (29,0); (30,0)

(31,0).

2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans la formule

I, x est compris entre 8 et 15.

3. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans la formule

I, x est compris entre 20 et 23.

4. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, au moins un peptide de formule: ANx Pep ACy (I) dans laquelle:

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Pep est le fragment 27-77 de l'apoprotéine AII (forme monomère) et correspond à la séquence:

EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY

FVELGTQPAT Q

- ANx correspond à une délétion des x acides aminés N-terminaux du peptide Pep défini ci-dessus, - ACy correspond à une délétion des y acides aminés C-terminaux du peptide Pep défini ci-dessus, - x est un nombre entier compris entre O et 31 (ces valeurs étant incluses), - y est un nombre entier compris entre O et 4 (ces valeurs étant incluses),

selon une quantité thérapeutiquement efficace.

5. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement ou à la prévention des affections liées aux

hypercholestérolémies.

6. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la prophylaxie ou la régression des plaques d'athérome

et/ou la diminution des risques d'accidents cardio-vasculaires.