JP6549554B2 - コレステロール流出を刺激する、減少した毒性を有するペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月15日出願の米国仮出願第61/798,191号の優先利益を主張し、その出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国エネルギー省によって授与された契約番号DE−AC02−05CH11231、及び国立衛生研究所によって授与された助成金番号HL085791の下で、政府支援によって成された。米国政府は、この発明に一定の権利を有する。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24(配列1)
を含むペプチドを提供する。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24(配列2)
を含む、細胞障害性をほとんどまたは全く有しないコレステロール流出活性を有する単離ペプチドを、加えて提供する。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24(配列3)
を含むコレステロール流出活性を有する単離ペプチドを提供する。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24(配列4)
を含むコレステロール流出活性を有する単離ペプチドを提供する。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24(配列5)
を含むコレステロール流出活性を有する単離ペプチドを提供する。
「ABC」または「ATP結合カセット」という用語は、細胞膜にわたる輸送物質(allocrite)(例えば、コレステロール)の制御された流出及び流入を担う多ドメイン膜タンパク質を指す。ABCタンパク質は、輸送物質の結合及び輸送を担う2つの膜貫通ドメイン(TMD)と、TMDの構造変化へのATP加水分解のエネルギーの連結を担う2つのヌクレオチド結合ドメイン(NBD)との4つのドメインを含む。ファミリーメンバーとして、例えば、ABCA1及びABCA7が挙げられる(例えば、Dean et al.,J.Lipid Res.,42:1007−1017(2001)を参照されたい)。ABCA1は、Denis et al.,J Biol Chem.,279(40):41529−36(2004)において特徴付けられる。ABCA1は、コレステロール流出において役割を果たし、コレステロール濃縮条件に曝露される細胞において上方調節され、タンジール病における欠損分子である(Brooks−Wilson et al.,Nat.Gen.,22:336−344(1999)、Bodzioch et al.,Nat.Gen.,22:347−351(1999)、Rust et al.,Nat.Gen.,22:352−355(1999))。ABCA1は急速に代謝回転し、アポリポタンパク質などの好適な安定剤の非存在下では約1時間の半減期を有する(例えば、Wang et al.,J.Clin.Invest.,111:99−107(2003)を参照されたい)。ABCA1配列は、Genbank受託番号AJ012376、NM_173076、NM_015657、NM_005502、NP_005493、O95477に示される。ABCAファミリーメンバーは、Broccardo et al.,Biochimica et Biophysica Acta,1461:395−404(1999)に概説される。
本発明は、強力なコレステロール逆輸送(RCT)経路を使用してコレステロール流出を媒介する、非自然発生ポリペプチドのファミリーを提供する。本発明のポリペプチドは、典型的に、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチド、もしくは配列番号1の非自然発生ペプチド変種を含むか、あるいは配列番号2のアミノ酸配列を有するペプチド、もしくは配列番号2の非自然発生変種を含む。配列番号1の変種のアミノ酸位置は、配列番号1を参照して決定される。同様に、配列番号2の変種のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して決定される。本発明のペプチドは、アポリポタンパク質(例えば、Apo A−I、Apo Eなど)のものと同様のモル力価でABCA1依存性コレステロール流出を刺激する。ABCA1依存性コレステロール流出の強力かつ選択的なメディエータであることに加えて、該ポリペプチドは、高用量で投与した場合、毒性をほとんどまたは全く有しない。本発明のポリペプチドはまた、ABCA安定化活性、LDL低下活性、抗酸化活性、及び抗炎症活性も有し、グルコース代謝を向上させ、アルツハイマー病の症状を治療するか、これらの活性の任意の組み合わせ、及び好ましくはこれらの活性の全てを有し得る。
‡所与の疎水性は、「小断片アプローチ」によるコンピュータlog(P)判定による「調整」値である(“Development of Hydrophobicity Parameters to Analyze Proteins Which Bear Post−or Cotranslational Modifications”Black,S.D.and Mould,D.R.,Anal.Biochem.,193:72−82(1991)を参照されたい)。調整パラメータ=(原パラメータ+2.061)/4.484という式を使用して、原log(P)値を所与の調整値に調整する。
例えばレトロインベルソペプチド模倣体を含む、本発明のポリペプチド及びペプチド模倣体は、構成アミノ酸及び/または末端アミノ酸上のR基が保護基によって遮断される、すなわち、保護されるように、修飾することができる。特にアミノ酸及び/またはカルボキシ末端の遮断は、経口送達を大いに向上させ、血清半減期を有意に増大させることが分かっている。本明細書で使用する「保護基」は、望ましくない化学変換から、反応性である可能性のある官能基を保護する、一時的な置換基を指す。このような保護基の例としては、概して、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、ならびにアルデヒド及びケトンそれぞれのアセタール及びケタールが挙げられる。保護基化学の分野は概説されている(Greene,T.W.;Wuts,P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.;Wiley:New York,1991)。
本発明のポリペプチドは、既知の技法を使用して調製することができる。例えば、ペプチドは、例えば固相合成を含む、当技術分野で公知の方法を使用して、化学的に合成することができる(例えば、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963)及びAbelson et al.,Methods in Enzymology,Volume 289:Solid−Phase Peptide Synthesis(1st ed.1997)を参照されたい)。ポリペプチド合成を行って、完全長ペプチドを生成することができる。あるいは、ポリペプチドの種々の断片を別個に化学的に合成し、その後、化学的方法を使用して組み合わせ、完全長ポリペプチドを産生することもできる。
本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、当業者に周知の方法を使用して、それらのコレステロール流出を媒介する能力及び/またはABCA(例えば、ABCA1)を安定させる能力について、容易に評価することができる。ペプチドは、更に毒性について評価し得る。
好適なコレステロール流出アッセイは、例えば、Bielicki,J.K and Oda,M.N.,Biochemistry,41:2089−2096(2002)、Jia et al.,Biochem.Biophys.Res.Common.,297:206−213(2002)に記載される。一部の実施形態では、コレステロール流出を媒介することが知られているポリペプチド(例えば、Apo A−Iのヘリックス9/10)を使用して、細胞系アッセイにおいて、コレステロール流出のさらなるメディエータについてスクリーニングする。例えば、ABCA1タンパク質発現を上方調節するcAMP類似体を使用してコレステロール流出を強化することができる細胞株(例えば、J774マクロファージ)を簡便に使用して、コレステロール流出を媒介する本発明のポリペプチドの能力を評定することができる。細胞を、細胞によるコレステロール取り込みに適した条件下で、標識したコレステロール(例えば、[3H]コレステロール)と共にインキュベートする。故に、細胞コレステロール流出の開始前に、すなわち細胞を試験ポリペプチドと接触させる前に、cAMPまたはcAMP類似体(例えば、CPT−cAMP)を、好適な時間、細胞と共にインキュベートする。培地中に出現する標識したコレステロールの測定値を使用して、試験ポリペプチドのコレステロール流出媒介活性を決定する。
当技術分野で公知の複数のアッセイを使用して、本発明のポリペプチドのABCA安定化活性を測定することができる。例えば、結合アッセイを使用して、試験ポリペプチドがABCA(例えば、ABCA1)に結合する能力を試験することができる。ABCA安定化活性を有するポリペプチドは、コレステロール流出のメディエータである可能性も高いことが見出されている。このように、好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、コレステロール流出を媒介する能力、及びABCAを安定させる能力を有する。1つのスクリーニング実施形態では、結合アッセイは競合アッセイであり得る。他のアッセイとしては、例えば、試験ポリペプチドとの接触後のABCA(例えば、ABCAタンパク質または核酸)の直接測定が挙げられる。
結合アッセイは通常、ABCAを1つ以上の試験ポリペプチドと接触させること、及びABCAと試験ポリペプチドが結合複合体を形成するのに十分な時間を与えることを伴う。形成された任意の結合複合体は、いくつかの確立された分析技法のいずれかを使用して、検出することができる。タンパク質結合アッセイとしては、免疫組織化学的結合アッセイ、フローサイトメトリー、または他のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、競合アッセイを使用して、試験ポリペプチドがABCA安定化活性を有するか否かを決定する。競合アッセイは当技術分野で公知である。典型的には、競合化合物、すなわち、ABCAと結合することが知られている化合物を、(例えば、ABCAに結合し得る本発明の試験ポリペプチドの漸増量の存在下で)ABCAへの結合の差が測定できるように標識する。ABCAへの試験化合物の結合に有意に干渉しない限り、アッセイに使用する特定の標識または検出可能な基は、本発明の重要な態様ではない。本明細書に記載のように、検出可能な基(または代替的に、検出可能な部分もしくは標識)は、検出可能な物理的または化学的性質を有する任意の物質であり得る。そのような検出可能な標識は、免疫測定法の分野で十分に開発されており、概して、そのような方法で有用な大部分の任意の標識を本発明に適用することができる。故に、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明で有用な標識としては、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADSTM(商標))、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Texas red、ローダミンなど)、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びELISAで一般的に使用されるその他のもの)、及びコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)などの比色標識が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、細胞系アッセイを使用して、ABCA(例えば、ABCAタンパク質または核酸)の直接測定によってABCAの安定化を測定する。細胞系アッセイは、ABCAでトランスフェクションした細胞(例えば、HeLa細胞)を含む、ABCAが発現されている任意の細胞(例えば、J774マクロファージ)中で行うことができる。任意の細胞型を使用することができる。例えば、J774マクロファージを使用して、本発明のポリペプチドの存在下及び非存在下における、相対ABCA1タンパク質レベルを評定することができる。最初に、細胞を、ABCAを誘導する化合物(例えば、cAMP、または8−ブロモ−cAMPなどのcAMP類似体)と接触させてABCA(例えば、ABCA1)発現を上方調節し、その後、cAMP刺激の非存在下において、本発明のポリペプチドの存在下及び非存在下で合成ABCA1タンパク質レベルに曝露して、ABCA1タンパク質が安定したかまたは分解されたか否かを評価する。ABCA1タンパク質の相対レベルは、例えば、細胞膜の免疫ブロット解析(Oram et al.,J.Biol.Chem.,278:52379−52385(2003))、またはABCA mRNAに対する核酸プローブのハイブリダイゼーションを含む、当技術分野で既知の任意の手段を使用して評定することができる。
本発明のペプチドまたはペプチド模倣体は、既知のアッセイを使用して、毒性について評価することができる。そのようなアッセイの例は実施例の節で例解する。毒性は、典型的に、ラット、マウス、サル、またはイヌモデルにおいてアッセイする。実施例1で説明するものなどの例解的アッセイでは、ペプチドを、ウサギまたはラットモデルを使用して、3、30、及び300mg/kgで静脈内投与し、ビヒクルのみも、48時間間隔、全4回の注射で投与する。その後、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、及びクレアチンキナーゼ(CK)を含む血中の安全性化学パネルを決定することができる。対照の正常値と比較して血中でこれらの酵素のレベルの上昇がある場合、それは毒性を示す。本発明のペプチドは典型的に、最高用量、この例解的アッセイでは300mg/kgを使用した結果が、ビヒクルのみを受けた対照動物について測定した値と同等である(標準偏差内である)か、またはビヒクルのみで得られたバックグラウンドの2または3倍以下である場合に、無毒であるか、毒性をほとんど有しないと見なされる。一部の実施形態では、毒性アッセイは、本発明のペプチドの毒性をATI−5261のものと比較する場合に行う。毒性をほとんどまたは全く有しない本発明のペプチドは典型的に、300mg/kgの用量で、マウス、ラット、またはウサギに投与した場合、例えば、注射から4時間後に、ATI−5261で観察された毒性の50%未満、好ましくは20%未満、またはより好ましくは10%未満を呈する。他の動物モデル、例えばサルを使用して、毒性を評価してもよい。
本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、当技術分野で既知の方法を使用して、抗酸化活性について評価することができる。例えば、米国特許公開第2003/0087819号は、例えばミセル基質アッセイを含む、ポリペプチドの抗酸化活性を決定するために使用できる複数のアッセイを説明する。リン脂質(例えば、1−パルミトイル−2−リノレオイルホスファチジルコリン)を含むミセル基質を使用して、特定の酵素(例えば、大豆リポキシゲナーゼ及び/またはキサンチン/キサンチンオキシダーゼ)によって触媒される脂質の過酸化の速度を測定する。本発明の組換えポリペプチドをリン脂質ミセルに添加した後、酵素で脂質の過酸化を開始する。共役ジエン(脂質の過酸化の産物)の増加を、25℃で紫外線吸収分光法(234nm)によりモニターする。リン脂質ヒドロペルオキシドの質量を、共役ジエンのモル吸光係数(ε=29,500Lcm-1mol-1)を使用して計算する。酸化曲線の直線部分の勾配から、リポキシゲナーゼが媒介する脂質の過酸化の初速度を計算し、形成されたリン脂質過酸化物nmole/分として結果を表すことができる。ポリペプチドの非存在下で得られた脂質過酸化物の蓄積の最大レベル(すなわち、酸化曲線に関連するプラトー)に基づいて、本発明のポリペプチドの効力に関する定量的情報(例えば、脂質の過酸化に対して50%の保護をもたらすポリペプチドの濃度)を導出することが可能である。他の方法は、LDL、VLDL、及びLp(A)としてのApoBリポタンパク質の酸化を防止するポリペプチド資質についてのスクリーニングに関する。
本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、当技術分野で既知の任意の手段を使用して、抗炎症活性について評価することができる。例えば、炎症事象に感受性のある酵素(例えば、レシチン:コレステロールアセチルトランスフェラーゼ(LCAT)またはパラオキソナーゼ(PON))の活性を評定するアッセイを使用して、本発明のポリペプチドの抗炎症活性を評定することができる。好適なアッセイは、例えば、外因性プロテオリポソーム基質を使用するLCAT活性の定量化を説明するChen et al..,J.Lipid Res.,23:680−691(1982)、及びPON活性の定量化を説明するForte et al.,J.Lipid Res.,43:477−485(2002)に記載される。その他のスクリーニングとしては、種々の刺激(例えば、接着分子、TNF−α、LPS、またはそれらの組み合わせ)後の標的細胞のmRNA発現及び/またはタンパク質産生を阻害するポリペプチド資質をモニターすることが挙げられる。
コレステロール流出を媒介するかまたはABCAと相互作用すると最初に特定されるポリペプチドを更に試験して、それらのコレステロール流出を媒介する能力及び/またはABCAを安定させる能力を確認することができる。このような方法の基本的形式は、最初のスクリーニング中に特定されたリード化合物を、モデルとなる動物に投与することを伴う。確認研究に利用される動物モデルは、概して、任意の種類の哺乳動物である。好適な動物の具体例としては、霊長類(例えば、チンパンジー、サルなど)及びげっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギなど)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、Apo E−/−マウス、Apo A−II−/−マウス、またはApo C−III−/−マウスを使用する。更なる動物モデルは、例えば、Marschang et al.,Sem.Cell Dev.Biol.,14:25−35(2003)に記載される。
ペプチドは、HDLと結合し、ラットで8時間(実施例の節におけるラットPK実施例、図36及び52Aを参照されたい)、ヒトで3〜5日であると推定される長いHDL半減期を仮定するため、長い間隔での投与が可能となる。他のペプチドと結合した場合のペプチド、小分子、または部分(積荷分子)は、類似の形でこれらの分子の半減期を増大させることができる。血漿中のHDL結合特性及びペプチドのABCA1細胞結合は、心不全、血管疾患、真性糖尿病、癌、及び神経疾患を含むがこれらに限定されない診断及び治療目的に使用することができる、ペプチド及びその積荷の固有のPK、組織、及び細胞分布特性を創出する。
本発明の非自然発生ポリペプチドは、強力なコレステロール逆輸送(RCT)経路を使用して、コレステロール流出を媒介する。本発明のポリペプチドは、ABCA1依存性コレステロール流出の強力かつ選択的なメディエータであることに加えて、ABCA安定化活性、抗糖尿病活性、抗酸化活性、及び抗炎症活性、これらの活性の任意の組み合わせ、ならびに好ましくはこれらの活性の全ても有する。
一実施形態では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の1つ以上の症状を治療、緩和、及び/または予防するための方法を提供する。本方法は、生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの本発明の1つ以上のポリペプチド(またはそのようなポリペプチドのペプチド模倣体)の投与を伴うことが好ましい。ポリペプチド(複数可)は、本明細書に記載のように、注射、坐剤、経鼻スプレー、徐放性インプラント、経皮パッチ、経口などを含むがこれらに限定されないいくつかの標準的な方法のいずれかに従って投与することができる。特に好ましい一実施形態では、ポリペプチド(複数可)を経口投与する(例えば、シロップ剤、カプセル剤、錠剤などとして)。
本発明のアテローム性動脈硬化症阻害ポリペプチドは、いくつかの他の背景においても有用である。特に、心血管系合併症(例えば、アテローム性動脈硬化症、卒中など)は、頻繁に、急性期炎症反応の開始を伴うか、またはこれに続くことが見出されている。このような急性期炎症反応は、多くの場合、再発性炎症性疾患(例えば、ハンセン病、結核症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎など)、ウイルス感染(例えば、インフルエンザ、HIVなど)、細菌感染、真菌感染、臓器移植、創傷または他の外傷、埋め込み人工器官、バイオフィルムなどと関連付けられる。
更なる態様では、本発明は、グルコース代謝異常を有する哺乳動物の改変方法を提供する。一部の実施形態では、哺乳動物は、2型糖尿病を有する。一部の実施形態では、哺乳動物は、1型糖尿病を有する。一部の実施形態では、哺乳動物は、前糖尿病または代謝症候群を有する。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態では、哺乳動物は、空腹時の血中グルコースレベルが100mg/dLを上回るヒトである。一部の実施形態では、哺乳動物は、大血管もしくは微小血管疾患、腎疾患、または鬱血性心不全としての糖尿病の合併症を有する。
更なる態様では、本発明は、アルツハイマー病もしくは軽度認識障害、前頭側頭型認知症、または血管性認知症を有する患者を治療する方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明のペプチドを使用して、治療薬剤を送達し得る。故に、例えば、一部の実施形態では、ペプチドは、癌を治療するための毒素または放射性標識などの作用剤と連結させてもよい。いかなる型の癌も治療することができる。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えばコレステロール逆輸送を通してプラークの脂質含量を減少させることにより、血栓性動脈閉塞を引き起こす可能性の高い不安定プラークの破裂傾向を安定させることができる。故に、別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチド(またはこのようなポリペプチドのペプチド模倣体)のうち1つ以上を哺乳動物(及びより好ましくはヒト)に投与することで、哺乳動物の血管中の不安定プラークを安定させる方法を提供する。「不安定」プラークは、概して、適当なコラーゲン及び平滑筋細胞支持を欠いた薄膜化した線維性被膜を持つ、脂質の豊富なプラークとして定義される。哺乳動物、好ましくは、ヒトは、温度検出手法、標識手法、撮像手法(例えば、磁気共鳴、超音波、赤外線、蛍光、可視光、電波、X線などを利用するデバイス)、不安定プラークを周辺の正常な維管束組織から見分けるための一般的な手法などを含む既知の方法を使用して、1つ以上の不安定プラークを有すると診断され得る(例えば、米国特許第6,245,026号、同第6,475,159号、同第6,475,210号、及び同第7,118,567号を参照されたい)。別の実施形態では、哺乳動物、好ましくはヒトは、1つ以上の不安定プラークを有する危険性がある。この実施形態では、該哺乳動物が1つ以上の不安定プラークを有する危険性があることを当業者が信じるに至る、臨床症状が発症している、及び/または臨床事象が発生している。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、アテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患などの、脂質異常症、高コレステロール血症、及び炎症と関連付けられる疾患及び障害を治療及び予防するための1つ以上の追加の治療薬剤と併用して投与する。例えば、一実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、スタチン(例えば、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、またはロスバスタチン)、Nieman−Pick C1−Like 1ステロールトランスポーターチャネル阻害剤(例えば、エゼチミブ)、胆汁酸結合剤(例えば、コレスチラミンまたはコレスチポール)、血小板凝集阻害剤(例えば、アスピリン、チクロピジン、またはクロピドグレル)、ナイアシン/ニコチンアミド、PPAR活性化剤、ビタミンE、手術介入(例えば、血管形成術、ステント、ステント、または動脈内膜切除術)、及び生活習慣の変更(例えば、低脂肪食、減量、及び運動)を含む、アテローム性動脈硬化症のための標準的治療のうち任意のものと併用して投与する。
本発明の方法を実行するためには、1つ以上の本発明のポリペプチドまたはそのペプチド模倣体を、脂質異常症、高コレステロール血症、及び炎症と関連付けられる疾患もしくは障害(例えば、アテローム性動脈硬化症の1つ以上の症状を有するか、またはアテローム性動脈硬化症の危険性があると診断された個体に)、またはグルコース代謝異常と関連付けられる疾患、またはアルツハイマー病を有するか、または有する危険性があると診断された個体に投与する。ポリペプチドまたはそれらのペプチド模倣体は、それらの「天然」形態か、または所望の場合は、例えば、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体などの形態で投与することができるが、但し、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体が、薬理的に好適である、すなわち、本発明の方法において効果的であることが条件である。
別の態様では、本発明のポリペプチド及びペプチド模倣体は、1つ以上の脂質と共に投与することが好ましい。脂質は、ポリペプチドまたはペプチド模倣体の輸送/取り込みを保護及び/または強化するために賦形剤として製剤するか、または別個に投与することができる。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示のポリペプチドをコードする単離核酸、核酸を含む発現ベクター、及び発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。より具体的には、本発明は、分子当たりの基準で、完全長アポリポタンパク質と同様のコレステロール流出活性を有し、かつ完全長アポリポタンパク質と同様の形でABAC1に対する高選択性を有する、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸を提供し、該ポリペプチドとしては、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸配列または本明細書に記載の変種を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチド及びペプチド模倣体は、研究ツールとしても有用である。例えば、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、動物及び動物モデルにおけるリポタンパク質−受容体間の相互作用を調査するために使用することができる。加えて、本発明のポリペプチドを使用して、脂質代謝経路の解明のために適切な動物モデルを特定することもできる。例えば、脂質の過酸化がアテローム性動脈硬化症の進行に寄与する場合、ポリペプチドを使用して動物モデルを特定することができる。その上、本発明のポリペプチドを使用して、他の化合物(例えば、ペプチド変種及び他のペプチド模倣体を含む)の抗アテローム性動脈硬化症への潜在力を評価することができる。
別の態様では、本発明は、脂質異常症、高コレステロール血症、及び炎症と関連付けられる疾患もしくは障害、すなわち状態、またはグルコース代謝異常と関連付けられる疾患もしくは状態、またはアルツハイマー病の治療、すなわち緩和または予防のためのキットを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、疾患の1つ以上の症状の治療、すなわち緩和のため、または疾患の危険性がある対象(例えば、ヒトまたは動物)の予防的治療のためのキットを提供する。キットは、本発明のポリペプチド(またはペプチド模倣体)のうち1つ以上を含む容器を備えることが好ましい。ポリペプチドまたはペプチド模倣体は、単位剤形(例えば、錠剤、カプレット、パッチ、坐薬など)で提供することができ、及び/または任意に1つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせることができる。
この実施例は、ペプチドを高用量で投与した場合のペプチドATI−5261の毒性を示す。
この実施例は、ATI−5261の非極性表面と関連付けられる芳香族フェニルアラニン残基がペプチド毒性の大部分に寄与したことを例解する(図5)。脂肪族ロイシン(L)を持つATI−5261の類似体を創出して、毒性を評価した(図5)。フェニルアラニン(F)を代置するために体系的に使用した脂肪族ロイシン(L)を持つATI−5261の変種(配列表パネルA)を、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにIP注射した。血漿の単離のため、注射の4時間後に眼窩後方の神経叢を介して血液を採取した。血漿CPK(パネルA)、ALT(パネルB)、及びAST(パネルC)のレベルを、図1に記載のように決定した。値は、平均値±SD、n=群当たり4マウスである。パネルA中の挿入図は、フェニルアラニン残基を欠く全脂肪族類似体(T5055−13、すなわち、ゼロまたはFなし)対ビヒクルのみ(PBS対照)と関連付けられる残留毒性を示す。
ATI−5261の細胞傷害性応答がアルギニンまたはリジン残基に優先的に連結されたか否かを試験するために、リジン排除またはR>K置換を持つATI−5261のペプチド類似体を、マウスにおいて創出及び評価した(図8)。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。切除(T5766−5)またはアミノ酸置換(K25→N、T5594−4)のいずれかによるATI−5261のC末端からのリジン25(K25)の除去は、血漿中の減少したCPK活性(左のパネル)によって判断して、筋肉毒性を大いに減少させ、これは、リジン残基が毒性を促進することを示す。全リジン残基を持つペプチド(すなわち、R>K置換、T5594−5)も、ペプチドの悪影響を媒介することにおけるリジンまたはアルギニンのいずれかの役割と一致する、細胞傷害性活性及びTG上昇活性を示した。パネルB−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したペプチドのABCA1依存性コレステロール流出活性。結果を、図7に記載のように、流出のABCA1成分として表す。全ペプチドは官能性であり、親ATI−5261ペプチドを使用して見られたものと同様に、3μg/mlの飽和濃度で高レベルのコレステロール流出を刺激した。
この実施例は、疎水性を調節してATI−5261類似体の残基毒性を減少させ得ることを実証する。ATI−5261の毒性を排除する荷電残基に加えて因子を特定するために、アラニン置換を使用して疎水性を体系的に減少させた(図10)。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。LeuATI−5261ペプチドにおけるアラニン置換への単一ロイシン(L24AまたはL21A、すなわちT4883−6またはT4883−7)の使用は、残留筋肉毒性(すなわちCPK活性)を排除するのに十分であり、細胞傷害性反応及びTG上昇効果を更に減少させた。パネルB−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したペプチドのABCA1依存性コレステロール流出活性。結果を、図7に記載のように、流出のABCA1成分として表す。単一L24AまたはL21A置換を持つペプチドは官能性であり、親ATI−5261ペプチドを使用して見られたものと同様に、3μg/mlの飽和濃度で高レベルのコレステロール流出を刺激した。パネルC−ペプチドの強力な官能性を検証する詳細な研究。標識した[3H]コレステロール、cAMPで処理したJ774細胞を、漸増する濃度のペプチドと共にインキュベートし、4h後に媒体へのコレステロール流出を評定した。単一アラニン置換を持つペプチドは、コレステロール流出における低Km(3μg/ml以下)及び飽和によって判断して、極めて強力な流出活性を支持し、これは、全体的な疎水性を減少させるアミノ酸置換を使用して、安全かつ効果的なペプチドを創出し得ることを示す。
この実施例は、疎水性アミノ酸をR14位に使用して、安全かつ効果的なペプチドを創出し得ることを実証する。LeuATI−5261の長さの下部での複数のアラニン置換の使用は、ATI−5261類似体の低い毒性及び大いに小さくなったTG上昇効果をもたらした(図11、ペプチドT5505−12)。しかしながら、アラニン置換の過剰使用は、細胞コレステロール流出の媒介における官能性の喪失をもたらす。複数のアラニン置換を持つペプチドのコレステロール流出活性を救援するため、T5505−12またはATI−5261内でR14を削除したか、またはR14を疎水性ロイシンで代置した(図13)。これらの削除/置換は、ペプチドの脂質/水界面から有害な正荷電残基を除去しながら、疎水性表面を拡大する。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。R14L置換を持つペプチド(T5211−2)は、種々の位置(V2、L6、及びL24>A)におけるアラニンの使用にもかかわらず、血漿中の毒性反応及び低TGをほとんどまたは全く示さなかった。パネルB−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したペプチドのABCA1依存性コレステロール流出活性。結果を、図7に記載のように、流出のABCA1成分として表す。R14L置換を持つT5055−12のペプチド類似体(すなわちT5211−2)は、飽和濃度(10μg/ml)で、ATI−5261と同様の、及び親T5055−12ペプチドに対して著明に向上した高レベルのコレステロール流出活性を示した。故に、両親媒性αヘリックスペプチドの脂質/水界面での疎水性ロイシン残基の使用は、アラニン置換の使用によって毒性が低下したペプチドのコレステロール流出活性を回復するために使用することができる。
この実施例は、R14L置換を他のATI−5261類似体中で使用して、安全かつ効果的なHDL模倣ペプチドを創出し得ることを実証する。種々のアラニン残基をバリン(V)で置換することによって、R14L置換を含むT5211−2のペプチド類似体を創出した(図14)。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。単一または複数のA→V置換を含みC末端残基KSを欠くT5211−2のペプチド類似体は、ATI−5261陽性対照と比較して、比較的低い細胞傷害性応答を呈した。パネルB−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したペプチドのABCA1依存性コレステロール流出活性。T5211−2のペプチド類似体は官能性であり、ATI−5261と同様の濃度(10μg/ml)で、ABCA1に依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルC−濃度依存性研究は、バリン置換を持つR14Lペプチド及び持たないR14Lペプチドが、極めて効率的な形でコレステロール流出を刺激し、3μg/mlでコレステロール流出の低Km及び飽和を示したことを実証した。左のパネルは、R14Lペプチド(バッチ#T6023−3、すなわちT5211−2原型)の流出活性を示し、これは、R14L置換が、親T5055−12ペプチドの弱い活性と比較して強力な官能性を授けたことを例解する(図11、パネルCを参照されたい)。
この実施例は、アルギニンのシトルリン置換を使用して、安全かつ効果的なHDL模倣ペプチドを創出し得ることを実証する(図15)。シトルリンは、正荷電を欠くが、塩橋構成を保存するために水素結合を保持するアルギニンの天然アミノ酸類似体である。正荷電の欠如それ自体がATI−5261の毒性及びTG上昇効果を排除するか否かを試験するために、一連のペプチド類似体を、3位、14位、及び23位でのR→シトルリン置換を用いて創出した(図15中の配列表を参照されたい)。本図及び表は、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにIP注射したペプチド(300mg/kg)の安全性及びTG上昇効果を示す。値は、平均値SD、n=4である。試験したペプチドについては、3位及び14位でのシトルリンの使用がATI−5261の筋肉毒性を大いに減少させたが、一方で、全体的な一般毒性(AST)及び血漿TGは増加したままであった。
この実施例は、ATI−5261のシトルリン類似体が他のアミノ酸置換を支持することを実証する。種々の疎水性アミノ酸(W→L、V、またはA)置換をATI−5261の二重シトルリン形態(すなわち、R3、14→シトルリン、T5426−4)で創出して、該ペプチドが毒性反応及びTG上昇効果を更に排除するために他のアミノ酸変化を支持し得るか否かを試験した。これらの実験の結果を図17に示す。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。W9→L、V、またはA置換(複数可)を持つATI−5261のシトルリン形態は、血漿中の毒性反応及びTG上昇反応をほとんどまたは全く示さなかった。パネルB−J774マクロファージを使用して決定したペプチドのABCA1依存性コレステロール流出活性。結果を、図7に記載のように、流出のABCA1成分として表す。シトルリン置換を持つペプチド類似体は官能性であり、ATI−5261と同様に、飽和濃度(3μg/ml)で高レベルのコレステロール流出活性を示した。
この実施例は、LeuATI−5261ペプチドが、シトルリン置換を支持して、安全かつ効果的なHDL模倣ペプチドを創出し得ることを実証する。正荷電アルギニン及び芳香族フェニルアラニン(F)残基の両方の排除が、強力なコレステロール流出活性を保持した安全なペプチドを創出したか否かを試験するために、一連のシトルリン置換をLeuATI−5261類似体中で創出した(図18中の配列表を参照されたい)。ペプチドを評価した結果を図18に提供する。本グラフ及び表は、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにIP注射したペプチド(300mg/kg)の安全性及びTG上昇効果を示す。値は、平均値SD、n=4である。試験したペプチドについては、3位及び14位でのシトルリンの使用が、ATI−5261の筋肉毒性(CPK活性)及び全体的な細胞障害反応(ALT及びAST)及びTG上昇効果を大いに減少させた。最も注目すべきは、3位及び14位での2つのシトルリン置換(すなわち、R3、14→シトルリン)を持つペプチドが、PBS対照と比較して検出可能な筋肉毒性または肝毒性を示さなかったことである。これは、F残基を保有するATI−5261のシトルリン形態(図15、すなわちT5426ペプチド)で観察されたAST及びTGの穏やかな増加とは対照的であり、LeuATI−5261のシトルリン類似体が、高用量で投与したときにひときわ安全であったことを示す。
この実施例は、両親媒性αヘリックスの極性表面に沿った負荷電残基の存在が、HDL模倣ペプチドの毒性特性を加減する主要な役割を果たすことを示す(図20)。非荷電グルタミン(Q)を使用して、図20中の配列表に示すように、ATI−5261、LeuATI−5261、及びそのシトルリン類似体全体の種々の位置で負荷電グルタミン酸塩(E)を代置した。ペプチドの正味の荷電は、示す配列について+1(T5554−1)〜−1(T5554−5及びT5554−6)の範囲であった。本グラフ及び表は、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにIP注射したペプチド(300mg/kg)の安全性及びTG上昇効果を示す。値は、平均値SD、n=4である。ATI−5261からの酸性残基の除去(E7、18→Q、すなわちT5554−1)は、親ATI−5261ペプチドで見られたものと比較して、毒性反応の大規模な増加をもたらした。これは、好ましいシトルリン置換(すなわち、T5554−5及びT5554−4)の存在下では多少減退したが、共に強い毒性反応(CPK、ALT、及びAST)及びTG上昇反応を保持した。これらの結果は、HDL模倣ペプチドATI−5261の安全性特性が、負荷電アミノ酸の存在及び位置に部分的に依存したことを示す。
この実施例は、Leu−ATI5261の小型の24−mer形態及びそのシトルリン類似体が安全かつ効果的であることを実証する(図22)。C末端残基の除去は、ペプチド活性を改変することなくATI−5261の毒性反応を減少させるように思われた(図8、T5766−5)。この効果がATI−5261の他のより安全な形態で繰り返されるかどうかを試験するために、アミノ酸25及び26(それぞれKS)をLeuATI−5261及びそのシトルリン類似体から削除した(図22)。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。C末端残基KSを欠くペプチドは、比較的低い細胞傷害性応答を呈したが、ATI−5261に基づく24−merを使用して見られたように、TG上昇効果を保持した(図8)。パネルB−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したペプチドのコレステロール流出活性。ペプチドは官能性であり、LeuATI−5261のシトルリン形態に基づく親26−merペプチド(CS6253、すなわち、バッチT5237−4と同等)と同様の濃度(10μg/ml)で、ABCA1に依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルC−24−merペプチドが極めて効率的な形でコレステロール流出を刺激し、3μg/mlでコレステロール流出の低Km及び飽和を示したことを実証する用量反応。
この実施例は、疎水性ロイシンを使用し、両親媒性αヘリックスの脂質/水界面でシトルリンを代置して、安全かつ効果的なHDL模倣ペプチドを創出し得ることを実証する(図23)。LeuATI−5261の二重シトルリン形態(T5237−4)をプラットフォームとして使用して安全かつ効果的なHDL模倣ペプチドを創出し得ることを検証するために、疎水性ロイシンを3位で使用するか、または2位でバリンの代わりに使用した。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。ロイシン置換を持つペプチドは、R14L置換を持つ類似体と同様に、細胞傷害性特性をほとんどまたは全く示さなかった(図13)。これは、R3位及び14位が極めて頑強であり、多様なアミノ酸置換によって標的化されて、安全かつ効果的なHDL模倣ペプチドを創出し得ることを示す。パネルB−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したペプチドのコレステロール流出活性。ペプチドは官能性であり、LeuATI−5261の親シトルリン形態(CS6253、すなわち、T5237−4のバッチと同等)と同様の濃度(10μg/ml)で、ABCA1に依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルC−ロイシン置換を持つペプチドが極めて効率的な形でコレステロール流出を刺激し、3μg/mlでコレステロール流出の低Km及び飽和を示したことを実証する用量反応。
この実施例は、LeuATI−5261のシトルリン形態が、他のアミノ酸置換を支持して、安全かつ効果的なペプチドを創出することを実証する(図24)。leuATI−5261の種々の類似体を、3位及び14位にあるロイシンまたはシトルリンのいずれか、または2位のロイシンによって創出した。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスに代表的なペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。14位にロイシンを保有する(シトルリン14→L)ペプチドは、R14L置換を持つ類似体と同様に、細胞傷害性特性をほとんどまたは全く示さなかった(図13)。
この実施例は、種々のロイシン置換を持つLeuATI−5261のシトルリン形態がコレステロール流出活性を保持したことを実証する。[3H]コレステロールで標識し、ABCA1発現を調節するためにcAMPで処理したJ774マクロファージ(右の棒)及び処理していないJ774マクロファージ(左の棒)を使用して、ペプチドのコレステロール流出活性(図25)を決定した。パネルA−シトルリン及び/またはロイシン置換を持つペプチド類似体は官能性であり、10μg/mlの濃度で、ABCAに依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルB−T6275−5ペプチド(単一シトルリン14→L置換)が極めて効率的な形でコレステロール流出を刺激し、3μg/mlでコレステロール流出の低Km及び飽和を示したことを実証する用量反応。
この実施例は、イソロイシンを使用し、ATI−5261中のフェニルアラニンを代置して、安全かつ効果的なコレステロール流出ペプチドを創出し得ることを実証する(図26)。ATI−5261のペプチド類似体を創出し、非極性表面で使用することができるアミノ酸置換を特定して、安全なペプチドを創出した。安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。本棒グラフ(左下)は、イソロイシン置換(F10、13、16、20→I)を保有するATI−5261(T6991−1)及びCit.ATI−5261(T6991−2)の類似体が、CPK上昇に関係する細胞傷害性特性をほとんどまたは全く示さないことを示す。血清ALT及びAST値も、イソロイシンペプチド対ATI−5261対照で著明に減少した(表)。対照的に、非極性表面でのセリンまたはチロシン代置を持つATI−5261の類似体は、比較的高いCPK、ALT、及びAST反応を誘導し、これは、ペプチドの脂質結合表面上の極性残基の位置が細胞傷害性応答を低下させなかったことを示した。これらの結果は、ATI−5261の毒性特性が芳香族及び正荷電残基に関係し、シトルリン及び脂肪族アミノ酸残基の戦略的使用によってこれを排除し得ることの証拠を提供する。値は、平均値SD、n=4である。
この実施例は、ATI−5261のイソロイシン形態がコレステロール流出活性を保持することを実証する(図27)。[3H]コレステロールで標識し、ABCA1発現を調節するためにcAMPで処理したJ774マクロファージ(右の棒)及び処理していないJ774マクロファージ(左の棒)を使用して、ペプチドのコレステロール流出活性を決定した。パネルA−ATI−5261(T6991−1)及びCit.ATI−5261(T6991−2)のイソロイシン形態は官能性であり、10μg/mlの濃度で、ABCAに依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルB−ATI−5261のイソロイシン形態が極めて効率的な形でABCA1コレステロール流出を刺激したことの実証。パネルC−Cit.ATI−5261(T6991−2)のイソロイシン形態が極めて効率的な形でABCA1コレステロール流出を刺激したことの実証。パネルD−非極性表面にセリンまたはチロシンを持つペプチド(10μg/ml)は、ABCA1に依存する形で、すなわち、cAMPで処理したJ774細胞及び処理していないJ774細胞を使用して、高レベルのコレステロール流出を媒介する能力を保持した。パネルE−ペプチドT6991−2及びCS6253が、J774マクロファージからの完全長apoA−Iと同一の速度動態でコレステロール流出を刺激したことを示すデータ。ペプチド及びapoAIを、濃度10μg/mlの無脂質形態で使用した。値は、平均値SD、n=4である。
この実施例は、ペプチドCS6253及びT6991−2が高力価でABCA1を介して細胞コレステロール流出を刺激したことを実証する。(図28)。[3H]コレステロールで標識し、ABCA1発現を調節するためにcAMPで処理したJ774マクロファージ(右の棒)及び処理していないJ774マクロファージ(左の棒)を使用して、ペプチドのコレステロール流出活性を決定した。パネルA−Cit.ATI−5261のロイシン(CS6253)及びイソロイシン(T6991−2)形態は官能性であり、10μg/mlの濃度で、ABCA1に依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルB−ミカエリス・メンテン式(Graph−Pad Prism5ソフトウェア)を使用して計算した、ペプチド、apoA−I、apoE、及びapoE C末端(CT)ドメインについてのコレステロール流出力価(Km値)、ならびにcAMP処理したJ774細胞から得た流出データの要約。Km値を質量(μg/ml)またはモル基準(μM)で表す。後者は、CS6253及びT6991−2が、apoEの天然流出ドメイン(CT)と比較した場合に特に、近いアポリポタンパク質モル力価でコレステロール流出を刺激したことを示す。パネルC−T6991−2及びCS6253が極めて効率的な形でコレステロール流出を刺激し、3μg/mlでコレステロール流出の低Km及び飽和を示したことを実証する用量反応。
この実施例は、Cit.ATI−5261のロイシン形態が、マクロファージABCA1を安定させ、ABCA1に依存する形でコレステロール流出を刺激することを実証する。(図29)。J774マクロファージを実験に使用した。パネルA−細胞を、3Hコレステロールで標識(48時間)し、ABCA1発現を調節するためにcAMP類似体を用いて(右の棒)及び用いずに(左の棒)処理した。アポリポタンパク質(apo)A−I、E、apoEのC末端(CT)ドメイン、及びペプチドCS6253を無脂質形態で細胞に添加して(10μg/ml)、細胞コレステロール流出を開始させた。4時間後、流出した[3H]コレステロールについて培地をアッセイした。値及び平均値±SD、n=3。cAMPを使用したABCA1反応対cAMP非存在下の低反応に対して上方調節した細胞を使用した全アポリポタンパク質及びペプチドに高レベルのコレステロール流出が見られた。したがって、ペプチドCS6253は、天然アポリポタンパク質と同様にABCA1依存性コレステロール流出を刺激した。パネルB−cAMPによるJ774細胞の処理後のABCA1タンパク質発現を示す全細胞溶解液のウエスタンブロット(レーン1、t=0)。ABCA1が、後続の6時間の追跡の間、ペプチドCS6253(レーン4)またはapoA−I(レーン5)のいずれかの継続した存在下で高レベルで維持されたのに対し、ABCA1タンパク質は、無血清培地のみで分解された(レーン3)。これらのデータは、Cit.ATI−5261のロイシン形態が細胞膜中のABCA1タンパク質を安定させたことを示す。パネルC−CS6253:リン脂質複合体のABCA1依存性コレステロール流出活性。CS6253ペプチドとPOPCとの7〜8nmの小型の複合体を、コール酸塩透析によって調製し、cAMPを用いて及び用いて処理した[3H]コレステロール標識化J774細胞と共にインキュベートした。値は、平均値±SD、n=3である。POPCと複合体化した新しく安全なペプチドCS6253のコレステロール流出活性は、対応する親ATI−5261ペプチドと同一であったため、保持された官能性についての更なる補助データを提供する。
この実施例は、ペプチドCS6253が、天然ABCA1オリゴマー形態と相互作用して、細胞脂質流出及び新生HDL集合を媒介することを実証する(図30)。ABCA1によって安定してトランスフェクトしたBHK細胞または模擬トランスフェクトした対照細胞を、図5に記載のように、[3H]コレステロールで標識した。パネルA−ペプチドまたはapoA−Iのいずれかに対する抗体を使用した架橋アッセイ及びウエスタンブロット分析によって決定した、CS6253が、ATI−5261及びapoA−Iと同様に細胞膜中の天然形態のABCA1と相互作用したことの実証。パネルB−CS6253は、apoA−I及びATI−5261と同様に、高力価でABCA1を介してコレステロール流出を刺激した。パネルC−ペプチドは、天然PAGEによって決定した、apoA−Iと比較して同様のサイズの新生HDL粒子の集合を媒介した。データは、CS6253を例とする本発明の単一のαヘリックスペプチドが、コレステロール及びリン脂質流出を含むABCA1脂質流出を高力価で媒介し、新生HDL粒子の集合/構造を支持するのに十分であったことを示す。
この実施例は、リン脂質を用いて配合したペプチドCS6253が、SRB1を介してコレステロール流出を刺激したことを実証する(図31)。CS6253の可能性のある抗動脈硬化性機序を更に評価するために、細胞脂質流出媒介のためのSR−B1を主に発現するFu5AH細胞を、[3H]コレステロールで標識し、流出実験で使用した。POPCを用いて脂質化したCit.ATI−5261のロイシン形態(CS6253)を、50μgのペプチド/ml濃度の培地においてコレステロールアクセプターとして使用した。パネルA−SR−B1によって媒介されたコレステロール流出の経時変化。CS6253:POPCの複合体は、無脂質ペプチドの低い活性と対比して、高レベルのコレステロール流出を刺激し、これは、基質として脂質化アクセプター粒子を必要とするSR−B1の関与と一致する。パネルB−SR−B1を介した細胞コレステロール流出の媒介におけるCS6253とATI−5261との間の比較。[3H]コレステロール標識化Fu5AH細胞を、無脂質ペプチドかPOPCを用いて配合したペプチドかのいずれかと共にインキュベートした。CS6253:POPC複合体への比較的高レベルのコレステロール流出(4時間)が達成され、これは、ATI−5261:POPC複合体で得られたものを超越した。データは、リン脂質を持つペプチド製剤が、SR−B1を介したコレステロール流出の媒介において極めて効果的であるHDL様粒子をもたらしたことを示す。
この実施例は、リン脂質を用いて配合したペプチドCS6253が、ABCG1を介してコレステロール流出を刺激することを実証する(図32)。CS6253の可能性のある抗動脈硬化性機序を更に評価するために、ABCG1によって安定してトランスフェクトしたBHK細胞または模擬トランスフェクトした対照細胞を、[3H]コレステロールで標識し、流出実験で使用した。POPCを用いて脂質化したCit.ATI−5261のロイシン形態(CS6253)及びATI−5261を、50μgのペプチド/ml濃度の無血清培地でコレステロール流出アクセプターとして使用した。パネルA−細胞から無脂質CS6253ペプチドまたはCS6253:POPC複合体へのABCG1によって媒介されたコレステロール流出の経時変化。CS6253:POPCの複合体は、無脂質ペプチドの低い活性と対比して、高レベルのコレステロール流出を刺激し、これは、基質として脂質化粒子を必要とするABCG1の関与と一致する。パネルB−ABCG1を介した細胞コレステロール流出の媒介におけるCS6253とATI−5261との間の比較。[3H]コレステロール標識化BHK細胞(ABCG1対模擬トランスフェクト化、左の棒が対照BHK、右の棒がG1−BHK)を、無脂質ペプチドかPOPCを用いて配合したペプチドかのいずれかと共にインキュベートした。意外にも、比較的高レベルのコレステロール流出(4時間)がCS6253:POPC複合体を使用して観察されたのに対し、ATI−5261(遊離ペプチドまたはPOPC複合体)は活性が低かった。したがって、CS6253は、種々の細胞表面受容体を介したコレステロール流出を媒介するための安全性及び活性を含むいくつかの基準に基づいて、秀でたペプチドであることが証明された。
この実施例は、CS6253が、プレβ−HDLの形成を誘導し、ヒト血漿のコレステロール流出活性を強化することを示す。(図33)。CS6253が生物学的環境において抗動脈硬化効果を発揮するか否かを試験するために、ヒト血漿を無脂質ペプチドに曝露した(5分)。血漿中でのHDLとのCS6253の相互作用、及びコレステロール流出を刺激する血漿の活性を、後者には[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して評定した。パネルA−無脂質ペプチドで処理した血漿のコレステロール流出活性。ヒト血漿を、5分間300μg/mlのペプチドと共にインキュベートし(4℃)、無血清RPMI−1640培地中で1%に希釈し、すぐに[3H]コレステロール標識化J774細胞に添加した。ペプチド(CS6253またはATI−5261)で処理した血漿は、ビヒクルのみで処理した対照血漿(左の棒)と対比して、ABCA1を介した細胞からの(すなわち、cAMP処理した細胞からの(右の棒))コレステロール流出を刺激するより優れた資質を保有した。パネルB−CS6253によるヒト血漿処理後のプレβ HDLの誘導。血漿を少量のペプチド対内因性apoA−I(それぞれ1:10モル比)に曝露し、プレβ HDLの形成を2Dの非変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(NDGGE)及びウエスタンブロット分析によって評定した。左のパネルは、apoA−Iに対する抗体を使用して判断した、ペプチド処理していない血漿中のプレβ HDLの量(総HDLの5〜6%)を示す。右のパネルは、ペプチド処理したプレβ HDLの増加、及びα−移動性HDL種(apoA−I抗体)の対応する減少を示す。中央のパネルは、CS6253に対する抗体を使用して判断して、CS6253が血漿中のα−HDLと関連したことを例解する。結果は、CS6253が、α−HDLの表面からapoA−Iを動かして、プレβ HDL形成及びコレステロール流出活性を誘導したことを示す(パネルA)。結果は、全て内因性apoA−Iからなる真正プレβ HDL粒子の産生と一致する。
この実施例は、ペプチドT6991−2が、プレβ−HDLの形成を誘導し、ヒト血漿のコレステロール流出活性を強化することを実証する(図34)。T6991−2が生物学的環境において抗動脈硬化効果を発揮するか否かを試験するために、ヒト血漿を無脂質ペプチドに曝露した(5分)。血漿中のHDLとのT6991−2の相互作用、及びコレステロール流出を刺激する血漿の活性を、[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して評定した。パネルA−無脂質ペプチドで処理した血漿のコレステロール流出活性。ヒト血漿を、5分間300μg/mlのペプチドと共にインキュベートし(4℃)、無血清RPMI−1640培地中で1%に希釈し、すぐに[3H]コレステロール標識化J774細胞に添加した。ペプチド(T6991−2またはCS6253)で処理した血漿は、ビヒクルのみで処理した対照血漿(左の棒)と対比して、ABCA1を介した細胞からの(すなわち、cAMP処理した細胞からの(右の棒))コレステロール流出を刺激するより優れた資質を保有した。パネルB−T6991−2によるヒト血漿処理後のプレβ HDLの誘導。血漿を少量のペプチド対内因性apoA−I(それぞれ1:10モル比)に曝露し、プレβ HDLの形成を2Dの非変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(NDGGE)及びウエスタンブロット分析によって評定した。左の2つのパネル(すなわち、2回の実行)は、apoA−Iに対する抗体を使用して判断した、ペプチド処理していない血漿中のプレβ HDLの量(総HDLの約6%)を示す。右のパネルは、ペプチド処理したプレβ HDLの増加、及びα−移動性HDL種(apoA−I抗体)の対応する減少を示す。結果は、T6991−2が、ペプチドCS6253と同様に、ABCA1を介したコレステロール流出の媒介において機能的である血漿中のプレβ HDL粒子を誘導したことを示す。
この実施例は、CS6253がハムスターにおけるインビボでのプレβ HDL形成を誘導することを実証する(図35)。マウスよりもよりヒト様のHDL代謝を有することで知られるゴールデンシリアンハムスターに、高脂肪の西洋食を4週間与え、30mg/kgの無脂質CS6253ペプチドを皮下(SC)注射した。注射後1、2、及び4時間で、apoA−Iに対する抗体を使用する天然2D PAGE及びウエスタンブロット法によるプレβ HDLレベルの分析のために、血漿を採取した。パネルA−ビヒクル対照注射(4時間の時点)について及びペプチド(1、2、及び4時間)についてのプレβ1 HDL(左の棒)及び主要なα−HDL移動性種(右の棒)として、HDL種の分布を示す棒グラフ。対照と対比してペプチド治療でプレβ1 HDLの大規模な増加(約8倍)が観察され、これは、CS6253がインビボにおいてHDLと相互作用し、HDLを好ましく調節することが可能であることを示す。パネルB−PBS対照及びCS6253注射についてのHDL亜種の分布を示す2D−PAゲル(天然)の代表的なウエスタンブロット(apoA−I抗体)(4時間データ)。パネルC−ゴールデンシリアンハムスターにおけるペプチド治療によるわずかなHDL増加及びLDL低下についての用量反応。ハムスターに、10、30、及び100mg/kgのペプチドをSC注射し、4時間後にPBS(n=群当たり3)及び血漿を採取した。遠心分離によるアルブミンの除去の後、血漿を注射し、リポタンパク質を気相示差電気泳動高分子移動度に基づく方法(イオン移動度またはIM)(Caulfield et al.Clin Chem 2008 54:8 1307−16)によって分離した。プレβ HDL増加についての用量反応は、LDL粒子、特にサイズの小さいLDL粒子と関連付けられた。
この実施例は、ラットにおけるCS6253の半減期を示す(図36)。S26→Y置換を用いてCS6253を設計して、125I(配列は図の上部)による標識化を促進した。その後、放射性標識したペプチドを、固形飼料を与えた雄のウィスターラットに種々の投与経路によって注射し、その血漿中の取り込みを定量化した。パネルA−125I−CS6253の注射後の血漿からのクリアランス動態。表(右)は、クリアランス曲線から計算したCS6253の半減期、及び注射した用量の%としてのその生物学的利用能を示す。パネルB−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したCS6253のY26形態のコレステロール流出活性。ペプチドは官能性であり、親CS6253ペプチドと同様の濃度(10μg/ml)で、ABCA1に依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルC−ペプチドが高い効率でコレステロール流出を刺激し、3μg/mlでコレステロール流出の低Km及び飽和を示したことを実証する用量反応。
この実施例は、T6991−2及びCS6253が、インビボにおける便へのマクロファージコレステロール逆輸送(RCT)を刺激したことを示す(図37)。アセチル化LDL(100μg/ml)を充填し、[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージ泡沫細胞を、10または30mg/kgの用量で、ビヒクルのみ(PBS)または指示された無脂質ペプチドと共に、生後4ヶ月の雄のアテローム性動脈硬化性apoE欠乏(apoE−/−)マウスにIP注射した。[3H]ステロールの評定のために24時間で便を採取した。パネルA及びB−PBSビヒクル治療群と比較したT6991−2注射に反応しての[3H]ステロールの排出。結果を、便1グラム当たりのdpmとして(パネルA)、または注射した[3H]コレステロールの%として(B)表した。パネルC−CS6253に反応しての[3H]ステロールの排出。平均してペプチドは、マクロファージ特異的コレステロール逆輸送を増大させた。値は、平均値±SD、n=群当たり4マウスである。
この実施例は、CS6253がapoE−/−マウスにおいて相当なアテローム性動脈硬化症を減少させたことを示す。(図38)。生後8週の雄のapoE−/−マウスに高脂肪の西洋食を14週間与えた。次いで、マウスを、6週間48時間間隔でビヒクルのみ(左の棒)のIP注射を受ける対照群、または無脂質ペプチド(30mg/kg)のIP注射を受ける群のいずれかに任意抽出した。ATI−5261ペプチドを含有するロイシンの2つのシトルリン形態を評価した。T5460−1(中央の棒)は単一のR3→シトルリン置換を保有するT5237−1と同等であり、T5460−2(右の棒)はR3、14→シトルリンを保有するCS6253(すなわち、T5237−4)と同等であった(図18を参照されたい)。Oil−Red O染色によって決定した、脂肪性病変で覆われた全大動脈の範囲を示す。値は、平均値±SD、n=群当たり10マウスである。
この実施例は、CS6253の低用量投与がapoE−/−マウスにおいて相当なアテローム性動脈硬化症を減少させたことを示す(図39)。生後8週の雄のapoE−/−マウスに高脂肪の西洋食を14週間与えた。次いで、マウスを、10週間48時間間隔でビヒクルのみ(左の棒)のIP注射を受ける対照群、または無脂質CS6253(10mg/kg、右の棒)のいずれかに任意抽出した。Oil−Red O染色によって決定した、脂肪性病変で覆われた全大動脈の範囲を示す。値は、平均値±SD、n=群当たり10マウスである。
この実施例は、皮下(SC)投与したCS6253も、apoE−/−マウスにおいて相当なアテローム性動脈硬化症を減少させたことを示す。(図40)。生後8週の雄のapoE−/−マウスに高脂肪の西洋食を14週間与えた。1つの群は、基準値対照として治療開始前に終了した。次いで、マウスを、ビヒクルのみ、30mg/kgのCS6253、または60mg/kgのCS6253皮下(SC)注射を6週間隔日で受ける3部門のうち1つに任意抽出した。最初の4治療週の間は、マウスは高脂肪の西洋食を続け、最後の2週の間は、固形飼料食に切り替えた。Oil−Red O染色によって決定した、脂肪性病変で覆われた全大動脈の範囲を示す。値は、平均値±SD、n=群当たり10マウスである。
この実施例は、ステープルペプチドがABCA1依存性コレステロール流出を媒介するように設計し得ることを示す。
この実施例は、例解的な本発明のペプチドの血中グルコース低下特性を例解する。
この実施例は、CitATI−5261のロイシン形態が、種々のアミノ酸置換を支持して、安全かつ効果的なペプチドを創出することを例解する(図47)。ATI−5261の類似体を、10位、13位、16位、20位にイソロイシン(I)、ならびに/または3位及び14位にシトルリン、同様にC末端KS残基を欠くより短い24−merを用いて、創出した(配列−図47の上部、すなわちペプチドのT7983シリーズ)。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。特定の位置において種々の組み合わせでシトルリン、ロイシン、及びイソロイシンを有する全ペプチドは、安全であり、TG上昇効果をほとんどまたは全く示さなかった。
この実施例は、ロイシン置換またはイソロイシン置換のいずれかを持つCitATI−5261の脂肪族形態が、コレステロール流出活性を保持し、マウスにおいて血中グルコースを減少させることを例解する(図48)。試験したペプチドは図47から、すなわち、T7983シリーズであった。パネルA−[3H]コレステロールで標識し、ABCA1発現を調節するためにcAMPで処理したJ774マクロファージ(右の棒)及び処理していないJ774マクロファージ(左の棒)を使用して、ペプチドのコレステロール流出活性を決定した。ロイシン、イソロイシン、及び/またはシトルリン置換を持つペプチド類似体は官能性であり、10μg/mlの濃度で、ABCAに依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルB−T7983ペプチド300mg/kgの単回IP注射後の、図47で使用したC57Bl/6マウス(固形飼料を与えた)の血中のグルコース濃度。ほぼ全ての試験したペプチドが、単回注射後の血中グルコースレベルを減少させた。
この実施例は、漸増する数のイソロイシン残基を持つCS6253の類似体が安全かつ効果的であることを例解する(図49)。漸増する数のイソロイシン残基を、疎水性のペプチドの長さを下った異なる場所でのL→I置換によってCS6253中に体系的に導入した(配列−図49の上部、すなわちペプチドのT8212シリーズ)。パネルA−安全性及びTG上昇効果を、図5に記載のように、固形飼料を与えた雄のC57Bl/6マウスにペプチド(300mg/kg)を注射(IP)することによって評価した。値は、平均値SD、n=4である。特定の位置において種々の組み合わせのロイシン及びイソロイシンを有する全ペプチドは、安全であり、TG上昇効果をほとんどまたは全く示さなかった。
この実施例は、漸増するイソロイシン置換を持つCS6253の脂肪族形態が、コレステロール流出活性を保持し、マウスにおいて血中グルコースを減少させることを例解する(図50)。試験したペプチドは図49から、すなわち、T8212シリーズであった。パネルA− C[3H]コレステロールで標識し、ABCA1発現を調節するためにcAMPで処理したJ774マクロファージ(右の棒)及び処理していないJ774マクロファージ(左の棒)を使用して、ペプチドのコレステロール流出活性を決定した。漸増するイソロイシン置換を持つペプチド類似体は官能性であり、10μg/mlの濃度で、ABCAに依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルB−Rつまたは2ついずれかのL→I置換を持つ代表的なCS6253ペプチドは、濃度に依存する形かつ高力価で、ABCA1コレステロール流出を刺激する。cAMPで処理したJ774マクロファージを使用して結果を得た。パネルC−T8212ペプチド300mg/kgの単回(IP)注射後の、図49で使用したC57Bl/6マウス(固形飼料を与えた)の血中のグルコース濃度(左の棒が4時間、右の棒が6時間)。ほぼ全ての試験したペプチドが、単回注射後、PBSと比較して血中グルコースレベルを減少させた。
この実施例は、CS6253及びT6991−2が、C57Bl/6マウスにおけるグルコースチャレンジの際に血中グルコース濃度を低下させる(図51)。固形飼料食の雄の絶食C57Bl/6マウスは、図5で安全性研究について記載したように、ビヒクルのみまたは300mg/kgの無脂質ペプチドのいずれかの単回腹腔内(IP)注射を受けた。治療の後、グルコース2g/kgのIP注射によるグルコース負荷試験を行った。指定された時間で尾静脈から血液を採取し、グルコメータを使用して血中グルコースを測定した。パネルA及びB−それぞれ、曲線下の対応する領域と共にグルコースチャレンジ後の経時的な質量値として表した血中グルコース濃度。(棒グラフ、パネルB、棒は左から右にそれぞれ、PBS、CS6253、T699102、2、4、5、6、及び9)値は、平均値±SD、n=群当たり4マウスである。10位、13位、16位、及び20位に全ロイシン(CS6253)または全イソロイシン(T6991−2)のいずれかを持つATI−5261の2つのシトルリン形態は、グルコースチャレンジの際に血中グルコース濃度を低下させた。対照的に、種々の組み合わせのロイシン及びイソロイシン残基を持つペプチド2、4、5、6、及び9(図49中の配列T8212−2、T8212−4、T8212−5、T8212−6、及びT8212−9に対応する)は、血中グルコース反応の低下における活性が低かった。総じてこれらのデータは、HDL模倣ペプチドの長さを下った重要な位置にロイシンまたはイソロイシンのいずれかを均質に使用することが、極めて有効な抗糖尿病性化合物の創出における因子であることを示す。
この実施例は、ラットにおけるCS6253及びT6991−2の血漿クリアランスを例解する(図52)。図36に記載のように、S26→Y置換を用いて両ペプチドを設計して、125Iによる標識化を促進した。放射性標識したペプチドを、固形飼料を与えた雄のウィスターラットにIP注射し、その出現及び後続の血漿からのクリアランスを定量化した。パネルA−両ペプチドについておよそ7.5時間の血漿半減期を示す、125I−CS6253または125I−T6991−2ペプチドの注射後の血漿動態。パネルB−注射後6及び24時間の125Iペプチドの組織分布(CS6253=左の棒、T6991−2=右の棒)。少量の両ペプチドが脳中に出現し、それが経時的に増加したことに留意されたい。パネルC−[3H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを使用して決定したT6991−2及びそのY26類似体(T7983−11)のコレステロール流出活性(ABCA依存性流出を右の棒に示す)。ペプチドは官能性であり、濃度(10μg/ml)で、ABCA1に依存する形で、高レベルのコレステロール流出を媒介した。パネルD−T6991−2及びそのY26類似体(T7983−11)が高い効率でコレステロール流出を刺激し、3μg/mlでコレステロール流出の低Km及び飽和を示したことを実証する用量反応。
この実施例は、本発明のペプチドがマウスにおいて脳のABCトランスポーターを増加させることを例解する。ペプチドT6991−2の全身投与がマウスにおいて脳のABCトランスポーターを増加させたことを示す例解的なデータを、図53に提供する。T6991−2:EVC*SKLEEWIAAIC*EIAEEILARLKS、(C*)、ATI−5261のイソロイシン形態を、1日1回5週間、30mg/kg/48時間で、ApoE3マウスにIP投与した。終了時に、海馬を、ELISAによって、ABCA1、ABCG1、及びapoEについて評定した。T6991−2(右の棒)は、PBS(左の棒)と比較して、その濃度(p<0.05)を有意に増大させた。
この実施例は、本発明のペプチドが、ヒトapoE3及びE4代置マウスモデルを使用して、脳のapoEレベル及び脂質化を増大させることを例解する。CS6253またはT6991−2のいずれかの全身投与が脳のapoEレベル及び脂質化を増大させたことを示す例解的なデータを、図54に提供する。T5237−4(すなわちCS6253):EVC*SKLEEWLAALC*ELAEELLARLKS(C*=シトルリン)、ATI−5261のロイシン形態、及びT6991−2:EVC*SKLEEWIAAIC*EIAEEILARLKS、(C*)、ATI−5261のイソロイシン形態を、5週間、30mg/kg/48時間のIPで、ヒトapoE3(huApoE3)及びE4(huApoE4)代置マウスに投与し、PBSと比較した(n=群当たりのマウス)。すなわち「AD研究」である。終了時に、海馬をapoEタンパク質レベル(SDSゲル)及び脂質化(天然ゲル)について評定した。パネルA−ペプチド治療による、及びそれらの各マウスモデルにおけるapoEタンパク質の相対レベル、すなわちE3対E4タンパク質を示す代表的なブロット。パネルB及びC−それぞれ、E3マウス(無色の棒)対E4マウス(塗りつぶした棒)における脂質化apoEタンパク質(天然)及び総apoEタンパク質のレベル(SDS−PAGE)。脂質化apoEは、対応するレベルのhuApoE4よりも、huApoE3マウスにおいて著明に高かった。ペプチド、特にCS6253は、T6991−2で治療したマウスの対応する試料に対して脂質化apoE4の量を増大させた。T6991−2は、huApoE3マウスにおいてapoEレベルを増大させた。
この実施例は、本発明のペプチドの全身投与が、マウスの脳中でP−tau及びアミロイドβ42を減少させたことを例解するデータ(図55)を提供する。実施例39及び図54に記載したAD研究の終了時に、海馬のCA3領域をP−Tau(AT−8 a.b.)及びアミロイドβ42について評定した。huApoE4マウス中では、CS6253は、PBSと比較して、P−Tau(p<0.001)及びアミロイドβ42(p=0.04)を著明に減少させた。ペプチドT6991−2も、huApoE3及びhuApoE4マウス両方において、P−Tau及びアミロイドβ42を減少させた。
この実施例は、本発明のペプチドの全身投与が、E4表現型を逆転させたことを例解するデータを提供する。CS6253またはT6991−2の全身投与が、抑圧されたVGlut1及びapoE受容体2に関する病理的apoE4表現型を逆転させたことを示す例解的なデータを、図56に提供する。実施例39の図54に記載したAD研究の終了時に、海馬のCA3領域をVGlut1(グルタミン酸作動性ニューロン)及びapoE受容体2について評定した。両ペプチドは、PBSと比較して、huAapoE4マウスのVGluT1及びapoER2のレベルにおける欠乏を逆転させた。
Claims (24)
- コレステロール流出活性を有する単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、非極性表面及び極性表面を有する両親媒性αヘリックスである、長さが24アミノ酸であるアミノ酸配列を含み、前記極性表面が、脂質/水界面に荷電及び非荷電アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸配列が、
配列番号1を参照して決定される、1位、7位、8位、15位、18位、及び19位に、酸性アミノ酸残基を含み、
配列番号1を参照して決定される、2位、6位、9位、10位、13位、16位、17位、20位、21位、及び24位に、疎水性アミノ酸を含み、
配列番号1を参照して決定される、3位、14位、及び23位のうち少なくとも2つに、非荷電アミノ酸残基を有し、ここで、3位、14位、及び23位の第3の位置がRまたはKであり;及び非荷電アミノ酸残基の少なくとも1つがシトルリンであり、及び
配置番号1と少なくとも90%の同一性を有し、または配置番号2と少なくとも90%の同一性を有する、前記単離ポリペプチド。 - 前記3位、14位、及び23位のうちの2番目にある前記非荷電アミノ酸残基が、極性非荷電アミノ酸残基である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、25位がKまたはNであり、26位がSまたはYである、25位及び26位を更に含む、請求項1または2に記載の単離ポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、3位、14位、及び23位のうち2つにシトルリンを有する、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- シトルリンを有する前記2つの位置が、3位及び14位である、請求項4に記載の単離ポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、3位、14位、または23位に、Q、N、L、V、I、もしくはAを有し、または3位、14位、または23位に、QもしくはNを有する、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 2位、6位、10位、13位、16位、17位、20位、及び24位にある残基のうち4つ、5つ、6つ、7つ、または8つ全てが、脂肪族アミノ酸である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
- 前記脂肪族アミノ酸が、L、V、A、及びIからなる群から選択される、請求項7に記載の単離ポリペプチド。
- 10位、13位、16位、及び20位にある前記残基が、L、I、及びVからなる群から選択される、請求項7に記載の単離ポリペプチド。
- 10位、13位、16位、及び20位にある前記残基がIであるか、または10位、13位、16位、及び20位にある前記残基がLである、請求項7に記載の単離ポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号1と少なくとも90%の同一性を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号2と少なくとも90%の同一性を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが配列番号1または配列番号2を含む、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、保護基を更に含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
- 前記保護基が、アセチル(Ac)、アミド、3〜20個の炭素のアルキル基、Fmoc、t−ブトキシカルボニル(Tboc)、9−フルオレンアセチル基、1−フルオレンカルボキシル基、9−フルオレンカルボキシル基、9−フルオレノン−1−カルボキシル基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4−メチルトリチル(Mtt)、4−メトキシトリチル(Mmt)、4−メトキシ−2,3,6−トリメチル−ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン−2−スルホニル(Mts)、4,4−ジメトキシベンズヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(Pmc)、4−メチルベンジル(MeBzl)、4−メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル(Npys)、1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6−ジクロロベンジル(2,6−DiCl−Bzl)、2−クロロベンジルオキシカルボニル(2−Cl−Z)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−Br−Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、シクロへキシルオキシ(cHxO)、t−ブトキシメチル(Bum)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu)、及びトリフルオロアセチル(TFA)からなる群から選択される保護基である、請求項14に記載の単離ポリペプチド。
- 前記保護基が、アミノまたはカルボキシ末端に連結される、請求項14または15に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記アミノ末端に連結された第1の保護基、及び前記カルボキシ末端に連結された第2の保護基を含む、請求項14または15に記載の単離ポリペプチド。
- 前記第1の保護基がアセチルであり、及び前記第2の保護基がアミドである、請求項17に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ペプチドが、鏡像異性D型アミノ酸を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 脂質と複合体化している、請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
- 哺乳動物における、コレステロール流出を媒介し、アテローム性動脈硬化症の症状を治療し、内腔壁における不安定プラークを安定させ、グルコースレベルを低下させ、またはアルツハイマー病の症状を治療または予防するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、前記医薬組成物。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記ヒトがApoE4対立遺伝子を有する、請求項23に記載の医薬組成物。
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