DE69837809T2

DE69837809T2 - Apolipoprotein a-i agonisten sowie deren verwendung zur behandlung dislipidemischer erkrankungen

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Publication number: DE69837809T2
Application number: DE69837809T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Dasseux; Renate Sekul; Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Gunther Metz
Original assignee: DASSEUX JEAN LOUIS
Current assignee: DASSEUX JEAN LOUIS
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2018-09-29
Also published as: US6046166A; EP1019074A4; AU2002300464C1; CN1699410A; HUP0103114A3; AU1063399A; ES2287982T3; CN1198640C; IL135319A0; ATE362766T1; US7157425B2; KR20010030804A; US7273848B2; AU746686B2; NO20001598L; HUP0103114A2; US20050203284A9; US20030060604A1; EP1019074A1; KR100650953B1

Description

1. EINFÜHRUNG
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen eines Agonisten von Apolipoprotein A-I (ApoA-I) zum Behandeln von Erkrankungen in Verbindung mit Dyslipoproteinämie, einschließlich Hypercholesterinämie, Herz-Kreislauf-Krankheit, Atherosklderose, Restenose und anderen Erkrankungen wie beispielsweise septischer Schock.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zirkulierendes Cholesterin wird von Plasmalipoproteinen transportiert – Teilchen mit komplexer Lipid- und Proteinzusammensetzung, die Lipide im Blut transportieren. Lipoproteine mit niedriger Dichte (Low Density Lipoproteine, LDL) und Lipoproteine mit hoher Dichte (High Density Lipoproteine, HDL) sind die wichtigsten Cholesterinträgerstoffe. LDL gelten als verantwortlich für den Transport von Cholesterin von der Leber (wo es synthetisiert bzw. aus der Nahrung erhalten wird) zu extrahepatischen Geweben im Körper. Der Begriff „umgekehrter Cholesterintransport" beschreibt den Transport von Cholesterin aus extrahepatischen Geweben zur Leber, wo es verstoffwechselt und eliminiert wird. Man nimmt an, dass HDL-Teilchen im Plasma eine wichtige Rolle beim Vorgang des umgekehrten Transports spielen, indem sie als Fänger (Scavenger) des Gewebecholesterins dienen.
Die Hinweise, die einen erhöhten Cholesterinserumspiegel mit koronarer Herzerkrankung verknüpfen, sind überwältigend. Atherosklerose ist beispielsweise eine langsam voranschreitende Krankheit, die von der Ansammlung von Cholesterin in der Arterienwand gekennzeichnet ist. Zwingende Beweise unterstützen das Konzept, dass in Atheroskleroseläsionen abgelagerte Lipide hauptsächlich von Plasma-LDL stammen, weshalb LDL inzwischen gemeinhin als das „schlechte" Cholesterin bekannt ist. Der HLD-Serumspiegel korreliert dagegen umgekehrt mit koronarer Herzkrankheit – tatsächlich gilt ein hoher HDL-Serumspiegel als negativer Risikofaktor. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein höherer HDL-Plasmaspiegel nicht nur vor koronarer Herzkrankheit schützt, sondern sogar die Regression atherosklerotischer Plaques auslöst (siehe z. B. Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Suppl. III):86-94). HDL wurde daher gemeinhin als das „gute Cholesterin" bekannt.
2.1. CHOLESTERINTRANSPORT
Das Fetttransportsystem lässt sich in zwei Wege aufteilen: einen exogenen für Cholesterin und Triglyzeride, die aus dem Darm resorbiert werden, und einen endogenen für Cholesterin und Triglyzeride, die aus der Leber und anderen nicht-hepatischen Geweben in den Blutstrom gelangen.
Beim exogenen Weg werden Nahrungsfette in als Chylomikronen bezeichnete Lipoproteinteilchen verpackt, die in den Blutstrom gelangen und ihre Triglyzeride an Fettgewebe (zur Speicherung) und Muskeln (zur Oxidation als Energielieferant) abgeben. Der Rest der Chylomikronen, der Cholesterylester enthält, wird mithilfe eines spezifischen Rezeptors aus dem Blut entfernt, der nur auf Leberzellen vorkommt. Dieses Cholesterin wird dann in Form von Plasmalipoproteinen wieder dem Zellstoffwechsel oder zur Wiederaufbereitung an extrahepatische Gewebe zur Verfügung gestellt.
Im endogenen Weg sezerniert die Leber ein großes Lipoproteinteilchen mit sehr geringer Dichte (Very-low-density Lipoprotein (VLDL) in den Blutstrom. Der Kern von VLDL besteht überwiegend aus in der Leber synthetisierten Triglyzeriden, mit einer kleineren Menge an Cholesterylestern (entweder in der Leber synthetisiert oder aus Chylomikronen wiederaufbereitet). Auf der Oberfläche von VLDL werden zwei vorherrschende Proteine präsentiert, Apolipoprotein B-100 und Apoprotein E. Wenn VLDL die Kapillargefäße von Fettgewebe oder Muskel erreicht, werden seine Triglyzeride extrahiert, wodurch eine neue Art von Teilchen entsteht, das eine geringere Größe aufweist und mit Cholesterylestern angereichert ist, aber seine beiden Apoproteine behält und als Lipoprotein mit mittlerer Dichte (Intermediate-Density Lipoprotein, IDL) bezeichnet wird.
Beim Menschen wird etwa die Hälfte der IDL-Teilchen rasch (innerhalb von zwei bis sechs Stunden nach ihrer Bildung) aus dem Blut entfernt, das sie fest an Leberzellen binden, welche ihr Cholesterin extrahieren, um neue VLDL und Gallensäulen herzustellen. Die IDL-Teilchen, die nicht von der Leber aufgenommen werden, bleiben länger im Blut. Mit der Zeit dissoziiert sich das Apoprotein E von den zirkulierenden Teilchen, wodurch diese zu LDL mit Apoprotein B-100 als alleinigem Protein umgewandelt werden.
Das von der Leber aufgenommene Cholesterin wird dort zum größten Teil zu Gallensäulen abgebaut, bei denen es sich um die Endprodukte des Cholesterinstoffwechsels handelt. Die Aufnahme von Cholesterin-haltigen Teilchen wird von LDL-Rezeptoren vermittelt, die in hoher Konzentration auf Hepatozyten vorhanden sind. Der LDL-Rezeptor bindet sowohl Apoprotein E als auch Apoprotein B-100 und ist für die Bindung und Entfernung von LDL und LDL aus dem Blutkreislauf zuständig. Die Affinität von Apoprotein E für den LDL-Rezeptor ist allerdings höher als die von Apoprotein B-100. Daraus folgt, dass die LDL-Teilchen eine viel längere zirkulierende Halbwertszeit als IDL-Teilchen haben – LDL zirkulieren durchschnittlich zweieinhalb Tage, bevor sie an LDL-Rezeptoren in der Leber und anderen Geweben binden. Ein hoher LDL-Serumspiegel (das „schlechte" Cholesterin) ist positiv mit koronarer Herzkrankheit assoziiert. Beispielsweise sammelt sich bei der Atherosklerose Cholesterin aus zirkulierenden LDL in den Wanden von Arterien an, was zur Bildung von sperrigen Plaques führt, die den Blutfluss hemmen, bis sich schließlich ein Pfropf bildet, der die Arterie verstopft und einen Herzanfall bzw. Schlaganfall verursacht.
Die Menge an intrazellulärem Cholesterin, das aus LDL freigesetzt wird, kontrolliert letztendlich den zellulären Cholesterinstoffwechsel. Die Ansammlung von aus VLDL und LDL stammendem zellulärem Cholesterin kontrolliert drei Prozesse: erstens reduziert sie die zelluläre Cholesterinsynthese, indem die Synthese der HMGCoA-Reduktase abgeschaltet wird – einem Schlüsselenzym im Biosyntheseweg von Cholesterin. Zweitens begünstigt das herein kommende, von LDL stammende Cholesterin die Speicherung von Cholesterin durch Aktivierung von ACHT – dem zellulären Enzym, das Cholesterin zu Cholesterylestern umwandelt, die in Speichertröpfchen abgelagert werden. Drittens treibt die Ansammlung von Cholesterin in der Zelle einen Rückkopplungsmechanismus an, der die zellulare Synthese neuer LDL-Rezeptoren hemmt. Zellen passen ihre Anzahl an LDL-Rezeptoren deshalb derart an, dass genug Cholesterin eingeschleust wird, um ihren Stoffwechselbedarf ohne Überladung zu decken (für eine Übersicht siehe Brown & Goldstein, In, The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8. Aufl., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Kapitel 36, S. 874-896)
2.2. UMGEKEHRTER CHOLESTERINTRANSPORT
Insgesamt erhalten periphere (nicht-hepatische) Zellen ihr Cholesterin durch eine Kombination aus lokaler Synthese und der Aufnahme vorgeformten Sterols aus VLDL und LDL. Unter umgekehrtem Cholesterintransport (reverser Cholesterintransport, RCT) versteht man dagegen den Weg, mit dem Cholesterin einer peripheren Zelle zurück zur Leber gebracht werden kann, um für extrahepatische Zellen wiederaufbereitet zu werden oder um als Galle in den Darm ausgeschieden zu werden, entweder in modifizierter oder in oxidierter Form als Gallensäuren. Der RCT-Weg stellt das einzige Mittel zur Eliminierung von Cholesterin aus den meisten extrahepatischen Geweben dar und ist für die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion der meisten Zellen im Körper entscheidend.
Der RCT besteht hauptsächlich aus drei Schritten: (a) dem Cholesterineinstrom, der anfänglichen Entfernung von Cholesterin aus verschiedenen Pools peripherer Zellen; (b) der Cholesterinveresterung durch die Wirkung der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT), wodurch ein Wiedereintreten des ausgeströmten Cholesterins in Zellen verhindert wird; und (c) die Aufnahme/Abgabe von HDL-Cholesterylester von/an Leberzellen. Der RCT-Weg wird von HDL vermittelt. HDL ist ein allgemeiner Begriff für Lipoproteinteilchen, die sich durch ihre hohe Dichte auszeichnen. Die Hauptlipidbestandteile von HLD-Komplexen sind verschiedene Phospholipide, Cholesterin(ester) und Triglyzeride. Die prominentesten Apolipoproteinbstandteile sind A-I und A-II, welche die Funktionseigenschaften von HDL bestimmen, des Weiteren sind geringfügigere Mengen an Apolipoprotein C-I, C-II, C-III, D, E, J, etc. beobachtet worden. HDL kann in sehr unterschiedlichen Größen und verschiedenen Mischungen der oben erwähnten Bestandteile vorkommen, je nach dem Status der Umformung während der metabolischen RCT-Kaskade.
Das am RCT-Weg beteiligte Schlüsselenzym ist LCAT. LCAT wird hauptsächlich in der Leber produziert und zirkuliert im Plasma assoziiert mit der HDL-Fraktion. LCAT wandelt aus der Zelle stammendes Cholesterin in Cholesterylester um, die anschließend in zur Beseitigung vorgesehenen HDL gebunden (sequestered) werden. Cholesterylestertransferprotein (CETP) und Phospholipidtransferprotein (PLTP) tragen zu einer weiteren Umformung der zirkulierenden HDL-Population bei. CETP kann von LCAT hergestellte Cholesterylester zu anderen Lipoproteinen verschieben, insbesondere ApoB-haltige Lipoproteine wie VLDL und LDL. PLTP liefert Lezithin an HDL. HDL-Triglyzeride können von der extrazellulären hepatischen Triglyzeridlipase katabolisiert werden und Lipoprotein-Cholesterin wird von der Leber über mehrere Mechanismen entfernt.
Jedes HDL-Teilchen enthält mindestens eine Kopie (und in der Regel zwei bis vier Kopien) von ApoA-I. ApoA-I wird von der Leber und dem Dünndarm als Präproapolipoprotein synthetisiert, das as Proprotein sezerniert wird, welches schnell gespaltet wird, um ein reifes Polypeptid mit 243 Aminosäureresten zu erzeugen. ApoA-I besteht hauptsächlich aus 6 bis 8 verschiedenen Wiederholungen von 22 Aminosäuren, die von einer Linkereinheit beabstandet sind, bei der es sich häufig um Prolin handelt und in manchen Fallen aus einer Sequenz aus mehreren Resten besteht. ApoA-I bildet drei Arten stabiler Komplexe mit Lipiden: kleine, lipidarme Komplexe, die als Prä-beta-1-HDL; abgeflachte scheibenförmige Teilchen, die polare Lipide (Phospholipid und Cholesterin) enthalten und als Prä-beta-2-HDL bezeichnet werden, und kugelförmige Teilchen, die sowohl polare als auch unpolare Lipide enthalten und als kugelförmige oder reife HDL bezeichnet werden (HDL₃ und HDL₂). Das meiste HDL in der zirkulierenden Population enthält sowohl ApoA-I als auch ApoA-II (das zweitwichtigste HDL-Protein) und wird hierin als die AI/AII-HDL-Fraktion von HDL bezeichnet. Die Fraktion von HDL, die nur ApoA-I enthält (hierin als die AI-HDL-Fraktion bezeichnet) scheint jedoch bei RCT effektiver zu sein. Bestimmte epidemiologische Studien stützen die Hypothese, dass die AI-HDL-Fraktion anti-atherogen ist (Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-707; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307).
Obgleich der Mechanismus für den Cholesterintransfer von der Zelloberfläche (d. h. der Cholesterinausstrom) unbekannt ist, wird angenommen, dass der lipidarme Komplex, Prä-beta-1-HDL, der bevorzugte Akzeptor für das von an der RCT beteiligtem peripherem Gewebe übertragene Cholesterin darstellt (siehe Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22975-22982; Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1699-1709; Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1091-1097; und Kawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-5028; Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-9825). Während dieses Vorgangs der Cholesterinrekrutierung von der Zelloberfläche wird Prä-beta-1-HDL rasch zu Prä-beta-2-HDL umgewandelt. PLTP könnte die Rate der Bildung der Prä-beta-2-Scheiben beschleunigen, aber es liegen keine Daten vor, die auf eine Rolle von PLTP bei der RCT hindeuten. LCAT reagiert vorzugsweise mit scheibenförmigem und kugelförmigem HDL, wobei die 2-Acylgruppe von Lecithin oder anderen Phospholipiden auf den freien Hydroxylrest von Cholesterin übertragen wird, um Cholesterylester (die in den HDL bleiben) und Lysolecithin herzustellen. Die LCAT-Reaktion benötigt ApoA-I als Aktivator, d.h.. ApoA-I ist der natürliche Cofaktor für LCAT. Die Umwandlung von Cholesterin in seinen in HDL verbleibenden Ester verhindert, dass Cholesterin wieder in die Zelle zurück gelangt, mit dem Ergebnis, dass Cholesterylester zur Beseitigung bestimmt sind. Cholesterylester in den reifen HDL-Teilchen in der AI-HDL-Fraktion (d. h. die ApoA-I und kein ApoA-II enthalten) werden effektiver von der Leber beseitigt und zu Galle verarbeitet, als die Cholesterylester, die von HDL stammenden, das sowohl ApoA-I als auch ApoA-II enthält (der AI/AII-HDL-Fraktion). Dies könnte teilweise auf die effektivere Bindung von AI-HDL an die Hepatozyten-Membran zurückzuführen sein. Das Vorhandensein eines HDL-Rezeptors wurde angenommen, und kürzlich wurde ein Fängerrezeptor, SR-BI, als HDL-Rezeptor identifiziert (Acton et al., 1996, Science 271:518-520; Xu et al., 1997, J. Lipid Res. 38:1289-1298). SR-BI wird am häufigsten in steroidogenen Geweben (z. B. den Nebennieren) und in der Leber exprimiert (Landshulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-995; Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-33549).
CETP scheint keine wichtige Rolle beim RCT zu spielen, sondern ist vielmehr am Stoffwechsel von VLDL und LDL abstammenden Lipiden beteiligt. Allerdings spielen Veränderungen der Aktivität der CETP oder ihrer Akzeptoren VLDL und LDL eine Rolle bei der „Umformung" der HDL-Population. Beispielsweise werden die HDL in Abwesenheit von CETP zu vergrößerten Teilchen, die nicht beseitigt werden (für Übersichtsarbeiten zu RCT und HDL siehe Fielding & Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:228-244; Barrans et al., 1996 Biochem. Biophys. Acta. 1300:73-85; Hirano et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasco Biol. 17(6) 1053-1059).
2.3. AKTUELLE BEHANDLUNGEN FÜR DYSLIPOPROTEINÄMIEN
Derzeit steht eine Reihe von Behandlungen zur Senkung des Serumcholesterins und der Serumtriglyzeride zur Verfügung (siehe z. B. Brown & Goldstein, oben). Jede hat aber ihre eigenen Nachteile und Einschränkungen in Bezug auf Wirksamkeit, Nebenwirkungen und infrage kommende Patientenpopulation.
Gallensäurebindenden Harze sind eine Klasse von Wirkstoffen, welche die Wiederaufbereitung von Gallensäuren aus dem Darm zur Leber unterbrechen, z. B. Cholestyramin (Questran Light^®, Bristol-Myers Squibb) und Colestipolhydrochlorid (Colestid^®, The Upjohn Company). Bei oraler Einnahme binden diese positiv geladenen Harze an die negativ geladenen Gallensäuren im Darm. Weil die Harze vom Darm nicht resorbiert werden können, werden sie ausgeschieden, wobei sie die Gallensäulen mitnehmen. Die Verwendung solcher Harze erreicht aber bestenfalls eine Senkung des Cholesterinserumspiegels um etwa 20% und ist mit Nebenwirkungen im Magendarmtrakt verbunden, einschließlich Verstopfung und bestimmter Vitaminmangelzustände. Da die Harze an andere Wirkstoffe binden, müssen darüber hinaus andere orale Medikamente mindestens eine Stunde vor oder vier bis sechs Stunden nach der Einnahme des Harzes genommen werden; dadurch verkompliziert sich der Medikamenteneinnahmeplan des Herzkranken.
Stative sind Cholesterin senkende Mittel, welche die Cholesterinsynthese durch Hemmung der HMGCoA-Reduktase blockieren, dem am Biosyntheseweg von Cholesterin beteiligten Schlüsselenzym. Die Statine, z. B. Lovastatin (Mevacor^®, Merck & Co., Inc.) und Pravastatin (Pravachol^®, Bristol-Myers Squibb Co.) werden bisweilen in Kombination mit Gallensäuren bindenden Harzen eingesetzt. Die Statine bewirken eine signifikante Senkung des Serumspiegels von Cholesterin und LDL und verlangsamen das Fortschreiten einer koronaren Atherosklerose. Der Serumspiegel an HDL-Cholesterin wird aber nur mäßig erhöht. Der Mechanismus der senkenden Wirkung auf LDL könnte sowohl die Reduzierung der VLDL-Konzentration als auch die Induktion der zellulären Expression von LDL-Rezeptor umfassen, was zu einer verringerten Produktion und/oder einem erhöhten Abbau von LDL führt. Mit der Verwendung dieser Wirkstoffe sind Nebenwirkungen wie Leber- und Nierenfunktionsstörungen verbunden (Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J., 1997). Die FDA hat vor kurzem Atovastatin (ein von Parke-Davis entwickelter HMGCoA-Reduktaseinhibitor) (Warner Lambert) die Marktzulassung zur Behandlung seltener, aber dringender Fälle an familiärer Hypercholesterinämie erteilt (1995, Scrip 20(19):10).
Niacin oder Nikotinsäure ist ein wasserlöslicher Vitamin-B-Komplex, der als Nahrungsergänzungsmittel und antihyperlipidämisches Mittel verwendet wird. Niacin vermindert die Produktion von VLDL und wirkt LDL-senkend. In einigen Fällen wird es in Kombination mit Gallensäure bindenden Harzen verwendet. Niacin kann HDL erhöhen, wenn es in angemessenen Dosen verwendet wird, sein Nutzen wird allerdings durch schwere Nebenwirkungen bei Verwendung bei solch hohen Dosen eingeschränkt.
Fibrate sind eine Klasse von Lipid senkenden Wirkstoffen, die zur Behandlung verschiedener Formen einer Hyperlipidämie verwendet werden (d. h. erhöhte Serumtriglyzeride), die auch mit einer Hypercholesterinämie assoziiert sein können. Fibrate scheinen die VLDL-Fraktion zu verringern und HDL moderat zu erhöhen – allerdings ist der Effekt dieser Wirkstoffe auf das Serumcholesterin variabel. In den Vereinigten Staaten sind Fibrate für die Anwendung als antilipidämische Wirkstoffe zugelassen, haben aber noch nicht die Zulassung als Mittel gegen Hypercholesterinämie erhalten. Beispielsweise ist Clofibrat (Atromid-S^®, Wyeth-Ayerst Laboratories) ein antilipidämisches Mittel, das (über einen unbekannten Mechanismus) durch Reduzierung der VLDL-Fraktion senkend auf Serumtriglyzeride wirkt. Obgleich das Serumcholesterin bei manchen Patientensubpopulationen gesenkt sein kann, ist das biochemische Ansprechen auf den Wirkstoff variabel und es ist nicht immer möglich vorherzusagen, welche Patienten günstige Ergebnisse erhalten. Atromid-S^® hat sich hinsichtlich der Vorbeugung einer koronaren Herzkrankheit nicht als wirksam erwiesen. Der chemisch und pharmakologisch verwandte Wirkstoff Gemfibrozil (Lopid^®, Parke-Davis) ist ein Lipid regulierendes Mittel, das Serumtriglyzeride und VLDL-Cholesterin mäßig senkt und HLD-Cholesterin mäßig erhöht – die HDL2- und HDL3-Unterfraktionen sowie ApoA-I und A-II (d. h. die AI/AII-HDL-Fraktion). Die Lipidreaktion ist allerdings heterogen, vor allem bei verschiedenen Patientenpopulationen. Obgleich außerdem zwar eine Prävention einer koronaren Herzkrankheit bei männlichen Patienten zwischen 40 und 55 Jahren ohne Krankengeschichte oder Symptome vorhandener koronarer Herzkrankheit beobachtet wurde, ist es jedoch nicht klar, in welchem Maß diese Befunde auf andere Patientenpopulationen (z. B. Frauen, ältere und jüngere Männer) extrapolierbar sind. Tatsächlich wurde bei Patienten mit etablierter koronarer Herzkrankheit keine Wirksamkeit beobachtet. Mit dem Gebrauch von Fibraten sind schwere Nebenwirkungen assoziiert, einschließlich Toxizität, wie beispielsweise Malignome (insbesondere Magendarmkrebs), Gallenblasenerkrankung und eine erhöhte Inzidenz an nicht koronarer Mortalität. Diese Wirkstoffe sind nicht für die Behandlung von Patienten mit hohem LDL oder niedrigem HDL als einzige Lipidanomalie bestimmt (Physician's Desk Reference, 1997, Medical Economics Co., Inc. Montvale, N.J.).
Bei moderater Hypercholesterinämie bei postmenopausalen Frauen kann eine orale Estrogenersatztherapie in Betracht gezogen werden. Ein Anstieg des HDL kann aber von einem Anstieg der Triglyzeride begleitet sein. Eine Estrogenbehandlung ist natürlich auf eine bestimmte Patientenpopulation (postmenopausale Frauen) beschränkt und geht mit schweren Nebenwirkungen einher, einschließlich der Induktion maligner Neoplasien, Gallenblasenkrankheit, thromboembolische Krankheit, hepatisches Adenom, erhöhter Blutdruck, Glukoseintoleranz und Hyperkalziämie.
Es besteht daher die Notwendigkeit zur Entwicklung sicherer Medikamente, die wirksam das Serumcholesterin senken, den HDL-Serumspiegel erhöhen, koronare Herzkrankheit verhindern und/oder bestehende Krankheiten, insbesondere Atherosklerose, behandeln.
2.4. ApoA-I ALS ZIEL
Keines der derzeit verfügbaren Medikamente zur Senkung von Cholesterin erhöht sicher den HDL-Spiegel und stimuliert den RCT – die meisten scheinen auf den Cholesterintransportweg zu wirken, wobei die nahrungsbedingte Aufnahme, die Wiederaufbereitung und Synthese von Cholesterin und die VLDL-Population moduliert werden.
Während es wünschenswert ist, Wirkstoffe zu finden, die den Ausstrom und die Beseitigung von Cholesterin stimulieren, gibt es mehrere mögliche Ziele beim RCT – z. B. LCAT, HDL und seine verschiedenen Komponenten (ApoA-I, ApoA-II und Phospholipide), PLTP und CETP –, und es ist nicht bekannt, welches Ziel am wirksamsten wäre, um die wünschenswerten Lipoproteinprofile und Schutzeffekte zu erzielen. Die Störung eines einzelnen Bestandteils des RCT-Wegs beeinflusst letztendlich die Zusammensetzung zirkulierender Lipoproteinpopulationen und die Effizienz des RCT.
Mehrere auf in vivo erhaltenen Daten basierende Beweislinien legen nahe, dass HDL und seine Hauptproteinkomponente, ApoA-I, bei der Prävention atherosklerotischer Läsionen und möglicherweise der Rückbildung von Plaques eine Rolle spielen, was sie zu attraktiven Zielen für therapeutische Maßnahmen macht. Erstens besteht beim Menschen eine umgekehrte Korrelation zwischen der Serumkonzentration von ApoA-I (HDL) und der Atherogenese (Gordon & Rifkind, 1989, N. Eng. J. Med. 321:1311-1316; Gordon et al., 1989, Circulation 79:8-15). Tatsächlich sind bestimmte Unterpopulationen von HDL mit einem verringerten Atheroskleroserisiko beim Menschen in Verbindung gebracht worden (Miller, 1987, Amer. Heart 113:589-597; Cheung et al., 1991, Lipid Res. 32:383-394); Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38:79).
Zweitens belegen Tierstudien die schützende Rolle von ApoA-I (HDL). Die Behandlung von mit Cholesterin gefütterten Kaninchen mit ApoA-I oder HDL verringerte die Entwicklung und das Fortschreiten von Plaque (Fettstreifen, Fatty Streaks) bei mit Cholesterin gefütterten Kaninchen (Koizumi et al., 1988, J. Lipid Res. 29:1405-1415; Badimon et al., 1989, Lab. Invest. 60:455-461; Badimon et al., 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-1241). Die Wirksamkeit variierte jedoch je nach Herkunft von HDL (Beitz et al., 1992, Prostaglandins, Leukotrienes und Essential Fatty Acids 47:149-152; Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113:237-246).
Drittens stammen direkte Hinweise für die Rolle von ApoA-I aus Experimenten mit transgenen Tieren. Die Expression des menschlichen Gens für ApoA-I, auf Mäuse mit genetischer Prädisposition für ernährungsbedingte Atherosklerose übertragen, schützte vor der Entwicklung aortaler Läsionen (Rubin et al., 1991, Nature 353:265-267). Das ApoA-I-Transgen unterdrückte außerdem Atherosklerose bei ApoE-defizienten Mäusen und bei Apo(a)-transgenen Mäusen (Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:899-903; Plump et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611; Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35:2263-2266). Ähnliche Ergebnisse wurden bei transgenen Kaninchen beobachtet, die humanes ApoA-I exprimieren (Duverger, 1996, Circulation 94:713-717; Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasco Biol. 16:1424-1429), sowie bei transgenen Ratten, bei denen ein erhöhter Spiegel von humanem ApoA-I vor Atherosklerose schützte und eine Restenose nach Ballon-Angioplastie hemmte (Burkey et al., 1992, Circulation, Supplement I, 86:1-472, Kurzzusammenfassung Nr. 1876; Burkey et al., 1995, J. Lipid Res. 36:1463-1473).
AI-HDL scheint beim RCT wirksamer zu sein als die AI/AII-HDL-Fraktion. Studien mit Mäusen, die für das humane ApoA-I oder Apo-I und ApoA-II (AI/AII) transgen sind, zeigten, dass die Proteinzusammensetzung von HDL seine Rolle signifikant beeinflusst – AI-HDL hat eine stärkere anti-atherogene Wirkung als AI/AII-HDL (Schultz et al., 1993, Nature 365:762-764). Parallelstudien mit transgenen Mäusen, die das humane LCAT-Gen exprimieren, zeigen, dass ein moderater Anstieg der LCAT-Aktivität den Lipoproteincholesterinspiegel signifikant verändert und dass LCAT HDL mit ApoA-I signifikant bevorzugt (Francone et al., 1995, J. Clinic. Invest. 96:1440-1448; Berard et al., 1997, Nature Medicine 3(7):744-749). Während diese Daten eine signifikante Rolle von ApoA-I bei der Aktivierung von LCAT und der Stimulation des RCT unterstützen, zeigen andere Studien ein komplizierteres Szenario: Ein Hauptbestandteil von HDL, der den Ausstrom von zellulärem Cholesterin moduliert, sind die Phospholipide (Fournier et al., 1996, J. Lipid Res. 37:1704-1711).
In Anbetracht der möglichen Rolle von HDL, d. h. sowohl von ApoA-I als auch dem assoziierten Phospholipid, beim Schutz vor atherosklerotischer Krankheit wurden klinische Studien am Menschen, in denen rekombinant hergestelltes ApoA-I verwendet wurde, begonnen, abgebrochen und scheinbar von UCB Belgium wieder aufgenommen (Pharmaprojects, 27. Okt. 1995; IMS R & D Focus, 30. Juni 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2(6):261-265); siehe auch M. Eriksson auf dem Kongress „The Role of HDL in Disease Prevention", 7.-9. Nov 1996, Fort Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lip. Res. 38:1267-1273; und WO94/13819 ) und von Bio-Tech begonnen und abgebrochen (Pharmaprojects, 7. April 1989). Es wurde auch versucht, ApoA-I zur Behandlung von septischem Schock zu verwenden (Opal, „Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis" IBC's 7th International Conference an Sepsis, 28.-30. April 1997, Washington, D.C.; Gouni et al., 1993, J. Lipid Res. 94:139-146; Levine, WO96/04916 ). Allerdings gibt es bei der Produktion und Verwendung von ApoA-I viele Stolperfallen, was es als Wirkstoff suboptimal macht; beispielsweise ist ApoA-I ein großes Protein, das schwierig und teuer herzustellen ist; es müssen erhebliche Herstellungs- und Reproduktionsprobleme im Hinblick auf die Stabilität während der Aufbewahrung, die Verabreichung eines aktiven Produktes und die Halbwertszeit in vivo überwunden werden.
In Anbetracht dieser Nachteile wurde versucht, Peptide herzustellen, die ApoA-I nachahmen. Da die Schlüsselaktivitäten von ApoA-I dem Vorhandensein mehrerer Wiederholungen eines einmaligen Sekundärstrukturmerkmals in dem Protein zugeschrieben wurde – einer amphipathischen α-Helix der Klasse A (Segrest, 1974, FEBS Lett. 38:247-253), konzentrierten sich die meisten Anstrengungen zur Entwicklung von Peptiden mit ähnlicher Aktivität wie ApoA-I auf den Entwurf von Peptiden, die amphipathische α-Helices vom Klasse-A-Typ bilden.
Amphipathische α-Helices vom Klasse-A-Typ sind insofern einmalig, als an der Übergangsstelle von hydrophob zu hydrophil positiv geladene Aminosäurereste gruppiert (geclustert) sind und im Zentrum der hydrophilen Fläche negativ geladene Aminosäurereste gruppiert (geclustert) sind. Darüber hinaus weisen Peptide mit α-Helix der Klasse A einen hydrophoben Winkel von weniger als 180° auf (Segrest et al., 1990, PROTEINS: Structure, Function und Genetics 8:103-117). Die ersten De-novo-Strategien zum Entwurf von ApoA-I-Mimetika beruhten nicht auf den Primärsequenzen natürlich vorkommender Apolipoproteine, sondern darauf, diese einmaligen Klasse-A-Helix-Merkmale sowie einige der Eigenschaften der ApoA-I-Domänen in die Sequenzen der Peptidanaloga einzubauen (siehe z. B. Davidson et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13605-13610; Rogers et al., 1997, Biochemistry 36:288-300; Lins et. al., 1993, Biochim. Biophys. Acta biomembranes 1151:137-142; Ji and Jonas, 1995, J. Biol. Chem. 270:11290-11297; Collet et al., 1997, Journal of Lipid Research, 38:634-644; Sparrow and Gotto, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 348:187-211; Sparrow and Gotto, 1982, CRC Crit. Rev. Biochem. 13:87-107; Sorci-Thomas et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:21403-21409; Wang et al., 1996, Biochim. Biophys. Acta 174-184; Minnich et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:16553-16560; Holvoet et al., 1995, Biochemistry 34:13334-13342; Sorci-Thomas et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(11):7278-7284; und Frank et al., 1997, Biochemistry 36:1798-1806).
In einer Studie synthetisierten Fukushima et al. ein Peptid mit 22 Resten, das vollständig aus Glu-, Lys- und Leu-Resten bestand, die regelmäßig angeordnet waren, um eine amphipathische α-Helix mit gleichen hydrophilen und hydrophoben Flächen zu bilden („ELK-Peptid") (Fukushima et al., 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13):3703-3704; Fukushima et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:10651-10657). Das ELK-Peptid teilt eine Sequenzhomologie von 41% mit dem Fragment 198-219 von ApoA-I. Wie durch quantitative Ultrafiltration, Gelpermeationschromatographie und Cirkulardichroismus untersucht wurde, ist dieses ELK-Peptid wirksam mit Phospholipiden assoziiert und ahmt einige der physikalischen und chemischen Eigenschaften von ApoA-I nach (Kaiser et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1137-1140; Kaiser et al., 1984, Science 223:249-255; Fukushima et al., 1980, oben; Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092). Yokoyama et al. folgerten aus diesen Untersuchungen, dass der entscheidende Faktor für die Aktivierung von LACT einfach das Vorhandensein einer amphipathischen Struktur ausreichender Größe ist (Yokoyama et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(15):7333-7339). Später wurde festgestellt, dass ein Dimer dieses Peptids mit 22 Resten ApoA-I enger nachahmt als das Monomer; ausgehend von diesen Ergebnissen wurde vorgeschlagen, dass das 44-Mer, das in der Mitte von einem Helix-Breaker (Aminosäure, welche die Helix aufbricht) (entweder Gly oder Pro) unterbrochen wird, die Mindestfunktionsdomäne bei ApoA-I darstellt (Nakagawa et al., 1985, oben).
In einer anderen Studie wurden amphipathische Peptide verwendet, die so genannten „LAP-Peptide" (Pownall et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(6):3154-3158; Sparrow et al., 1981, In: Peptides: Synthesis-Structure-Function, Roch and Gross, Hrsg., Pierce Chem. Co., Rockford, 253-256). Basierend auf Lipidbindungsstudien mit Fragmenten nativer Apolipoproteine wurden mehrere LAP-Peptide mit der Bezeichnung LAP-16, LAP-20 und LAP-24 entworfen (die 16, 20 bzw. 24 Aminosäurereste aufweisen). Diese Modelle für amphipathische Peptide weisen keine Sequenzhomologie mit den Apolipoproteinen auf und wurden entworfen, um hydrophile Flächen aufzuweisen, die auf andere Weise wie bei den mit Apolipoproteinen assoziierten amphipathischen Helixdomänen vom Klasse-A-Typ organisiert sind (Segrest et al., 1992, J. Lipid Res. 33:141-166). Aus diesen Untersuchungen zogen die Autoren den Schluss, dass eine Mindestlänge von Resten erforderlich ist, um den amphipathischen Peptidmodellen Lipid bindende Eigenschaften zu verleihen.
Studien mit Mutanten von LAP20 mit einem Prolinrest an verschiedenen Positionen in der Sequenz deuteten darauf hin, dass zwischen der Lipidbindung und LCAT-Aktivierung ein direkter Zusammenhang besteht, aber das helikale Potenzial eines Peptids alleine nicht zur Aktivierung von LCAT führt (Ponsin et al., 1986 J. Biol. Chem. 261(20):9202-9205). Darüber hinaus reduziert das Vorhandensein dieses Helix-Breakers (Pro) in der Nähe der Mitte des Peptids dessen Affinität für Phospholipidflächen sowie seine Fähigkeit zur Aktivierung von LCAT. Obgleich bestimmte LAP-Peptide Phospholipide banden (Sparrow et al., oben), bestehen Unstimmigkeiten hinsichtlich des Ausmaßes, in dem LAP-Peptide in Gegenwart von Lipiden helikal sind (Buchko et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(6):3039-3045; Zhong et al., 1994, Peptide Research 7(2):99-106).
Segrest et al. haben Peptide synthetisiert, die aus 18 bis 24 Aminosäureresten zusammengesetzt sind, die keine Sequenzhomologie mit den Helices von ApoA-I teilen (Kannelis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(3):11464-11472; Segrest et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2290-2295). Die Sequenzen waren insbesondere entworfen, um die amphipathischen helikalen Domänen von austauschbaren Klasse-A-Apolipoproteinen in Bezug auf das hydrophobe Moment (Eisenberg et al., 1982, Nature 299:371-374) und Ladungsverteilung (Segrest et al., 1990, Proteins 8:103-117; U.S. Patent Nr. 4643988 ) nachzuahmen. Ein Peptid mit 18 Resten, das „18A"-Peptid, wurde entworfen, um ein Modell für eine α-Helix der Klasse A zu sein (Segrest et al., 1990, oben). Studien mit diesen Peptiden und anderen Peptiden mit umgekehrter Ladungsverteilung, wie dem „18R"-Peptid, zeigten übereinstimmend, dass die Ladungsverteilung fix die Aktivität entscheidend ist; Peptide mit umgekehrter Ladungsverteilung zeigen relativ zu den 18A-Klasse-A-Mimetika eine verminderte Lipidaffinität und einen niedrigeren Helixgehalt in Gegenwart von Lipiden (Kanellis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:11464-11472; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10255; Chung et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10256-10262; Eiland et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:9389-9396; Anantharamaiah et al., 1991, Adv. Exil. Med. Biol. 285:131-140).
Andere synthetische Peptide, die keine Sequenzhomologie mit den Apolipoproteinen teilen und die mit eingeschränktem Erfolg vorgeschlagen wurden, umfassen Diniere und Trimere des 18A-Peptids (Anantharamaiah et al., 1986, Proteins of Biological Fluids 34:63-66), GALA- und EALA-Peptide (Subbarao et al., 1988, PROTEINS: Structure, Function und Genetics 3:187-198) und ID-Peptide (Labeur et al., 1997, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17:580-588) und das 18AM4-Peptid (Brasseur et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7).
Es wurde auch ein „Konsensus"-Peptid mit 22 Aminosäureresten basierend auf den Sequenzen der Helices von humanem ApoA-I entworfen (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105; Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B;585-596). Die Sequenz wurde konstruiert, indem der prävalenteste Rest an jeder Position der hypothetischen Helices von humanem ApoA-I identifiziert wurde. Wie die oben beschriebenen Peptide weist die von diesem Peptid gebildete Helix positiv geladene Aminosäurereste auf, die an der hydrophilen-hydrophoben Übergangsstelle gruppiert sind, negativ geladene Aminosäuren, die in der Mitte der hydrophilen Fläche gruppiert sind, und einen hydrophoben Winkel von weniger als 180°. Obgleich ein Dimer dieses Peptids bei der Aktivierung von LCAT einigermaßen effektiv ist, zeigte das Monomer schlechte Lipidbindungseigenschaften (Venkatachalapathi et al., 1991, oben).
Hauptsächlich ausgehend von In-vitro-Studien mit den oben beschriebenen Peptiden hat sich ein „Regelsatz" zum Entwurf von Peptiden herausgebildet, welche die Funktion von ApoA-I nachahmen. Signifikanterweise wird angenommen, dass eine amphipathische α-Helix mit positiv geladenen Resten, die an der hydrophilen-hydrophoben Übergangsstelle gruppiert sind, und negativ geladenen Aminosäuren, die in der Mitte der hydrophilen Flache gruppiert sind, für Lipidaffinität und LCAT-Aktivierung erforderlich ist (Venkatachalapathi et al., 1991, oben). Anantharamaiah et al. haben darüber hinaus darauf hingewiesen, dass der negativ geladene Glu-Rest an Position 13 des 22-Mer-Konsensuspeptids, der innerhalb der hydrophoben Fläche der α-Helix positioniert ist, eine wichtige Rolle bei der LCAT-Aktivierung spielt (Anantharamaiah et al., 1991, oben). Brasseur hat darüber hinaus darauf hingewiesen, dass ein hydrophober Winkel (Winkel Pho) von weniger als 180° für optimale Stabilität des Lipid-Apolipoproteinkomplexes erforderlich ist und auch für die Bildung scheibenförmiger Teilchen verantwortlich ist, bei denen die Peptide um den Rand der Lipiddoppelschicht herum liegen (Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66(24):16120-16127). Rosseneu et al. bestanden ferner darauf, dass ein hydrophober Winkel von weniger als 180° für die LCAT-Aktivierung erforderlich ist ( WO93/25581 ).
Trotz dieser „Regeln" hat bislang niemand ein Peptid entworfen oder hergestellt, das so aktiv wie ApoA-I ist – wobei die Besten weniger als 40% der Aktivität von ApoA-I haben, wie im hierin beschriebenen LCAT-Aktivierungstest gemessen wurde. Keines der in der Literatur beschriebenen Peptid-„Mimetika" zeigte sich nützlich als Wirkstoff.
In Anbetracht des Vorhergehenden besteht ein Bedarf für die Entwicklung eines stabilen ApoA-I-Agonisten, der die Aktivität von ApoA-I nachahmt und der relativ einfach und kostenwirksam zu produzieren ist. Die „Regeln" für das Entwerfen wirksamer ApoA-I-Mimetika sind jedoch noch nicht entdeckt wurden, und die Prinzipien für das Entwerfen organischer Moleküle mit der Funktion von ApoA-I sind unbekannt.
3. KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ApoA-I-Agonisten, die amphipathische α-Helices bilden können und die Aktivität von ApoA-I nachahmen, mit spezifischen Aktivitäten, d.h.. Aktivitätseinheiten (Aktivierung von LCAT/Masseneinheit), welche sich an die des nativen Moleküls annähern oder diese übertreffen. Insbesondere handelt es sich bei den erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten um Peptide oder Peptidana loga, die aphipathische Helices bilden (in Gegenwart von Lipiden), Lipide binden, prä-β-artige oder HDL-artige Komplexe bilden, LCAT aktivieren, den Serumspiegel von HDL-Fraktionen erhöhen und den Cholesterinausstrom begünstigen.
Die Erfindung beruht zum Teil auf dem Entwurf und der Entdeckung von Peptiden durch die Anmelder, welche die Funktion von ApoA-I nachahmen. Die erfindungsgemäßen Peptide wurden auf Basis der angenommenen Helixstrukturen und amphipathischen Eigenschaften der Konsensussequenz aus 22 Aminosäuren entworfen, die von den helikalen Wiederholungen von ApoA-I abgeleitet wurde. Überraschenderweise haben die erfindungsgemäßen Peptide eine spezifische Aktivität, die deutlich über der für von ApoA-I abstammenden Peptiden in der Literatur Berichteten liegt. Tatsächlich erreichen einige Ausführungsformen der Erfindung nahezu 100% der Aktivität von nativem ApoA-I, während hierin beschriebenen Superagonisten die spezifische Aktivität von ApoA-I übersteigen.
Die Erfindung wird anhand von Arbeitsbeispielen veranschaulicht, welche die Struktur, Herstellung und Verwendung bestimmter amphipathischer Peptide beschreiben, die Helices bilden (in Gegenwart von Lipiden), Lipide binden, Komplexe bilden und die LCAT-Aktivität erhöhen. Ausgehend von der Struktur und Aktivität der beispielhaft angeführten Ausführungsformen haben die Anmelder einen Satz von „Regeln" aufgestellt, die verwendet werden können, um veränderte bzw. mutierte Formen zu entwerfen, welche ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten sind.
Die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Formulierungen, die solche ApoA-I-Agonisten als Wirkstoff enthalten (entweder als Peptide oder peptidartige Komplexe), sowie Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen und deren Verwendung zur Behandlung von Krankheiten in Verbindung mit Dyslipoproteinämie (z. B. Herz-Kreislauf-Krankheiten, Atherosklerose, metabolisches Syndrom, Restenose oder Endotoxämie (z. B. septischer Schock).
3.1. ABKÜRZUNGEN

Wie hierin verwendet, sind die Abkürzungen für die genetisch kodierten L-enantiomeren Aminosäuren konventionell und wie folgt:

Aminosäure	Ein-Buchstaben-Symbol	Übliche Abkürzung
Alanin	A	Ala
Arginin	R	Arg
Asparagin	N	Asn
Asparaginsäure	D	Asp
Cystein	C	Cys
Glutamin	Q	Gln
Glutaminsäure	E	Glu
Glycin	G	Gly
Histidin	H	His
Isoleucin	I	Ile
Leucin	L	Leu
Lysin	K	Lys
Methionin	M	Met
Phenylalanin	F	Phe
Prolin	P	Pro
Serin	S	Ser
Threonin	T	Thr
Tryptophan	W	Trp
Tyrosin	Y	Tyr
Valin	V	Val

Die für die D-Enantiomere der genetisch kodierten Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind kleinbuchstabige Äquivalente der Ein-Buchstaben-Symbole. Beispielsweise bezeichnet „R" L-Arginin, und „r" bezeichnet D-Arginin.
3.2. DEFINITIONEN
Wie hierin verwendet haben die folgenden Begriffe folgende Bedeutungen:

„Alkyl": bezeichnet ein gesättigtes verzweigtes geradkettiges oder zyklisches Kohlenwasserstoffradikal. Typische Alkylgruppen umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Alkylgruppen (C₁-C₆)Alkyl.
„Alkenyl": bezeichnet ein ungesättigtes verzweigtes geradkettiges oder zyklisches Kohlenwasserstoffradikal mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung. Das Radikal kann entweder in der cis- oder trans-Konformation um die Doppelbindung(en) vorliegen. Typische Alkenylgruppen umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, Butenyl, Isobutenyl, tert-Butenyl, Pentenyl, Hexenyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkenylgruppe (C₁-C₆)Alkenyl.
„Alkynyl": bezeichnet ein ungesättigtes verzweigtes geradkettiges oder zyklisches Kohlenwasserstoffradikal mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung. Typische Alkynylgruppen umfassen, jedoch nicht ausschließlich Ethynyl, Propynyl, Butynyl, Isobutynyl, Pentynyl, Hexynyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkynylgruppe (C₁-C₆)Alkynyl.
„Aryl": bezeichnet ein ungesättigtes zyklisches Kohlenwasserstoffradikal mit einem konjugierten π-Elektronensystem. Typische Arylgruppen umfassen, jedoch nicht ausschließlich Penta-2,4-dien, Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Azulenyl, Chrysenyl, Coronenyl, Fluoranthenyl, Indacenyl, Idenyl, Ovalenyl, Perylenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, Picenyl, Pleiadenyl, Pyrenyl, Pyranthrenyl, Rubicenyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylgruppe (C₅-C₂₀)Aryl, wobei (C₅-C₁₀) besonders bevorzugt ist.
„Alkaryl": bezeichnet eine geradkettige Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynylgruppe, wobei eines der an einen endständigen Kohlenstoff gebundenen Wasserstoffatome durch eine Aryleinheit ersetzt ist. Typische Alkarylgruppen umfassen, aber nicht ausschließlich, Benzyl, Benzyliden, Benzylidyn, Benzenobenzyl, Naphthenobenzyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkarylgruppe (C₆-C₂₆)Alkaryl, d. h. die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynyleinheit der Alkarylgruppe ist (C₁-C₆) und die Aryleinheit ist (C₅-C₂₀). In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkarylgruppe (C₆-C₁₃)Alkaryl, d. h. die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynyleinheit der Alkarylgruppe ist (C₁-C₃) und die Aryleinheit ist (C₅-C₁₀).
„Heteroaryl": bezeichnet eine Aryleinheit, bei der eines oder mehrere Kohlenstoffatome durch ein anderes Atom ersetzt sind, wie beispielsweise durch N, P, O, S, As, Se, Si, Te, etc. Typische Heteroarylgruppen umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Acridarsin, Acridin, Arsanthridin, Arsindol, Arsindolin, Carbazol, β-Carbolin, Chromen, Cinnolin, Furan, Imidazol, Indazol, Indol, Indolizin, Isoarsindol, Isoarsinolin, Isobenzofuran, Isochromen, Isoindol, Isophosphoindol, Isophosphinolin, Isochinolin, Isothiazol, Isoxazol, Naphthyridin, Perimidin, Phenanthridin, Phenanthrolin, Phenazin, Phosphoindol, Phosphinolin, Phthalazin, Pteridin, Purin, Pyran, Pyrazin, Pyrazol, Pyridazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrol, Pyrrolizin, Chinazolin, Chinilin, Chinolizin, Chinoxalin, Selenophen, Tellurophen, Thiophen und Xanthen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylgruppe ein 5- bis 20-gliqedriges Heteroaryl, wobei ein 5- bis 10-gliedriges Aryl besonders bevorzugt ist.
„Alkheteroaryl": bezeichnet eine geradkettige Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynylgruppe, wobei eines der an einen endständigen Kohlenstoff gebundenen Wasserstoffatome durch eine Heteroaryleinheit ersetzt ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkheteroarylgruppe ein 6- bis 26-gliedriges Alkheteroaryl, d. h. die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynyleinheit des Alkheteroaryl ist (C₁-C₆) und das Heteroaryl ist ein 5- bis 20-gliedriges Heteroaryl. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Alkheteroaryl ein 6- bis 13-gliedriges Alkheteroaryl, d. h. die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynyleinheit ist ein 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl.
„Substituiertes Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Alkaryl, Heteroaryl oder Alkheteroaryl": bezeichnet eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Aryl-, Alkaryl-, Heteroaryl- oder Alkheteroarylgruppe, bei der eines oder mehrere Wasserstoffatome durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Bevorzugte Substituenten umfassen -OR, -SR, -NRR, -NO₂, -CN, Halogen, -C(O)R, -C(O)OR und -C(O)NR, wobei jedes R unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Alkaryl, Heteroaryl oder Alkheteroaryl ist.

4. KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A ist ein Helixraddiagramm nach Schiffer-Edmundson einer idealisierten amphipathischen α-Helix, in der ungefüllte Kreise hydrophile Aminosäure darstellen und gepunktete Kreise hydrophobe Aminosäurereste darstellen.
1B ist ein Helixnetzdiagramm der idealisierten amphipathischen Helix von 1A.
1C ist ein Helixzylinderdiagramm der idealisierten amphipathischen Helix von 1A.
2A ist ein Helixraddiagramm nach Schiffer-Edmundson des Kernpeptids der Struktur (I), welches die Amphipathie der Helix veranschaulicht (ungefüllte Kreise stellen hydrophile Aminosäure dar, gepunktete Kreise stellen hydrophobe Aminosäurereste dar und teilweise gepunktete Kreise stellen entweder hydrophile oder hydrophobe Aminosäurereste dar).
2B ist ein Helixnetzdiagramm des Kernpeptids der Struktur (1), wobei die hydrophobe Flache der Helix veranschaulicht ist.
2C ist ein Helixnetzdiagramm des Kernpeptids der Struktur (I), wobei die hydrophile Flache der Helix veranschaulicht ist
3A ist ein Helixnetzdiagramm, welches die hydrophile Fläche des Konsensus-22-Mers von Segrest veranschaulicht (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID Nr.:75).
3B ist ein Helixnetzdiagramm, das die hydrophile Fläche des beispielhaften Kernpeptids 146 (PVLELFENLLERLLDALQKKLK; SEQ ID Nr.:146) veranschaulicht.
4A ist ein Helixnetzdiagramm, das die hydrophobe Fläche des Konsensus-22-Mers von Segrest veranschaulicht (SEQ ID Nr.:75).
4B ist ein Helixnetzdiagramm, das die hydrophobe Fläche des beispielhaften Kernpeptids 146 (SEQ ID Nr.:146) veranschaulicht.
5A ist ein Helixraddiagramm nach Schiffer-Edmundson des Konsensus-22-Mers von Segrest (SEQ ID Nr.:75).
5B ist ein Helixraddiagramm nach Schiffer-Edmundson des beispielhaften Kernpeptids 146 (SEQ ID Nr.:146).
6 ist ein Rechnermodell von zwei 146er-Peptiden (SEQ ID NO:146), die auf antiparallele Weise angeordnet sind, bei denen Glu-7 und Gln-18 hervorgehoben sind, um die Fähigkeit dieser beiden Peptide zur Bildung intermolekularer Wasserstoffbindungen bei Bindung an Lipiden auszubilden.
7A veranschaulicht ein verzweigtes Netzwerk dritten Grades der Erfindung.
7B veranschaulicht ein verzweigtes Netzwerk vierten Grades der Erfirndung.
7C veranschaulicht ein verzweigtes Netzwerk gemischten Grades der Erfindung.
7D veranschaulicht beispielhafte „Lys-Baum"-verzweigte Netzwerke der Erfindung.
8A ist ein Schaubild, das die Unterschiede zwischen den beobachteten chemischen Hα-Verschiebungen und den tabellierten chemischen Hα-Random-Coil-Verschiebungen für Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) und das 22-Mer-Konsensuspeptid von Segrest (SEQ ID Nr.:75) veranschaulicht.
8B ist ein Schaubild, das die Unterschiede zwischen den beobachteten chemischen Amidprotonen-Verschiebungen und den tabellierten chemischen Random-Coil-Amidprotonen-Verschiebungen für Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) und das 22-Mer-Konsensuspeptid von Segrest (SEQ ID Nr.:75) veranschaulicht.
8C ist ein Schaubild, das die sekundären chemischen Amidprotonen-Verschiebungen für Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146)
mit denen einer idealisierten α-Helix
vergleicht (in der idealisierten Helix sind hydrophile Reste als ungefüllte Kreise, hydrophobe Reste als gefüllte Kreise dargestellt).
9 ist ein Schaubild, welches das Lipoproteinprofil eines Kaninchens veranschaulicht, dem 8 mg/kg Körpergewicht von Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) injiziert wurden (in der Form von Peptid/DPPC-Komplexen).
10A ist eine Zeichnung, welche die verschiedenen Aggregatzustände und Peptidlipidkomplexe darstellt, die mit den ApoA-I-Agonisten der Erfindung erhalten werden können. Links: Multimerisierungsprozess der Peptide, der aus der Wechselwirkung mehrerer Peptidhelices resultiert und unter Bedingungen einer definierten Peptidkonzentration, eines definierten pH-Wertes und einer definierten Ionenstärke zur Bildung von Oligomeren führt. Mitte: Die Wechselwirkung der Peptide (in jedem dieser Aggregatzustände) mit Lipideinheiten (wie beispielsweise SUV) führt zur Lipidreorganisation. Rechts: Durch Änderung des molaren Verhältnisses von Lipid zu Peptid lassen sich verschiedene Arten von Peptid-Lipid-Komplexen erhalten, von Lipid-Peptid-Co-Mizellen mit niedrigen Lipid-Peptid-Verhältnissen zu scheibenförmigen Teilchen und schließlich zu großen mehrschichtigen Komplexen mit steigenden Lipid-Peptid-Verhältnissen
10B veranschaulicht das allgemein anerkannte Modell für scheibenförmige Peptid-Lipid-Komplexe, die sich in einem definierten Bereich von Lipid:Peptid-Verhältnissen bilden. Jedes den Scheibenrand umgebende Peptid befindet sich in engem Kontakt mit seinen beiden nächsten Nachbarn.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung ahmen die Funktion und Aktivität von ApoA-I nach. Die bilden amphipathische Helices (in Gegenwart von Lipiden), binden Lipide, bilden prä-β-artige oder HDL-artige Komplexe, aktivieren LCAT, erhöhen die Serumkonzentration von HDL und begünstigen den Cholesterinausstrom. Die biologische Funktion der Peptide korreliert mit ihrer Helixstruktur bzw. der Konvertierung zu Helixstrukturen in Gegenwart von Lipiden.
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung lassen sich in stabilen Großmengen- oder Einheitsdosierungsformen herstellen, z. B. lyophilisierte Produkte, die vor der Anwendung in vivo rekonstituiert oder reformuliert werden können. Die Erfindung umfasst die pharmazeutischen Formulierungen und die Verwendung solcher Zubereitungen bei der Behandlung von Hyperlipidämie, Hypercholesterinämie, koronarer Herzkrankheit, Atherosklerose und anderen Zuständen wie beispielsweise einer Endotoxämie, die einen septischen Schock verursacht.
Die Erfindung ist durch Arbeitsbeispiele veranschaulicht, die zeigen, dass die ApoA-I-Agonisten der Erfindung LCAT äußerst wirksam aktivieren und damit den RCT begünstigen. Die Verwendung der ApoA-I-Agonisten der Erfindung in vivo bei Tiermodellen führte zu einem Anstieg der HDL-Serumkonzentration.
Die Erfindung wird in den Unterabschnitten unten weiter ausgeführt, die Folgendes beschreiben: die Zusammensetzung und Struktur der ApoA-I-Peptidagonisten; die strukturelle und funktionelle Charakterisierung; Verfahren der Herstellung von Großmengen- und Einheitsdosierungsformulierungen; und Anwendungsverfahren.
5.1. PEPTIDSTRUKTUR UND -FUNKTION
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten sind im Allgemeinen Peptide oder Analoga davon, die in der Lage sind, in Gegenwart von Lipiden amphipathische α-Helices zu bilden und die die Aktivität von ApoA-I nachahmen. Die Agonisten weisen als Hauptmerkmal ein „Kern"-Peptid auf, das aus 15 bis 29 Aminosäureresten zusammengesetzt ist, vorzugsweise aus 22 Aminosäureresten.
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten beruhen teilweise auf der überraschenden Entdeckung der Anmelder, dass die Veränderung und/oder Deletion bestimmter Aminosäurereste in der Primärsequenz der 22-Mer-Konsensussequenz von Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation und Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B:585-596 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID Nr.:75; hiernach „Konsensus-22-Mer nach Segrest" oder „Konsensus-22-Mer"), die als entscheidend für die Aktivität erachtet wurde, synthetische Peptide ergibt, die Aktivitäten aufweisen, welche sich der Aktivität des nativen ApoA-I annähern oder diese in manchen Ausführungsformen sogar übersteigen. Insbesondere haben die Anmelder entdeckt, dass das Ersetzen von drei geladenen Aminosäureresten im 22-Mer-Konsensuspeptid von Segrest (Glu-5, Lys-9 und Glu-13) durch einen hydrophoben Leu-Rest Peptide bereitstellt, welche die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von ApoA-I in einem Maß nachahmen, die im Stand der Technik unübertroffen ist.
Ohne sich durch eine bestimmte Theorie binden zu wollen, wird angenommen, dass die von ApoA-I-Agonisten der Erfindung gebildete Helix die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der amphipathischen helikalen Regionen des nativen ApoA-I, die für die Ausübung der Lipidbindung, des Cholesterinausstroms und der LCAT-Aktivierung wichtig sind, besser nachahmen als die α-Helix, die von den ApoA-I-Peptidmimetika gebildet wird, welche in der Literatur beschrieben sind, was deshalb zu Peptiden führt, die wesentlich höhere ApoA-I-artige Aktivität aufweisen als diese anderen Peptide. Während viele der erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten die Aktivität von ApoA-I zwar fast erreichen und in manchen Ausführungsformen sogar übersteigen, weisen die besten, in der Literatur beschriebenen ApoA-I-Peptidmimetika – Peptid 18AM4 (EWLEAFYKKVLEKLKELF; SEQ ID Nr.:246) (Corinjn et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:8-16; Labeur et al., Okt. 1994, Arteriosclerosis: Kurzzusammenfassung Nr. 186 und 187) und das N-acetylierte, C-amidierte Peptid 18AM4 (SEQ ID Nr.:239) (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7) – weniger als 4% bzw. 11% der Aktivität von ApoA-I auf, wie mit dem hierin beschriebenen LCAT-Aktivierungsassay gemessen wurde.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform der Erfindung haben die Kernpeptide (oder deren Analoga), aus welchen die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten zusammengesetzt sind, die folgende Strukturformel (I): X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X₂₂ wobei:
X₁ Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) oder D-Pro (p) ist;
X₂ eine aliphatische Aminosäure ist;
X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₄ Glu (E) ist;
X₅ eine aliphatische Aminosäure ist;
X₆ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₇ Glu (E) oder Leu (L) ist;
X₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist;
X₉ Leu (L) ist;
X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist;
X₁₁ eine saure Aminosäure ist;
X₁₂ Arg (R) ist;
X₁₃ Leu (L) oder Gly (G) ist;
X₁₄ Leu (L), Phe (F) oder Gly (G) ist;
X₁₅ Asp (D) ist;
X₁₆ Ala (A) ist;
X₁₇ Leu (L) ist;
X₁₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist;
X₁₉ eine basische Aminosäure ist;
X₂₀ eine basische Aminosäure ist;
X₂₁ Leu (L) ist; und
X₂₂ eine basische Aminosäure ist.
Die Kernpeptide der Struktur (I) sind teilweise im Sinne von Aminosäuren ausgewiesener Klassen definiert. Die Definitionen der verschiedenen ausgewiesenen Klassen sind unten in Verbindung mit der Beschreibung mutierter oder veränderter Ausführungsformen der Struktur (I) bereit gestellt.
In den Kernpeptiden der Struktur (I) bezeichnet das Symbol „-" zwischen Aminosäureresten X_n im Allgemeinen eine konstitutive Gerüst-Verknüpfungsfunktion. Das Symbol „-" gibt daher in der Regel eine Peptidbindung oder Amidverknüpfung (-C(O)NH-) wieder. Es versteht sich jedoch, dass die vorliegende Erfindung Peptidanaloga in Betracht zieht, bei denen eine oder mehrere Amidverknüpfungen wahlweise durch eine andere Bindung als Amid ersetzt sind, vorzugsweise durch ein substituiertes Amid oder ein Isoster von Amid. Während daher die verschiedenen X Reste in Struktur (I) in der Regel im Sinne von Aminosäuren beschrieben sind, und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anhand von Peptiden beispielhaft dargestellt sind, erkennt ein Fachmann, dass sich der Begriff „Aminosäure" oder „Rest", wie hierin verwendet, in Ausführungsformen mit Nicht-Amid-Verknüpfungen auf andere bifunktionale Einheiten bezieht, die Gruppen tragen, welche eine ähnliche Struktur wie die Seitenketten der Aminosäuren aufweisen.
Ein kritisches Merkmal der Kernpeptide der Struktur (I) ist deren Fähigkeit, in Gegenwart von Lipiden eine amphipathische α-Helix zu bilden. Mit amphipathisch ist gemeint, dass die α-Helix gegenüber liegende hydrophile und hydrophobe Flächen aufweist, die entlang ihrer Längsachse ausgerichtet sind, d. h. aus einer Fläche der Helix weisen hauptsächlich hydrophile Seitenketten, während aus der gegenüber liegenden Fläche hauptsächlich hydrophobe Seitenketten weisen. 1A und 1B präsentieren zwei veranschaulichende Ansichten der gegenüber liegenden hydrophilen und hydrophoben Flächen einer beispielhaften idealisierten amphipathischen α-Helix. 1A ist ein Helixraddiagramm nach Schiffer-Edmundson (Schiffer and Edmundson, 1967, Biophys. J. 7:121-135). In dem Rad befindet sich die Längsachse der Helix senkrecht zur Seite. Beginnend am N-Terminus sind nachfolgende Aminosäurereste (durch Kreise dargestellt) um den Umfang eines Kreises in Intervallen von 100° radial verteilt. Der Aminosäurerest n + 1 ist daher 100° von Rest n positioniert, Rest n + 2 ist 100° von Rest n + 1 positioniert und so weiter. Die Platzierung 100° ist der Grund für die 3,6 Aminosäurereste je Schleife, die in einer idealisierten α-Helix typischerweise beobachtet werden. In 1A sind die gegenüber liegenden hydrophilen und hydrophoben Flächen der Helix deutlich sichtbar; hydrophile Aminosäuren sind als ungefüllte Kreise und hydrophobe Aminosäurereste sind als gepunktete Kreise wiedergegeben.
1B zeigt ein Helixnetzdiagramm der idealisierten amphipathischen Helix von 1A (Lim, 1978, FEBS Lett. 89:10-14). In einem typischen Helixnetzdiagramm ist die α-Helix als Zylinder dargestellt, der entlang dem Zentrum seiner hydrophilen Flache aufgeschnitten und abgeflacht wurde. Das Zentrum der hydrophilen Fläche, bestimmt von dem hydrophoben Moment der Helix (Eisenberg et al., 1982, Nature 29:371374), liegt also in der Mitte der Figur und ist so ausgerichtet, dass es sich aus der Seitenebene heraus erhebt. Eine Veranschaulichung des Helixzylinders vor dem Schneiden und Abflachen ist in 1C gezeigt. Indem der Zylinder entlang verschiedener Ebenen geschnitten wird, lassen sich verschiedene Ansichten derselben amphipathischen Helix beobachten, und es werden verschiedene Informationen über die Eigenschaften der Helix erhalten.
Die amphipathische Natur der von den Kernpeptiden der Struktur (I) in Gegenwart von Lipiden gebildeten α-Helix ist in 2 veranschaulicht. 2A zeigt ein Helixraddiagramm nach Schiffer-Edmundson, 2B zeigt ein Helixnetzdiagramm, welches die hydrophobe Fläche veranschaulicht, und 2C zeigt ein Helixnetzdiagramm, welches die hydrophile Fläche veranschaulicht. In jeder der 2A, 2B und 2C sind hydrophile Reste als ungefüllte Kreise und hydrophobe Reste als gefüllte Kreise wiedergegeben, und Reste, die weder hydrophil noch hydrophob sein können, sind als teilgefüllte Kreise wiedergegeben. Wie unten in Verbindung mit veränderten oder mutierten Formen der Peptide der Struktur (I) ausführlicher erläutert wird, können bestimmte Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste ersetzt werden, so dass die hydrophilen und hydrophoben Flächen der von den Peptiden gebildeten Helix nicht vollständig aus hydrophoben bzw. hydrophilen Aminosäuren zusammengesetzt ist. Es versteht sich also, dass sich bei Bezugaufnahme auf die von den erfindungsgemäßen Kernpeptiden gebildete amphipathische α-Helix der Begriff „hydrophile Fläche" auf eine Fläche der Helix bezieht, deren Gesamtcharakter netto hydrophil ist. Der Begriff „hydrophobe" Fläche bezieht sich auf eine Fläche des Peptids, deren Gesamtcharakter netto hydrophob ist.
Ohne sich durch eine bestimmte Theorie binden zu wollen, wird angenommen, dass bestimmte strukturelle und/oder physikalische Eigenschaften der von den Kernpeptiden der Struktur (I) gebildeten amphipathischen Helix für die Aktivität wichtig sind. Diese Eigenschaften umfassen den Grad der Amphipathie, die Gesamthydrophobizität, die mittlere Hydrophobizität, die hydrophoben und hydrophilen Winkel, das hydrophobe Moment, das mittlere hydrophobe Moment und die Nettoladung der α-Helix.
Während das Helixraddiagramm von 2A ein praktisches Mittel zur Visualisierung der amphipathischen Art der Kernpeptide der Struktur (I) darstellt, lässt sich der Grad der Amphipathie (Grad der Asymmetrie der Hydrophobizität) geeignet durch Berechnung des hydrophoben Moments (μ_H) der Helix quantifizieren. Verfahren zum Berechnen von μ_H für eine bestimmte Peptidsequenz sind am dem Stand der Technik gut bekannt und sind zum Beispiel in Eisenberg, 1984, Ann. Rev. Biochem. 53:595-623 beschrieben. Der eigentliche für ein bestimmtes Peptid erhaltene Wert μ_H richtet sich nach der Gesamtzahl von Aminosäureresten, aus welchen das Peptid zusammengesetzt ist. Es ist daher im Allgemeinen nicht informativ, den Wert μ_H für Peptide unterschiedlicher Länge direkt zu vergleichen.
Ein direkter Vergleich der Amphipathien von Peptiden verschiedener Länge kann mithilfe des mittleren hydrophoben Moments (<μ_H>) erfolgen. Das mittlere hydrophobe Moment lasst sich erhalten, indem μ_H durch die Anzahl der Reste in der Helix dividiert wird (d. h. <μ_H> = μ_H/n). Kernpeptide, die einen <μ_H> im Bereich von 0,45 bis 0,65 aufweisen, wie bestimmt anhand der normalisierten Konsensus-Hydrophobizitätsskala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142), werden als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet, wobei ein <μ_H> im Bereich von 0,50 bis 0,60 bevorzugt ist.
Die allgemeine Hydrophobizität bzw. Gesamthydrophobizität (H_o) eines Peptids kann geeignet berechnet werden, indem die algebraische Summe der Hydrophobizität jedes Aminosäurerestes in dem Peptid N
hergenommen wird, wobei N die Anzahl der Aminosäurereste in dem Peptid ist und H_i die Hydrophobizität des i-ten Aminosäurerestes. Die mittlere Hydrophobizität (<H_o>) ist die Hydrophobizität dividiert durch die Anzahl der Aminosäurereste (d. h. <H_o> = H_o/N). Im Allgemeinen werden Kernpeptide, die eine mittlere Hydrophobizität im Bereich von –0,050 bis –0,070 aufweisen, wie bestimmt anhand der normalisierten Konsensus-Hydrophobizitätsskala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142), als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet, wobei eine mittlere Hydrophobizität im Bereich von –0,030 bis –0,055 bevorzugt ist.
Die Gesamthydrophobizität der hydrophoben Fläche (H_o ^pho) einer amphipathischen Helix kann erhalten werden, indem die Summe der Hydrophobizitäten der hydrophoben Aminosäurereste errechnet wird, die in den hydrophoben Winkel fallen, wie unten definiert (d. h.
wobei H_i wie oben definiert ist und N_H die Gesamtanzahl hydrophober Aminosäuren in der hydrophoben Fläche ist). Die mittlere Hydrophobizität der hydrophoben Fläche (<H_o ^pho>) ist H_o ^pho/N_H, wobei N_H wie oben definiert ist. Im Allgemeinen werden Kernpeptide, die eine (<H_o ^pho>) im Bereich von 0,90 bis 1,2 aufweisen, wie bestimmt anhand der normalisierten Konsensus-Hydrophobizitätsskala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142), als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet, wobei ein (<H_o ^pho>) im Bereich von 0,940 bis 1,10 bevorzugt ist.
Der hydrophobe Winkel (Winkel pho) ist generell als der Winkel bzw. der Bogen definiert, welcher von der längsten fortlaufenden Strecke von hydrophoben Aminosäureresten beschrieben wird, wenn das Peptid in der Helixraddarstellung von Schiffer-Edmundson angeordnet ist (d. h. der Anzahl kontiger hydrophober Reste auf dem Rad, multipliziert mit 20°). Der hydrophile Winkel (Winkel phi) ist die Differenz zwischen 360° und dem Winkel pho (d. h. 360°-Winkel pho). Ein Fachmann erkennt, dass die Winkel pho und phi teilweise von der Anzahl von Aminosäureresten in dem Peptid abhängen. Beispielsweise ist unter Bezugnahme auf 5A und 5B zu erkennen, dass nur 18 Aminosäuren um eine Drehung des Helixrads nach Schiffer-Edmundson passen. Weniger Aminosäuren hinterlassen eine Lücke in dem Rad; mehr Aminosäuren bewirken, dass bestimmte Positionen des Rads von mehr als einem Aminosäurerest besetzt werden.
In dem Fall von Peptiden, die mehr als 18 Aminosäurereste enthalten, wie beispielsweise die Kernpeptide der Struktur (I), ist mit einer „kontigen" Strecke von hydrophoben Aminosäureresten gemeint, dass mindestens ein Aminosäurerest an Positionen entlang dem Rad, die von zwei oder mehr Aminosäuren besetzt sind, eine hydrophobe Aminosäure ist. Unter Bezugnahme auf 5B ist daher der Winkel pho der von Rest 5, 16, 9, 2, 13, 6, 17, 10, 3 und 14 beschriebene Bogen, trotz des Vorhandenseins eines hydrophilen Restes an Position 20, da der Rest an Position 2, der dieselbe Position auf dem Rad wie Rest 20 einnimmt, ein hydrophober Rest ist. Typischerweise werden Kernpeptide mit einem Winkel pho im Bereich von 160° bis 220° als im Umfang der Erfindung liegend betrachtet, wobei ein Winkel pho im Bereich von 180° bis 200° bevorzugt ist.
Bestimmte strukturelle und/oder physikalische Eigenschaften der Kernpeptide der Struktur (I) sind in 3 und 4 veranschaulicht. 3B zeigt ein Helixnetzdiagramm eines beispielhaften Kernpeptids der Erfindung, Peptid 146 (PVLELFENLLERLLDALQKKLK; SEQ ID Nr.:146), wobei die Ladungsverteilung über der hydrophilen Fläche der Helix veranschaulicht ist. In 3B wurde der Helixzylinder entlang dem Zentrum der hydrophoben Flache aufgeschnitten und abgeflacht. Die drei hydrophoben Leu (L)-Reste, welche hydrophile Reste im Konsensus-22-Mer von Segrest ersetzen (3C) sind dunkel hervorgehoben. Wie in 3B zu sehen ist, sind positiv geladene Aminosäurereste an der letzten C-terminalen Schleife der Helix gruppiert (geclustert) (der C-Terminus befindet sich oben auf der Seite). Ohne sich durch eine bestimmte Theorie binden zu wollen, wird angenommen, dass diese Gruppe (Cluster) basischer Reste am C-Terminus (Rest 19, 20 und 22) die Helix durch elektrostatische (NH₃ ⁺)-Helixdipol-Wechselwirkungen stabilisiert. Es wird außerdem angenommen, dass die Stabilisierung durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Lysinseitenketten und dem Helixkern stattfindet (siehe Groebke et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:4025-4029; Esposito et al., 1997, Biopolymers 41:27-35).
Mit Ausnahme der positiv geladenen Gruppe am C-Terminus sind auf dem Rest der hydrophilen Fläche negative Ladungen verteilt, mit mindestens einem negativ geladenen (sauren) Aminosäurerest je Schleife, was zu einer fortlaufenden Strecke negativer Ladungen entlang der hydrophilen Fläche der Helix führt. Eine positive Ladung befindet sich an Rest 12, welcher möglicherweise zur Stabilität der Helix beiträgt, indem er eine Salzbrücke mit einem sauren Rest bildet, der eine Schleife weiter auf der Helix vorliegt.
4B zeigt ein Helixnetzdiagramm, welches die hydrophobe Fläche der von dem beispielhaften Kernpeptid 146 (SEQ ID Nr.:146) gebildeten amphipathischen Helix veranschaulicht. In 4B ist der Helixzylinder entlang der Mitte der hydrophilen Fläche aufgeschnitten und abgeflacht. Die hydrophobe Fläche des Kernpeptids besteht aus zwei hydrophoben Resten je Schleife, mit Ausnahme der letzten C-terminalen Schleife, wo basische Reste dominieren. NMR-Studien deuten an, dass Aminosäurerest 3, 6, 9 und 10 dieses Kernpeptids eine hydrophobe Gruppe (Cluster) in der Nähe des N-Terminus der Helix bilden. Phe-6 befindet sich in der Mitte dieser Gruppe (Cluster), und es wird angenommen, dass es eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des hydrophilen Gruppe (Cluster) spielt.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die von Rest 3, 6, 9 und 10 gebildete hydrophobe Gruppe (Cluster) für die Ausübung der Lipidbindung und LCAT-Aktivierung wesentlich ist. Amphipathische Peptid dürften Phospholipide binden, indem sie ihre hydrophoben Flächen in Richtung der Alkylketten der Lipideinheiten wenden. Daher wird angenommen, dass diese stark hydrophobe Gruppe (Cluster) zu den starken Lipidaffinitäten beitragen, welche für die Kernpeptide der Erfindung beobachtet werden. Da die Lipidbindung eine Voraussetzung für die LCAT-Aktivierung ist, wird angenommen, dass diese hydrophobe Gruppe (Cluster) auch für die LCAT-Aktivierung wesentlich ist.
Aromatische Reste erweisen sich häufig als wichtig bei der Verankerung von Peptiden und Proteinen an Lipiden (De Kruijff, 1990, Biosci. Rep. 10:127-130; O'Neil and De Grado, 1990, Science 250:645-651; Blondelle et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1202:331-336). Es wird daher weiter angenommen, dass auch Phe-6, welches sich in der Mitte der hydrophoben Gruppe (Cluster) befindet, eine zentrale Rolle bei der Verankerung der Kernpeptide der Struktur (I) an Lipide spielt.
Wechselwirkungen zwischen den erfindungsgemäßen Kernpeptiden und Lipiden führen zu der Bildung von Peptid-Lipid-Komplexen. Wie in 10A veranschaulicht ist, hängt die Art des erhaltenen Komplexes (Co-Mizellen, Scheiben, Vesikel oder mehrschichtige Komplexe) von dem molaren Verhältnis von Lipid zu Peptid ab, wobei Co-Mizellen generell bei niedrigen molaren Verhältnissen von Lipid zu Peptid gebildet werden und sich scheibenförmige und vesikuläre oder mehrschichtige Komplexe bei steigenden molaren Verhältnissen von Lipid zu Peptid bilden. Diese Eigenschaft wurde für amphipathische Peptide (Epand, The Amphipathic Helix, 1993) und für ApoA-I (Jones, 1992 Struktur und Function of Apolipoproteins, Kapitel 8, S. 217-250) beschrieben. Das molare Verhältnis von Lipid zu Peptid bestimmt auch die Größe und Zusammensetzung der Komplexe (siehe Abschnitt 5.3.1, unten).
Die Längsachse der von den Kernpeptiden der Struktur (1) gebildeten α-Helix hat eine gekrümmte Gesamtform. Es wurde festgestellt, dass die Länge der Wasserstoffbindungen der hydrophilen und hydrophoben Flächen in typischen amphipathischen Helices derart variieren, dass die hydrophobe Seite der Helix konkav ist (Barlow und Thornton, 1988, J. Mol. Biol. 201:601-619; Zhou et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 33:11174-11183; Gesell et al., 1997, J. Biomol. NMR 9:127-135). Ohne sich theoretisch binden zu wollen, wird angenommen, dass die Gesamtkrümmung der hydrophoben Fläche der Helix bei der Bindung scheibenförmiger Komplexe wichtig sein könnte – eine gekrümmte Helix erlaubt einem Peptid, sich den Rändern scheibenförmiger Teilchen besser „anzupassen", wodurch sich die Stabilität des Peptid-Scheiben-Komplexes erhöht.
In dem allgemein anerkannten Strukturmodell von ApoA-I sind die amphipathischen α-Helices um den Rand der scheibenförmigen HDL gepackt (siehe 10B). Man geht davon aus, dass die Helices in diesem Modell so ausgerichtet sind, dass ihre hydrophoben Flächen zu den Lipidacylketten zeigen (Brasseur et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1043:245-252). Die Helices sind in antiparalleler Weise angeordnet, und es wird angenommen, dass ein kooperativer Effekt zwischen den Helices zu der Stabilität des scheibenförmigen HDL-Komplexes beiträgt (Brasseur et al., oben). Es wurde vorgeschlagen, dass das Vorhandensein ionischer Wechselwirkungen zwischen sauren und basischen Resten, die zur Bildung intermolekularer Salzbrücken oder Wasserstoffbindungen zwischen Resten auf benachbarten antiparallelen Helices führen, ein Faktor ist, der zur Stabilität des scheibenförmigen HDL-Komplexes beiträgt. In diesem Modell gelten die Peptide nicht als eine einzelne Einheit, sondern als in Wechselwirkung mit mindestens zwei anderen benachbarten Peptidmolekülen stehend (10B).
Es ist außerdem allgemein anerkannt, dass die Bildung intramolekularer Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken zwischen sauren bzw. basischen Resten an Position i und i + 3 der Helix die Helixstruktur stabilisiert (Marqusee et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(24):8898-8902).
Zusätzliche Schlüsselmerkmale der Kernpeptide der Struktur (I) sind daher ihre Fähigkeit zur Ausbildung intermolekularer Wasserstoffbindungen miteinander, wenn sie auf antiparallele Weise ausgerichtet sind, wobei ihre hydrophoben Flächen in dieselbe Richtung zeigen, so wie es der Fall wäre, wenn die Peptide an Lipide gebunden waren (d. h. zwischen den sauren Resten an Position 4 und 7 und den basischen Resten an Position 19, 20 und 22), sowie auch ihre Fähigkeit zur Bildung intermolekularer Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken in der Nähe des N- oder des C-Terminus der Helix.
Die Fähigkeit der Kernpeptide der Struktur (I) zur Bildung intermolekularer Wasserstoffbindungen ist in 6 veranschaulicht. In 6 sind zwei ideale α-Helices des beispielhaften Kernpeptids 146 (SEQ ID Nr.:146) auf antiparallele Weise ausgerichtet, wobei ihre jeweiligen hydrophoben Flächen in dieselbe Richtung zeigen (aus der Seitenebene heraus). H-Bindungswechselwirkungen könnten zwischen Rest E-7 und Q-18 auftreten (Huyghues-Despointes et al., 1995, Biochemistry 34(41):13267-13271).
Wenn die Helices des Weiteren auf diese antiparallele Weise angeordnet sind, sind sie dicht gepackt; der enge Kontakt zwischen den Helices wird sterisch nicht behindert. Veränderungen in der Sequenz der Kernpeptide, welche die Packung der Helices beeinflussen, beeinflussen die Aktivität der Kernpeptide negativ.
Es wird daher angenommen, ohne sich an eine bestimmte Theorie binden zu wollen, dass die Fähigkeit der Kernpeptide der Struktur (I) zur dichten Packung und ionischen Wechselwirkung, um intra- und/oder intermolekulare Salzbrücken und/oder Wasserstoffbindungen zu bilden, wenn sie auf antiparallele Weise an Lipide gebunden sind, ein wichtiges Merkmal der Kernpeptide der Erfindung ist.
Es wird angenommen, dass die Fähigkeit der Kernpeptide zur Bildung günstiger intermolekularer Peptid-Peptid-Wechselwirkungen auch in der Abwesenheit von Lipiden relevant ist. Die Kernpeptide der Erfindung führen eine Selbstassemblierung durch, teilweise aufgrund ihrer hohen <μ_H>, <H_o> und ihres hydrophoben Winkels (siehe TABELLE I, unten). Das Phänomen der Selbstassemblierung hängt von den Bedingungen des pH-Wertes, der Peptidkonzentration und der Ionenstärke ab und kann zu mehreren Stadien der Assoziierung führen, von monomeren bis hin zu mehreren multimeren Formen (10A). Der hydrophobe Kern der Peptidaggregate begünstigt die hydrophoben Interaktionen mit Lipiden. Die Fähigkeit der Peptide zur Selbstassemblierung selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen könnte ihre Bindung an Lipide begünstigen. Es wird angenommen, dass auch im Kern der Peptidaggregate Peptid-Peptid-Wechselwirkungen stattfinden und mit Lipid-Peptid-Wechselwirkungen konkurrieren.
Neben den oben beschriebenen Eigenschaften gelten noch andere Parameter als wichtig für die Aktivität, einschließlich der Gesamtzahl an hydrophoben Resten, die Gesamtzahl geladener Reste und die Nettoladung der Peptide.

Eine Zusammenfassung der bevorzugten physikalischen und strukturellen Eigenschaften der Kernpeptide der Struktur (I) ist in TABELLE I unten gegeben: TABELLE I PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN BEVORZUGTER APoA-I-AGONISTEN DER STRUKTUR (I)

Eigenschaft	Bereich	Bevorzugter Bereich
% hydrophobe Aminosäuren	40-70	50-60
<H_o>	–0,050 bis –0,070	–0,030 bis –0,055
<H_o ^pho>	0,90-1,2	0,94-1,1
<μ_H>	0,45-0,65	0,50-0,60
Winkel pho	160°-220°	180°-200°
Anzahl positiv geladener Aminosäuren	3-5	4
Anzahl negativ geladener Aminosäuren	3-5	4
Nettoladung	–1 bis +1	0
Hydrophobe Gruppe (Cluster)	Position 3, 6, 9, 10 sind hydrophobe Aminosäuren
Saure Gruppe (Cluster)	Mindestens 1 saure Aminosäure je Schleife, außer den letzten 5 C-terminalen Aminosäuren
Basische Gruppe (Cluster)	Mindestens 3 basische Aminosäuren in mindestens 5 C-terminalen Aminosäuren

Die Eigenschaften der von den erfindungsgemäßen Kernpeptiden gebildeten amphipathischen α-Helices unterscheiden sich wesentlich von den Eigenschaften amphipathischer α-Helices der Klasse A, insbesondere der α-Helix der Klasse A des 22-Mer-Konsensuspeptids von Segrest. Diese Unterschiede werden mit dem beispielhaften Kernpeptid 146 (SEQ ID Nr. 146) in den 3 bis 5 gezeigt.
Bezugnehmend auf 4A und 4B wird erkannt, dass die hydrophobe Fläche des Peptids 146 eine wesentlich größere hydrophobe Eigenschaft als die hydrophobe Fläche des Konsensus-22-Mer aufweist. Insbesondere sind Rest 5, 9 und 13 (dunkel hervorgehobene Region in 4B) hydrophobe Leu (L)-Reste in Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) im Vergleich zu geladenen Resten im Konsensus-22-Mer (SEQ ID Nr.:75). Der Austausch dieser drei geladenen Reste im Konsensus-22-Mer von Segrest durch hydrophobe Leu (L)-Reste führt zu wesentlichen Unterschieden in der Amphipathie, Hydrophobizität, dem Winkel pho und anderen Eigenschaften der Helix.

Ein Vergleich der physikalischen und strukturellen Eigenschaften von Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) und dem Konsensus-22-Mer von Segrest (SEQ ID Nr.:75) ist in TABELLE II unten gegeben. TABELLE II VERGLEICH DER EIGENSCHAFTEN DES BEISPIELHAFTEN KERNPEPTIDS 146 (SEQ ID Nr.:146) UND DES KONSENSUS-22-MERS VON SEGRESTSE ID Nr.:75

Eigenschaft	Konsensus-22-Mer	Peptid 146
Anzahl der Aminosäuren	22	22
Anzahl der hydrophilen Aminosäuren	13	10
Anzahl der hydrophoben Aminosäuren	9	12
Prozentanteil der hydrophoben Aminosaüren	41	55
<H_o>	–0,293	–0,013
<H_o ^pho>	0,960	0,990
<μ_H>	0,425	0,577
Winkel pho	100°	200°
Anzahl positiv geladener Aminosäuren	5	4
Anzahl negativ geladener Aminosäuren	6	4
Nettoladung	–1	0

Auffällig ist vor allem, dass die Kernpeptide der Struktur (I) aus einem größeren Prozentanteil hydrophober Reste zusammengesetzt sind, wesentlich höhere <H_o>- und <μ_H>-Werte aufweisen und einen doppelt so großen Winkel pho aufweisen wie das Konsensus-22-Mer von Segrest (siehe 5A und 5B).
Diese unterschiedlichen Eigenschaften führen zu wesentlichen Unterschieden in Bezug auf die Aktivität. Während das Konsensus-22-Mer von Segrest (SEQ ID Nr.:75) im Vergleich zum nativen ApoA-I in den hierin beschriebenen Assays nur eine LCAT-Aktivierung von 10% zeigt, zeigt Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) in denselben Assays im Vergleich zu nativem ApoA-I eine Aktivierung von 86%. Peptid 144 (pVLELFENLLERLLDALQKKLK; SEQ ID Nr.:144), das sich von Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) nur durch ein D-Pro (p) an Position X₁ unterscheidet, zeigt in denselben Assays im Vergleich zu nativem ApoA-I eine LCAT-Aktivierung von 111%.
Bestimmte Aminosäurereste in den Kernpeptiden der Struktur (I) lassen sich durch andere Aminosäurereste ersetzen, ohne die Aktivität der Peptide wesentlich negativ zu beeinflussen, sondern in manchen Fallen sogar zu erhöhen. Daher zieht die vorliegende Erfindung auch veränderte oder mutierte Formen der Kernpeptide der Struktur (I) in Betracht, wobei mindestens ein definierter Aminosäurerest in der Struktur durch einen anderen Aminosäurerest substituiert ist. Da die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Kernpeptide zur Bildung von α-Helices, welche die amphipathischen und anderen oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, in Gegenwart von Lipiden als eines ihrer entscheidendsten, die Aktivität beeinflussenden Merkmale betrachtet wird, wird anerkannt, dass die Aminosäuresubstitutionen in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung konservativ sind, d. h. der ersetzende Aminosäurerest hat physikalische und chemische Eigenschaften, die ähnlich sind wie der Aminosäurerest, der ersetzt wird.
Zum Zweck der Bestimmung konservativer Aminosäuresubstitutionen können die Aminosäuren geeignet in zwei Hauptkategorien klassifiziert werden – hydrophil und hydrophob – hauptsächlich bezogen auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Aminosäurenseitenkette. Diese beiden Hauptkategorien lassen sich weiter in Unterkategorien einteilen, welche die Eigenschaften der Aminosäurenseitenketten deutlicher unterscheiden. Beispielsweise lässt sich die Klasse der hydrophilen Aminosäuren weiter in saure, basische und polare Aminosäuren aufteilen. Die Klasse der hydrophoben Aminosäuren lasst sich weiter in unpolare und aromatische Aminosäuren aufteilen. Die Definitionen der verschiedenen Kategorien von Aminosäuren, welche Struktur (I) definieren, sind Folgende:

„Hydrophile Aminosäure" bezieht sich auf eine Aminosäure, die eine Hydrophobizität von weniger als Null entsprechend der normalisierten Konsensushydrophobizitätsskala von Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142 aufweist. Genetisch kodierte hydrophile Aminosäuren umfassen Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) und Arg (R).
„Saure Aminosäure" bezieht sich auf eine hydrophile Aminosäure, deren Seitenkette einen pK-Wert von weniger als 7 aufweist. Same Aminosäuren haben bei physiologischem pH-Wert aufgrund des Verlustes eines Wasserstoffions typischerweise negativ geladene Seitenketten. Genetisch kodierte saure Aminosäuren umfassen Glu (E) und Asp (D).
„Basische Aminosäure" bezieht sich auf eine hydrophile Aminosäure, deren Seitenkette einen pK-Wert größer als 7 aufweist. Basische Aminosäuren haben bei physiologischem pH-Wert aufgrund der Assoziierung mit einem Hydroniumion typischerweise positiv geladene Seitenketten. Genetisch kodierte basische Aminosäuren umfassen His (H), Arg (R) und Lys (K).
„Polare Aminosäure" bezieht sich auf eine hydrophile Aminosäure mit einer Seitenkette, die bei physiologischem pH-Wert ungeladen ist, aber mindestens eine Bindung aufweist, bei der das Elektronenpaar, das von den beiden Atomen geteilt wird, von einem der Atome enger gehalten wird. Genetisch kodierte polare Aminosäuren umfassen Asn (N), Gln (Q) Ser (S) und Thr (T).
„Hydrophobe Aminosäure" bezieht sich auf eine Aminosäure mit einer Hydrophobizität größer Null entsprechend der normalisierten Konsensushydrophobizitätsskala von Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Genetisch kodierte hydrophobe Aminosäuren umfassen Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) und Tyr (Y).
„Aromatische Aminosäure" bezieht sich auf eine hydrophobe Aminosäure mit einer Seitenkette, die mindestens einen aromatischen oder heteroaromatischen Ring aufweist. Der aromatische oder heteroaromatische Ring kann einen oder mehrere Substituenten enthalten, wie beispielsweise -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR und dergleichen, wobei jedes R unabhängig (C₁-C₆)Alkyl, substituiertes (C₁-C₆)Alkyl, (C₁-C₆)Alkenyl, substituiertes (C₁-C₆)Alkenyl, (C₁-C₆)Alkynyl, substituiertes (C₁-C₆)Alkynyl, (C₅-C₂₀)Aryl, substituiertes (C₅-C₂₀)Aryl, (C₆-C₂₆)Alkaryl, substituiertes (C₆-C₂₆)Alkaryl, 5- bis 20-gliedriges Heteroaryl, substituiertes 5- bis 20-gliedriges Heteroaryl, 6- bis 26-gliedriges Alkheteroaryl oder substituiertes 6- bis 26-gliedriges Alkheteroaryl ist. Genetisch kodierte aromatische Aminosäuren umfassen Phe (F), Tyr (Y) und Trp (W).
„Unpolare „Aminosäure" bezieht sich auf eine hydrophobe Aminosäure mit einer Seitenkette, die bei physiologischem pH-Wert ungeladen ist und Bindungen aufweist, in denen das Elektronenpaar, das von den beiden Atomen geteilt wird, von jedem der beiden Atome in der Regel gleich gehalten wird (d. h. die Seitenkette ist unpolar). Genetisch kodierte unpolare Aminosäuren umfassen Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) und Ala (A).
„Aliphatische Aminosäure" bezieht sich auf eine hydrophobe Aminosäure mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffseitenkette. Genetisch kodierte aliphatische Aminosäuren umfassen Ala (A), Val (V), Leu (L) und Ile (I).

Der Aminosäurerest Cys (C) ist insofern ungewöhnlich, als er Disulfidbrücken mit anderen Cys(C)-Resten oder anderen sulfanylhaltigen Aminosäuren ausbilden kann. Die Fähigkeit von Cys(C)-Resten (und anderen Aminosäuren mit -SH-haltigen Seitenketten), entweder in der reduzierten Form mit freiem -SH oder als oxidierte Form mit Disulfidbrücke in einem Peptid vorzuliegen, beeinflusst, ob Cys(C)-Reste zum hydrophoben oder hydrophilen Nettocharakter eines Peptids beitragen. Obgleich Cys (C) nach der normalisierten Konsensusskala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, oben) eine Hydrophobizität von 0,29 aufweist, versteht sich, dass Cys (C) für den Zweck der vorliegenden Erfindung als eine polare hydrophile Aminosäure kategorisiert wird, ungeachtet der oben definierten allgemeinen Klassifizierungen.
Wie ein Fachmann zu schätzen wissen wird, schließen sich die oben definierten Kategorien nicht gegenseitig aus. Aminosäuren, die Seitenketten mit zwei oder mehr physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweisen, können daher in mehreren Kategorien enthalten sein. Beispielsweise können Aminosäureseitenketten mit aromatischen Einheiten, die weiter mit polaren Substituenten substituiert sind, wie beispielsweise Tyr (Y), sowohl aromatische hydrophobe Eigenschaften als auch polare oder hydrophile Eigenschaften aufweisen und lassen sich daher sowohl in die Kategorie „aromatisch" als auch in die Kategorie „polar" eingliedern. Ein Fachmann kennt die passende Kategorisierung jeder Aminosäure, vor allem in Anbetracht der ausführlichen Beschreibung, wie sie hierin gegeben wird.
Bestimmte Aminosäurereste, so genannte „Helix aufbrechende" Aminosäuren, neigen dazu, die Struktur von α-Helices aufzubrechen, wenn sie an internen Positionen in der Helix enthalten sind. Aminosäurereste, die solche Helix aufbrechenden Eigenschaften aufweisen, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Chou and Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276) und umfassen Pro (P), Gly (G) und potenziell alle D-Aminosäuren (wenn sie in einem L-Peptid enthalten sind; umgekehrt brechen L-Aminosäuren Helixstrukturen auf, wenn sie in einem D-Peptid enthalten sind). Obgleich diese Helix aufbrechenden Aminosäurereste in die oben definierten Kategorien fallen, sollten diese Reste nicht verwendet werden, um Aminosäurereste an internen Positionen innerhalb der Helix zu substituieren – sie sollten nur verwendet werden, um 1-3 Aminosäurereste am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Peptids zu substituieren.
Während die oben definierten Kategorien anhand der genetisch kodierten Aminosäuren beispielhaft erläutert wurden, brauchen die Aminosäuresubstitutionen nicht auf die genetisch kodierten Aminosäuren beschränkt zu sein und sind es in bestimmten Ausführungsformen vorzugsweise nicht. Vielmehr enthalten viele der bevorzugten Peptide der Struktur (I) genetisch nicht kodierte Aminosäuren. Außer den natürlich vorkommenden genetisch kodierten Aminosäuren können also Aminosäurereste in den Kernpeptiden der Struktur (I) durch natürlich vorkommende nicht kodierte Aminosäuren und synthetische Aminosäuren substituiert werden.
Bestimmte häufig vorkommende Aminosäuren, die geeignete Substitutionen für die Kernpeptide der Struktur (I) sind, umfassen, aber nicht ausschließlich, β-Alanin (β-Ala) und andere Omega-Aminosäuren wie beispielsweise 3-Aminopropionsäure, 2,3-Diaminopropionsäure (Dpr), 4-Aminobuttersäure und so weiter; α-Aminoisobuttersäure (Aib); ε-Aminohexansäure (Aha); δ-Aminovaleriansäure (Ava); N-Methylglycin oder -sarcosin (MeGly); Ornithin (Orn); Citrullin (Cit); t-Butylalanin (tBuA); t-Butylglycin (t-BuG); N-Methylisoleucin (MeIle); Phenylglycin (Phg); Cyclohexylalanin (Cha); Norleucin (Nle); Naphthylalanin (Nal); 4-Chlorphenylalanin (Phe(4-Cl)); 2-Fluorphenylalanin (Phe(2-F)); 3-Fluorphenylalanin (Phe(3-F)); 4-Fluorphenylalanin (Phe(4-F)); Penicillamin (Pen); 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic); β-2-Thienylalanin (Thi); Methioninsulfoxid (MSO); Homoarginin (hArg); N-Acetyllysin (AcLys); 2,4-Diaminobuttersäure (Dbu); 2,3-Diaminobuttersäure (Dab); p-Aminophenylalanin (Phe(pNH₂)); N-Methylvalin (MeVal); Homocystein (hCys), Homophenylalanin (hPhe) und Homoserin (hSer); Hydroxyprolin (Hyp), Homoprolin (hPro), N-methylierte Aminosäuren und Peptoide (N-substituierte Glycine).

Die Klassifizierungen der genetisch kodierten und gängigen nicht kodierten Aminosäuren nach den oben beschriebenen Kategorien sind in TABELLE III unten zusammengefasst. Es versteht sich, dass TABELLE III nur veranschaulichenden Zwecken dient und keine erschöpfende Liste von Aminosäureresten ist, die verwendet werden können, um die hierin beschriebenen Kernpeptide zu substituieren. Andere, hierin nicht spezifisch erwähnten Aminosäurereste können in Anbetracht der hierin gegebenen Definitionen auf Basis ihrer beobachteten physikalischen und chemischen Eigenschaften einfach kategorisiert werden. TABELLE III KLASSIFIZIERUNGEN HÄUFIG VORKOMMENDER AMINOSÄUREN

Klassifizierung	Genetisch kodiert	Genetisch nicht kodiert
Hydrophob
Aromatisch	F, Y, W	Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), hPhe
Apolar	L, V, I, M, G, A, P	t-BuA, t-BuG, MeIle, Nle, MeVal, Cha, McGly, Aib
Aliphatisch	A, V, L, I	b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, MeIle, Cha, Nle, MeVal
Hydrophil
Sauer	D, E
Basisch	H, K, R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH₂), Dbu, Dab
Polar	C, Q, N, S, T	Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer
Helix aufbrechend	P, G	D-Pro und andere D-Aminosäuren (in L-Peptiden)

Während die Aminosäuren der Kernpeptide der Struktur (I) in den meisten Fällen durch L-enantiomere Aminosäuren ersetzt werden, sind die Substitutionen nicht auf L-enantiomere Aminosäuren begrenzt. In der Definition von „mutierten" oder „veränderten" Formen sind daher solche Situationen inbegriffen, bei denen mindestens eine L-Aminosäure durch eine identische D-Aminosäure (z. B. L-Arg → D-Arg) oder durch eine D-Aminosäure derselben Kategorie oder Unterkategorie (z. B. L-Arg → D-Lys) ersetzt ist, und umgekehrt. Tatsächlich können die Peptide in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, die für eine orale Verabreichung an Tierindividuen geeignet sind, vorteilhafterweise aus mindestens einer D-enantiomeren Aminosäure zusammengesetzt sein. Peptide, die solche D-Aminosäuren enthalten, gelten als stabiler gegenüber einem Abbau in der Mundhöhle, im Darm oder im Serum als Peptide, die ausschließlich aus L-Aminosäuren zusammengesetzt sind.
Wie oben erwähnt, neigen D-Aminosäuren dazu, die Struktur von α-Helices zu stören, wenn sie an internen Positionen eines α-helikalen L-Peptids enthalten sind. Es wurde ferner beobachtet, dass bestimmte mutierte Formen der Kernpeptide der Struktur (I), die vollständig aus D-Aminosäuren zusammengesetzt sind, in den hierin beschriebenen Assays wesentlich niedrigere LCAT-Aktivierung aufweisen als identische Peptide, die vollständig aus L-Aminosäuren zusammengesetzt sind. Folglich sollten D-Aminosäuren nicht verwendet werden, um interne L-Aminosäuren zu substituieren; D-Aminosäuresubstitutionen sollten auf 1-3 Aminosäurereste am N-Terminus und/oder C-Terminus des Peptids beschränkt werden.
Wie oben erörtert wirkt die Aminosäure Gly (G) üblicherweise als Helix aufbrechender Rest, wenn sie an internen Positionen eines Peptids enthalten ist. Recht überraschend haben die Anmelder entdeckt, dass die Helixstruktur der erfindungsgemäßen Kernpeptide in Abwesenheit von Lipiden zwar aufgebrochen wird, wenn interne Aminosäurereste durch Gly (G) ersetzt werden, solche Gly(G)-haltigen Peptide in Gegenwart von Lipiden aber signifikante Helixstruktur sowie Aktivität aufweisen. Während beispielsweise Peptid 154 (PVLELFENLLERGLDALQKKLK; SEQ ID Nr.:154) in Puffer nur eine Helixstruktur von 13% aufweist, wurde in Gegenwart von Mizellen eine Helixstruktur von 76% beobachtet. Bemerkenswert ist, dass mehrere Kernpeptide mit internen Gly(G)-Resten eine LCAT-Aktivierung von ≥ 38% aufweisen. Obgleich Gly (G) daher im Allgemeinen als Helix aufbrechender Rest gilt, kann Gly (G) verwendet werden, um Aminosäuren an internen Positionen der Kernpeptide der Struktur (I) zu ersetzen. Vorzugsweise werden nur interne Reste, die sich innerhalb von etwa ±1 Helixschleife der Mitte des Peptids befinden (insbesondere bei Peptiden, die aus einer geraden Anzahl von Aminosäuren bestehen), durch Gly (G) ersetzt. Darüber hinaus ist bevorzugt, dass nur ein interner Aminosäurerest in dem Peptid durch Gly (G) ersetzt wird. Bevorzugte Ausführungsformen der ApoA-I-Agonisten der Erfindung, die interne Glycine enthalten, sind in Abschnitt 5.1.2 unten beschrieben.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Aminosäurerestklassifizierungen in Verbindung mit dem Helixrad nach Schiffer-Edmundson und den Helixnetzdiagrammdarstellungen der Kernpeptide der Struktur (I), sowie der ausführlichen Beschreibung der gewünschten Eigenschaften, wie sie hierin gegeben wird, lassen sich veränderte oder mutierte Formen der Kernpeptide der Struktur (I), welche die amphipathischen und anderen Eigenschaften der Helix im Wesentlichen beibehalten und die daher als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend gelten, einfach erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden veränderte oder mutierte Formen der Kernpeptide der Struktur (I) erhalten, indem die hydrophilen oder hydrophoben Reste nach Struktur (I) fixiert und mindestens ein nicht fixierter Rest durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, vorzugsweise konservativ, d. h. mit einer anderen Aminosäure derselben Kategorie oder Unterkategorie. Die Reste, aus denen die basischen und/oder hydrophoben Gruppen (Cluster) zusammengesetzt sind, können ebenfalls nach Struktur (I) fixiert und mindestens ein nicht fixierter Rest substituiert werden, vorzugsweise konservativ.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden veränderte oder mutierte Formen der Kernpeptide der Struktur (I) erhalten, indem die in der hydrophilen Fläche der Helix positionierten hydrophilen Aminosäurereste nach Struktur (I) fixiert werden und mindestens ein nicht fixierter Aminosäurerest durch eine andere Aminosäure substituiert wird, vorzugsweise durch eine andere Aminosäure derselben Kategorie oder Unterkategorie. Unter Bezugnahme auf 2A ist zu sehen, dass Rest 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 und 22 in der hydrophilen Fläche der von den Kernpeptiden der Struktur (I) gebildeten amphipathischen Helix positioniert sind. Von diesen Resten sind alle hydrophil, außer Rest 1, der entweder hydrophil oder hydrophob sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform sind daher Rest 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 und 22 nach Struktur (I) fixiert und mindestens einer der Reste 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 und 21 ist durch eine andere Aminosäure derselben Kategorie substituiert, vorzugsweise durch eine andere Aminosäure derselben Unterkategorie. Alternativ ist auch Rest 1 nach Struktur (I) fixiert und mindestens einer der Reste 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 und 21 ist substituiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist auch die C-terminale basische Gruppe (Cluster) (Rest 19, 20 und 22) nach Struktur (I) fixiert und nur Rest 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16 und/oder 17 ist substituiert.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist auch die hydrophobe Gruppe (Cluster) nach Struktur (I) fixiert und nur Rest 2, 5, 13, 14, 16, 17, 20 und/oder 21 ist substituiert.
In noch einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind sowohl die basische als auch die hydrophobe Gruppe (Cluster) fixiert und nur Rest 2, 5, 13, 14, 16 und/oder 17 ist substituiert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden veränderte oder mutierte Formen der Kernpeptide der Erfindung erhalten, indem die hydrophoben Aminosäurereste, die in der hydrophoben Fläche der Helix positioniert sind, fixiert und mindestens ein nicht fixierter Aminosäurerest durch einen anderen Aminosäurerest substituiert wird, vorzugsweise durch einen anderen Rest derselben Kategorie oder Unterkategorie.
Unter Bezugnahme auf 2A ist zu sehen, dass die Reste 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 und 21 in der hydrophoben Fläche positioniert sind. Von diesen sind alle hydrophob, außer Rest 20, der hydrophil ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind daher Rest 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17 und 21 nach Struktur (I) fixiert und mindestens einer der Reste 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19, 20 und 22 ist durch einen anderen Aminosäurerest substituiert, vorzugsweise durch eine andere Aminosäure derselben Kategorie oder Unterkategorie.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist auch die C-terminale basische Gruppe (Cluster) (Rest 19, 20 und 22) fixiert und nur Rest 1, 4, 7, 8, 11, 12 und/oder 15 ist substituiert.
In einer anderen Ausführungsform werden veränderte oder mutierte Formen der Peptide der Struktur (I) erhalten, indem alle Aminosäurereste, die in der hydrophoben oder hydrophilen Flache der Helix liegen, fixiert werden und mindestens ein Aminosäurerest, der in der anderen Fläche liegt, durch einen anderen Aminosäurerest, vorzugsweise konservativ, substituiert wird. Die Reste, aus denen die hydrophobe Gruppe (Cluster) und/oder die basische Gruppe (Cluster) zusammengesetzt ist, können gegebenenfalls ebenfalls nach Struktur (I) fixiert werden, wie oben erläutert.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die veränderten oder mutierten Formen von Struktur (I) erhalten, indem mindestens eine Aminosäure durch eine nicht konservative Aminosäure substituiert wird. Einem Fachmann ist bekannt, dass solche Substitutionen die amphipathischen und/oder strukturellen Eigenschaften der oben erläuterten Helix nicht wesentlich verändern dürften. In bestimmten Fällen kann es daher wünschenswert sein, ein Paar oder mehrere Paare von Aminosäuren zu substituieren, um die Nettoeigenschaften der Helix zu konservieren. Weitere Richtlinien zur Auswahl geeigneter Aminosäuresubstitutionen geben die in TABELLE X aufgelisteten Peptidsequenzen (siehe Abschnitt 8.3. unten).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden der erste bis vierte Aminosäurerest am N-Terminus und/oder C-Terminus der Kernpeptide der Struktur (I) durch einen oder mehrere Aminosäurereste oder durch eines oder mehrere Peptidsegmente substituiert, von denen bekannt ist, dass sie Regionen einer α-helikalen Sekundärstruktur Stabilität verleihen („Endkappen"-Reste oder -Segmente). Solche Endkappenreste und -segmente sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30):7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Segle et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-7; Doig und Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35:387397; Doig et al., 1997, Protein Science 6:147-155). Alternativ kann der erste bis vierte N-terminale und/oder C-terminale Aminosäurerest von Struktur (I) durch peptidomimetische Einheiten ersetzt werden, welche die Struktur und/oder Eigenschaften von Endkappenresten oder -segmenten nachahmen. Geeignete Endkappenmimetika sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und beispielsweise in Richardson and Richardson, 1988, Science 240:16481652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30):7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Segle et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-7; Doig und Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig et al., 1997, Protein Science 6:147-155 beschrieben.
Obgleich Struktur (1) 22 spezifizierte Aminosäurerestpositionen enthält, versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Kernpeptide weniger als 22 Aminosäurereste enthalten können. Vielmehr werden trunkierte oder intern deletierte Formen der Struktur (1), die nur 18 oder sogar nur 15 Aminosäurereste enthalten und welche die Gesamtmerkmale und -eigenschaften der von den Kernpeptiden der Struktur (I) gebildeten amphipathischen Helix im Wesentlichen beibehalten, als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
Trunkierte Formen der Peptide der Struktur (I) werden erhalten, indem eine oder mehrere Aminosäuren vom N- und/oder C-Terminus der Struktur (1) deletiert werden. Intern deletierte Formen der Struktur (I) werden durch Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren von internen Positionen in dem Peptid der Struktur (1) erhalten. Bei den internen deletierten Aminosäureresten kann es sich um aufeinander folgende Reste handeln, was jedoch nicht zwingend der Fall sein muss.
Einem Fachmann ist bekannt, dass die Deletion eines internen Aminosäurerestes von einem Kernpeptid der Struktur (I) bewirkt, dass sich die Ebene der hydrophil-hydrophoben Berührungsfläche der Helix am Deletionspunkt um 100° dreht. Da solche Rotationen die amphipathischen Eigenschaften der resultierenden Helix signifikant verändern können, sind in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Aminosäurereste derart deletiert, damit die Ausrichtung der Ebene der hydrophil-hydrophoben Berührungsfläche entlang der gesamten Langsachse der Helix beibehalten wird.
Dies kann geeignet erreicht werden, indem eine ausreichende Anzahl aufeinander folgender oder nicht aufeinander folgender Aminosäurereste derart deletiert wird, dass eine ganze Helixschleife deletiert wird. Eine idealisierte Helix enthält 3,6 Reste je Schleife. In einer bevorzugten Ausführungsform sind daher Gruppen von 3-4 aufeinander folgenden oder nicht aufeinander folgenden Aminosäureresten deletiert. Ob 3 Aminosäuren oder 4 Aminosäuren deletiert werden, richtet sich nach der Position des ersten zu deletierenden Restes innerhalb der Helix. Die Bestimmung der geeigneten Zahl aufeinander folgender oder nicht aufeinander folgender Aminosäurereste, die von einem beliebigen Anfangspunkt innerhalb einer amphipathischen Helix eine ganze Helixschleife ausmachen, liegt im Fähigkeitsbereich eines Fachmanns.
Aufgrund der vermuteten Bedeutung der basischen Gruppe (Cluster) am C-Terminus der Kernpeptide der Struktur (I) bei der Stabilisierung der Helix und der Bedeutung der hydrophoben Gruppe (Cluster) bei der Herbeiführung der Lipidbindung und der LCAT-Aktivierung werden Reste, welche die basischen und hydrophoben Gruppen (Cluster) umfassen, in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung nicht deletiert. In bevorzugten Ausführungsformen werden daher Rest 19, 20 und 22 (basisches Cluster) und Rest 3, 6, 9 und 10 (hydrophobes Cluster) nicht deletiert.
Die Kernpeptide der Struktur (I) können auch an einem oder beiden Enden oder intern mit weiteren Aminosäureresten verlängert bzw. erweitert sein, welche die strukturellen und/oder funktionellen Eigenschaften der Peptide nicht wesentlich beeinflussen, sondern in manchen Ausführungsformen sogar verstärken. Vielmehr gelten verlängerte bzw. erweiterte Kernpeptide, die bis zu 23, 25, 26, 29 oder noch mehr Aminosäurereste enthalten, als im Umfang der Erfindung liegend. Vorzugsweise behalten solche verlängerten bzw. erweiterten Peptide die amphipathischen Nettoeigenschaften und anderen Nettoeigenschaften der Peptide der Struktur (I) im Wesentlichen bei. Natürlich wird anerkannt, dass sich bei internem Hinzufügen von Aminosäuren die Ebene der hydrophob-hydrophilen Berührungsfläche an dem Einfügungspunkt auf ähnliche Weise wie oben für interne Deletionen beschrieben dreht. Die oben in Verbindung mit internen Deletionen erläuterten Überlegungen gelten daher auch für interne Additionen.
In einer Ausführungsform sind die Kernpeptide am N- und/oder C-Terminus durch mindestens eine Helixschleife erweitert/verlängert. Vorzugsweise stabilisieren solche Erweiterungen/erlängerungen die Sekundärstruktur der Helix in Gegenwart von Lipiden, wie beispielsweise die oben beschriebenen Endkappen-Aminosäuren und -segmente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Kernpeptid der Struktur (I) am C-Terminus durch einen einzelnen basischen Aminosäurerest, vorzugsweise Lys (K) verlängert.
Im Unfang der vorliegenden Erfindung sind auch „blockierte" Formen des ApoA-I-Agonisten enthalten, d. h. Formen der ApoA-I-Agonisten, bei denen der N- und/oder C-Terminus mit einer Einheit blockiert ist, die mit dem N-terminalen NH₂ oder C-terminalen -C(O)OH reagieren kann. Es wurde entdeckt, dass das Entfernen der N- und/oder C-terminalen Ladungen von den erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten mit 18 oder weniger Aminosäureresten (durch Synthese N-acylierter Peptidamide/-ester/-hydrazide/-alkohole und Substitutionen davon) zu Agonisten führt, welche ungefähr die Aktivität der nicht blockierten Form des Agonisten aufweisen und in manchen Ausführungsformen sogar übertreffen. In manchen Ausführungsformen, die 22 oder mehr Aminosäuren enthalten, ergibt die Blockierung des N- oder C-Terminus ApoA-I-Agonisten, die eine geringere Aktivität als die unblockierten Formen aufweisen. Die Blockierung sowohl des N- als auch des C-Terminus von aus 22 Aminosäuren zusammengesetzten ApoA-I- Agonisten sollte die Aktivität jedoch wiederherstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist daher entweder der N- und/oder der C-Terminus (vorzugsweise beide Termini) von Kernpeptiden blockiert, die 18 oder weniger Aminosäuren enthalten, während die N- und C-Termini von Peptiden mit 22 oder mehr Aminosäuren entweder beide blockiert oder beide nicht blockiert sind. Typische N-terminale Blockierungsgruppen umfassen RC(O)-, wobei R -H, (C₁-C₆)Alkyl, (C₁-C₆)Alkenyl, (C₁-C₆)Alkynyl, (C₅-C₂₀)Aryl, (C₆-C₂₆)Alkaryl, 5- bis 20-gliedriges Heteroaryl oder 6- bis 26-gliedriges Alkheteroaryl umfasst. Bevorzugte N-terminale Blockierungsgruppen umfassen Acetyl, Formyl und Dansyl. Typische C-terminale Blockierungsgruppen umfassen -C(O)NRR und -C(O)OR, wobei jedes R unabhängig wie oben definiert ist. Bevorzugte C-terminale Blockierungsgruppen umfassen solche, bei denen jedes R unabhängig Methyl ist. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass solche terminalen Blockierungsgruppen die α-Helix in Gegenwart von Lipiden stabilisieren (siehe z. B. Venkatachelapathi et al., 1993, PROTEINS: Struktur, Function und Genetics 15:349-359).
Die native Struktur von ApoA-I enthält acht Helixeinheiten, von denen angenommen wird, dass sie zur Bindung von Lipiden zusammen wirken (Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10262; Vanloo et al., 1991, J. Lipid Res. 32:1253-1264; Mendez et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:1698-1705; Palgunari et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasco Biol. 16:328-338; Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84). In der vorliegenden Erfindung enthalten sind daher auch ApoA-I-Agonisten, die aus Dimeren, Trimeren, Tetrameren und Polymeren noch höherer Ordnung („Multimeren") der hierin beschriebenen Kernpeptide zusammengesetzt sind. Solche Multimere können in Form von Tandemwiederholungen, verzweigten Netzwerken oder Kombinationen davon vorliegen. Die Kernpeptide können direkt aneinander angebracht sein oder können durch einen oder mehrere Linker getrennt sein.
Die Kernpeptide, welche die Multimere aufweisen, können die Peptide der Struktur (I), Analoga von Struktur (I), mutierte Formen von Struktur (I), trunkierte oder intern deletierte Formen von Struktur (I), erweiterte/verlängerte Formen von Struktur (I) und/oder Kombinationen davon sein. Die Kernpeptide können auf die Art Kopf-zu-Schwanz (d. h. N-Terminus zu C-Terminus), Kopf-zu-Kopf (d. h. N-Terminus zu N-Terminus), Schwanz-zu-Schwanz (d. h. C-Terminus zu C-Terminus) oder Kombinationen davon verbunden sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Multimere Tandemwiederholungen von zwei, drei, vier und bis zu etwa zehn Kernpeptiden. Vorzugsweise sind die Multimere Tandemwiederholungen von 2 bis 8 Kernpeptiden. In einer Ausführungsform umfassen daher die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten Multimere mit folgender Strukturformel: HH{LL_m-HH}_nLL_m-HH, (II)worin:
jedes m unabhängig eine Ganzzahl von 0 bis 1, vorzugsweise 1, ist;
n eine Ganzzahl von 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 8, ist;
jedes „HH" unabhängig ein Kernpeptid oder ein Peptidanalog der Struktur (I) oder eine mutierte, trunkierte, intern deletierte oder erweiterte/verlängerte Form davon wie hierin beschrieben wiedergibt;
jedes „LL" unabhängig einen Linker wiedergibt und
jedes „-" unabhängig eine kovalente Bindung bezeichnet.
In Struktur (II) kann der Linker LL jedes bifunktionale Molekül sein, das zwei Peptide kovalent miteinander verknüpfen kann. Geeignete Linker sind daher bifunktionale Moleküle, bei denen die funktionellen Gruppen kovalent an den N- und/oder C-Terminus eines Peptids angebracht werden können. Für die Befestigung am N- und/oder C-Terminus eines Peptids geeignete funktionelle Gruppen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt, wie auch geeignete Chemien zur Herstellung der Ausbildung einer solchen kovalenten Bindung.
Der Linker kann flexibel, steif oder halbsteif sein, je nach den gewünschten Eigenschaften des Multimers. Geeignete Linker umfassen zum Beispiel Aminosäurereste wie Pro oder Gly oder Peptidsegmente, die von etwa 2 bis etwa 5, 10, 15 oder 20 oder noch mehr Aminosäuren enthalten, bifunktionale organische Verbindungen wie H₂N(CH₂)_nCOOH, wobei n eine Ganzzahl von 1 bis 12 ist, und dergleichen. Beispiele solcher Linker sowie Verfahren zur Herstellung solcher Linker und von Peptiden, die solche Linker enthalten, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Hünig et al., 1974, Chem. Ber. 100:3039-3044; Basak et al., 1994, Bioconjug. Chem. 5(4):301-305).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tandemwiederholungen intern durch einen einzelnen Prolinrest unterbrochen. Zu diesem Zweck ist in solchen Fällen, bei denen die Kernpeptide an ihrem N- oder C-Terminus mit Prolin enden, wie beispielsweise wenn X₁ in Struktur (I) Pro (P) oder D-Pro (p) ist, m in Struktur (II) vorzugsweise 0. In solchen Fällen, bei denen die Kernpeptide kein N- oder C-terminales Prolin enthalten, ist LL vorzugsweise Pro (P) oder D-Pro (p), und m ist vorzugsweise 1.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann es wünschenswert sein, spaltbare Linker zu verwenden, welche unter bestimmten Bedingungen die Freisetzung von einem oder mehreren Helixsegmenten (HH) gestatten. Geeignete spaltbare Linker umfassen Peptide mit Aminosäuresequenzen, die von Proteasen erkannt werden, Oligonukleotide, die von Endonukleasen gespalten werden, und organische Verbindungen, die chemisch spaltbar sind, beispielsweise unter sauren, basischen oder anderen Bedingungen. Vorzugsweise sind die Spaltbedingungen relativ mild, um die Helixsegmente und/oder nicht gespaltene Linker, aus denen die multimeren ApoA-I-Agonisten zusammengesetzt sind, nicht zu denaturieren oder anderweitig abzubauen.
Peptid- und Oligonukleotidlinker, die selektiv spaltbar sine, sowie Mittel zum Spalten der Linker sind gut bekannt und einem Fachmann bekannt. Geeignete Linker aus organischen Verbindungen, die selektiv spaltbar sind, sind einem Fachmann bekannt und umfassen die beispielsweise in WO 94/08051 sowie den darin zitierten Bezugsverweisen Genannten.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den verwendeten Linker um Peptide, die Substrate für endogene zirkulatorische Enzyme sind, wodurch die multimeren ApoA-I-Agonisten in vivo selektiv gespalten werden können. Zum Spalten der Linker geeignete endogene Enzyme umfassen zum Beispiel Proapolipoprotein-A-I-Propeptidase. Geeignete Enzyme sowie Peptidsegmente, die als Substrate für solche Enzyme wirken, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Edelstein et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:11430-11433; Zanis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2574-2578).
Wie oben erörtert, ist ein Schlüsselmerkmal der Kernpeptide der Erfindung ihre Fähigkeit, intermolekulare Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken zu bilden, wenn sie auf antiparallele Weise angeordnet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden daher Linker ausreichender Länge und Flexibilität verwendet, damit sich die Helixsegmente (HH) von Struktur (II) auf antiparallele Weise ausrichten und in Gegenwart von Lipiden Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken bilden können.
Linker ausreichender Länge und Flexibilität umfassen, aber nicht ausschließlich, Pro (P), Gly (G), Cys-Cys, H₂N-(CH₂)_n-C(O)OH, wobei n 1 bis 12, vorzugsweise 4 bis 6 ist; H₂N-Aryl-C(O)OH und Kohlenhydrate.
Wenn die nativen Apolipoproteine eine kooperative Bindung zwischen antiparallelen Helixsegmenten gestatten, können alternativ Peptidlinker, deren Primärsequenz den Peptidsegmenten entspricht, welche benachbarte Helices der nativen Apolipoproteine verbinden, einschließlich zum Beispiel ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE und ApoJ, geeignet verwendet werden, um die Kernpeptide zu verknüpfen. Diese Sequenzen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Rosseneu et al., „Analysis of the Primary and of the Secondary Struktur of the Apolipoproteins", In: Structure and Function of Lipoproteins, Kap. 6, 159-183, CRC Press, Inc., 1992).
Andere Linker, welche die Bildung intermolekularer Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken zwischen Tandemwiederholungen antiparalleler Helixsegmente zulassen, umfassen Peptidumkehrschleifen wie β-Schleifen und γ-Schleifen, sowie organische Moleküle, welche die Strukturen von Peptid-β-Schleifen und/oder γ-Schleifen nachahmen. Umkehrschleifen sind generell Segmente eines Peptids, welche die Richtung der Polypeptidkette derart umkehren, dass eine einzelne Polypeptidkette Bereiche eines antiparallelen β-Faltblatt- oder einer antiparallelen α-Helixstruktur annehmen können. β-Schleifen sind üblicherweise aus vier Aminosäureresten zusammengesetzt, und γ-Schleifen sind üblicherweise aus drei Aminosäureresten zusammengesetzt.
Die Konformationen und Sequenzen vieler Peptid-β-Schleifen sind im Stand der Technik gut beschrieben und umfassen beispielsweise, ohne Einschränkung Typ-I, Typ-I', Typ-II, Typ-II', Typ-III, Typ-III', Typ-IV, Typ-V, Typ-V', Typ-VIa, Typ-VIb, Typ-VII und Typ-VIII (siehe Richardson 1981, Adv. Protein Chem. 34:167-339; Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394).
Die spezifischen Konformationen kurzer Peptidschleifen, wie beispielsweise von β-Schleifen, richten sich primär nach der Position bestimmter Aminosäurereste in der Schleife (üblicherweise Gly, Asn oder Pro). Generell ist die β-Schleife von Typ-I mit jedem Aminosäurerest an Position 1 bis 4 der Schleife kompatibel, außer dass Pro nicht an Position 3 vorkommen kann. An Position 4 kommt Gly am häufigsten vor, und an Position 2 von Typ-I- und von Typ-II-Schleifen ist Pro am häufigsten. An Position 1 kommen häufig Asp-, Asn-, Ser- und Cys-Reste vor, wobei ihre Seitenketten häufig über eine Wasserstoffbrücke mit dem NH von Rest 3 verbunden sind.
Bei Typ-II-Schleifen kommen an Position 3 am häufigsten Gly und Asn vor, da sie am einfachsten den erforderlichen Gerüstwinkel annehmen. Idealerweise haben Typ-I'-Schleifen Gly an Position 2 und 3, und Typ-II'-Schleifen haben Gly an Position 2. Typ-III-Schleifen können generell die meisten Aminosäurereste aufweisen, aber Typ-III'-Schleifen erfordern in der Regel Gly an Position 2 und 3. Schleifen vom Typ- VIa und -VIb weisen generell eine cis-Peptidbindung und Pro als internen Rest auf. Für eine Übersicht über die verschiedenen Typen und Sequenzen von β-Schleifen in Proteinen und Peptiden sei der Leser verwiesen auf Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232.
Auch die Konformationen und Sequenzen vieler Peptid-γ-Schleifen sind im Stand der Technik gut beschrieben (siehe z. B. Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394). Alle dieser Arten von β-Schleifen- und γ-Schleifenstrukturen und ihre entsprechenden Sequenzen sowie später entdeckte Peptid-β-Schleifen- und -γ-Schleifenstrukturen und -sequenzen sind in der Erfindung spezifisch berücksichtigt.
Alternativ kann der Linker (LL) ein organisches Molekül oder eine organische Einheit aufweisen, welche die Struktur einer Peptid-β-Schleife der -γ-Schleife nachahmt. Solche hinsichtlich β- und/oder γ-Schleifen mimetische Einheiten, sowie Verfahren zum Synthetisieren von Peptiden, die solche Einheiten enthalten, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und umfassen, unter anderem, die in Giannis and Kolter, 1993 Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 32:1244-1267; Kahn et al., 1988, J. Molecular Recognition 1:75-79; und Kahn et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28:1623-1626 beschriebenen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung haben die Multimere die Form verzweigter Netzwerke (siehe z. B. 7). Solche Netzwerke werden geeignet durch Verwendung multifunktioneller Verknüpfungseinheiten erhalten, die es gestatten, dass mehr als zwei Helixeinheiten an eine einfache Verknüpfungseinheit angebracht werden können. Verzweigte Netzwerke verwenden daher Moleküle mit drei, vier oder noch mehr funktionellen Gruppen, welche kovalent am N- und/oder C-Terminus eines Peptids befestigt werden können. Geeignete Verknüpfungseinheiten umfassen beispielsweise Aminosäurereste mit Seitenketten, die Hydroxyl-, Sulfanyl-, Amino-, Carboxyl-, Amid- und/oder Esterfunktionalitäten tragen, wie beispielsweise Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q), Lys (K), Arg (R), Orn, Asp (D) und Glu (E), oder andere organische Moleküle, die solche funktionellen Gruppen enthalten.
Die Helixsegmente, die an einer einzelnen Verknüpfungseinheit befestigt sind, brauchen nicht über gleiche Enden befestigt sein. Vielmehr sind die Helixsegmente in manchen Ausführungsformen so an einer einzelnen Verknüpfungseinheit befestigt, damit sie auf antiparallele Weise angeordnet sind, d. h. einige der Helices sind über ihre N-Termini, andere über ihre C-Termini befestigt.
Die Helixsegmente können direkt an der Verknüpfungseinheit befestigt sein oder können durch einen oder mehrere bifunktionale Linker (LL), wie oben beschrieben, von der Verknüpfungseinheit beabstandet sein.
Unter Bezugnahme auf 7A und 7B ist ersichtlich, dass ein verzweigtes Netzwerk in Bezug auf die Anzahl der „Knoten", welche das Netzwerk aufweist, beschrieben werden kann, wobei jede multifunktionelle Verknüpfungseinheit einen Knoten darstellt. In 7A und 7B sind Helixsegmente (d. h. erfindungsgemäße Kernpeptide) als Zylinder veranschaulicht und multifunktionelle Verknüpfungseinheiten (bzw. Knoten) als Kreise (•), wobei die Anzahl der Linien, die von jedem Kreis ausgehen, die „Ordnung" (bzw. die Anzahl der funktionellen Gruppe) der multifunktionellen Verknüpfungseinheit anzeigt.
Die Anzahl der Knoten in dem Netzwerk richtet sich generell nach der gewünschten Gesamtanzahl der Helixsegmente und liegt typischerweise bei etwa 1 bis 2. Natürlich haben Netzwerke mit Verknüp fungseinheiten höherer Ordnung bei einer gegebenen Anzahl gewünschter Helixsegmente weniger Knoten. Unter Bezugnahme auf 7A und 7B weist beispielsweise ein Netzwerk tertiärer Ordnung (d. h. ein Netzwerk mit trifunktionalen Verknüpfungseinheiten) aus sieben Helixeinheiten drei Knoten auf (7A), wohingegen ein Netzwerk quaternärer Ordnung (d. h. ein Netzwerk mit tetrafunktionellen Verknüpfungseinheiten) aus sieben Helixeinheiten nur zwei Knoten aufweist (7B).
Die Netzwerke können einheitlicher Ordnung sein, d. h. Netzwerke, bei denen alle Knoten beispielsweise trifunktionale oder tetrafunktionelle Verknüpfungseinheiten sind, oder können gemischter Ordnung sein, z. B. Netzwerke, bei denen die Knoten Mischungen aus beispielsweise trifunktionalen oder tetrafunktionellen Verknüpfungseinheiten sind. Natürlich versteht sich, dass selbst bei Netzwerken einheitlicher Ordnung die Verknüpfungseinheiten nicht identisch sein müssen. Ein Netzwerk tertiärer Ordnung kann beispielsweise zwei, drei, vier oder noch mehr verschiedene trifunktionale Verknüpfungseinheiten verwenden.
Wie die linearen Multimere können die Helixsegmente, welche die verzweigten Netzwerke aufweisen, identisch sein, was aber nicht zwingend erforderlich ist.
Ein Beispiel eines solchen verzweigten Netzwerks gemischter Ordnung ist in 7C veranschaulicht. In 7C sind Helixsegmente (d. h. erfindungsgemäße Kernpeptide) als Zylinder und multifunktionelle Verknüpfungseinheiten als Kreise (•) veranschaulicht, wobei die Anzahl der Linien, die von jedem Kreis ausgehen, die „Ordnung" (bzw. die Anzahl der funktionellen Gruppe) der multifunktionellen Verknüpfungseinheit anzeigt. Linien, die Helixsegmente verbinden, stellen bifunktionale Linker LL dar, wie oben beschrieben. Helixsegmente, welche die verzweigten Netzwerke aufweisen, können Tandemwiederholungen von Kernpeptiden, wie oben beschrieben, sein.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform sind die verzweigten Netzwerke der Erfindung durch folgende Formel beschrieben: X-N_ya-X_(ya-1)-(N_yb-X_(yb-1))_p (III) wobei
jedes X unabhängig HH-(LL_m-HH)-_nLL_m-HH ist;
jedes HH unabhängig ein Kernpeptid der Struktur (I) oder ein Analog oder eine mutierte, trunkierte, intern deletierte oder erweiterte/verlängerte Form davon wie hierin beschrieben ist;
jedes LL unabhängig ein bifunktionaler Linker ist;
jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist;
jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist;
N_ya und N_yb unabhängig jeweils eine multifunktionelle Verknüpfungseinheit sind, wobei y_a und y_b die Anzahl der funktionellen Gruppen an N_ya bzw. N_yb darstellen;
jedes y_a oder y_b unabhängig eine ganze Zahl von 3 bis 8 ist;
p eine ganze Zahl von 0 bis 7 ist und
jedes „-" unabhängig eine kovalente Bindung bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das verzweigte Netzwerk einen „Lys-Baum", d. h. ein Netzwerk, bei dem die multifunktionelle Verknüpfungseinheit einer oder mehrere Lys(K)-Reste ist bzw. sind (siehe z. B. 7D).
In einer veranschaulichenden Ausführungsform sind die „Lys-Baum"-verzweigten Netzwerke der Erfindung durch folgende Formel beschrieben:
wobei
jedes X unabhängig HH-(LL_m-HH)-_n-LL_m-HH ist;
jedes HH unabhängig ein Kernpeptid der Struktur (I) oder ein Analog oder eine mutierte analoge oder mutierte, trunkierte, intern deletierte oder erweiterte/verlängerte Form davon wie hierin beschrieben ist;
jedes LL unabhängig ein bifunktionaler Linker ist;
jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist;
jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist;
R₁ -OR oder -NRR ist;
jedes R unabhängig -H, (C₁-C₆)Alkyl, (C₁-C₆)Alkenyl, (C₁-C₆)Alkynyl, (C₅-C₂₀)Aryl, (C₆-C₂₆)Alkalyl, ein 5- bis 20-gliedriges Heteroaryl oder ein 6- bis 26-gliedriges Alkheteroaryl ist.
5.1.1. ANALYSE VON STRUKTUR UND FUNKTION
Die Struktur und Funktion der Kernpeptide bzw. Peptidanaloga der Erfindung sowie von ApoA-I-Agonisten, die aus solchen Kernpeptiden zusammengesetzt sind, einschließlich der oben beschriebenen multimeren Formen, lassen sich testen, um aktive Agonisten oder Mimetika von ApoA-I auszuwählen. Beispielsweise lassen sich die Kernpeptide oder Peptidanaloga hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung von α-Helices in Gegenwart von Lipiden, zur Lipidbindung, zur Bildung von Komplexen mit Lipiden, zur Aktivierung von LCAT, zur Begünstigung des Cholesterinausstroms, etc. testen.
Verfahren und Assays zur Analyse der Struktur und/oder Funktion der Peptide sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Bevorzugte Verfahren sind in den Arbeitsbeispielen unten bereitgestellt. Beispielsweise können der Test auf Cirkulardichroismus (CD) und der Kernmagnetresonanz (NMR)-Assay, die in Abschnitt 7 unten beschrieben sind, zur Analyse der Struktur der Peptide oder Peptidanaloga verwendet werden – insbesondere des Grades der Helizität in Gegenwart von Lipiden. Die Fähigkeit zur Lipidbindung kann mithilfe des in Abschnitt 7 unten beschriebenen Fluoreszenzspektroskopieassays bestimmt werden. Die Fähigkeit der Peptide und/oder Peptidanaloga zur Aktivierung von LCAT kann mithilfe der in Abschnitt 8 unten beschriebenen LCAT-Aktivierung einfach beschrieben werden. Die in Abschnitt 9, 10 und 11 unten beschriebenen In-vitro- und In-vivo-Assays können zur Bestimmung der Halbwertszeit, der Verteilung, des Cholesterinausstroms und der Effekte auf den RCT verwendet werden.

Im Allgemeinen gelten erfindungsgemäße Kernpeptide und/oder Peptidanaloga, welche die in Tabelle IV unten aufgelisteten Eigenschaften aufweisen, als aktiv. TABELLE IV EIGENSCHAFTEN AKTIVER PEPTIDE

EIGENSCHAFT	BEREICH	BEVORZUGTER BEREICH
% Helizität in Gegenwart von Lipiden (Ri = 30) (unblockierte Peptide mit 22 Aminosäureresten)	≥ 60%	≥ 80%
% Helizität in Gegenwart von Lipiden (Ri = 30) (unblockierte Peptide mit 18 Aminosäureresten)	≥ 40%	≥ 60%
% Helizität in Gegenwart von Lipiden (Ri = 30) (blockierte Peptide mit 18 Aminosäureresten)	≥ 60%	≥ 80%
Lipidbindung (in Gegenwart von SUVs)	0,5-10 μM Peptid R_i = 1-50
LCAT-Aktivierung	≥ 38%	≥ 80%

R_i = molares Verhältnis von Lipid:Peptid

Wie in den Arbeitsbeispielen unten veranschaulicht, besitzen Kernpeptide, die einen hohen Grad an LCAT-Aktivierung aufweisen (≥ 38%), generell eine wesentliche α-Helixstruktur in Gegenwart von kleinen unilamellaren Lipidvesikeln (SUVs) (≥ 60% Helixstruktur im Falle unblockierter Peptide mit 22 oder mehr Aminosäureresten und blockierten Peptiden mit 18 oder weniger Aminosäureresten; ≥ 40% Helixstruktur im Falle unblockierter Peptide mit 18 oder weniger Aminosäuren) und solche Peptide, die wenig oder keine LCAT-Aktivierung aufweisen, besitzen wenig α-Helixstruktur. In bestimmten Fallen bewirken jedoch Peptide mit wesentlicher Helixstruktur in Gegenwart von Lipiden keine wesentliche LCAT-Aktivierung.
Obwohl entsprechend Kernpeptide, die wesentliche LCAT-Aktivierung zeigen, Lipide typischerweise binden, bewirken in manchen Fällen Peptide, die Lipidbindung zeigen, keine wesentliche LCAT-Aktivierung.
Infolgedessen wird von Fachleuten anerkannt, dass die Fähigkeit der hierin beschriebenen Kernpeptide zur Bildung von α-Helices (in Gegenwart von Lipiden) und zur Bindung von Lipiden für die Aktivität entscheidend ist, diese Eigenschaften in vielen Fällen aber gegebenenfalls nicht ausreichend sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Kernpeptide daher einer Reihe von Rastern unterzogen, um auf Kernpeptide zu selektieren, welche wesentliche pharmakologische Aktivität zeigen.
In einem ersten Schritt wird ein Kernpeptid mithilfe des in Abschnitt 7 unten beschriebenen CD-Assays hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Bildung einer von α-Helix in Gegenwart von Lipiden getestet. Solche Peptide, die in Gegenwart von Lipiden (bei einer Konzentration von etwa 5 μM und einem molaren Lipid:Peptid-Verhältnis von etwa 30) zu mindestens 40% helikal (unblockierte Peptide mit 18 oder weniger Aminosäuren) oder zu 60% helikal sind (blockierte Peptide mit 18 oder weniger Aminosäuren; unblockierte Peptide mit 22 oder mehr Aminosäuren), werden dann mithilfe des in Abschnitt 7 unten beschriebenen Fluoreszenzassays hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Lipidbindung getestet. Natürlich werden nur solche Kernpeptide mittels Fluoreszenz auf Lipidbindung getestet, die einen fluoreszenten Trp (W)- oder Nal-Rest enthalten. Bei Peptiden, die keine fluoreszierenden Reste enthalten, ist die Bindung an Lipide offensichtlich, wenn die Helizität in Gegenwart von Lipiden ansteigt.
Kernpeptide, die Lipidbindung in Gegenwart von SUVs aufweisen (0,5-10 μM Peptid; molares Lipid:Peptid-Verhältnis im Bereich von 1 bis 50) werden dann hinsichtlich einer pharmakologischen Aktivität getestet. Natürlich richtet sich die pharmakologische Aktivität, auf die getestet wird, nach der gewünschtem Verwendung der ApoA-I-Agonisten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kernpeptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Aktivierung von LCAT getestet, da Peptide, die LCAT aktivieren, in den hierin beschriebenen Verfahren besonders geeignet sind. Kernpeptide, die im Vergleich zu nativem humanem ApoA-I eine LCAT-Aktivierung von mindestens etwa 38% aufweisen (wie bestimmt anhand des in Abschnitt 8 unten beschriebenen LCAT-Aktivierungsassays), sind bevorzugt, wobei Kernpeptide, die 50%, 60%, 70%, 80% oder sogar 90% oder mehr aufweisen, besonders bevorzugt sind.
5.1.2. BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten können weiter anhand bevorzugter Ausführungsformen definiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten nach Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder -veresterten Formen davon.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten nach Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder -veresterten Formen davon, bei denen:
X₁ Pro (P), Gly (G), Ala (A), Asn (N) oder D-Pro (p) ist;
X₂ Ala (A), Val (V) oder Leu (L) ist;
X₅ Leu (L) ist;
X₆ Phe (F) ist;
X₁₁ Glu (E) ist;
X₁₉ Lys (K) ist;
X₂₀ Lys (K) ist und/oder
X₂₂ Lys (K) ist und jedes von X₃, X₄, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈ und X₂₁ wie oben für Struktur (I) definiert ist.
Besonders bevorzugte ApoA-I-Agonisten nach diesem Aspekt der Erfindung sind solche, bei denen X₂ Val (V) und/oder X₁₈ Gln (Q) ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten nach Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, bei denen eines von X₁₀, X₁₃ oder X₁₄ Gly (G) ist und die anderen von X₁₀, X₁₃ und X₁₄ nicht Gly (G) sind. Wenn X₁₄ Gly (G) ist, ist X₇ vorzugsweise Glu (E).
Besonders bevorzugte ApoA-I-Agonisten nach diesem Aspekt der Erfindung sind Peptide, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche besteht aus:

Peptid 148: PVLELFENLLERLGDALQKKLK (SEQ ID Nr.:148);

Peptid 151: PVLELFENLGERLLDALQKKLK (SEQ ID Nr.:151);

Peptid 154: PVLELFENLLERGLDALQKKLK (SEQ ID Nr.:154);

und die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon.
Ausführungsformen, die interne Glycinreste enthalten, können mit hoher Ausbeute einfach durch Segmentkondensation synthetisiert werden, was signifikante Vorteile für die Produktion in großem Maßstab bietet. Segmentkondensation, d. h. das Miteinanderverbinden kleiner Peptidkettenkonstituenten zur Ausbildung einer größeren Peptidkette, wurde verwendet, um viele biologisch aktive Peptide herzustellen, einschließlich ApoA-I-Mimetika mit 44 Aminosäureresten (siehe z. B. Nakagawa et al., 1985, J. Am Chem. Soc. 107:7087-7083; Nokihara et al., 1989, Peptides 1988:166-168; Kneib-Cordonnier et al., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:527-538), und gilt als kosteneffektivstes Verfahren für die Synthese großer Mengen der erfindungsgemäßen Kernpeptide mit hoher Ausbeute.
Zu den Vorzügen einer Synthese über Segmentkondensation gehören die Möglichkeit zur Kondensation vorgeformter Segmente in der Lösungsphase und die Einfachheit der Reinigung des Endproduktes. Zu den Nachteilen des Verfahrens gehören die niedrige Kopplungseffizienz und -ausbeute beim Kondensationsschritt und die niedrige Löslichkeit bestimmter Peptidsequenzen.
Die Kopplungseffizienz des Kondensationsschrittes lässt sich wesentlich erhöhen, indem die Kopplungsdauer erhöht wird. Typischerweise resultiert die Erhöhung der Kopplungsdauer zu einer verstärkten Razemisierung des Produktes (Sieber et al., 1970, Helv. Chim. Acta 53:2135-2150). Da Glycin jedoch kein chirales Zentrum aufweist, wird es keiner Razemisierung unterzogen (auch bei Prolinresten findet aufgrund sterischer Behinderung bei langer Kopplungsdauer wenig oder keine Razemisierung statt). Ausführungsformen, die interne Glycinreste enthalten, können deshalb durch Segmentkondensation in großer Menge und mit hoher Ausbeute synthetisiert werden, indem Segmentkonstituenten synthetisiert werden, welche die Tatsache nutzen, dass bei Glycinresten keine Razemisierung stattfindet. Ausführungsformen, die interne Glycinreste enthalten, bieten daher wesentliche Vorteile für die Großmengenproduktion in großem Maßstab.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den ApoA-I-Agonisten um Peptide mit 22 Aminosäureresten nach Struktur (I) oder um die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, bei denen jedes von X₁₀, X₁₃ und X₁₄ nicht Gly (G) ist.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den ApoA-I-Agonisten um veränderte oder mutierte Formen der Peptide nach Struktur (I) oder um die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, bei denen:
X₄ nicht Asp (D) ist;
X₅ nicht Phe (F) ist;
X₆ nicht Trp (W) ist;
X₇ nicht Leu (L) oder Asp (D) ist;
X₉ nicht Gly (G) oder Trp (W) ist;
X₁₂ nicht Lys (K) ist;
X₁₃ nicht Trp (W) ist;
X₁₄ nicht Trp (W) ist;
X₁₅ nicht Glu (E) ist;
X₁₆ nicht Trp (W) oder Leu (L) ist und/oder
X₁₇ nicht Trp (W) ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den ApoA-I-Agonisten um Peptide mit 22 Aminosäureresten nach Struktur (I) oder um die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, bei denen X₇ Leu (L) ist, X₁₀ Trp (W) ist, X₁ nicht Gly (G) ist und/oder X₁₄ nicht Gly (G) ist. Ein besonders bevorzugtes Peptid nach diesem Aspekt der Erfindung ist Peptid 155 (PVLELFLNLWERLLDALQKKLK; SEQ ID Nr.:155).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den ApoA-I-Agonisten um Peptide mit 22 Aminosäureresten oder um die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, bei denen mindestens eines von X₁₉, X₂₀ oder X₂₂ nicht Orn ist. Mehr bevorzugt sind mindestens zwei von X₁₉, X₂₀ und X₂₂ nicht Orn. Am meisten bevorzugt ist jedes von X₁₉, X₂₀ und X₂₂ nicht Orn.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten aus der Gruppe der unten ausgeführten Peptide ausgewählt:

Peptid 144:	pVLELFENLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:144);
Peptid 145:	GVLELFENLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:145);
Peptid 146:	PVLELFENLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:146);
Peptid 147:	PVLELFENLLERLFDALQKKLK	(SEQ ID NR.:147);
Peptid 148:	PVLELFENLLERLGDALQKKLK	(SEQ ID NR.:148);
Peptid 149:	PVLELFENLWERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:149);
Peptid 150:	PLLELFENLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:150);
Peptid 151:	PVLELFENLGERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:151);
Peptid 152:	PVFELFENLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:152);
Peptid 153:	AVLELFENLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:153);
Peptid 154:	PVLELFENLLERGLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:154);
Peptid 155:	PVLELFLNLWERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR.:155);
Peptid 155:	PVLELFLNLWERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR:155);
Peptid 186:	PVLELFEQLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR:186);
Peptid 187:	PVLELFENLLERLLDALNKKLK	(SEQ ID NR:187);
Peptid 188:	PVLELFENLLDRLLDALQKKLK	(SEQ ID NR:188);
Peptid 189:	DVLELFENLLERLLDALQKKLK	(SEQ ID NR:189);

und die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterte Formen davon.

In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten multimere Formen nach Struktur II, III und/oder IV, bei denen jedes HH unabhängig ein Peptid nach Struktur (I) oder eine N-terminal acylierte und/oder C-terminal amidierte oder veresterte Form davon ist oder eines der bevorzugten Peptide nach der hierin beschriebenen Struktur (I).

In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Kernpeptide, aus denen die ApoA-I-Agonisten zusammengesetzt sind, keine der folgenden Peptide:

Peptid 75:	PVLDEFREKLNEELEALKQKLK	(SEQ ID NR.:75);
Peptid 94:	PVLDEFREKLNEALEALKQKLK	(SEQ ID NR.:94);
Peptid 109:	PVLDEFREKLNERLEALKQKLK	(SEQ ID NR.:109);
Peptid 237:	LDDLLQKWAEAFNQLLKK	(SEQ ID NR.:237);
Peptid 238:	EWLKAFYEKVLEKLKELF*	(SEQ ID NR.:238);
Peptid 241:	DWFKAFYDKVFEKFKEFF	(SEQ ID NR.:241);
Peptid 242:	GIKKFLGSIWKFIKAFVG	(SEQ ID NR.:242);
Peptid 243:	DWFKAFYDKVAEKFKEAF	(SEQ ID NR.:243);
Peptid 244:	DWLKAFYDKVAEKLKEAF	(SEQ ID NR.:244);
Peptid 245:	DWLKAFYDKVFEKFKEFF	(SEQ ID NR.:245);
Peptid 246:	EWLEAFYKKVLEKLKELF	(SEQ ID NR.:246);
Peptid 247:	DWFKAFYDKFFEKFKEFF	(SEQ ID NR.:247);
Peptid 248:	EWLKAFYEKVLEKLKELF	(SEQ ID NR.:248);
Peptid 249:	EWLKAEYEKVEEKLKELF*	(SEQ ID NR.:249);
Peptid 250:	EWLKAEYEKVLEKLKELF*	(SEQ ID NR.:250); und
Peptid 251:	EWLKAFYKKVLEKLKELF*	(SEQ ID NR.:251).

In einer letzten bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I Agonisten keine der in TABELLE X (Abschnitt 8.3 unten) aufgeführten Peptide, die eine LACT-Aktivierungsaktivität von weniger als 38% im Vergleich zu nativem humanem ApoA-I zeigen.
5.2 SYNTHESE UND REINIGUNG DER ApoA-I-PEPTIDAGONISTEN
Die erfindungsgemäßen Kernpeptide können mithilfe praktisch jedem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von Peptiden hergestellt werden. Beispielsweise können die Peptide anhand einer herkömmlichen schrittweisen Lösung oder durch Festphasenpeptidsynthesen oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
5.2.1 CHEMISCHE SYNTHESE
Kernpeptide können mit einer herkömmlichen schrittweisen Lösung oder durch Festphasenpeptidsynthese (siehe z. B. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides und Proteins, Williams et al., Hrsg., 1997, CRC Press, Boca Raton Florida, und darin genannte Bezugsverweise; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Hrsg., 1989, IRL Press, Oxford, England, und darin genannte Bezugsverweise).
Alternativ können die erfindungsgemäßen Peptide durch Segmentkondensation hergestellt werden, wie beispielsweise beschrieben in Liu et al., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Baca, et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887; Tam et al., 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216; Schnolzer and Kent, 1992, Science 256:221-225; Liu and Tam, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(10):4149-4153; Liu and Tam, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588; Yamashiro and Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334). Segmentkondensation ist ein besonders geeignetes Verfahren zum Synthetisieren von Ausführungsformen mit internen Glycinresten. Andere zum Synthetisieren der erfindungsgemäßen Peptide geeignete Verfahren sind beschrieben in Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092.
ApoA-I-Agonisten, die N- und/oder C-terminale Blockierungsgruppen enthalten, können mithilfe von Standardverfahren der organischen Chemie hergestellt werden. Beispielsweise sind Verfahren zum Acylieren des N-Terminus eines Peptids oder zum Amidieren oder Verestern des C-Terminus eines Peptids aus dem Stand der Technik gut bekannt. Wege zur Durchführung anderer Modifikationen am N- und/oder C-Terminus sind einem Fachmann bekannt, sowie auch Wege zum Schützen etwaiger Seitenkettenfunktionalitäten, wie es möglicherweise erforderlich ist, um terminale Blockierungsgruppen anzubringen.
Pharmazeutisch annehmbare Salze (Gegenionen) können durch Ionenaustauschchromatographie oder andere Verfahren, wie sie aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, geeignet hergestellt werden.
Erfindungsgemäße Verbindungen, welche in der Form von Tandemmultimeren vorliegen, können durch Hinzufügen des/der Linker(s) zu der Peptidkette in dem entsprechenden Schritt der Synthese geeignet synthetisiert werden. Alternativ können die Helixsegmente synthetisiert und jedes Segment mit dem Linker umgesetzt werden. Natürlich hängt das tatsächliche Syntheseverfahren von der Zusammensetzung des Linkers ab. Geeignete Schutzmaßnahmen und Chemien sind gut bekannt und einem Fachmann offensichtlich.
Erfindungsgemäße Verbindungen, welche in Form verzweigter Netzwerke vorliegen, können mithilfe der trimeren und tetrameren Harze und Chemien geeignet synthetisiert werden, welche in Tam, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413 und Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84, beschrieben sind. Die Modifikation der synthetischen Harze und Strategien zur Synthese verzweigter Netzwerke höherer oder niedrigerer Ordnung oder von solchen, die Kombinationen verschiedener Kernpeptid-Helixsegmente enthalten, liegen im Kompetenzbereich eines Fachmanns für Peptidchemie und/oder organische Chemie.
Die Bildung von Disulfidverknüpfungen wird, falls gewünscht, im Allgemeinen in Gegenwart schwacher Oxidationsmittel durchgeführt. Es können chemische Oxidationsmittel verwendet werden, oder die Verbindungen können einfach atmosphärischem Sauerstoff ausgesetzt werden, um diese Verknüpfungen herbeizuführen. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren bekannt, einschließlich die, die beispielsweise beschrieben sind von Tam et al., 1979, Synthesis 955-957; Stewart et al., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Company Rockford, IL; Ahmed et al., 1975, J. Biol. Chem. 250:8477-8482; und Pennington et al., 1991 Peptides 1990 164-166, Giralt and Andren, Hrsg., ESCOM Leiden, Niederlande. Eine weitere Alternative ist von Kamber et al., 1980, Helv. Chim. Acta 63:899-915, beschrieben. Ein auf festen Trägern durchgeführtes Verfahren ist beschrieben Albericio, 1985, Int. J. Peptide Protein Res. 26:92-97. Jedes dieser Verfahren kann verwendet werden, um in den erfindungsgemäßen Peptiden Disulfidverknüpfungen auszubilden.
5.2.2 REKOMBINANTE SYNTHESE
Wenn das Peptid vollständig aus genkodierten Aminosäuren zusammengesetzt ist oder wenn ein Anteil davon so zusammengesetzt ist, kann das Peptid oder der relevante Anteil auch mithilfe herkömmlicher genetischer Rekombinationstechniken synthetisiert werden.
Für eine rekombinante Produktion wird eine Polynukleotidsequenz, welche das Peptid kodiert, in ein geeignetes Expressionsvehikel, d. h. einen Vektor, eingesetzt, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der eingesetzten Kodierungssequenz oder im Falle eines viralen RNA-Vektors die erforderlichen Elemente für die Replikation und Translation enthält. Das Expressionsvehikel wird dann in eine geeignete Zielzelle transfiziert, die das Peptid exprimiert. Je nach dem verwendeten Expressionssystem wird das exprimierte Peptid dann durch aus dem Stand der Technik gut bekannte Verfahren isoliert. Verfahren für die Produktion rekombinanter Proteine und Peptide sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y., von denen jedes hierin durch Bezugnahme in Gänze enthalten ist).
Zur Steigerung der Produktionseffizienz kann das Polynukleotid entworfen werden, um mehrere Einheiten des Peptids getrennt durch enzymatische Spaltungsstellen zu kodieren – auf diese Weise können entweder Homopolymere (sich wiederholende Peptideinheiten) oder Heteropolymere (unterschiedliche Peptide, die zusammen aufgereiht sind) hergestellt werden. Das resultierende Polypeptid kann gespalten werden (z. B. durch Behandlung mit dem jeweiligen Enzym), um die Peptideinheiten wiederzugewinnen. Dies kann die Ausbeute von Peptiden erhöhen, welche von einem einzelnen Promotor gesteuert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein polyzistronisches Polynuldeotid derart entworfen sein, dass eine einzelne mRNA transkribiert wird, die mehrere Peptide kodiert (d. h. Homopolymere oder Heteropolymere), wobei jede Kodierungsregion operativ mit einer cap-unabhängigen Translationskontrollsequenz verknüpft ist, d. h. einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (Internal Ribosome Entry Site, IRES). Bei Verwendung in geeigneten viralen Expressionssystemen ist die Translation eines jeden von der mRNA kodierten Peptids in dem Transkript intern gerichtet, z. B. durch die IRES. Das polyzistronische Konstrukt steuert also die Transkription einer einzelnen großen polyzistronischen mRNA, welche wiederum die Translation mehrerer einzelner Peptide steuert. Dieser Ansatz macht die Produktion und enzymatische Prozessierung von Polyproteinen überflüssig und könnte die Ausbeute von Peptiden, die von einem einzelnen Promotor angetrieben werden, wesentlich erhöhen.
Es kann eine Vielzahl verschiedener Wirtsexpressionsvektorsysteme verwendet werden, um die hierin beschriebenen Peptide zu exprimieren. Dazu gehören, jedoch nicht ausschließlich Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien, die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA transformiert sind, oder DNA-Plasmidexpressionsvektoren, die eine geeignete Kodierungssequenz enthalten, Hefen oder Fadenpilze, welche mit rekombinanten Hefe- oder Pilzexpressionsvektoren transformiert sind, die eine geeignete Kodierungssequenz enthalten, Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Bakulovirus) infiziert sind, welche eine geeignete Kodierungssequenz enthalten, Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus oder Tabakmosaikvirus) infiziert oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid) transformiert sind, die eine geeignete Kodierungssequenz enthalten, oder Tierzellsysteme.
Die Expressionselemente der Expressionssysteme variieren hinsichtlich ihrer Stärke und Spezifität. Je nach dem verwendeten Wirt/Vektor-System kann ein Beliebiges aus einer Reihe geeigneter Transkriptions- und Translationselemente, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, in dem Expressionsvektor verwendet werden. Beim Klonieren in bakterielle Systeme können beispielsweise induzierbare Promotoren wie pL des Bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromotor) und dergleichen verwendet werden; beim Klonieren in Insektenzellsysteme können Promotoren wie der Bakuloviruspolyhedronpromotor verwendet werden; beim Klonieren in Pflanzenzellsysteme können Promotoren aus dem Genom von Pflanzenzellen (z. B. Hitzeschockpromotoren; der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO; der Promotor für das Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein) oder aus Pflanzenviren (z. B. der 35S-RNA-Promoter von CaMV; der Hüllproteinpromoter von TMV) verwendet werden; beim Klonieren in Säugerzellsysteme können Promotoren aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. der Metallothioneinpromotor) oder aus Säugerviren (z. B. der Late-Promotor von Adenovirus; der 7,5-K-Promotor von Vakziniavirus) verwendet werden; beim Herstellen von Zelllinien, welche mehrere Kopien des Expressionsproduktes enthalten, können SV40-, BPV- und EBV-basierte Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
In Fällen, bei denen Pflanzenexpressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, welche die erfindungsgemäßen Peptide kodieren, von einem Beliebigen einer Reihe von Promotoren angetrieben werden. Beispielsweise können virale Promotoren wie der 35S-RNA- und 19S-RNA-Promotor von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514) oder der Hüllproteinpromotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311) verwendet werden; alternativ können Pflanzenpromotoren wie die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838843) oder Hitzeschockpromoteren, z. B. Sojabohnen-hsp17.5-E oder hsp17.3-B (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565) verwendet werden. Diese Konstrukte lassen sich mithilfe von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirusvektoren, direkte DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation etc. in Pflanzenzellen einführen. Für eine Übersicht über solche Verfahren siehe z. B. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Kapitel VIII, S. 421-463; und Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2. Aufl., Blackie, London, Kapitel 7-9.
In einem Insektenexpressionssystem, das zur Produktion der erfindungsgemäßen Peptide verwendet werden kann, wird das Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) als Vektor verwendet, um die Fremdgene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Eine Kodierungssequenz kann in nicht-essenzielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedrongen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors gestellt werden (zum Beispiel des Polyhedronpromotors). Ein erfolgreiches Einsetzen in eine Kodierungssequenz führt zur Inaktivierung des Polyhedrongens und zur Produktion von nicht-okkludiertem rekombinantem Virus (d. h. von Virus ohne die proteinöse Hülle, die von dem Polyhedrongen kodiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen das eingesetzte Gen exprimiert wird (siehe z. B. Smith et al., 1983, J. Viral. 46:584; Smith, US-Patent Nr. 4,215,051 ). Weitere Beispiele dieses Expressionssystem können in Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Ausubel et al., Hrsg., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, gefunden werden.
In Säugerwirtszellen kann eine Reihe virusbarierter Expressionssysteme verwendet werden. Wenn ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann eine Kodierungssequenz mit einem Adenovirus-Transkriptions-Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. dem Later-Promotor und einer dreiteiligen Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann durch In-Vitro- oder In-Vivo- Rekombination in das Adenovirusgenom eingesetzt werden. Einsetzen in eine nicht-essenzielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) ergibt ein rekombinantes Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, Peptide in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe z. B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659). Alternativ kann der 7.5-K-Promotor von Vakzinia verwendet werden (siehe z. B. Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).
Weitere Expressionssysteme zum Herstellen der erfindungsgemäßen Peptide sind für einen Fachmann offensichtlich.
5.2.3 REINIGUNG VON PEPTIDEN
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren wie beispielsweise Umkehrphasenchromatographie, Flüssigkeitschromatgraphie (High Performance Liquid Chromatography), Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen. Die tatsächlichen Bedingungen, die zur Reinigung eines bestimmten Peptids verwendet werden, richten sich zum Teil nach der Synthesestrategie und nach Faktoren wie Nettoladung, Hydrophobizität, Hydrophilität, etc. und sind einem Fachmann bekannt. Multimere verzweigte Peptide können beispielsweise durch Ionenaustausch oder durch Größenausschlusschromatographie gereinigt werden.
Für eine Affinitätschromatographie kann jeder Antikörper verwendet werden, der das Peptid spezifisch bindet. Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Kaninchen, Mäuse, Ratten etc. durch Injektion mit einem Peptid immunisiert werden. Das Peptid kann über eine funktionelle Seitenkettengruppe oder über einen an eine funktionelle Seitenkettengruppe angebrachten Linker an einen geeigneten Träger angebracht werden, beispielsweise an BSA. Es können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich Freunds (vollständiges und unvollständiges) Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Dinitrophenol und möglicherweise geeignete humane Adjuvanzien wie BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Monoklonale Antikörper gegen ein Peptid können mit jeder Technik hergestellt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bietet. Dazu gehören, aber nicht ausschließlich, die Hybridomatechnik, ursprünglich beschrieben von Köhler und Milstein, 1975, Nature 256:495-497, oder Kaprowski, US-Patent Nr. 4.376.110 , welche hierin durch Bezugnahme enthalten ist; die humane B-Zellhybridoma-Technik, Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) und die EBV-Hybridomatechnike (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies und Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96 (1985)). Darüber hinaus können Techniken verwendet werden, die für die Produktion „chimärer Antikörper" entwickelt wurden (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, Boss, US-Patent Nr. 4816397 ; Cabilly, US-Patent Nr. 4816567 ; die hierin durch Bezugnahme enthalten sind), indem die Gene eines Mausantikörpermoleküls geeigneter Spezifität mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls geeigneter biologischer Aktivität zusammen gesplict werden. Oder es können „humanisierte" Antikörper hergestellt werden (siehe z. B. Queen, US-Patent Nr. 5585089 , das hierin durch Bezugnahme enthalten ist). Alternativ können Techniken, die für die Produktion von Einzelkettenantikörpern beschrieben sind ( US-Patent Nr. 4946778 ), angepasst werden, um peptidspezifische Einzelkettenantikörper herzustellen.
Antikörperfragmente, die Deletionen spezifischer Bindungsstellen enthalten, können durch bekannte Verfahren erzeugt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, und Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281), die eine schnelle und einfache Identifikation monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität für das relevante Peptid gestatten.
Der Antikörper bzw. das Antikörperfragment, die für das gewünschte Peptid spezifisch sind, können zum Beispiel an Agarose angebracht werden, und der Antikörper-Agarose-Komplex wird bei der Immunchromatographie verwendet, um erfindungsgemäße Peptide zu reinigen. Siehe Scopes, 1984, Protein Purification: Principles und Practice, Springer-Verlag New York, Inc., NY, Livingstone, 1974, Methods In Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731.
5.3 PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN UND BEHANDLUNGSVERFAHREN
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten können verwendet werden, um jede Krankheit bei Tieren, insbesondere Säugern einschließlich Menschen, zu behandeln, bei denen eine Erhöhung der HDL-Serumkonzentration, die Aktivierung von LCAT und die Förderung des Cholesterinausstroms und des RCT günstig ist. Solche Zustände umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Hyperlipidämie und insbesondere Hypercholesterinämie und Herz-Kreislauf-Krankheit wie beispielsweise Atherosklerose (einschließlich Behandlung und Vorbeugung von Atherosklerose), Restenose (z. B. Vorbeugen oder Behandeln atherosklerotischer Plaques, welche sich infolge von medizinischen Verfahren wie einer Ballonangioplastie bilden) und andere Krankheiten, wie beispielsweise Endotoxämie, welche häufig zu einem septischen Schock führt.
Die ApoA-I-Agonisten können alleine oder im Rahmen einer Kombinationstherapie mit anderen Arzneimitteln verwendet werden, um die obigen Zustände zu behandeln. Solche Therapien umfassen, aber nicht ausschließlich, gleichzeitige oder aufeinander folgende Verabreichung der jeweiligen Arzneimittel.
Bei der Behandlung von Hypercholesterinämie oder Atherosklerose können die ApoA-I-Agonistenformulierungen beispielsweise mit einem beliebigen oder mehreren der derzeit verwendeten Cholesterin senkenden Therapien verabreicht werden, z. B. Gallensäureharzen, Niacin und/oder Statinen. Ein solches kombiniertes Regime kann besonders günstige therapeutische Effekte produzieren, da jeder Wirkstoff auf ein anderes Ziel bei Cholesterinsynthese und -transport wirkt, d. h. Gallensäureharze beeinflussen die Cholesterinwiedergewinnung, die Chylomikronen und die LDL-Population, Niacin beeinflusst hauptsächlich die VLDL- und LDL-Population, die Statine hemmen die Cholesterinsynthese, wobei die LDL-Population verringert wird (und möglicherweise die Expression von LDL-Rezeptor erhöht wird), während die ApoA-I-Agonisten den RCT beeinflussen, das HDL erhöhen, die LCAT-Aktivität erhöhen und den Cholesterinausstrom begünstigen.
In einer anderen Ausführungsform können die ApoA-I-Agonisten in Verbindung mit Fibraten verwendet werden, um Hyperlipidämie, Hypercholesterinämie und/oder Herz-Kreislauf-Krankheit wie beispielsweise Atherosklerose zu behandeln.
In einer weiteren Ausfürungsform können die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten in Kombination mit den derzeit zur Behandlung von durch Endotoxin ausgelöstem septischem Schock verwendeten antimikrobiellen und entzündungshemmenden Wirkstoffen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten können als Peptide oder als Peptid-Lipid-Komplexe formuliert sein, die auf unterschiedliche Weise an Individuen verabreicht werden können, um die ApoA-I-Agonisten in den Blutkreislauf zu bringen. Beispielhafte Formulierungen und Behandlungsregimes sind unten beschrieben.
5.3.1 ApoA-I-AGONISTEN UND PEPTID/LIPID-KOMPLEX ALS WIRKSTOFF
Die ApoA-I-Peptidagonisten können mithilfe jeder in Abschnitt 5.2 und deren Unterabschnitten beschriebenen Technik hergestellt werden. Stabile Zubereitungen mit langer Haltbarkeit lassen sich durch Lyophilisierung der Peptide herstellen – entweder zur Herstellung von Großmengen zur Reformulierung oder zur Herstellung einzelner Teilmengen oder Dosiseinheiten, die durch Rehydrierung mit sterilem Wasser oder einer geeigneten sterilen gepufferten Lösung vor der Verabreichung an ein Individuum rekonstituiert werden können.
In bestimmten Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, die ApoA-I-Agonisten in einem Peptid-Lipid-Komplex zu formulieren und zu verabreichen. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile, da der Komplex im Blutkreislauf eine längere Halbwertszeit haben dürfte, insbesondere, wenn der Komplex eine ähnliche Größe und Dichte wie HDL und insbesondere die Prä-β-1- oder Prä-β-2-HDL-Populationen aufweist. Die Peptid-Lipid-Komplexe können mit einem beliebigen einer Reihe von unten beschriebenen Verfahren geeignet hergestellt werden. Stabile Zubereitungen mit einer langen Haltbarkeit können durch Lyophilisation hergestellt werden – wobei das unten beschriebene Co-Lyophilisationsverfahren der bevorzugte Ansatz ist. Die lyophilisierten Peptid-Lipid-Komplexe können verwendet werden, um Großmengen zur Reformulierung herzustellen oder um einzelne Teilmengen oder Dosiseinheiten herzustellen, die durch Rehydrierung mit sterilem Wasser oder einer geeigneten sterilen gepufferten Lösung vor der Verabreichung an ein Individuum rekonstituiert werden können.
Es können verschiedene, einem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden, um die Peptid-Lipid-Vesikel oder -Komplexe herzustellen. Dazu kann eine Reihe verfügbarer Techniken zur Herstellung von Liposomen oder Proteoliposomen verwendet werden. Beispielsweise kann das Peptid gemeinsam mit geeigneten Lipiden ultraschallbehandelt werden (mithilfe eines Ultraschallbads oder einer Ultraschallsonde), um Komplexe zu bilden. Alternativ kann das Peptid mit vorgeformten Lipidvesikeln kombiniert werden, was zur spontanen Bildung von Peptid-Lipid-Komplexen führt. In einer weiteren Alternative können die Peptid-Lipid-Komplexe mit einem Detergenz-Dialyseverfahren gebildet werden, z. B. wird ein Gemisch des Peptids, Lipids und Detergens dialysiert, um das Detergens zu entfernen und Peptid-Lipid-Komplexe zu rekonstituieren oder zu bilden (z. B. siehe Jonas et al., 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582).
Obgleich die obigen Ansätze machbar sind, präsentiert jedes Verfahren seine eigenen besonderen Produktionsprobleme in Bezug auf Kosten, Ausbeute, Reproduzierbarkeit und Sicherheit. Die Anmelder haben ein einfaches Verfahren zum Herstellen von Peptid- oder Protein-Phospholipid-Komplexen entwickelt, die ähnliche Eigenschaften wie HDL aufweisen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die ApoA-I-Peptid-Lipid-Komplexe herzustellen und hat folgende Vorteile: (1) Es werden die meisten oder alle der enthaltenen Inhaltsstoffe verwendet, um die entworfenen Komplexe zu bilden, wodurch Ausgangsmaterialabfall, wie er bei den anderen Verfahren häufig anfällt, vermieden wird. (2) Es werden lyophilisierte Verbindungen gebildet, die bei Aufbewahrung sehr stabil sind. Die resultierenden Komplexe können unmittelbar vor den Gebrauch rekonstituiert werden. (3) Die resultierenden Komplexe müssen in der Regel nach der Formulierung und vor dem Gebrauch nicht weiter gereinigt werden. (4) Toxische Verbindungen, einschließlich Detergenzien wie Cholat werden vermieden. Darüber hinaus kann der Maßstab des Produktionsverfahrens einfach erhöht werden und eignet sich für GMP-Herstellung (d. h. in einer endotoxinfreien Umgebung).
Nach dem bevorzugten Verfahren werden das Peptid und das Lipid in einem Lösungsmittelsystem kombiniert, das jeden Inhaltsstoff gemeinsam löst und das durch Lyophilisierung vollständig entfernt werden kann. Dazu müssen die Lösungsmittelpaare sorgfältig ausgewählt werden, um die gemeinsame Löslichkeit sowohl des amphipathischen Peptids als auch des Lipids sicherzustellen. In einer Ausführungsform können das Protein bzw. die Proteine oder das Peptid bzw. die Peptide, die in die Teilchen integriert werden soll(en), in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch gelöst werden (Lösungsmittel 1). Die (Phospho)lipid-Komponente wird in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch gelöst (Lösungsmittel 2), das mit Lösungsmittel 1 mischbar ist, und die beiden Lösungen werden gemischt. Alternativ können das Peptid und das Lipid in ein Co-Lösungsmittelsystem integriert werden, d. h. in ein Gemisch der mischbaren Lösungsmittel. Ein geeigneter Anteil von Peptid (Protein) zu Lipiden wird zunächst empirisch bestimmt, so dass die resultierenden Komplexe die geeigneten physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzen, d. h. für gewöhnlich (jedoch nicht zwingend) mit ähnlicher Größe wie HDL. Das resultierende Gemisch wird gefroren und bis zur Trockenheit lyophilisiert. Bisweilen muss dem Gemisch ein weiteres Lösungsmittel zugegeben werden, um die Lyophilisierung zu erleichtern. Dieses lyophilisierte Produkt kann lange Zeit aufbewahrt werden und bleibt stabil.
In den unten beschriebenen Arbeitsbeispielen wurden das Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) und Phospholipide separat in Methanol gelöst, kombiniert und dann vor der Lyophilisierung mit Xylol gemischt. Sowohl Peptid als auch Lipid können einem Gemisch der beiden Lösungsmittel zugegeben werden. Alternativ kann eine Lösung des in Methanol gelösten Peptids mit einer Lösung von in Xylol gelösten Lipiden gemischt werden. Es ist darauf zu achten, Salz aus dem Lösungsmittelsystem zu entfernen, um das Aussalzen des Peptids zu vermeiden. Die resultierende Lösung, die das gemeinsam in Methanol/Xylol gelöste Peptid und Lipid enthält, wird lyophilisiert, um ein Pulver zu bilden.
Das lyophilisierte Produkt kann rekonstituiert werden, um eine Lösung oder eine Suspension des Peptid-Lipid-Komplexes zu erhalten. Dazu wird das lyophilisierte Pulver mit einer wässrigen Lösung zu einem geeigneten Volumen rehydriert (häufig 5 mg Peptid/ml, was für die intravenöse Injektion geeignet ist). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das lyophilisierte Pulver mit phosphatgepufferter Salzlösung oder einer physiologischen Salzlösung rehydriert. Das Gemisch muss unter Umständen bewegt oder auf dem Vortex gemischt werden, um die Rehydrierung zu erleichtern, und in den meisten Fällen sollte der Rekonstitutionsschritt bei einer Temperatur durchgeführt werden, die mindestens der Phasenübergangstemperatur der Lipidkomponente des Komplexes entspricht. Innerhalb von Minuten resultiert eine klare Zubereitung rekonstituierter Lipid-Protein-Komplexe.
Ein Aliquot der resultierenden rekonstituierten Zubereitung kann charakterisiert werden um zu bestätigen, dass die Komplexe in der Zubereitung die gewünschte Größenverteilung aufweisen, z. B. die Größenverteilung von HDL. Dazu kann Gelfiltrationschromatographie verwendet werden. In den unten beschriebenen Arbeitsbeispielen wurde ein Superose-6-FPLC-Gelfiltrationschromatographiesystem von Pharmacia verwendet. Der verwendete Puffer enthält 150 mM NaCl in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4. Ein typisches Probenvolumen ist 20 bis 200 Mikroliter der Komplexe, die 5 mg Peptid/ml enthalten. Die Säulenflussrate beträgt 0,5 ml/Min. Eine Reihe von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht und Stokes-Durchmesser sowie humanes HDL wird als Standard verwendet, um die Säule zu kalibrieren. Die Proteine und Lipoproteinkomplexe werden durch Absorption oder Streuung von Licht bei einer Wellenlänge von 254 oder 280 nm überwacht.
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten können mit unterschiedlichen Lipiden komplexiert werden, einschließlich gesättigten, ungesättigten, natürlichen und synthetischen Lipiden und/oder Phospholipiden. Geeignete Lipide umfassen, aber nicht ausschließlich, kleine Alkylkettenphospholipide, Ei-Phosphatidylcholin, Sojabohnen-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, 1-Myristoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2myristoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2stearoylphosphatidylcholin, 1-Stearoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholindioleophosphatidylethanolamin, Dilauroylphosphatidylglycerolphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Sphingomyelin, Sphingolipide, Phosphatidylglycerol, Diphosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidylglycerol, Dipalmitoylphosphatidylglycerol, Distearoylphosphatidylglycerol, Dioleoylphosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatidsäure, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin, Gehirnphosphatidylserin, Gehirnsphingomyelin, Dipalmitoylsphingomyelin, Distearoylsphingomyelin, Phosphatidsäure, Galactozerebrosid, Ganglioside, Zerebrosidee, Dilaurylphosphatidylcholin, (1,3)-D-Mannosyl-(1,3)diglycerid, Aminophenylglycosid, 3-Cholesteryl-6'-(glycosylthio)hexyletherglycolipide und Cholesterin und seine Derivate.
Die Anmelder haben entdeckt, dass, wenn die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten mit Sphingomyelin komplexiert werden, das gesamte HDL der prä-β-artigen Teilchen entfernt wird. Entsprechend werden die ApoA-I-Agonisten in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung als ein Komplex mit Sphingomyelin verabreicht.
5.3.2 BEHANDLUNGSVERFAHREN
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Peptidagonisten oder Peptid-Lipid-Komplexe können auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, der Bioverfügbarkeit im Blutkreislauf gewährleistet. Dies kann am besten auf parenteralem Verabreichungsweg erreicht werden, einschließlich intravenöser (i.v.), intramuskulärer (i.m.), intradermaler, subkutaner (s.c.) und intraperitonealer (i.p.) Injektionen.
Es können aber andere Verabreichungswege verwendet werden. Beispielsweise kann auf oralem Verabreichungsweg (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Schlucken, bukkale und sublinguale Wege) eine Resorption durch den Magendarmtrakt erreicht werden, vorausgesetzt, es werden geeignete Formulierungen (z. B. magensafiresistente Beschichtungen) verwendet, um den Abbau des Wirkstoffes z. B. in den rauen Umgebungen der Mundschleimhaut, des Magens und/oder des Dünndarms zu vermeiden oder zu minimieren. Alternativ kann die Verabreichung auf dem Weg aber Schleimhautgewebe wie der Vagina oder des Rektums erfolgen, um einen Abbau im Magendarmtrakt zu vermeiden oder zu minimieren. Bei einer weiteren Alternative können die erfindungsgemäßen Formulierungen transkutan (z. B. transdermal) oder durch Inhalation verabreicht werden. Der bevorzugte Weg kann je nach Zustand, Alter und Compliance des Empfängers variieren.
Die tatsächliche Dosis des verwendeten ApoA-I-Agonisten oder des Peptid-Lipid-Komplexes variiert je nach Verabreichungsweg und sollte angepasst werden, um zirkulierende Plasmakonzentrationen von 100 mg/l bis 2 g/l zu erreichen. In hierin beschriebenen Tiermodellsystemen erhaltene Daten zeigen, dass die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten mit der HDL-Komponente assoziieren und beim Menschen eine voraussichtliche Halbwertszeit von etwa fünf Tagen haben. In einer Ausführungsform können die ApoA-I-Agonisten daher durch Injektion in einer Dosis zwischen 0,5 mg/kg bis 100 mg/kg einmal wöchentlich verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform können wünschenswerte Serumkonzentrationen durch kontinuierliche Infusion oder durch intermittierende Infusion, die etwa 0,5 mg/kg/Std. bis 100 mg/kg/Std. liefern, aufrechterhalten werden.
Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der verschiedenen ApoA-I-Agonisten kann anhand von pharmazeutischen Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren zum Bestimmen der LD₅₀ (der für 50% der Population tödlichen Dosis) und der ED₅₀ (der bei 50% der Population therapeutische wirksamen Dosis) bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index und kann als Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. ApoA-I-Peptidagonisten, die einen hohen therapeutischen Index aufweisen, sind bevorzugt.
5.3.3 PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN
Die pharmazeutischen Formulierungen der Erfindung enthalten den ApoA-I-Peptidagonisten oder den Peptid-Lipid-Komplex als Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, der für die Verabreichung und den Transport in vivo geeignet ist. Da die Peptide saure und/oder basische Enden und/oder Seitenketten enthalten können, können die Peptide entweder in der Form freier Säuren oder Basen oder in der Form pharmazeutisch annehmbarer Salze in der Formulierung vorhanden sein.
Injizierbare Zubereitungen umfassen sterile Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen von Wirkstoff in wässrigen oder öligen Vehikeln. Die Zusammensetzungen können auch Formulierungsmittel, wie beispielsweise Suspensionsmittel, Stabilisatoren und/oder Dispersionsmittel enthalten. Die Formulierungen für die Injektion können in Einheitsdosierungsform, z. B. in Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern, vorliegen und können hinzugefügte Konservierungsmittel enthalten.
Alternativ kann die injizierbare Formulierung in Pulverform zur Rekonstitution mit einem geeigneten Vehikel vor dem Gebrauch, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, steriles pyrogenfreies Wasser, Puffer, Dextroselösung, etc., bereitgestellt sein. Dazu kann der ApoA-I-Agonist lyophilisiert sein, oder es kann der co-lyophilisierte Peptid-Lipid-Komplex hergestellt werden. Die gelagerten Zubereitungen können in Einheitsdosierungsformen bereitgestellt sein und vor dem Gebrauch in vivo rekonstituiert werden.
Für verlängerte Abgabe kann der Wirkstoff als Depotzubereitung formuliert sein, zur Verabreichung durch Implantation, z. B. durch subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion. Der Wirkstoff kann daher mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwer lösliche Derivate formuliert sein, z. B. als schwer lösliche Salzform des ApoA-I-Agonisten.
Alternativ können transdermale Abgabesysteme, hergestellt als Haftscheibe oder Haftpflaster (Patch), verwendet werden, die den Wirkstoff langsam freisetzen, um perkutan resorbiert zu werden. Dazu können Permeationsverstärker verwendet werden, um die transdermale Penetration des Wirkstoffes zu erleichtern. Ein besonderer Vorteil kann erreicht werden, indem die ApoA-I-Agonisten der Erfindung oder der Peptid-Lipid-Komplex in einen Nitroglycerin-Patch zur Verwendung bei Patienten mit ischämischer Herzkrankheit und Hypercholesterinämie integriert werden.
Für die orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form von beispielsweise Tabletten oder Kapseln annehmen, die auf herkömmliche Weise mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten wie Bindemitteln (z. B. vorgelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z. B. Laktose, mikrokristalline Zellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmitteln (z. B. Magnesiumstearat, Talk oder Silica); Zerfallsmitteln (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycolat) oder Benetzungsmitteln (z. B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Die Tabletten können mit aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren beschichtet werden. Flüssigzubereitungen für die orale Verabreichung können die Form von beispielsweise Lösungen, Sirupen oder Suspensionen annehmen oder können als ein Trockenprodukt zur Konstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor dem Gebrauch präsentiert sein. Solche Flüssigzubereitungen können auf herkömmliche Weise mit pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoffen wie Suspensionsmitteln (z. B. Sorbitolsirup, Zellulosederivate und hydrogenierten essbaren Fetten), Emulgatoren (z. B. Lecithin oder Akazie), nicht-wässrigen Vehikeln (z. B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle) und Konservierungsmitteln (z. B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch gegebenenfalls Puffersalze, Aromastoffe, Farbstoffe und Süßstoffe enthalten. Zubereitungen für die orale Verabreichung können geeignet formuliert sein, um eine kontrollierte Freisetzung der aktiven Verbindung zu ergeben.
Für die bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen, die auf herkömmliche Weise formuliert sind. Für rektale und vaginale Verabreichungswege kann der Wirkstoff als Lösungen (für längeres Verhalten bestimmte Einläufe), als Zäpfchen oder als Salben formuliert sein.
Für die Verabreichung durch Inhalation kann der Wirkstoff geeignet in der Form einer Aerosolspraypräsentation aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Vernebler abgegeben werden, wobei ein geeignetes Treibmittel verwendet wird, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas. In dem Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit festgelegt werden, indem ein Ventil bereitgestellt wird, um eine abgemessene Menge abzugeben. Kapseln und Kartuschen aus z. B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalaor oder Insufflator können so formuliert sein, dass sie ein Pulvergemisch der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie beispielsweise Laktose oder Stärke enthalten.
Die Zusammensetzungen können, falls gewünscht, in einer Packung oder einer Spendervorrichtung dargereicht sein, die eine oder mehrere Einheitsdosierungsformen enthalten können, welche den Wirkstoff enthalten. Die Packung kann beispielsweise Metall oder Kunststofffolie aufweisen, wie beispielsweise als Blisterpackung. Der Packung oder Spendervorrichtung können Anleitungen für die Verabreichung beiliegen.
5.4 SONSTIGE VERWENDUNG
Die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten können in Assays in vitro verwendet werden, um beispielsweise für diagnostische Zwecke Serum-HDL zu messen. Da die ApoA-I-Agonisten mit der HDL-Komponente des Serums assoziieren, können die Agonisten als „Marker" für die HDL-Population verwendet werden. Darüber hinaus können die Agonisten als Marker für die Subpopulation von HDL verwendet werden, die beim RCT wirksam ist. Dazu kann der Agonist einer Patientenserumprobe zugegeben oder damit gemischt werden; nach einer geeigneten Inkubationszeit kann die HDL-Komponente gemessen werden, indem der eingebaute ApoA-I-Agonist erfasst wird. Dies kann durch markierte Agonisten (z. B. radioaktive Marker, fluoreszente Marker, Enzymmarker, Farbstoffe, etc.) oder durch Immunassays unter Verwendung von Antikörpern (oder Antikörperfragmenten), die für den Agonisten spezifisch sind, erreicht werden.
Alternativ können markierte Agonisten in Bildgebungsverfahren (z. B. CAT-Scans, MRT-Scans) verwendet werden, um das Blutkreislaufsystem zu visualisieren oder den RCT zu überwachen oder die Ansammlung von HDL an Fettstreifen, atherosklerotischen Läsionen, etc. zu visualisieren (wo das HDL beim Cholesterinausstrom aktiv sein sollte).
6. BEISPIEL: SYNTHESE VON PEPTIDAGONISTEN VON ApoA-I
Die in TABELLE X (Abschnitt 8.3 unten) beschriebenen Peptide wurden synthetisiert und charakterisiert, wie in den Unterabschnitten unten beschrieben. Die Peptide wurden außerdem strukturell und funktionell wie in Abschnitt 7 und 8 unten analysiert.
6.1 SYNTHESE VON KERNPEPTIDEN

Peptide wurden auf einer Festphase nach der Technik von Merrifield synthetisiert (Merrifield, 1969, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154), wobei 0,25 mmol p-Alkoxybenzylalkoholharz (HMP-Harz) (Wang, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95:1328-1333) und Fmoc-Chemie verwendet wurden. Alle Synthesen wurden auf einer automatisierten ABI-Peptidsynthesevorrichtung, Modell 430 A, von Applied Biosystems (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die für jeden Kopplungszyklus verwendeten Solvatisierungs- und Aktivierungszeiten sind in TABELLE V unten gezeigt: TABELLE V EINZELKOPPLUNGSAKTIVATORZYKLEN

ZYKLUSBEZEICHNUNG	VORGESEHENE AMINOSÄUREN	LÖSUNGSMITTEL	ZEIT	AKTIVIERUNGSZEIT	TRANSFERZEITEN*
afmc 31	Asn (trt) His (trt), Lys (Boc), Trp	~0,4 ml DCM ~1,2 ml NMP ~1,0 ml HOBt/NMP	~7 Min.	~51 Min.	1 = 50 Sek. 2 = 36 Sek.
afmc 32	Arg (Pmc), Gln (trt), Aib	~0,8 ml DCM ~1,2 ml NMP ~1,0 ml HOBt/NMP	~32 Min.	~51 Min.	1 = 60 Sek. 2 = 40 Sek.
afmc 33	Ala, Asp (OtBu), Glu (OtBu), Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro	~0,4 ml DCM ~0,8 ml NMP ~0,1 ml HOBt/NMP	~4 Min.	~36,5 Min.	1 = 38 Sek. 2 = 27 Sek.
afmc 34	Val	~0,4 ml DCM ~0,8 ml NMP ~0,1 ml HOBt/NMP	~4 Min.	~61,5 Min.	1 = 38 Sek. 2 = 27 Sek.
*1 = Transfer von Kartusche zu Aktivator 2 = Transfer von Aktivator zu Kartusche
DCC ist Dicyclohexylcarbodiimid HOBt ist 1-Hydroxybenzotriazol NMP ist N-Methylpyrrolidon			BOC ist t-Butyloxycarbonyl Pmc ist Pentamethylchroman-6-sulfonyl OtBu ist t-Butylester trt ist Trityl

Die Harze wurden zwischen jedem Kopplungsschritt mit NMP gewaschen. Das Protokoll für einen Synthesezyklus ist unten in TABELLE VI gezeigt: TABELLE VI KOPPLUNGSPROTOKOL FÜR EINEN SYNTHESEZYKLUS

VORGANG	ZEIT (Min.)
1. Entschützen (10% Piperidin in NMP)	20
2. Waschen (NMP)	5
3. Koppeln (4 Äquiv. Fmoc-Aminosäure-HOBT-Ester in NMP, 50 Min. voraktiviert)	61
4.Waschen	3
5. Harzprobe (gegebenenfalls)	3
GESAMT	92

Auf diese Weise wurden alle Aminosäuren außer Fmoc-β-(1-naphthyl)alanin gekoppelt. Fmoc-β-1-naphthyl)alanin wurde manuell gekoppelt. Zur manuellen Kopplung wurden 1 mmol Fmoc-β-(1-naphthyl)alanin und 1 mmol 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU) in 5 ml NMP gelöst und mit dem Peptidharz gemischt.
Anschließend wurden 2 mmol N-Ethyldiisopropylamin zugegeben, das Gemisch 2 Stunden geschüttelt und das Peptidharz 6 Mal mit 10 ml NMP gewaschen. Die Kopplungseffizienz wurde mithilfe des Kaiser-Tests kontrolliert (Kaiser, 1970, Anal. Biochem. 34:59577) und die Kopplung, falls erforderlich, wiederholt. Nach dem Koppeln von Naphthylalanin wurde der Rest der Synthese wie oben beschrieben automatisch durchgeführt.
6.2 SYNTHESE VON PEPTIDAMIDEN
Wo angegeben in TABELLE IX (Abschnitt 8.3. unten), wurden Peptidamide synthetisiert, wobei das Rink-Amidharz, welches den Fmoc-Rink-Amidlinker 4-(2',4'-Dimethylphenyl)-Fmoc-phenoxymethyl enthält (Rink, 1987, Tetrahedron Lett. 28:3787-3790), und das in Abschnitt 6.1 oben beschriebene Syntheseprotokoll verwendet wurden.
6.3 SYNTHESE VON N-TERMINAL ACYLIERTEN PEPTIDEN
Wo angegeben in TABELLE IX (Abschnitt 8.3. unten), wurden N-terminal acylierte Formen der Peptide hergestellt, indem das harzgebundene Peptid, das wie in Abschnitt 6.1 oder 6.2 oben beschrieben hergestellt wurde, einem geeigneten Acylierungsmittel ausgesetzt wurde.
Für N-terminal acylierte Peptide wurden je 1 g harzgebundenem Peptid 15 ml Essigsäureanhydridlösung (10% Vol./Vol. in NMP) gegeben, das Gemisch 5 Min. geschüttelt und das Harz durch Filtration rückgewonnen. Das rückgewonnene Harz wurde dreimal mit NMP (15 ml) und dreimal mit Ethanol (15 ml) gewaschen.
6.4 SPALTUNG UND ENTSCHÜTZUNG
Nach der Synthese wurden die in Abschnitt 6.1, 6.2 und 6.3 oben beschriebenen Peptide von dem Harz gespalten und mit einer Spaltlösung entschützt, die 92,5% Trifluoressigsäure (TFA)/3,75% Anisol/3,75% Dodecanthiol (Vol./Vol./Vol.) enthielt. Zur Durchführung der Spaltung wurde 10 ml Spaltlösung zu 0,25 mmol Peptidharz gegeben und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und das gespaltene/entschützte Peptid mit Diethylether ausgefällt, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Der Spaltcocktail für Peptide, die Trp (W) enthalten, sowie für Peptidamide setzte sich aus 86,5% TFA, 4,5% H₂O, 4,5% 1,2-Ethandithiol, 4,5% Anisol und 3% Phenol zusammen.
6.5 REINIGUNG
Die ungereinigten gespaltenen Peptide von Abschnitt 6.4 wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Reinheit eines jeden Peptids wurde durch verschiedene Analysetechniken bestätigt (HPLC-Analyse, Kapillarelektrophorese). Die Kapillarelektrophoresen wurden auf Kieselglaskapillaren mit einer Länge von 70 cm und einem Innendurchmesser von 75 μm (Thermo Separation Products) durchgeführt. Die Trennungen erfolgten bei 25°C, 15 kV, einer Laufzeit von 35 Min. in zwei Puffersystemen: Puffer 1 (20 mM Na₂B₄O₇, pH 9,2) und Puffer 2 (10 mM Na₂HPO₄, pH 2,5). Die HPLC-Trennungen wurden auf Nucleosil 7C18- oder Nucleosil 7C4-Säulen (Macherey und Nagel, Deutschland), 250 × 21 mm, bei einer Flussrate von 8 ml/Min. durchgeführt. Die Gradientenelution wurde mit einem Gemisch aus 0,1% TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1% TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B) durchgeführt. Die verwendeten Gradienten waren entsprechend den Erfordernissen jedes Peptids angepasst.
6.6 CHARAKTERISIERUNG
Die Massen- und Aminosäureanalyse der in Abschnitt 6.5 beschriebenen Peptide wurde massenspektrometrisch bzw. durch Aminosäureanalyse wie unten beschrieben bestätigt. Zur Sequenzierung wurde der Edman-Abbau verwendet.
6.6.1 LC-MS
Zur Bestimmung der Massen wurde ein im Handel erhältliches Triple-Stage-Quadruple-Standardmassenspektrometer (Modell TSQ 700; Finnigan MAT, San Jose CA, USA) verwendet. Zum Einführen der Proben in die Atmosphärendruck-Ionisisierungsquelle des Massenspektrometers wurde ein pneumatisch unterstütztes Elektrospray-Interface (ESI) verwendet. Der Interface-Sprayer wurde bei einem positiven Potenzial von 4,5 kV betrieben. Die Temperatur der Stahlkapillare wurde bei 200°C gehalten, wohingegen das Manifold bei 70°C gehalten wurde. Durch diesen Ionenverdampfungsvorgang erzeugte positive Ionen gelangen in den Analysator des Massenspektrometers. Der Verstärker war auf 1000 V eingestellt. Das Analysatorkompartiment des Massenspektrometers war 4E-6. Alle Akquisitionen erfolgten bei einer Auflösung < 1 u.
Die Peptide wurden durch direkte Infusion der gereinigten Peptide mit einem ABI (Applied Biosystems)-Mikrobohrungssystem, das aus einer Spritzenpumpe (Modell 140B), einem UV-Detektor (Modell 785A) und einem Ofen/Injektor (Modell 112A) bestand, analysiert. Das Lösungsmittelsystem bestand aus Wasser (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B), jeweils mit 0,1% TFA. Die Peptide wurden entweder mit einem Gradienten oder unten isokratischen Bedingungen infundiert und aus einer Aquapore-C18-Säule eluiert. Die Flussrate betrug typischerweise 300 μl/Min. Die Konzentration jedes Peptids war etwa 0,03 mg/ml, wovon 20 μl injiziert wurden (z. B. 30 pmol).
Vollscan-MS-Experimente wurden erhalten, indem Quadrupel 1 von m/z 500-1500 in 4 Sek. gescannt wurde. Die Daten wurden mithilfe einer Alpha-DEC-Station erfasst und mit dem von Finnigan MAT (BIOWORKS) bereit gestellten Softwarepaket verarbeitet.
6.6.2 AMINOSÄUREANALYSE
Die Aminosäureanalyse wurde auf einem ABI-Aminosäureanalysator, Modell 420, von Applied Biosystems durchgeführt. Dieses System besteht aus drei Modulen: einer Hydrolyse- und Derivatisierungsvorrichtung, einer Umkehrphasen-HPLC und einem Datensystem. Die Peptidprobe wurde auf porösen Glasobjektträgern aufgetragen (3 Mal in dreifacher Ausführung) und anschließend unter Gasphasenbedingungen (155°C, 90 Min.) hydrolysiert. Nach dem Entfernen von HCL wurden die resultierenden Aminosäuren unter Verwendung von PITC (Phenylisothiocyanat) zu PTC-AA (Phenylthiocarbamoylaminosäuren) umgewandelt. Nach dem Transfer zu der HPC-Probenschleife wurden die resultierenden Gemische auf einer Aquapore-C18-Säule unter Verwendung des Gradientenmodus (Lösungsmittel A: 50 mmol Ammoniumacetat (NH₄Ac), pH 5,4, in Wasser; Lösungsmittel B: 32 mmol Natriumacetat (NaOAc) in wässrigem Acetonitril) unter Temperaturkontrollbedingungen fraktioniert. Die HPLC-Daten wurden von dem von Applied Biosystems bereitgestellten Softwarepaket verarbeitet. Die Quantifizierung erfolgte relativ zu einem Peptidstandard, der von Applied Biosystems geliefert wurde.
6.7 SYNTHESE VERZWEIGTER NETZWERKE
Tetramerkernpeptidylharz und Trimerkernpeptidylharz werden synthetisiert wie beschrieben in Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84. Die noch mit dem 4-Methylbenzhydrylaminharz verknüpfte tetramere und trimere Kernmatrix wird dann als erstes Peptidylharz für die automatisierte Synthese von Kernpeptiden wie zuvor beschrieben verwendet.
Verzweigte Netzwerke, die Helixsegmente unterschiedlicher Aminosäurezusammensetzungen enthalten, können mithilfe orthogonaler Synthese- und Schutzstrategien, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, synthetisiert werden.
7. BEISPIEL: STRUKTURELLE ANALYSE UND LIPIDBINDUNGSANALYSE VON ApoA-I-PEPTIDEN
Die strukturellen Eigenschaften und Lipidbindungseigenschaften der wie in Abschnitt 6 oben beschrieben synthetisierten, gereinigten Peptide wurden durch Cirkulardichroismus (CD), Fluoreszenzspektroskopie und Kernmagnetresonanz (NMR) bestimmt.
7.1 CIRKULARDICHROISMUS
Dieses Beispiel beschreibt ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen des Helizitätsgrades der erfindungsgemäßen Kernpeptide sowohl frei in Puffer als auch in Gegenwart von Lipiden.
7.1.1 EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Fern-UV-Cirkulardichroismusspektren wurden zwischen 190 and 260 nm (Abständen von 0,5 nm oder 0,2 nm) mit einem AVIV62DS-Spektrometer (AVIV Associates, Lakewood, NJ, USA), das über eine Halterung mit thermoelektrischer Zelle und einen Probenwechsler verfügt, aufgezeichnet. Das Instrument wurde mit (+)-10-Kamphersäure kalibriert. Für jede Probe wurden zwischen einem und drei Scans erfasst, wobei Suprasil-Quarzzellen mit einer Pfadlänge von 10 cm, 5 cm, 1 cm und 0,1 cm für Peptidkonzentrationen von 10^–7 M bis 10^–4 M verwendet wurden. Die Bandbreite war auf 1,5 nm festgelegt und die Abtastgeschwindigkeit je Wellenlängenstufe auf 1 Sek. Die angegebenen Daten sind der Mittelwert von mindestens 2 oder 3 unabhängigen Messungen.
Nach Abzug des Hintergrunds wurden die Spektren je Rest in molare Elliptizität (θ) in Grad cm 2 dmol^–1 konvertiert. Die Peptidkonzentration wurde durch Aminosäureanalyse und außerdem durch Absorptionsspektrometrie mit einem im UV- und sichtbaren Bereich arbeitenden Lambda-17-Spektrophotometer von Perkin Elmer bestimmt, wenn das Peptid einen Chromophor (Tryptophan, Dansyl, Naphtylalanin) enthielt.
CD-Spektren wurden mit freiem ungebundenem Peptid (5 μM in 5 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) mit Peptid-SUV-Komplexen (20:1 EPC:Chol., Ri = 50), mit Peptid-Mizellen-Komplexen (1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin, Ri = 100) und mit freiem ungebundenem Peptid in Gegenwart von 2,2,2-Trifluorethanol (TFE) (5 μM Peptid, 90 Vol.-% TFE) erhalten.
Die SUVs wurden erhalten, indem die Lipide (10 mM, 20:1 EPC:Chol., Avanti Polar Lipids, AL, USA) in Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4) mit N₂-Einleitung durch den Gefäßboden („Bubbling") 5 M. lang dispergiert wurden, gefolgt von Ultraschallbehandlung (1,5 Std.) in einem Ultraschallbad. Die Homogenität der Zubereitung wurde durch FPLC geprüft.
Die Mizellen wurden erhalten, indem das Lipid (6 mM 1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin, Avanti Polar Lipids, AL, USA) in Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4) mit N₂-Einleitung durch den Gefäßboden („Bubbling") 5 Min. lang dispergiert wurden, gefolgt von Vortexen.
Zum Erhalt der Peptid-SUV-Komplexe wurden die SUVs bei einem molaren Phospholipid-Peptid-Verhältnis (Ri) von 100 dem Peptid (5 μM in 5 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) zugegeben.
Zum Erhalt der Peptid-Mizellen-Komplexe wurden die Mizellen bei einem Ri von 100 dem Peptid (5 μM in 5 mM Phosphatpuffer, pH 7.4) zugegeben.
Alle Spektren wurden bei 37°C aufgezeichnet.
7.1.2 BESTIMMUNG DER HELIZITÄT
Der Helizitätsgrad der Peptide unter den verschiedenen Bedingungen wurde aus der mittleren Elliptizität der Reste bei 222 nm (Chef et al., 1974, Biochemistry 13:3350-3359) oder durch Vergleichen der erhaltenen CD-Spektren mit in Datenbanken verfügbaren Bezugsspektren (16 Helixbezugsspektren von Provencher & Glockner, 1981, Biochemistry 20:33-37; Bezugsspektren von denaturiertem Protein von Venyaminov et al., 1993, Anal. Biochem. 214:17-24) unter Zuhilfenahme des CONTIN-Kurvenanpassungsalgorithmus, Version 2DP, CD-1-Pack (Aug. 1982) (Provencher, 1982, Comput. Phys. Cornmun. 27:213-227, 229-242) bestimmt. Eine annehmbare Anpassung wurde anhand der vom CONTIN-Algorithmus ermöglichten statistischen Analyseverfahren bestimmt. Der Fehler aller Verfahren betrug +5% Helizität.
Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) enthält einen sehr hohen Gehalt an α-Helix (86% Helizität) in Puffer bei einer Konzentration von 5 μM. Die Helizität von Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) steigt in Gegenwart von SUVs (100% Helizität) und Mizellen (100% Helizität) und auch in Gegenwart von TFE (95% Helizität), bei dem es sich um ein Lösungsmittel handelt, das aufgrund einer wesentlich niedrigeren dielektrischen Konstante (ε = 26,7) als Wasser (ε = 78,4) α-Helices und Intrapeptid-Wasserstoffbindungen bei Konzentrationen zwischen 5-90% (Vol./Vol.) stabilisiert.
Unter Bezugnahme auf TABELLE X, Abschnitt 8.3 unten, ist zu sehen, dass solche Peptide, die einen hohen Grad an LCAT-Aktivierung (≥ 38%) zeigen, in Gegenwart von Lipiden im Allgemeinen eine wesentliche α-Helixstruktur besitzen (≥ 60% Helixstruktur im Falle unblockierter Peptide mit mindestens 22 Aminosäuren oder von blockierten Peptiden mit höchstens 18 Aminosäuren; ≥ 40% Helixstruktur im Falle von blockierten Peptiden mit höchstens 18 Aminosäuren), wohingegen Peptide, die wenig oder keine LCAT-Aktivierung zeigen, wenig α-Helixstruktur besitzen. In manchen Fällen zeigen aber Peptide, die in Gegenwart von Lipiden eine wesentliche α-Helixstruktur enthalten, keine wesentliche LCAT-Aktivierung. Infolgedessen wird die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Kernpeptide zur Annahme einer α-Helixstruktur als entscheidendes Merkmal der erfindungsgemäßen Kernpeptide betrachtet, da die Fähigkeit zur Bildung einer α-Helix in Gegenwart von Lipiden eine Voraussetzung für die LCAT-Aktivierung zu sein scheint.
7.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
Die Lipidbindungseigenschaften der in Abschnitt 6 oben synthetisierten Peptide wurden durch Fluoreszenzmessungen mit markierten Peptiden getestet, in dem vorliegenden Fall Tryptophan (Trp oder W) oder Naphtylalanin (Nal). Die Fluoreszenzspektren wurden mit einem Fluoromax von Spex (Jobin-Yvon), ausgestattet mit einer Xenon-Lampe von 150 W, zwei Monochromatoren (Anregung und Emission), einem Photovervielfacher R-928 für eine im roten Wellenlängenbereich bis zu 850 nm empfindliche Erfassung und einer thermoelektrischen Zellenhalterung mit Magnetrührer, aufgezeichnet. Für Messungen im mikromolaren Konzentrationsbereich wurden Suprasil-Quarzküvetten verwendet. Eine Vorrichtung variabler Spalte (0,4 bis 5 nm) erlaubt eine Modulierung der einfallenden und emittierten Intensitäten entsprechend der Konzentration des verwendeten Peptids. Die angegebenen Werte entsprechen im Allgemeinen dem Durchschnitt von 2 bis 4 Spektren. Die Peptidkonzentration wird durch Absorptionsspektrometrie auf einem Philips PU 8800 bestimmt, wobei die Absorptionsbande von Trp (ε_280nm = 5, 550 M^–1 cm^–1 in Tris-Puffer) oder Nal (ε_224nm = 92,770 M^–1 cm^–1 in Methanol) verwendet wurde.
Die Fluoreszenzspektren der Peptide wurden bei 290 nm und 450 nm in Tris-HCl-Puffer (20 mM, pH 7,5) in Gegenwart und Abwesenheit von Lipidvesikeln aufgezeichnet. Die kleinen unilamellaren Vesikel bildeten sich nach Rehydrierung der lyophilisierten Phospholipide in Puffer, Dispersion und Behandlung mit einer Ultraschallspitze unter einem N₂-Strom. Die verwendeten Lipide waren entweder EiPC/Chol. (20:1) oder POPC/Chol. (20:1). Die Spektren wurden bei einer Peptidkonzentration von 2 μM und einer Temperatur von 37°C aufgezeichnet. Der Fluroeszenzbezugsstandard in Fall von Trp war N-Acetyltryptophanylamid (NATA).
Lipidbindungsstudien erfolgten durch progressive Zugabe von Lipidvesikeln zu dem Peptid in Lösung bei 2 μM (Spalte: 5 nm bei Anregung und 1,5 nm bei Emission). Bei der Bestimmung der Fluoreszenzintensität wurden Verdünnungseffekte berücksichtigt. Die Lipidkonzentrationen wurden von 10 μM bis 600 μM variiert und das molare Verhältnis von Lipid zu Peptid (Ri) wurde von 5 bis 300 variiert. Die Anregungswellenlänge wurde sowohl für Trp als auch für Nal auf 280 nm gestellt.
7.2.1 SPEKTRALANALYSE DER FLUORESZENZSPEKTREN
Die Daten wurden direkt aufgezeichnet und mit einem IPM-PC bearbeitet, der durch die DM3000F-Software von Spex mit dem Spektrofluorometer verbunden war. Die Spektren wurden durch Subtraktion des Lösungsmittelbeitrags und durch Anwendung eines von dem Konstruktor vorgegebenen Koeffizienten korrigiert, wobei die Variation der Reaktion des Photovervielfachers gegenüber der Wellenlänge berücksichtigt wurde.
Die Fluoreszenzspektren der Peptide wurden durch die Wellenlänge bei ihrer maximalen Fluoreszenzemission und im Fall von mit Tryptophan markierten Peptiden durch ihre Quantenausbeute im Vergleich zu NATA charakterisiert. Der Vorgang der Bindung an Lipide wurde durch Berechnung der Wellenlängenverschiebung bei der maximalen Fluoreszenzemission, (λ_max), und der Variation der relativen Fluoreszenzintensität der Emission gegenüber der Lipidkonzentration analysiert. Die relative Fluoreszenzintensität ist als folgendes Verhältnis definiert: (I-I₀)_λmax/I_0λmax. I und I₀ werden bei der (λ_max) gemessen, die dem anfänglichen freien Zustand des Peptids, d. h. ohne Lipiden, entspricht. I ist die Intensität bei einem definierten Verhältnis von Lipid zu Peptid und I₀ ist derselbe Parameter, gemessen in Abwesenheit von Lipiden. Die Abwesenheit dieser Variationen ist relevant für das Nichtvorhandensein von Wechselwirkungen der Peptide mit den Lipiden.
7.2.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Die Lipidbindungseigenschaften von Peptid 149 (SEQ ID Nr.:149), welches eine ähnliche Primärsequenz wie Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) aufweist, außer dass es einen W (Trp)-Rest an Position 10 enthält, sind in Tabelle VII dargestellt. TABELLE VII EIGENSCHAFTEN DER BINDUNG VON PEPTID 149 (SEQ ID Nr.:149) AN LIPIDVESIKEL WIE GEMESSEN DURCH FLUORESZENZ

Molares Lipid:Peptid-Verhältnis (Ri) I/I₀ λ_max (nm)

0 0 347

5 19,7 334,5

10 31,4 329

30 49,4 325,5

60 64,3 325

100 77 325,5

200 84 325
In Puffer bei einer Konzentration von 2 μM beträgt das Maximum der Tryoptophan-Fluoreszenzemission (λ_max) von Peptid 149 (SEQ ID Nr:149) 347 nm. Dies entspricht einem Tryptophan, das im Vergleich zu NATA (λ_max = 350 nm) der wässrigen Umgebung gegenüber relativ ausgesetzt ist. Peptid 149 (SEQ ID Nr.:149) bindet sehr effektiv an kleine unilamellare Vesikel aus EPC/Chol. (20:1), wie sich am Vergraben des Tryptophans (die Wellenlänge für die maximale Fluoreszenzemission des Tryptophans verschiebt sich von 347 nm auf 325 nm) und der starken Erhöhung der Fluoreszenzintensität (siehe Tabelle VII) zeigte. Das Vergraben des Tryptophanrestes ist bei einem molaren Verhältnis von Lipid zu Peptid von etwa 30 am stärksten.
Auch andere Peptide, die einen hohen Helizitätsgrad in Gegenwart von Lipiden zeigten (≥ 60% für unblockierte Peptide aus ≥ 22 Aminosäuren oder blockierte Peptide mit ≤ 18 Aminosäuren; ≥ 40% für unblockierte Peptide mit ≤ 18 Aminosäuren), gemessen durch Cirkulardichroismus, wie in Abschnitt 7.1 oben beschrieben, zeigten gute Lipidbindung. Natürlich wurden unter allen durch das Cirkulardichroismusscreening ausgewählten Peptiden nur solche auf ihre Lipidbindungseigenschaften getestet, die durch Fluoreszenz nachverfolgt werden konnten.
7.3 KERNMAGNETRESONANZ (NMR)
Dieses Beispiel beschreibt ein NMR-Verfahren zum Analysieren der Struktur der erfindungsgemäßen Kernpeptide.
7.3.1 HERSTELLUNG DER NMR-PROBE
Die Proben wurden hergestellt, indem 5 mg Peptid in 90% H₂O/10% D₂O, das Spurenmengen von 2,2-Dimethyl-2-sila-5-pentansulfonat (DSS) als internen Bezug für chemische Verschiebung enthielt, gelöst wurde. Einige der Proben enthielten Trifluorethanol (TFE) (ausgedrückt als Vol.-%). Das Gesamtprobenvolumen war 500 μl und die Peptidkonzentration war etwa 5 mM.
7.3.2 NMR-SPEKTROSKOPIE
¹H NMR-Spektren wurden mithilfe eines DRX500-Spektrometers von Bruker, ausgestattet mit einer B-VT2000-Temperaturreglereinheit, bei 500 MHz erfasst. Unter Verwendung von Standardimpulssequenzen wurden ein- und zweidimensionale Experimente aufgezeichnet (Two Dimensional NMR Spectroscopy, Hrsg. W.R. Croasmun und RMK Carlson, 1994, VCH Publishers, New York, USA).
Wassersuppression wurde mit einer Vorsättigung bei Niederenergie für 2 Sek. erreicht. Zweidimensionale Experimente wurden im phasensensitiven Modus unter Anwendung der TPPI-Technik (Time Proportional Phase Incrementation) und einer Spektralbreite von 6000 Hz in beiden Dimensionen durchgeführt. Typischerweise wurden 40 Scans für 400 t₁-Inkremente mit 2048 Datenpunkten zusammenaddiert. Die Daten wurden mit der FELIX95-Software (Molecular Simulations) auf einer INDIGO2-Arbeitsstation (Silicon Graphics) verarbeitet. Die Daten wurden mit dem Wert „0" aufgefüllt (zero-filled), um eine 2×2K-Datenmatrix zu ergeben, und mit einer um 45° verschobenen quadratischen Sinusglockenfunktion apodisiert.
7.3.3 NMR-ZUWEISUNG
Vollständige Protonenresonanzzuweisungen wurden erhalten, indem die sequenzielle Zuweisungstechnik anhand von DQFCOSY-, TOCSY- und NOESY-Spektren angewandt wurde, wie in der Literatur beschrieben (Wuthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, 1986, John Wiley & Sons, New York, USA). Sekundäre chemische Verschiebungen für HN- und Hα-Protonen wurden berechnet, indem die tabellierten chemischen Random-Coil-Verschiebungen (Wishart and Sykes, 1994, Method. Enz. 239:363-392) von den entsprechenden experimentellen Werten subtrahiert wurden.
7.3.4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Allgemeiner Gesichtspunkt. Amphipathische helikale Peptide neigen dazu, bei den hohen Konzentrationen, die für die NMR-Spektroskopie erforderlich sind, in wässrigen Lösungen zu aggregieren, was den Erhalt von hoch auflösenden Spektren erschwert. Beispielsweise zeigen die NMR-Spektren des beispielhaften Kernpeptids 146 (SEQ ID Nr.:146) in Wasser sehr breite Linien. Deshalb ist es nicht möglich, die Resonanzen jedes Aminosäurerestes aufzulösen. Die Zugabe von TFE zu der Probe verbessert die Auflösung der Spektren. TFE löst bekanntlich Peptide und stabilisiert außerdem die Helixkonformationen von Peptiden mit Neigung zur Helixbildung. Die Ergebnisse der NMR-Spektroskopie sind für Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) als repräsentatives Beispiel gezeigt. Zum Vergleich wurde das Konsensus-22-Mer von Segrest (SEQ ID Nr.:75) untersucht.
Sekundäre chemische Verschiebungen. Chemische Protonenverschiebungen von Aminosäuren hängen sowohl von der Art des Restes als auch von der lokalen Sekundärstruktur in einem Peptid oder Protein ab (Szlagyi, 1995, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27:325-443). Durch Vergleich experimenteller Verschiebungen mit tabellierten Werten für die Random-Coil-Konformation ist daher die Identifizierung einer regulären Sekundärstruktur möglich.
Die Bildung einer α-Helix führt typischerweise zu einer Upfield-Verschiebung (Negativverschiebung) der Hα-Resonanz. Die Beobachtung einer Hα-Upfield-Verschiebung für mehrere aufeinander folgende Reste wird generell als Beweis einer Helixstruktur betrachtet. Die sekundären Hα-Verschiebungen für Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) in 25% TFE bei 295 K zeigen eine signifikante Negativverschiebung für Rest 4 bis 19 (8A), was auf eine stark helikale Konformation hinweist.
Die chemischen Verschiebungen von Amidwasserstoffen von Aminosäureresten, die sich in α-Helixregionen befinden, weisen, was die für Random-Coil beobachteten chemischen Verschiebungen angeht, ebenfalls eine Upfield-Verschiebung auf. Darüber hinaus lässt sich eine Periodizität der HN-Verschiebungen beobachten, welche die Periode der Helixschleifen wiedergibt. Die Amplitude der Verschiebungsvariation entlang der Sequenz hängt mit der Amphipathie eines helikalen Peptids zusammen. Ein höheres hydrophobes Moment führt zu einer ausgeprägteren Schwingung (Zhou et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:4320-4326). Die sekundären HN-Verschiebungen für Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) in 25% TFE bei 295 K zeigen ein Schwingungsverhalten, das der amphipathischen Art der Helix entspricht (8B).
Die Aminosäureaustausche führen zu einer ausgeprägteren Periodizität entlang der gesamten Sequenz (8B). Das Muster spiegelt klar die stärker amphipathische Art von Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) gegenüber dem Konsensus-22-Mer von Segnest (SEQ ID Nr:75) wider. Es kann das Vorhandensein von 4-5 Helixschleifen erkannt werden. Unter Bezugnahme auf 8C wird die Verteilung von Aminosäuren auf einer idealisierten α-Helix, bei der hydrophobe Reste gepunktete und hydrophile Reste als ungefüllte Kreise dargestellt sind, zusammen mit den sekundären chemischen Verschiebungen der Amidprotonen von Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) aufgetragen. Die experimentellen Werte sind zur Verdeutlichung mit einer geglätteten Kurve verbunden. Die NMR-Verschiebungen kartieren die Helixstruktur und das Vorhandensein von 5-6 Helixschleifen kann diskutiert werden.
Die sekundäre Verschiebung eines Amidprotons wird von der Länge der Wasserstoffbindung an den Carbonylsauerstoff eine Helixschleife entfernt beeinflusst. Die Periodizität der beobachteten Werte der chemischen Verschiebung spiegeln daher unterschiedliche Längen der Wasserstoffbindung wider. Dieser Unterschied ist mit einer insgesamt gekrümmten Helixform des Helixgerüstes verbunden. Die hydrophoben Reste befinden sich auf der konkaven Seite. Die sekundären Verschiebungen von Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) zeigen eine gekrümmte α-helikale Konformation.
8. BEISPIEL: LCAT-AKTIVIERUNGSASSAY
Die wie in Abschnitt 6 oben synthetisierten Peptide wurden in vitro auf ihre Fähigkeit zur Aktivierung von LCAT analysiert. Im LCAT-Assay werden Substratvesikel (kleine unilamellare Vesikel bzw. „SUV"), die aus Ei-Phophatidylcholin (EPC) oder 1-Palmitoyl-2-oleyl-phosphatidylcholin (POPC) und radioaktiv markiertem Cholesterin zusammengesetzt sind, mit äquivalenten Massen von entweder Peptid oder ApoA-I (am Humanplasma isoliert) vorinkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von LCAT (am Humanplasma isoliert) gestartet. Natives ApoA-I, das als Positivkontrolle verwendet wurde, stellt eine Aktivierungsaktivität von 100% dar. Die „spezifische Aktivität" (d. h. Aktivitätseinheiten (LCAT-Aktivierung)/Masseneinheit) der Peptide lässt sich als Konzentration des Peptids berechnen, das eine maximale LCAT-Aktivierung erreicht. Beispielsweise kann eine Reihe von Peptidkonzentrationen (z. B. eine „Limited-Dilution"-Verdünnungsreihe) getestet werden, um die „spezifische Aktivität" des Peptids zu bestimmen – die Konzentration, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in dem Test (z. B. 1 Std.) eine maximale LCAT-Aktivierung erreicht (d. h. prozentuale Umwandlung von Cholesterin in Cholesterinester). Wird die prozentuale Umwandlung von Cholesterin nach z. B. 1 Std. gegen die verwendete Peptidkonzentration aufgetragen, lässt sich die „spezifische Aktivität" als die Peptidkonzentration identifizieren, welche auf der aufgetragenen Kurve ein Plateau erreicht.
8.1 HERSTELLUNG VON SUBSTRATVESIKELN
Bei den im LCAT-Assay verwendeten Vesikeln handelt es sich um SUV, die aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) oder 1-Palmitoyl-2oleylphosphatidylcholin (POPC) und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 20:1 zusammengesetzt sind. Zur Herstellung einer für 40 Tests ausreichenden Vesikelstammlösung werden 7,7 mg EPC (oder 7,6 mg POPC; 10 μmol), 78 μg (0,2 μmol) 4-¹⁴C-Cholesterin, 116 μg Cholesterin (0,3 μmol) in 5 ml Xylol gelöst und lyophilisiert. Anschließend werden zu dem trockenen Pulver 4 ml Testpuffer gegeben und in einer Stickstoffatmosphäre bei 4°C mit Ultraschall behandelt. Bedingungen der Ultraschallbehandlung: Branson 250 Sonicator, 10 mm Spitze, 6 × 5 Minuten; Testpuffer: 10 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). Das mit Ultraschall behandelte Gemisch wird 6 Mal je 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute (16.000 × g) zentrifugiert, um Titanteilchen zu entfernen. Die resultierende klare Lösung wird für den Enzymtest verwendet.
8.2 REINIGUNG VON LCAT

Für die Reinigung von LCAT wird Humanplasma mit Dextransulfat/Mg²⁺ behandelt, um lipoproteindefizientes Serum (LPDS) zu erhalten, das nacheinander auf Phenylsepharose, Affigelblue, Concanavalin-A-Sepharose und einer Anti-ApoA-I-Affinitätssäule chromatographiert wurde, wie in TABELLE IX unten für eine repräsentative Reinigung zusammengefasst ist. TABELLE IX LCAT-REINIGUNG

Fraktion	Gesamtvolumen (ml)	Gesamtprotein (mg)	Gesamtaktivität (nmol CE/mg × Std.)	Ausbeute (%)	Reinigung(-fach)
Plasma	550	44550	63706
LPDS	500	31000	62620	98	1,4
Phenylsepharose	210	363	21909	82	100
Affigelblue	95	153	25092	39	115
ConA-Sepharose	43	36	11245	18	220
Anti-A-I-Affinität	120	3,5	5500	9	1109

8.2.1 HERSTELLUNG VON LPDS
Zur Herstellung von LPDS wird 500 ml Plasma zu einer Lösung von 50 ml Dextransulfat (MW = 500000) gegeben. 20 Minuten rühren. 30 Minuten bei 3000 Umdrehungen (16.000 × g) bei 4°C zentrifugieren. Den Überstand (LPDS) für die weitere Reinigung verwenden (ca. 500 ml).
8.2.2 PHENYLSEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE.
Für die Phenylsepharose-Chromatographie wurden die folgenden Materialien und Bedingungen verwendet.

Festphase: Phenylsepharose fast flow, hoher Substanzgrad, Pharmacia
Säule: XK26/40, Gelbetthöhe: 33 cm, V = ca. 175 ml
Flussraten: 200 ml/Std. (Probe)
Waschen: 200 ml/Std. (Puffer)
Elution: 80 ml/Std. (destilliertes Wasser)
Puffer: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7,4, 0,01% Natriumazid.

Die Säule wird in Tris-Puffer äquilibiert, es wird 29 g NaCal zu 500 ml LPDS zugegeben und auf die Säule aufgetragen. Mit mehreren Volumen von Tris-Puffer waschen, bis die Absorption bei 280 nm ungefähr an der Basislinie liegt, anschließend wird die Elution mit destilliertem Wasser gestartet. Die Protein enthaltenden Fraktionen werden gepoolt (Poolgröße: 180 ml) und für die Affigelblue-Chromatographie verwendet.
8.2.3 AFFIGELBLUE-CHROMATOGRAPHIE
Der Phenylsepharose-Pool wird übernacht bei 4°C gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% Natriumazid dialysiert. Das Poolvolumen wird durch Ultrafiltration (Amicon YM30) auf 50-60 ml reduziert und auf eine Affigelblue-Säule geladen.

Festphase: Affigelblue, Biorad, 153-7301 Säule, XK26/20, Gelbetthöhe: ca. 13 cm; Säulenvolumen: etwa. 70 ml.
Flussraten: Laden: 15 ml/Std., Waschen: 50 ml/Std.

Die Säule in Tris-Puffer äquilibrieren. Den Phenylsepharose-Pool auf die Säule auftragen. Parallel mit dem Auffangen von Fraktionen beginnen. Mit Tris-Puffer waschen. Die gepoolten Fraktionen (170 ml) wurden für die ConA-Chromatographie verwendet.
8.2.4 ConA-CHROMATOGRAPHIE
Der Affigelblue-Pool wurde über Amicon (YM30) auf 30-40 ml reduziert und gegen ConA-Startpuffer (1 mM Tris HCl pH 7,4; 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM CaCl₂, 0,01% Na-Azid) übernacht bei 4°C dialysiert.

Festphase: ConA-Sepharose (Pharmacia)
Säule: XK26/20, Gelbetthöhe: 14 cm (75 ml)
Flussraten: Laden: 40 ml/Std., Waschen (mit Startpuffer): 90 ml/Std, Elution: 50 ml/Std., 0,2 M Methyl-α-D-mannosid in 1 mM Tris, pH 7,4.

Die Proteinfraktionen der Mannosidelutionen wurden aufgefangen (110 ml), und das Volumen wurde durch Ultrafiltration (YM30) auf 44 ml reduziert. Der ConA-Pool wurde in Aliquots von 2 ml aufgeteilt, die bei –20°C gelagert wurden.
8.2.5 ANTI-ApoA-I-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE
Anti-ApoA-I-Affinitätschromatographie wurde Affigel-Hz-Material (Biorad) durchgeführt, an welches die Anti-ApoA-I-Antikörper kovalent gekoppelt wurden.

Säule: XK16/20, V = 16 ml. Die Säule wurde mit PBS pH 7,4 äquilibriert. Zwei ml des ConA-Pools wurden 2 Stunden gegen PBS dialysiert, bevor sie auf die Säule geladen wurden.
Flussraten: Laden: 15 ml/Stunde, Waschen (PBS): 40 ml/Stunde.

Die gepoolten Proteinfraktionen (V = 14 ml) werden für LCAT-Assays verwendet.
Die Säule wird mit 0,1 M Citratpuffer (pH 4,5) regeneriert, um gebundenes A-I zu eluieren (100 ml), und wird sofort nach diesem Schritt mit PBS erneut äquilibriert.
8.3 ERGEBNISSE
Die Ergebnisse des LCAT-Aktivierungsassays sind in TABELLE X unten präsentiert.
In TABELLE X zeigt *Peptide an, die N-terminal acetyliert und C-terminal amidiert sind; zeigt Peptide an, die N-terminal dansyliert sind; sp zeigt Peptide an, die unter den experimentellen Bedingungen Löslichkeitsprobleme aufwiesen; X ist Aib; Z ist Nal; O ist Orn; He (%) bezeichnet prozentuale Helizität; Miz bezeichnet Mizellen und – gibt deletierte Aminosäuren an.
9. BEISPIEL: PHARMAKOKINETIK DER ApoA-I-AGONISTEN
Die folgenden Experimente können verwendet werden um zu zeigen, dass die ApoA-I-Agonisten im Blutkreislauf stabil sind und mit der HDL-Komponente von Plasma assoziieren.
9.1. SYNTHESE VON RADIOAKTIV MARKIERTEN PEPTIDEN
Radioaktiv markierte Peptide werden synthetisiert, indem eine ¹⁴C-markierte Aminosäure als N-terminale Aminosäure angekoppelt wird. Die Synthese wird nach L. Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173, durchgeführt. In Kürze werden 250 μM unmarkierter N-terminaler Aminosäure in 225 μl einer 9%igen Na₂CO₃-Lösung gelöst und einer Lösung (9% Na₂CO₃) von 9,25 MBq (250 μM) ¹⁴C-markierter N-terminaler Aminosäure zugegeben. Die Flüssigkeit wird auf 0°C gekühlt, mit 600 μM (202 mg) 9-Fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonat (Fmoc-OSu) in 0,75 ml DMF gemischt und bei Raumtemperatur 4 Stunden lang geschüttelt. Anschließend wird das Gemisch mit Diethylether (2 × 5 ml) und Chloroform (1 × 5 ml) extrahiert, die verbleibende wässrige Phase wird mit 30%iger HCl angesäuert und mit Chloroform (5 × 8 ml) extrahiert. Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet, abgefiltert und das Volumen wurde unter einem Stickstoffstrom auf 5 ml eingeengt. Die Reinheit wird mittels TLC (CHCl₃:MeOH:Hac, 9:1:0,1 Vol./Vol./Vol., stationäre Phase RPTLC Silicagel 60, Merck, Deutschland) geschätzt.
Die Chloroformlösung, die die ¹⁴C-markierte Fmoc-Aminosäure enthält, wird direkt für die Peptidsynthese verwendet. Ein die Aminosäuren 2-22 enthaltendes Peptidharz wird automatisch wie in Abschnitt 67 beschrieben synthetisiert. Die Sequenz des Peptids wird durch Edman-Abbau bestimmt. Die Kopplung wird wie in Abschnitt 6.1. beschrieben durchgeführt.
9.2. PHARMAKOKINETIK BEI MÄUSEN
In jedem Experiment wird 2,5 mg/kg radioaktiv markiertes Peptid intraperitoneal in Mäuse injiziert, die normales Mausfutter oder das atherogene Thomas-Harcroft-modifizierte Futter (das zu stark erhöhtem VLDL- und IDL-Cholesterin führt) erhielten. In mehreren Zeitabständen werden Blutproben zur Bestimmung der Radioaktivität im Plasma entnommen.
9.3. STABILITÄT IN HUMANSERUM
Die Stabilität der erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten in Humanserum wird wie unten beschrieben gezeigt.
9.3.1. EXPERIMENTELLE VERFAHREN
100 μg ¹⁴C-markiertes Peptid (hergestellt wie beschrieben in Abschnitt 9.1. oben) wird mit 2 ml frischem Humanplasma (bei 37°C) gemischt und entweder sofort (Kontrollprobe) oder nach 8-tägiger Inkubation bei 37°C (Testprobe) entfettet. Die Entfettung erfolgt durch Extraktion der Lipide mit einem gleichen Volumen von 2:1 (Vol./Vol.) Chloroform:Methanol.
Die Proben werden auf eine C₁₈-Umkehrphasen-HPLC-Säule geladen und mit einem linearen Gradienten (25-58% über 33 Min.) aus Acetonitril (mit 0,1% TFA) eluiert. Die Elutionsprofile werden durch Absorption (220 nm) und Radioaktivität nachverfolgt.
9.4. BILDUNG VON PRA-β-ARTIGEN TEILCHEN
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten zur Bildung von prä-β-artigen Teilchen wird wie unten beschrieben gezeigt
9.4.1. EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Humanes HDL wird durch KBr-Ultradichtezentrifugation bei einer Dichte von d = 1,21 g/ml isoliert, um eine obere Fraktion zu erhalten, gefolgt von Superose-6-Gelfiltrationschromatographie, um HDL von anderen Lipoproteinen zu trennen. Isolierte HDL werden mit physiologischer Salzlösung auf eine Endkonzentration von 1,0 mg/ml eingestellt, basierend auf dem Proteingehalt, der mit dem Bradford-Proteinassay bestimmt wurde. Der isolierten HDL-Präparation wird ein Aliquot von 300 μl entnommen und mit 100 μl ¹⁴C-markiertem Peptid für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Es werden fünf separate Inkubationen analysiert, einschließlich eines Leerwerts mit 100 μl physiologischer Salzlösung und vier Verdünnungen von ¹⁴C-markiertem Peptid: (i) 0,20 μg/μl Peptid:HDL, Verhältnis = 1:15; (ii) 0,30 μg/μl Peptid:HDL, Verhältnis = 1:10; (iii) 0,60 μg/μl Peptid:HDL, Verhältnis = 1:5 und (iv) 1,00 μg/μl Peptid:HDL, Verhältnis = 1:3. Nach der zweistündigen Inkubation wird ein 200-μl-Aliquot der Probe (Gesamtvolumen = 400 μl) zur Lipoproteintrennung und -analyse auf eine Superose-6-Gelfiltrationssäule geladen und 100 μl wird verwendet, um die auf die Säule geladene Gesamtradioaktivität zu bestimmen.
9.5. ASSOZIATION VON Apo-A-I-AGONISTEN MIT HUMANEN LIPOPROTEINEN
9.5.1. EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten zur Assoziierug mit humanen Lipoproteinfraktionen wird bestimmt, indem ¹⁴C-markiertes Peptid mit jeder Lipoproteinklasse (HDL, LDL und VLDL) und einem Gemisch der unterschiedlichen Lipoproteinklassen inkubiert wird.
HDL, LDL und VLDL werden durch KBr-Ultradichtezentrifugation bei einer Dichte von d = 1,21 g/ml isoliert und durch FPLC auf einer Superose-6B-Größenausschlusssäule gereinigt (die Chromatographie wird bei einer Flussrate von 0,7 ml/Min. und einem Laufpuffer von 10 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA und 0,01% NaN₃ durchgeführt). ¹⁴C-markiertes Peptid wird mit HDL, LDL und VLDL bei einem Peptid:Phospholipid-Verhältnis von 1:5 (Masseverhältnis) für 2 Std. bei 37°C inkubiert. Die erforderliche Menge an Lipoprotein (die Volumen beruhen auf der erforderlichen Menge, um 1000 μg zu erhalten) wird mit 0,2 ml Peptidstammlösung (1 mg/ml) gemischt und die Lösung mit 0,9%iger NaCl auf 2,2 ml gebracht.
Nach Inkubation für 2 Std. bei 37°C wird ein Aliquot (0,1 ml) für die Flüssigszintillationszählung entnommen, um die Gesamtradioaktivität zu bestimmen, die Dichte des verleibenden Inkubationsgemisches wird mit KBr auf 1,21 g/ml eingestellt, und die Proben werden bei 100.000 Umdrehungen pro Minute (300.000 g) für 24 Stunden bei 4°C in einem TLA 100.3-Rotor in einer Beckman-Tischultrazentrifuge zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird fraktioniert, indem 0,3-ml-Aliquots oben von jeder Probe für insgesamt 5 Fraktionen abgenommen werden, und 0,05 ml jeder Fraktion wird für die Flüssigszintillationszählung verwendet. Die oberen beiden Fraktionen enthalten die schwimmenden Lipoproteine, die anderen Fraktionen (3-5) entsprechen Proteinen/Peptiden in Lösung.
9.6. DIE ERFINDUNGSGEMÄSSEN ApoA-I-AGONISTEN BINDEN HDL-PEPTIDE IN HUMANPLASMA SELEKTIV
9.6.1. EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Um zu zeigen, dass die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten HDL-Proteine in Humanplasma selektiv binden, werden 2 ml Humanplasma mit 20, 40, 60, 80 und 100 μg ¹⁴C-markiertem Peptid für 2 Std. bei 37°C inkubiert. Die Lipoproteine werden getrennt, indem die Dichte auf 1,21 g/ml eingestellt wird, und Zentrifugation in einem TLA 100.3-Rotor bei 100.000 Umdrehungen pro Minute (300.000 g) für 36 Std. bei 4°C. Die oberen 900 μl (in 300-μl-Fraktionen) werden für die Analyse abgenommen. 50 μl von jeder 300-μl-Fraktion werden hinsichtlich ihrer Radioaktivität gezählt, und 200 μl von jeder Fraktion werden durch FPLC (Superose-6/Superose-12-Kombinationssäule) analysiert.
10. BEISPIEL: DIE ApoA-I-AGONISTEN BEGÜNSTIGEN DEN CHOLESTERINAUSSTROM
Um zu zeigen, dass die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten den Cholesterinausstrom begünstigen, werden HepG2-Hepatomazellen in Kulturschalen mit 6 Vertiefungen ausplatiert und bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen werden mit ³H-Cholesterin markiert, indem das Cholesterin getrocknet wird, anschließend 1% Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zugegeben wird, die Lösung ultraschallbehandelt wird und den Zellen 0,2 ml dieser Markierungslösung und 1,8 ml Wachstumsmedium zugegeben wird, so dass jede Vertiefung 2 μCi Radioaktivität enthält. Die Zellen werden 24 Std. lang mit dem Markierungsmedium inkubiert.
Es werden Peptid (oder Protein):DMPC-Komplexe in einem Verhältnis von Peptid (oder Protein):DMPC von 1:2 (Gew./Gew.) hergestellt. Zur Herstellung der Komplexe wird Peptid oder natives humanes ApoA-I-Protein zu einer DMPC-Lösung in PBS gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert, woraufhin sich die Lösung geklärt hat. Die Peptid- oder Proteinkonzentration in der fertigen Lösung beträgt etwa 1 mg/ml.
Das Markierungsmedium wird von den Zellen entfernt, und die Zellen werden vor der Zugabe der Komplexe mit PBS gewaschen. Es werden 1,6 ml Wachstumsmedium in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von Peptid (oder Protein):DMPC-Komplexen und ausreichend PBS, um das Endvolumen auf 2 ml je Vertiefung zu bringen. Die Peptid- oder ApoA-I-Endkonzentrationen sind etwa 1, 2,5, 5, 7,5 und 25 μg/ml Medium. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37°C wird das Medium entfernt und die Zellen werden mit 2 ml 1% BSA/PBS gewaschen, gefolgt von 2 Waschschritten mit jeweils 2 ml PBS. Die Menge an in das Medium ausgeströmte ³H-Cholesterin wird durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.
11. BEISPIEL: ANWENDUNG DER ApoA-I-AGONISTEN IN TIERMODELLSYSTEMEN
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten lässt sich bei Kaninchen anhand der Protokolle unten aufzeigen.
11.1. HERSTELLUNG DER PHOSPHOLIPID/PEPTID-KOMPLEXE
Es werden kleine scheibenförmige Teilchen, die aus Phospholipid (DPPC) und Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) bestehen, nach dem Cholatdialyseverfahren hergestellt. Das Phospholipid wird in Chloroform gelöst und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Das Peptid wird in Puffer (Salzlösung) bei einer Konzentration von 1-2 mg/ml gelöst. Der Lipidfilm wird erneut in cholathaltigem Puffer gelöst (43°C), und die Peptidlösung wird in einem Phospholipid/Peptid-Verhältnis von 3:2 zugegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei 43°C inkubiert und anschließend bei 43°C (24 Std.), Raumtemperatur (24 Std.) und 4°C (24 Std.) inkubiert, wobei am Temperaturpunkt drei Pufferwechsel (große Volumen) erfolgen. Die Komplexe werden filtersterilisiert (0,22 μ) für Injektion und Lagerung bei 4°C.
11.2 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PEPTID/PHOSPHOLIPID-TEILCHEN
Die Teilchen werden auf einer Gelfiltrationssäule (Superose 6 HR) getrennt. Die Position der Spitze (des Peaks), welche die Teilchen enthält, wird durch Messung der Phospholipidkonzentration in jeder Fraktion identifiziert. Aus dem Elutionsvolumen lässt sich der Stokes-Radius ermitteln. Die Peptidkonzentration in dem Komplex wird ermittelt, indem der Phenylalaningehalt nach 16-stündiger Säurehydrolyse (durch HPLC) bestimmt wird.
11.3. INJEKTION IN KANINCHEN
Männlichen New Zealand White-Kaninchen (2,5-3 kg) wird eine Dosis des Phospholipid/Peptid-Komplexes (8 mg Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) oder 10 mg ApoA-I (Kontrolle) je kg Körpergewicht, ausgedrückt als Peptid- oder Proteingehalt) in einer einzelnen Bolusinjektion von höchstens 10-15 ml intravenös injiziert. Die Tiere werden vor den Manipulationen leicht sediert. Vor sowie 5, 15, 30, 60, 240 und 1440 Minuten nach der Injektion werden Blutproben (auf EDTA gesammelt) entnommen. Der Hämatokrit (HK) jeder Probe wird bestimmt. Die Proben werden aliquotiert und vor der Analyse bei –20°C aufbewahrt.
11.4. ANALYSE DER KANINCHENSEREN
Plasmalipide. Der Plasmagesamtgehalt an Cholesterin, Triglyzeriden und Phospholipiden wird enzymatisch unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Assays nach den Protokollen des Herstellers (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, und Biomerieux, 69280, Marcy-l'etoile, Frankreich) bestimmt.
Lipoproteinprofile. Die Plasmalipoproteinprofile der nach Auftrennung des Plasmas in seine Lipoproteinfraktionen erhaltenen Fraktionen wird durch Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten bestimmt. Die Fraktionen werden gesammelt, und in jeder einzelnen Fraktion wird enzymatisch der Phospholipid- und Cholesteringehalt gemessen.
11.5. ERGEBNISSE
Das Lipoproteinprofil von Kaninchen, denen 8 mg/kg Peptide 146 (SEQ ID Nr.:146) (in form von Peptid/DPPC-Komplexen) injiziert wurde, ist in 9 als Funktion der Zeit gezeigt. Fünf (5) Minuten nach der Injektion ist ein wesentlicher Anstieg des Cholesterins in den HDL-Cholesterinfraktionen (Fraktionen > 1,06 mg/ml) zu erkennen, der etwa 24 Std. andauert.
Das Cholesterin der kombinierten HDL-Fraktionen, das durch Dichtegradientenultrazentrifugation erhalten wurden, ist in Tabelle XI unten gezeigt. Der höchste Anstieg des HDL-Cholesterins (90%) fand 240 Min. nach der Verabreichung statt. Vierundzwanzig (24) Stunden nach der Verabreichung lag der Anstieg noch immer bei 71,2%.
Diese Daten zeigen, dass die Verabreichung von Peptid 146/DPPC-Komplexen (8 mg/kg) eine schnelle und effiziente Mobilisierung von peripherem Cholesterin induziert. TABELLE XI HDL-CHOLESTERIN BEI KANINCHEN NACH VERABREICHUNG VON 8 mg/kg PEPTID 146 (SEQ ID Nr.:146) oder 10 mg/kg NATIVEM ApoA-I

Zeit (Min.) Anstieg des HDL-Cholesterins (%) Natives ApoA-I Anstieg des HDL-Cholesterins (%) Peptid 146

5 19,3 31,3

15 16 60,4

60 15,8 42,9

240 –24,1 90,2

1440 * 71,2

*Tier verstar vorzeitig

12. BEISPIEL: HERSTELLUNG VON PEPTID-LIPID-KOMPLEX DURCH EINEN COLYOPHILISATIONSANSATZ
Es wurde das folgende Protokoll verwendet, um Peptid-Lipid-Komplexe herzustellen.
Ein mg Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) wurde in 250 μl Methanol, HPLC-Qualität (Perkin Elmer) in einem klaren Ein-Milliliter-Glasgefäß mit Deckel (Waters #WAT025054) gelöst. Das Lösen des Peptids wurde durch gelegentliches Vortexen über einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur unterstützt. Zu diesem Gemisch wurde ein Aliquot mit 3 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% Reinheit, Produktnr. 850355) aus einer Stammlösung mit 100 mg/ml in Methanol gegeben. Das Volumen des Gemisches wurde durch Zugabe von Methanol auf 400 μl gebracht, und das Gemisch wurde weiter für einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur periodisch auf dem Vortex gemischt. Dem Röhrchen wurden 200 μl Xylol (Sigma-Aldrich 99% rein, HPLC-Qualität) zugegeben, und die Röhrchen wurden für 10 Sekunden auf dem Vortex gemischt. Oben in das Röhrchen wurden mit einer Spritzenkanüle der Größe 20 Gauge zwei kleine Öffnungen gebohrt, das Röhrchen wurde 15 Sekunden lang in Flüssigstickstoff gefroren und über Nacht im Vakuum lyophilisiert. Dem Röhrchen wurden 200 ml 0,9%ige NaCl-Lösung gegeben. Das Röhrchen wurde für 20 Sekunden auf dem Vortex gemischt. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Lösung in dem Röhrchen ein milchiges Aussehen. Das Röhrchen wurde dann in einem Wasserbad 30 Minuten bei 41°C inkubiert. Nach einigen Minuten der Inkubation bei 41°C wurde die Lösung klar (d. h. nahm ein ähnliches Aussehen wie Wasser an).
12.1. CHARAKTERISIERUNG VON KOMPLEXEN DURCH SUPEROSE-6-GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
Peptid-Phospholipid-Komplexe, die Peptid 146 (SEQ ID Nr.:146) enthielten, wurden durch Co-Lyophilisation wie oben beschrieben hergestellt. Die Zubereitung enthielt 1 mg Peptid und 3 mg DPPC nach Gewicht. Nach der Rekonstitution der Komplexe in 200 μl 0,9% NaCl wurden 20 μl (enthaltend 100 μg Peptid 146) der Komplexe auf eine Superose-6-Säule von Pharmacia aufgetragen, wobei 0,9% NaCl als Flüssigphase mit einer Flussrate von 0,5 ml/Minute verwendet wurde. Die Chromatographie wurde durch Lichtabsorption bzw. Lichtstreuung bei einer Wellenlänge von 280 nm überwacht. Es wurden 1-ml-Fraktionen gesammelt. Aliquots, die 20 μl der Fraktionen enthielten, wurde hinsichtlich des Phospholipidgehaltes mit dem Phospholipides Enzymatique PAP 150 Kit (Art-Nr. 61491) von bioMerieux nach den vom Hersteller gelieferten Anleitungen getestet. Die überwiegende Mehrzahl der Phospholipide und die UV-Absorption wurden gemeinsam in einigen wenigen Fraktionen erhalten, wobei die Spitzen (Peaks) etwa bei 15,8 ml lagen. Dieses Elutionsvolumen entspricht einem Stokes-Durchmesser von 87 Ångström.
Zum Vergleich wurde ein separates Chromatogramm mit 20 μl humanem HDL₂ unter denselben Bedingungen und unter Verwendung der gleichen Säule wie für die Komplexe von Peptid 146 erstellt. Das HDL₂ wurde folgenderweise hergestellt: 300 ml gefrorenes Humanplasma (Mannheim Blutspendezentrale Nr. 1185190) wurden aufgetaut, mit festem Kaliumbromid auf eine Dichte von 1,25 gebracht und 45 Stunden bei 40.000 Umdrehungen pro Minuten mit einem Ti45-Rotor (Beckman) bei 20°C zentrifugiert. Die schwimmende Schicht wurde gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert, mit festem Kaliumbromid auf eine Dichte von 1,07 gebracht und wie oben beschrieben 70 Stunden lang zentrifugiert. Die untere Schicht (auf einer Höhe von einem cm über dem Boden des Röhrchens) wurde gesammelt, auf 0,01% Natriumazid gebracht und bis zur Chromatographie 4 Tage lang bei 4°C aufbewahrt. Das Säuleneluat wurde durch Lichtabsorption oder -streuung bei einer Wellenlänge von 254 nm überwacht. Eine Reihe von Proteinen bekannten Molekulargewichts und Stokes-Durchmessers wurde als Standard verwendet, um die Säule für die Berechnung der Stokes-Durchmesser der Teilchen zu kalibrieren (Pharmacia Gel Filtration Calibration Kit, Gebrauchsanleitung, Pharmacia Laboratory Separation, Piscataway, NJ, überarbeitet im April 1985). Das HDL₂ eluierte mit einem Retentionsvolumen von 14,8 ml, was einem Stokes-Durchmesser von 108 nm entspricht.
13. BEISPIEL: HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN
Zur Herstellung von Antikörpern gegen die erfindungsgemäßen ApoA-I-Agonisten wurde Peptid mit Keyhole-Limpet-Hämozyanin (KLH; 1 mg Peptid auf 10 mg KLH) konjugiert. Das KLH-Konjugat (LMG) wird in komplettem Freundschem Adjuvans suspendiert und zum Zeitpunkt 0 Kaninchen injiziert und nach 4 Wochen und erneut nach 5 Wochen mit 0,25 mg KLH-Konjugat geboostet. Blutproben, die vor der ersten Injektion entnommen, und Blutproben, die sechs Wochen nach der ersten Injektion entnommen wurden, werden mit einem ELISA hinsichtlich des Titers an Antikörpern gegen authentisches Antigen getestet.
Für die Herstellung wird Blut aus je 2 Kaninchen gepoolt. Antikörper, die ausschließlich gegen die Peptidantigene gerichtet sind, werden folgenderweise isoliert:

1. Freies Peptid wird an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) nach dem Protokoll des Herstellers gebunden.
2. Das Antiserum wird auf einer Säule irrelevanter Peptide und auf Säulen mit irrelevanten Human- und Mausserumproteinen vorabsorbiert.
3. Das vorabsorbierte Antiserum wird durch die entsprechende Peptidsäule geleitet (siehe Punkt 1).
4. Die Säulen werden mit 0,1 M boratgepufferter Salzlösung (pH 8,2) gewaschen und die gebundenen Antikörper mit Gradientenschritten bei niedrigem pH-Wert von pH 4,0 bis pH 3,0 bis pH 2,0 (0,1 M Glycinpuffer) und schließlich mit 0,1 M HCl eluiert.
5. Das eluierte Material wird mit einem Überschuss an Boratsalzlösung neutralisiert, durch Ultrafiltration eingeengt (Amicon, YM30) und gegen Boratsalzlösung dialysiert.
6. Die Proteinkonzentration wird über die Absorption bei 280 nm ermittelt.

Die resultierenden Antikörper werden mit gereinigtem humanem ApoA-I oder gereinigtem Maus-ApoA-I in einem direkten ELISA-Bindungsassay auf Speziesspezifität getestet.
Die Erfindung ist in ihrem Umfang nicht von den beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt, die nur als Veranschaulichung einzelner Aspekte der Erfindung beabsichtigt sind, und funktionell gleichwertige Verfahren und Komponenten sind im Umfang der Erfindung eingeschlossen. SEQUENCE LISTING

Claims

ApoA-I-Agonist, umfassend: (i) ein Peptid mit 15 bis 29 Resten, welches in Anwesenheit von Lipiden eine amphipathische α-Helix bildet und welches die Strukturformel (I): Z₁-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X₂₂-X₂₃-Z₂ umfaßt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei: X₁ Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) oder D-Pro (p) ist; X₂ ein aliphatischer Rest ist; X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₄ Glu (E) ist; X₅ ein aliphatischer Rest ist; X₆ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₇ Glu (E) oder Leu (L) ist; X₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₉ Leu (L) ist; X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₁ ein saurer Rest ist; X₁₂ Arg (R) ist; X₁₃ Leu (L) oder Gly (G) ist; X₁₄ Leu (L), Phe (F) oder Gly (G) ist; X₁₅ Asp (D) ist; X₁₆ Ala (A) ist; X₁₇ Leu (L) ist; X₁₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₁₉ ein basischer Rest ist; X₂₀ ein basischer Rest ist; X₂₁ Leu (L) ist; X₂₂ ein basischer Rest ist; X₂₃ abwesend oder ein basischer Rest ist; Z₁ H₂N- oder RC(O)NH- ist; Z₂ -C(O)NRR, -C(O)OR oder -C(O)OH oder ein Salz davon ist; jedes R unabhängig -H, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkenyl, (C₁-C₆)-Alkinyl, (C₅-C₂₀)-Aryl, (C₆-C₂₆)-Alkaryl, 5-20-gliedriges Heteroaryl oder 6-26-gliedriges Alkheteroaryl ist; jeder „-" zwischen Resten X, unabhängig eine Amidbindung bezeichnet; oder (ii) eine deletierte Form von Strukturformel (I), in der mindestens einer und bis zu acht von den Resten X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁ und X₂₂ deletiert sind; oder (iii) eine geänderte Form von Strukturformel (I), in der mindestens einer von den Resten X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂ oder X₂₃ konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher mindestens 38% LCAT-Aktivierungsaktivität im Vergleich zu humanem ApoA-I zeigt.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, bei dem die hydrophoben Reste entsprechend Strukturformel (I) fixiert sind und mindestens ein nicht fixierter Rest konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 3, bei dem: X₁ Pro (P), D-Pro (p), Gly (G), Asn (N) oder Ala (A) ist; X₂ Ala (A), Leu (L) oder Val (V) ist; X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₅ Leu (L) ist; X₆ Phe (F) ist; X₉ Leu (L) ist; X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₃ Leu (L) oder Gly (G) ist; X₁₄ Leu (L), Phe (F) oder Gly (G) ist; X₁₆ Ala (A) ist; X₁₇ Leu (L) ist; X₂₁ Leu (L) ist; und mindestens einer von X₄, X₇, X₈, X₁₁, X₁₂, X₁₅, X₁₈, X₁₉, X₂₂ und X₂₃ konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, bei dem die hydrophilen Reste entsprechend Strukturformel (I) fixiert sind und mindestens ein nichtfixierter Rest konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 5, bei dem: X₄ Glu (E) ist; X₇ Glu (E) ist; X₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₁₁ Asp (D) oder Glu (E) ist; X₁₂ Arg (R) ist; X₁₅ Asp (D) ist; X₁₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₁₉ Lys (K) ist; X₂₀ Lys (K) ist; X₂₂ Lys (K) ist; X₂₃ abwesend oder Lys (K) ist; und mindestens einer von X₁, X₂, X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄, X₁₆, X₁₇ und X₂₁ konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 5, bei dem X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist, X₆ Phe (F) ist, X₉ Leu (L) ist, X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist und mindestens einer von X₁, X₂, X₅, X₁₃, X₁₄, X₁₆, X₁₇ und X₂₁ konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
Deletierte Form eines ApoA-I-Agonisten, wobei der ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 1 (ii) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 8, bei dem eine helikale Wendung des Peptids deletiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher ein Peptid mit 22-23 Resten der Strukturformel (I) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 10, bei dem: der „-" zwischen Resten -C(O)NH- bezeichnet; Z₁ H₂N- ist; und Z₂ -C(O)OH oder ein Salz davon ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 11, bei dem: X₁ Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Asp (D), Gln (Q) oder D-Pro (p) ist; X₂ Ala (A), Val (V) oder Leu (L) ist; X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₄ Glu (E) ist; X₅ Leu (L) ist; X₆ Phe (F) ist; X₇ Leu (L) oder Glu (E) ist; X₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₉ Leu (L) ist; X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₁ Glu (E) ist; X₁₂ Arg (R) ist; X₁₃ Leu (L) oder Gly (G) ist; X₁₄ Leu (L), Phe (F) oder Gly (G) ist; X₁₅ Asp (D) ist; X₁₆ Ala (A) ist; X₁₇ Leu (L) ist; X₁₈ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₁₉ Lys (K) ist; X₂₀ Lys (K) ist; X₂₁ Leu (L) ist; X₂₂ Lys (K) ist; und X₂₃ abwesend oder Lys (K) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 12, bei dem X₂₃ abwesend ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 12, bei dem jeder von X₁₀, X₁₃ und X₁₄ anders als Gly (G) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 12, bei dem einer von X₁₀, X₁₃ und X₁₄ Gly (G) ist und die anderen anders als Gly (G) sind.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher aus der Gruppe, bestehend aus: (SEQ ID NO:144) pVLELFENLLERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:145) GVLELFENLLERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:146) PVLELFENLLERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:147) PVLELFENLLERLFDALQKKLK; (SEQ ID NO:148) PVLELFENLLERLGDALQKKLK; (SEQ ID NO:149) PVLELFENLWERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:150) PLLELFENLLERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:151) PVLELFENLGERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:152) PVFELFENLLERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:153) AVLELFENLLERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:154) PVLELFENLLERGLDALQKKLK; (SEQ ID NO:155) PVLELFLNLWERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:186) PVLELFEQLLERLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:187) PVLELFENLLERLLDALNKKLK; (SEQ ID NO:188) PVLELFENLLDRLLDALQKKLK; (SEQ ID NO:189) DVLELFENLLERLLDALQKKLK;

ausgewählt ist, und die N-terminalen acylierten und/oder C-terminalen amidierten oder veresterten Formen davon.
Multimerer ApoA-I-Agonist, welcher mindestens 38% LCAT-Aktivierungsaktivität im Vergleich zu humanem ApoA-I zeigt und welcher die Strukturformel (II): HH{LLm-HH}nLLm-HH (II)hat; oder ein pharmazeutisch vertragliches Salz davon, wobei: jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist; n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist; jedes „HH" unabhängig ein Peptid oder Peptidanaloges gemäß Anspruch 1 ist; jedes „LL" unabhängig ein bifunktioneller Linker ist; und jeder „-" unabhängig eine kovalente Bindung bezeichnet.
Multimerer ApoA-I-Agonist, welcher mindestens 38% LCAT-Aktivierungsaktivität im Vergleich zu humanem ApoA-I zeigt und welcher die Strukturformel (III): X-N_ya-X_(ya-1){N_yb-X_(yb-1)}_p (III)hat, oder ein pharmazeutisch vertragliches Salz davon, wobei: jedes X unabhängig HH{LL_m-HH}_nLL_m-HH ist; jedes HH unabhängig ein Peptid oder Peptidanaloges gemäß Anspruch 1 ist; jedes LL unabhängig ein bifunktioneller Linker ist; jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist; jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist; N_ya und N_yb jeweils unabhängig eine multifunktionelle Verbindungseinheit sind, wo y_a und y_b die Anzahl der funktionellen Gruppen an N_ya bzw. N_yb darstellen; jedes y_a oder y_b unabhängig eine ganze Zahl von 3 bis 8 ist; p eine ganze Zahl von 0 bis 7 ist; und jeder „-" unabhängig eine kovalente Bindung bezeichnet.
Multimerer ApoA-I-Agonist, welcher mindestens 38% LCAT-Aktivierungsaktivität im Vergleich zu humanem ApoA-I zeigt und welcher die Strukturformel (IV) oder (V):
hat, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei: jedes X unabhängig HH-(LL_m-HH)-_nLL_m-HH ist; jedes HH unabhängig ein Peptid oder Peptidanaloges gemäß Anspruch 1 ist; jedes LL unabhängig ein bifunktioneller Linker ist; jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist; jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist; R₁ -OR oder -NRR ist; und jedes R unabhängig -H, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkenyl, (C₁-C₆)-Alkinyl; (C₅-C₂₀)-Aryl, (C₆-C₂₆)-Alkaryl, 5-20-gliedriges Heteroaryl oder 6-26-gliedriges Alkheteroalkyl ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 17, 18 oder 19, bei dem der bifunktionelle Linker abspaltbar ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 17, 18 oder 19, bei dem n 0 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 20, bei dem m 0 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 17, 18 oder 19, bei dem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 13 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 17, 18 oder 19, bei dem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 14 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 17, 18 oder 19, bei dem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 18 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex, umfassend einen ApoA-I-Agonisten und ein Lipid, wobei der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 1, ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 17, ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 18 oder ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 19 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 26, bei dem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 10 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 26, bei dem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 11 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 26, bei dem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 12 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 26, bei dem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 16 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 26, bei dem das Lipid Sphingomyelin ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 26, welcher in der Form eines lyophilisierten Pulvers ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 26, welcher in der Form einer Lösung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen ApoA-I-Agonisten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Exzipienten oder ein Verdünnungsmittel, wobei der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 1, ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 17, ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 18 oder ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 19 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, bei der der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 10 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, bei der der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 11 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, bei der der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 12 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, bei der der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 16 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, 35, 36, 37 oder 38, bei der der ApoA-I-Agonist in der Form eines ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplexes ist, wobei der Komplex den ApoA-I-Agonisten und ein Lipid umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 39, bei der der ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex in der Form eines lyophilisierten Pulvers ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1 zum Behandeln eines Patienten, leidend an einer Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, wobei der ApoA-I-Agonist in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist, wobei die Zusammensetzung den ApoA-I-Agonisten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Exzipienten oder ein Verdünnungsmittel umfaßt.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, bei dem der ApoA-I-Agonist in der Form eines ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplexes ist, wobei der Komplex den ApoA-I-Agonisten und ein Lipid umfaßt.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, bei dem die Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie, Hypercholesterinämie ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, bei dem die Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie, eine kardiovaskuläre Erkrankung ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, bei dem die Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie, Atherosklerose ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, bei dem die Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie, Restenose ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, bei dem die Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie, HDL- oder ApoA-I-Defizienz ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, bei dem die Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie, Hyperglyceridämie ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41, in dem die Erkrankung, verbunden mit Dyslipidämie, metabolisches Syndrom ist.
ApoA-I-Agonist zum Behandeln eines Patienten, leidend an septischem Schock, wobei der ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 1 ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41 oder 51, bei dem der Patient ein Mensch ist.
ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 41 oder 51, bei dem etwa 0,5 mg/kg bis etwa 100 mg/kg ApoA-I-Agonist an den Patienten verabreicht werden.