NL1019540C2

NL1019540C2 - Werkwijze voor het detecteren van auto-antilichamen van patienten die lijden aan reumatoïde artritis, peptide en assaykit.

Info

Publication number: NL1019540C2
Application number: NL1019540A
Authority: NL
Inventors: Jan Wouter Drijfhout; Waltherus Jacobus Wil Venrooij; Martinus Adrianus Maria Boekel; Gerardus Jozef Maria Pruijn
Original assignee: Stichting Tech Wetenschapp
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2003-07-01
Also published as: EP1693673A3; BRPI0214872B8; HK1072805A1; AU2010200648B2; DE60212186D1; BR0214872A; US10119966B2; US20070087380A1; WO2003050542A3; EP1456662B1; AU2002354397A1; SI1456662T1; PT1456662E; US20170269078A1; US9689871B2; JP2005512092A; CN101408546A; CA3076702C; EP1456662A2; AU2002354397B2

Description

Werkwijze voor het detecteren van auto-antilichamen van patiënten die lijden aan reumatoïde artritis, peptide en as-saykit

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detecteren van auto-antilichamen van patiënten die lijden aan reumatoïde artritis onder gebruikmaking van een peptide dat een citrullineresidu of derivaat daarvan 5 bevat.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit de Internationale octrooiaanvrage PCT/NL97/00624. Deze publicatie beschrijft het gebruik van peptiden welke zijn afgeleid van fi-laggrine en welke citrulline of een derivaat daarvan bevatten 10 voor de detectie van auto-antilichamen van patiënten die lijden aan reumatoïde artritis. De gebruikte peptiden zijn derhalve geschikt voor diagnostische toepassingen en maken, in vergelijking met tot dan toe bekende technieken, een meer betrouwbare detectie mogelijk. Meer in het bijzonder betreft 15 dit een verlaagd aantal vals-positieven, derhalve een hogere specificiteit. Verder is de gevoeligheid (sensitiviteit) relatief hoog. Eén peptide, aangeduid als cfcl, werd herkend door 36% van de sera van patiënten die lijden aan reumatoïde artritis. De cyclische variant van het peptide bleek nog be-20 ter te worden herkend (63%).

Een werkwijze volgens de aanhef is ook bekend uit de Internationale octrooiaanvrage PCT/FR00/01857. Deze publicatie beschrijft het gebruik van peptiden welke zijn afgeleid van fibrine en welke citrulline of een derivaat daarvan be-25 vatten voor de detectie van auto-antilichamen van patiënten die lijden aan reumatoïde artritis.

Beide werkwijzen detecteren echter nog steeds slechts een beperkt deel van alle patiënten die lijden aan reumatoïde artritis. Er is derhalve een sterke behoefte aan 30 een werkwijze waarmee met een in hoofdzaak gelijke of zelfs verbeterde specificiteit een hogere gevoeligheid kan worden bereikt.

Voor het bereiken van dit doel verschaft de onderhavige uitvinding een werkwijze van de in de aanhef genoemde 10195 4 0 2 soort, welke werkwijze wordt gekenmerkt doordat een monster waarvan wordt gedacht dat het de auto-antilichamen kan bevatten in contact wordt gebracht met een peptide-eenheid die het motief XG bevat, en met een peptide-eenheid die het motief 5 XnonG bevat, waarbij X een citrullineresidu of een derivaat daarvan is, en nonG elk aminozuur anders dan glycine is; gedurende een tijd die toereikend is voor het vormen van een complex tussen de peptide-eenheden en auto-antilichaam, waarna het complex wordt gedetecteerd, 10 onder de voorwaarde dat - de peptide-eenheid met het XnonG een deel omvat dat niet is afgeleid van (pro)filaggrine, fibrine, of fibrinogeen; waarbij van elke peptide-eenheid optioneel - een of meer aminozuren de D-configuratie kunnen hebben, 15 - een of meer zij ketens (anders dan die van citrulline of een derivaat daarvan) of terminale uiteinden van de peptide-eenheid onafhankelijk van elkaar geacetyleerd, geglycosy-leerd, gealkyleerd, of gefosforyleerd kunnen zijn, en - een of meer aminozuren kunnen zijn vervangen door niet-20 natuurlijke aminozuren.

Verrassenderwijze is gebleken dat peptiden welke geen of slechts een beperkte homologie vertonen met, en overeenkomstig de bewoording van de onderhavige aanvrage niet zijn afgeleid van, (pro)filaggrine, fibrine en fibrinogeen 25 bij de combinatie volgens de uitvinding een verder verbeterde diagnostische werkwijze oplevert. Meer in het bijzonder maakt een dergelijke combinatie van peptide-eenheden het mogelijk een zeer hoge sensitiviteit, onder behoud van een uitstekende specificiteit mogelijk te maken. Dit is des te verrassender 30 aangezien de XnonG (hierna ook wel aangeduid als CitnonG, waarbij Cit zowel citrulline als het gedefinieerde derivaat ervan kan zijn) peptide-eenheid geen van (pro) f ilaggrine, fibrine of fibrinogeen afgeleid peptide is. Dat wil zeggen dat de homologie (het identiek zijn van de aminozuurvolgorde) met 35 deze eiwitten voor een door auto-antilichamen herkende peptide-eenheid minder is dan 85%, met meer voorkeur minder dan 70%, en met de meeste voorkeur minder dan 60%. De in tabel 5 gespecificeerde niet van (pro)filaggrine, fibrine en fibrino- 3 geen afgeleide peptide-eenheden hebben een homologie tussen 15 en 45%. Bij het bekijken van de homologie worden arginine, citrulline en derivaten van citrulline als equivalent beschouwd. Daarenboven geldt dat, bij voorkeur, van een derge-5 lijke peptide-eenheid met het XnonG motief, welke peptide-eenheid volgens de uitvinding ten minste 7 aminozuren lang is, een tripeptide deel uitmaakt, dat als centraal aminozuur citrulline of een derivaat daarvan, en aan de carboxyzijde ervan een aminozuur anders dan glycine heeft. Dit tripeptide 10 dient bij voorkeur een homologie te vertonen met (pro)filaggrine, fibrine en fibrinogeen van minder dan 67%. Daarbij is het tripeptide bij voorkeur gekozen uit QXX, XXK, XXY, LXR, KRI, MXR, RXY, WXK, MXH, VXK, YXR, NXR, QXR, WXS, RXW, en PXW. De het XG motief bevattende peptide-eenheid, die 15 ook ten minste 7 aminozuren lang is, is al dan niet van (pro)filaggrine, fibrine of fibrinogeen afgeleid, en doelmatig het uit PCT/NL97/00624 bekende cfcl. De peptide-eenheden kunnen al dan niet deel uitmaken van hetzelfde molecuul. Hierop zal hierna nog worden ingegaan. De peptide-eenheden 2 0 kunnen voor het uitvoeren van een detectieassay aan een drager zijn gebonden, en al dan niet zijn voorzien van een label . De detectie van het complex kan op elke voor de gewone vakman welbekende wijze geschieden. Hierbij kan de detectie van het complex indirect geschieden, bijvoorbeeld in geval 25 van een competitie-assay, waarbij het complex zelf niet is gelabeld. Deze aanvrage beoogt niet een publicatie te zijn voor opleiding tot vakman. Derhalve beperkt het zich tot het verschaffen van de informatie die voor de gewone vakman toereikend is om de uitvinding te begrijpen, na te werken, en de 30 beschermingsomvang te bevatten. De peptide-eenheden worden bij voorkeur door ten minste 2 van 100 a-selecte sera van bekende RA patiënten herkend. Vanzelfsprekend worden bij voorkeur peptide-eenheden gebruikt die door een aanzienlijk hoger percentage worden herkend, bij voorkeur ten minste 30%. Het 35 aantal peptide-eenheden is bij voorkeur groter dan 2. In de onderhavige aanvrage wordt onder een niet-natuurlijk aminozuur een aminozuur verstaan zoals dat voorkomt in een retro-inverso peptide, retro-peptide, een peptide waarbij de zijke- 4 ten zich op het amide-stikstofatoom bevindt van het peptide-skelet, en een peptide waarbij een CO van het peptideskelet is vervangen door 2, 3 of bij voorkeur een -CH2- groep (pseudo-peptide) . Niet voor herkenning kritische aminozuren kunnen 5 zijn gemodificeerd. Zo kunnen carbonzuurgroepen zijn veres-terd of tot een amide zijn omgevormd, en aminogroepen kunnen zijn gealkyleerd, bijvoorbeeld gemethyleerd. Ook kunnen op het peptide aanwezige functionele groepen zijn voorzien van een beschermgroep of een label (bijvoorbeeld een fluorescent 10 of radioactief label). Aminogroepen en carbonzuurgroepen in het peptide kunnen aanwezig zijn in de vorm van een zout, gevormd onder gebruikmaking van een zuur of base. Wanneer gebruik wordt gemaakt van synthetische peptiden is het zeer eenvoudig allerlei varianten te maken die binnen het kader 15 van de uitvinding vallen en kunnen worden toegepast. Zo kunnen aromatische zijgroepen, zoals van fenylalanine en tyrosine zijn gehalogeneerd met een of meer halogeenatomen. Pepti-domimetische en organomimetische uitvoeringsvormen vallen ook binnen het kader van de uitvinding, en de toepassing daarvan 20 in de werkwijze volgens de uitvinding. Bij voorkeur betreft de uitvinding een werkwijze als bovengenoemd, waarbij elke peptide-eenheid door ten minste 2% van een reeks sera van patiënten wordt herkend; en de peptide-eenheid met het XG motief en de peptide-eenheid 25 met het XnonG motief gezamenlijk door ten minste 10% van de reeks sera van patiënten wordt herkend.

Uit PCT/EP98/07714 is een enkel, van filaggrine afgeleid CitnonG peptide (IPG1249) bekend. Het is kruisreactief met 3,3% van de sera van SLE patiënten en heeft een homologie 30 van 82% met filaggrine.

Bij voorkeur is nonG een aminozuur gekozen uit Η, I, W, S, R, K, Y, Cit of een derivaat daarvan.

Dergelijke CitnonG peptide-eenheden blijken, zoals uit de onderstaande experimenten zal blijken, zeer doelmatig.

35 Bij voorkeur is ten minste een van de peptide- eenheden een cyclische peptide-eenheid.

Aldus kan de sensitiviteit van de detectie worden verhoogd.

r 0 * * o 5

Bij voorkeur maken de peptide-eenheid met XG motief en de peptide-eenheid met XnonG motief deel uit van een mul-tipeptide.

Een multipeptide is, binnen het kader van de onder-5 havige uitvinding, een molecuul opgebouwd uit ten minste twee antigene peptide-eenheden, d.w.z. combinaties van peptide-eenheden die al dan niet op covalente wijze met elkaar zijn verbonden. Dergelijke multipeptiden kunnen zijn opgebouwd uit lineaire, vertakte, cyclische peptide-eenheden of een combi-10 natie daarvan zijn. Multipeptiden kunnen zowel zijn opgebouwd uit peptide-eenheden met dezelfde aminozuurvolgorde, als uit peptide-eenheden met verschillende aminozuurvolgorden. Een multipeptide volgens de uitvinding omvat ten minste 10 aminozuren, dat wil zeggen dat de peptide-eenheden elkaar kunnen 15 overlappen. Het XG en XnonG motief kunnen elkaar daarbij, vanzelfsprekend, niet overlappen.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een peptide, zeer bruikbaar voor de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, dat een volgorde omvat met de formule (II) : 20 (A1-A2-A3-A4-A5) -Cit- (A6) - (A7-A8-A9-A10-A11) (II) waarbij - A1-A2-A3-A4-A5 een aminozuurvolgorde voorstelt gekozen uit

- RHGRQ

- IRCitYK

25 - HGRQCit - GRQCitCit

- FQMCitH

- CitWRGM

- ARFQM

30 - QCitYKW

- KPYTV

- RNLRL

- RRRCitY

- RFKSN

35 - RGKSN

- RWVSQ

- MKPRY

- KSFVW

6

- YSFVW

- FQMRH

- RNMNR

- RMGRP

5 en homologe volgorden ervan; - Cit een citrullineresidu of een derivaat daarvan voorstelt, waarbij het derivaat als zijketen een groep heeft met de formule (I)

Q Y

10 \ //

C

Z (I) 15 (CH2)n waarbij Q = NH2, CH3, NHCH3 of N(CH3)2; Y = O, NH, of NCH3; 20 Z = 0, NH of CH2; en n = 2, 3 of 4; onder de voorwaarde dat wanneer Q = NH2 en Z = NH, Y geen NH is; - A6 een aminozuur voorstelt anders dan glycine; 25 - A7-A8-A9-A10-A11 een aminozuurvolgorde voorstelt gekozen uit

- KYIIY

- TNRKF

- KWCitKI

30 - CitRAVI

- RCitGHS

- CitGRSR

- CitYIIY

- CitRLIR

35 - IERKR

- FMRKP

- FMRRP

- ERNHA

7

- AVITA

- TPNRW

- TYNRW

- RTPTR

5 - RIVW

- HARPR

- RGMCitR

- IRFPV

en homologe volgorden ervan; 10 alsmede derivaten van het peptide met de formule (II) waarbij de term "homologe volgorde", zoals gebruikt in samenhang met A1-A2-A3-A4-A5 en A7-A8-A9-A10-A11, betekent dat ten hoogste twee aminozuren van elke aminozuurvolgorde kunnen zijn vervangen 15 door evenzoveel andere aminozuren (daaronder begrepen ci- trulline of een derivaat daarvan), ten hoogste twee aminozuren (daaronder begrepen citrulline of een derivaat daarvan) kunnen zijn ingebracht, en ten hoogste twee aminozuren kunnen ontbreken; 20 -'derivaat' zoals gebruikt in samenhang met het peptide met de formule (II) betekent dat optioneel een of meer aminozuren de D-configuratie kunnen hebben, een of meer zijketens (anders dan die van citrulline of een derivaat daarvan) of terminale uiteinden van het peptide 25 onafhankelijk van elkaar geacetyleerd, geglycosyleerd, ge-alkyleerd, of gefosforyleerd kunnen zijn, en een of meer aminozuren kunnen zijn vervangen door niet-natuurlijke aminozuren.

Bij voorkeur is A6 gekozen uit Cit, Η, I, K, R, S, W

30 en Y.

Specifieke voorkeurspeptiden voor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding worden hierdoor gekenmerkt dat deze een peptide-volgorde omvatten gekozen uit R H G R Q Cit Cit K Y I I Y

35 I R Cit Y K Cit I T N R K F

R H G R Q Cit Cit Cit Y I I Y

A R F Q M Cit H Cit R L I R

Q Cit Y K W Cit K I E R K R

o 1 ·.,4 J

8 K P Y T V Cit Κ F Μ R Κ Ρ κ Ρ Υ τ V Cit Κ F Μ R R Ρ

RNLRL Cit R Ε R Ν Η A R R R Cit Υ Cit R A V I Τ A 5 R F K S N Cit R Τ Ρ N R W

R G K S N Cit R Τ Y N R W

R F K S N Cit R Τ Y N R W

R G K S N Cit R Τ Ρ N R W

R W V S Q Cit R R Τ Ρ T R

10 Μ Κ P R Y Cit R R I V V V

K S F V W Cit S H A R P R

Y S F V W Cit S H A R P R

R Ν Μ N R Cit W R G M Cit R, en R M G R P Cit W I R F Ρ V.

15 Geschikte XG peptiden voor toepassing bij de werk- wij ze volgens de uitvinding omvatten bij voorkeur de volgorde met de formule (III) (B1-B2)-(B3-B4-B5)-X-G-B6-(B7-B8-B9-B10) (III) 20 waarbij B1-B2 HQ, GF, EG of GV voorstelt; B3-B4-B5 3 aminozuren voorstellen waarvan er ten minste 1, en bij voorkeur 2 onafhankelijk van elkaar, basisch, aromatisch 25 of V zijn; B6 gelijk is aan een basisch of aromatisch aminozuur, of gelijk is aan A, Cit of derivaat daarvan, G, Ε, Ρ, V of S; en B7-B8-B9-B10 SRAA, SCitAA, RPLD, RWE of PGLD is; alsmede derivaten van het peptide met de formule (III) 30 waarbij de term - 'derivaat' zoals gebruikt in samenhang met het peptide met de formule (III) betekent dat optioneel - een of meer aminozuren de D-configuratie kunnen hebben, - een of meer zijketens (anders dan die van citrulline of een 35 derivaat daarvan) of terminale uiteinden van het peptide onafhankelijk van elkaar geacetyleerd, geglycosyleerd, ge-alkyleerd, of gefosforyleerd kunnen zijn; en een of meer aminozuren kunnen zijn vervangen door niet- 9 natuurlijke aminozuren.

Specifieke voorbeelden van XG peptiden geschikt voor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding omvatten een volgorde gekozen uit 5 H Q R K W Cit G A S R A A

H Q H W R Cit G A S R A A

H Q F R F Cit G Cit S R A A H Q E R R Cit G E S R A A

H Q K W R Cit G F S R A A

10 H Q R W K Cit G G S R A A

H Q R R T Cit G G S R A A

H Q R R G Cit G G S R A A

H Q Cit F R Cit G H S R A A G F F S A Cit G H R P L D

15 H Q E R G Cit G K S R A A

H Q E K R Cit G K S R A A

H Q R W L Cit G K S R A A

H Q K R N Cit G K S R A A

E G G G V Cit G P R V V E

20 H Q W R H Cit G R S Cit A A

H Q K W N Cit G R S R A A

H Q K F W Cit G R S R A A

H Q K Cit K Cit G R S R A A H Q K W R Cit G R S Cit A A

25 H Q A W R Cit G R S Cit A A

H Q N Q W Cit G R S R A A

H Q N S K Cit G R S R A A

H Q K R R Cit G R S R A A

H Q K R F Cit G R S R A A

30 H Q K R Y Cit G R S R A A

H Q K R H Cit G R S R A A

H Q E R A Cit G S S R A A

H Q E K M Cit G V S R A A

H Q K R G Cit G W S R A A

35 H Q R R V Cit G W S R A A

H Q W N R Cit G W S R A A

H Q Q R M Cit G W S R A A

H Q S H R Cit G W S R A A

10

H Q F R F Cit G W S R A A

H Q K R R Cit G W S R A A

G V K G H Cit G Y P G L D

of een derivaat ervan.

5 De peptiden volgens de uitvinding zijn bij voorkeur cyclische peptiden waarvan de ring ten minste 10 aminozuren omvat, en met meer voorkeur ten minste 11 aminozuren omvat.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een multi -peptide hierdoor gekenmerkt dat het een lineair of vertakt 10 multipeptide is dat ten minste twee lineaire of cyclische peptidevolgorden onafhankelijk van elkaar gekozen uit - een peptide-eenheid met de formule (II) en derivaten ervan; een peptide-eenheid met de formule (III) en derivaten ervan, 15 omvat.

Een dergelijk multipeptide is zeer geschikt voor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding. Het maakt het mogelijk om de werkwijze eenvoudiger en betrouwbaarder uit te voeren, aangezien peptiden in dezelfde bekende verhou-20 ding worden gebruikt, en extra handelingen tijdens de assay, of bij de voorbereiding daarvan (bijvoorbeeld coaten van een microtiterplaat met multipeptide) worden vermeden.

De uitvinding heeft ten slotte betrekking op een as-saykit voor het aantonen van auto-antilichamen tegen reumato-25 ide artritis, waarbij de assaykit het een peptide volgens een van de conclusies 5 tot 13, of een multipeptide volgens conclusie 14, of een mengsel daarvan bevat, tezamen met ten minste een verder reagens.

De peptiden volgens de uitvinding kunnen volgens in 30 het vak bekende wijzen worden gelabeld (radioactief, fluorescent of anderszins, zoals in het vak welbekend) of op een drager worden aangebracht. Ook in die hoedanigheid vallen dergelijke peptiden binnen het kader van de uitvinding. Een peptide kan bijvoorbeeld zijn gekoppeld aan een dragereiwit, 35 zoals Keyhole Limpet Haemocyanin of runder serumalbumine. Ook kan het peptide volgens de uitvinding al dan niet covalent zijn gekoppeld aan een vaste drager, zoals een microbolletje (goud, polystyreen etc.), glasplaatjes, chips, of een wand } 0 : . C : ; 11 van een reactievaatje of putje van een microtiterplaat. Het peptide kan zijn gelabeld met een direct of indirect label. Voorbeelden daarvan zijn biotine, fluoresceïne en een enzym, zoals horse radish peroxidase. Dit alles is algemeen bij de 5 gewone vakman bekend, en behoeft geen verdere toelichting.

VOORBEELDEN 1) Peptide-synthese

Gecitrullineerde peptiden werden gesynthetiseerd zoals be-10 schreven door De Koster H.S. et al (J. Immunol. Methods, 187. biz. 177-188, (1995)). Er zijn beads gebruikt waaraan de peptide-moleculen via een amide-binding bevestigd zijn zodat na verwijderen van beschermgroepen de peptide-moleculen nog aan de bead vast zitten. Voor de synthese 15 van peptiden werd gebruik gemaakt van een geautomatiseerde multiple peptide synthesizer (Abimed AMS422, Abimed, Lan-genfeld, Duitsland). De geïncorporeerde aminozuren en de peptide-linker 6-aminohexaanzuur waren beschermd door een Fmoc-groep, en de beschermde aminozuren werden ten behoeve 20 van de koppeling geactiveerd met PyBOP en N- methylmorfoline. Daar waar nodig waren de zijketens beschermd met zuur-labiele zijketenbeschermgroepen. De gebruikte beads hebben een diameter van ongeveer 100 μιτι en bevatten elk ongeveer 100 pmol peptide. Naar schatting is 25 ongeveer 0,5% van deze hoeveelheid aan de buitenkant gebonden en in principe bereikbaar voor antilichamen.

Voor synthese in grotere hoeveelheden werd gebruik gemaakt van beads die voorzien waren van een zuur-labiele linker. De chemie van peptidesynthese was zeer vergelijk-30 baar met die welke reeds boven beschreven is. De peptiden werden met trifluorazijnzuur afgesplitst en geïsoleerd middels etherprecipitatie, alles volgens in het vak welbekende werkwijzen uitgevoerd en die voor de gewone terzake kundige geen verdere toelichting behoeven. Vanzelfsprekend 35 kunnen peptiden met een gewenste volgorde ook commercieel worden aangeschaft. De zuiverheid en identiteit van de individuele peptiden werden gecontroleerd m.b.v. analytische RP-HPLC en time-of-flight massa-spectrometrie (MALDI-TOF).

12 2) Reactie van aan beads gekoppelde peptiden met sera van reumatoïde artritis (RA) patiënten .

IgG werd, met behulp van Proteïne A-Sepharose, geïsoleerd 5 uit serum van patiënten die klinisch waren gediagnosticeerd als lijdend aan RA. Beads werden geincubeerd met verdunning van i) totaal serum van de patiënt, of ii) IgG van een patiënt geconjugeerd aan een reporter enzym (alkaline phosphatase labeling kit; Roche/Boehringer, Mannheim, 10 Duitsland). In het geval van serum (i)) werd een tweede incubatie uitgevoerd met een met alkalische fosfatase geconjugeerd anti-humaan IgG antilichaam (Dako D0336; Dako Immunoglobulins, Glostrup, Denemarken). Na elke incubatie werden de beads goed gewassen met Tris buffer (50 mM Tris 15 pH 8,9, 150 mM NaCl, 0,5% Tween® 20).

Beads met peptiden die het meest humaan IgG hadden gebonden (na kleuring m.b.v. de alkalische fosfatase worden dit de meest intens gekleurde beads) werden geselecteerd m.b.v. een microscoop.

20

3) ELISA

De meest interessante peptiden werden in een wat grotere hoeveelheid gesynthetiseerd in een lineaire en een cyclische variant, en in de meeste gevallen ook in een citrul-25 line- en arginine- (=controle) variant. Deze peptiden wer den getest op reactiviteit met een reeks sera van RA patiënten. De peptiden werden gecoat op ELISA platen en geincubeerd met sera van RA patiënten. Elk serum werd in duplo getest. Sera van gezonde personen werden gebruikt als 30 negatieve controle.

RESULTATEN; 1) De familie van XG peptiden:

Onder gebruikmaking van sera die positief reageren met 35 cfcl (zie PCT/NL97/00624, hierin door verwijzing opgeno men) werden peptiden met glycine op positie +1 (d.w.z. C-terminaal) t.o.v. het citrulline residu gevonden. Vervanging van G op +1 door bijv. A (alanine) gaf een 65% reduc- 13 tie van de reactiviteit. De E (glutaminezuur) op positie -3 wordt in bepaalde peptiden bij voorkeur niet door A vervangen (47% verlies van activiteit). Ook de Q (glutamine) op -4, de H (histidine) op -5 en de S (serine) op +3 blij-5 ken dikwijls gunstig.

Aldus werd een aantal peptide sequenties met de combinatie -XG- geselecteerd, die allemaal in de lineaire en nog beter in de cyclische versie reageerden met RA sera. Specifieke voorbeelden van voorkeurs leden van deze XG familie zijn 10

Tabel 1: Familie van XG peptiden: H Q R K W Cit G A S R A A (0002-32) H Q H W R Cit G A S R A A (0002-42) H Q F R F Cit G Cit S R A A (0002-36) 15 H Q E R R Cit G E S R A A (020699-2) H Q K W R Cit G F S R A A (0102-74) 20 H Q R W K Cit G G S R A A (0002-28) H Q R R T Cit G G S R A A (0002-31) H Q R R G Cit G G S R A A (0002-33) H Q Cit F R Cit G H S R A A (0002-43) G F F S A Cit G H R P L D (0101-7) 25 H Q E R G Cit G K S R A A (020699-1) H Q E K R Cit G K S R A A (020699-4) H Q R W L Cit G K S R A A (0002-30) H Q K R N Cit G K S R A A (0002-38) 30 E G G G V Cit G P R V V E (0101-5) H Q W R H Cit G R S Cit A A (0002-34) H Q K W N Cit G R S R A A (0002-24) 35 H Q K F W Cit G R S R A A (0002-25) H Q K Cit K Cit G R S R A A (0002-26) H Q K W R Cit G R S Cit A A (0002-37) H Q A W R Cit G R S Cit A A (0002-40) 1 η ΐ e . ,.

\ . / *.4 i 14 H Q N Q W Cit G R S R A A (0002-44) H Q N S K Cit G R S R A A (0002-45) H Q K R R Cit G R S R A A (0102-76) H Q K R F Cit G R S R A A (0102-77) 5 H Q K R Y Cit G R S R A A (0102-78) H Q K R H Cit G R S R A A (0102-79) H Q E R A Cit G S S R A A (020699-3) 10 H Q E K M Cit G V S R A A (020699-5) H Q K R G Cit G W S R A A (0002-27) H Q R R V Cit G W S R A A (0002-29) H Q W N R Cit G W S R A A (0002-35) H Q Q R M Cit G W S R A A (0002-41) 15 H Q S H R Cit G W S R A A (0002-39) H Q F R F Cit G W S R A A (0002-63) H Q K R R Cit G W S R A A (0102-75) G V K G H Cit G Y P G L D (0101-3) 20 Bijna al deze peptiden gaven goede tot uitstekende resultaten te zien. Vooral de peptiden 0002-35, 0002-36 en 0002-63 voldeden goed. In de meeste gevallen bleek de cyclische variant van zo'n peptide nog beter te reageren (zie later) . Dit is overigens niet altijd het geval. Het lineaire 25 peptide 0101-7 reageerde bijvoorbeeld met 55% van de sera. De cyclische variant in dit peptide reageerde met "slechts" 45% van 186 RA-sera. De arginine-varianten van deze peptiden (waarbij de citrulline(s) is/zijn vervangen door arginine(s)) reageerden, zoals verwacht, niet met de RA sera.

30

Cyclische varianten:

De hieronder beschreven peptiden werden gecycliseerd volgens de cysteine-broomazijnzuur methode. Er zijn diverse cyclische varianten uitgetest, waarbij met name de cyclische 35 varianten van peptiden 0002-27, 0002-29, 0002-31, 0002-36, en 0002-63 interessant bleken.

Ringgrootte: Van een aantal goed reagerende peptiden werden extra cyclische peptiden met elk een andere ring- 15 grootte gesynthetiseerd. Uiteindelijk werden hiervan de 8, 9, 10, 11 en 12-meren getest. Al deze peptiden werden getest in ELISA met 48 RA sera respectievelijk 8 normale sera. De 8- en 9-meren reageerden met een deel van de sera (met respectieve-5 lijk 25% en 40%, en gemiddelde titers van respectievelijk 0,47 en 0,6), maar de titers (gevonden OD-waarden) lagen veel lager dan wanneer grotere ringen werden gebruikt (10-meer 35% met een titer van 0,5; 11- en 12-meer 50% met een gemiddelde titer van 0,74.

10

Tabel 2 : Resultaten van serum-analyses gebruikmakend van cy- clisch peptide 0002-36. ___ __N__% positieve sera RA__318__71_

Systemische Lupus 24 0 E ry t hema t ode s___

Prim Sjogren's syndroom__34__3_ SSc Scleroderma__10__0_ PM, Polymyositis__11__0_

Osteoarthritis__29__0_

Crohn's disease__40__ 0_

Colitis ulcerosa__40__0_

Infectieziekten (malaria, 250 1 chlamydia, mycoplasma, etc.)___

Psoriasis__10__0_

Vasculitis__30__0_

Normaal humaan serum 84 0

De bovenstaande tabel laat een overzicht zien van 15 ELISA's met sera afkomstig van RA patiënten en diverse andere auto-immuunziekten. Hieruit blijkt de hoge specificiteit van RA sera voor een peptide zoals 0002-36. Sera afkomstig van andere auto-immuunziekten, evenals materiaal van normale gezonde personen, bleken in vrijwel geen enkel geval positief 20 te zijn. De arginine variant van peptide 0002-36 (R op positie 0 en +2, d.w.z. in plaats van Cit in de formule) werd ook getest en bleek negatief met alle geteste RA en normaal sera.

i 16

Tabel 3: ELISA met 132 RA-sera met peptide 36 in vergelijking met peptide cfcl uit [PCT/NL97/00624]: peptide cfcl cfcl 0002-36 0002-36 __(lineair) (cyclisch) (lineair) (cyclisch) 48/132 83/132 80/132 94/132 positieve sera__36%__63%__61%_ 71% 5 Wanneer zowel cyclisch cfcl als cyclisch 0002-36 worden gebruikt dan kan nog een additionele 2% in sensitiviteit worden gewonnen (totaal 73%, zie tabel 4), wat voor dit soort toepassingen een welkome vooruitgang is, zolang dit niet gepaard gaat met een achteruitgang van de selectiviteit. 10 Dit laatste blijkt niet het geval. Binnen de XG groep van peptiden is er dus een diversiteit voor wat betreft het vermogen ervan te reageren met RA-antistoffen.

Tabel 4: ELISA met 186 RA sera en cyclische varianten van 15 cfl, 0002-36, en 0002-63 peptide cfcl 0002-63 0002-36 cfcl + 0002-36 (cyclisch) (cyclisch) (cyclisch) (cyclisch) positieve sera__51%__71%__71%__73%_

Wanneer de lineaire en de cyclische varianten van 0002-36 werden vergeleken in twee cohorten van RA sera (samen 20 318 sera) dan bleek de cyclische variant frequenter (en be ter) te reageren dan de lineaire variant. Beter, omdat ook de gevonden OD-waarden bij de cyclische variant veel hoger lagen dan bij de lineaire verbinding. Het maakte daarbij niet uit of de cyclische variant werd gemaakt via -S-S-bindingen tus-2 5 sen twee cysteines, of via een thioether die bijvoorbeeld gevormd is door reactie van een cysteine en een broomacetyl-groep (gevormd door reactie van een thiol in de zij keten van een cysteine met een N-terminale broomacetylgroep, waarbij een thioether wordt gevormd. De N-terminale broomacetylgroep 30 wordt gevormd door, na de synthese van het peptide, het nog aan de bead gebonden peptide (peptidyl-resin) te laten reage- join ;* !: 17 ren met de N-hydroxysuccinimide-ester van broomazijnzuur) in hetzelfde peptide. De ringsluiting wordt uitgevoerd in een met fosfaat gebufferde waterige acetonitriloplossing, pH = 8.

5 2) De familie van XnonG peptiden:

Verrassenderwijs zijn ook peptiden gevonden die niet zijn afgeleid van (pro)filaggrine, fibrine en fibrinogeen, en herkend werden door RA sera die niet of nauwelijks reageerden met hierboven beschreven peptiden uit de XG familie. Een ken-10 merk van deze peptiden is dat het aminozuur aan de C- terminale zijde van de Cit meestal basisch (R, K, H), aromatisch (W, Y) of Cit, I, of S is (zie tabel 5), maar geen G is. Vandaar de naam XnonG familie. Opmerkelijk is dat deze XnonG peptiden relatief veel positief geladen aminozuren be-15 vatten op de plaatsen -2, -1, +1 en +2. De antistoffen in deze RA sera reageren dus met een citrulline in een andere peptide context.

De genoemde XnonG peptiden reageerden allemaal met 1 of meer XG -negatieve sera. Zo reageren peptiden 0107-32, 20 0107-35, en 0107-45 met ca. 15-18% van de XG negatieve sera.

Een ELISA test gebaseerd op 1 of meer van deze peptiden geeft aanleiding tot een sensitiviteitsverhoging van minimaal 5% (73% naar 78%) ten opzichte van de combinatie cyclisch cfcl en cyclisch 0002-36. De genoemde XnonG peptiden reageerden 25 geen van alle met controle sera, wat zeer belangrijk is.

Tabel 5: Peptiden van de XnonG familie: R H G R Q Cit Cit K Y I I Y (0107-33) 30 R H G R Q Cit Cit Cit Y I I Y (0107-34) I R Cit Y K Cit I T N R K F (0107-37) A R F Q M Cit H Cit R L I R (0107-35) Q Cit Y K W Cit K I E R K R (0107-43) K P Y T V Cit K F M R K P (0107-31) K P Y T V Cit K F M R R P (0107-32) 'w' 35 18 RNLRL Cit R E R N H A (0107-36) R R R Cit Y Cit R A V I T A (0107-38) R F K S N Cit R T P N R W (0107-42) R G K S N Cit R T Y N R W (0107-39) 5 R F K S N Cit R T Y N R W (0107-40) R G K S N Cit R T P N R W (0107-41) R W V S Q Cit R R T P T R (0102-71) Μ K P R Y Cit R R I V V V (0102-73) 10 K S F V W Cit S H A R P R (0107-44) Y S F V W Cit S H A R P R (0107-45) R N Μ N R Cit W R G M Cit R (0107-30) R M G R P Cit W I R F P V (0102-72) 15 Experimenten hebben uitgewezen dat bijv. peptide 0107-35 in de cyclische vorm reageert met 18% van de sera die niet met cyclisch 0002-36 reageren. Deze sensitiviteit kan nog verder worden verhoogd met verdere peptiden. Zo voegt cyclisch peptide 0107-32 daar nog eens 8% aan toe. Daarmee 20 kan worden bereikt dat de sensitiviteit tot 80% wordt verhoogd. Een vergelijkbare waarde werd gevonden voor het peptide 0107-45. In totaal bleken 17 van de 52 (32%) XG-negatieve sera te reageren met een of meer XnonG peptiden. Dit betekent dat met combinaties van meer dan 2 XG en XnonG peptiden, een 25 voorkeursuitvoering van de uitvinding, een sensitiviteit kan worden bereikt van boven de 80%. Dit is dus beter dan wat kan worden bereikt door combinatie van de peptiden met de formule III en die welke bekend zijn uit PCT/NL97/00624.

De sensitiviteit kon nog verder worden verhoogd door 3 0 nog meer peptiden te gebruiken. Wanneer de RA sera werden getest met een cyclisch XG peptide (bijvoorbeeld 0002-63 of 0002-36) tezamen met een lineair of cyclisch CitnonG peptide (bijv. 0107-35) dan werd met 318 RA sera, een sensitiviteit bereikt van 78%. Toevoeging van een 3de, 4de en eventueel 5de 35 peptide verhoogde de sensitiviteit tot 85% (peptiden 0107-32, 0107-42 respectievelijk 0107-34). Daarbij reageerden slechts 48 van de 318 RA sera niet met een van de genoemde peptiden.

Claims

1. Werkwijze voor het detecteren van auto-antilichamen van patiënten die lijden aan reumatoïde artritis onder gebruikmaking van een peptide dat een citrullineresidu 5 of derivaat daarvan bevat, met het kenmerk, dat een monster waarvan wordt gedacht dat het de auto-antilichamen kan bevatten in contact wordt gebracht met een peptide-eenheid die het motief XG bevat, en met een peptide-eenheid die het motief XnonG bevat,' waarbij X een citrullineresidu of een derivaat 10 daarvan is, en nonG elk aminozuur anders dan glycine is; gedurende een tijd die toereikend is voor het vormen van een complex tussen de peptide-eenheden en auto-antilichaam, waarna het complex wordt gedetecteerd, onder de voorwaarde dat 15. de peptide-eenheid met het XnonG een deel omvat dat niet is afgeleid van (pro)filaggrine, fibrine, of fibrinogeen; waarbij van elke peptide-eenheid optioneel - een of meer aminozuren de D-configuratie kunnen hebben, - een of meer zijketens (anders dan die van citrulline of een 20 derivaat daarvan) of terminale uiteinden van de peptide- eenheid onafhankelijk van elkaar geacetyleerd, geglycosy-leerd, gealkyleerd, of gefosforyleerd kunnen zijn, en een of meer aminozuren kunnen zijn vervangen door niet-natuurlijke aminozuren.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat nonG een aminozuur is gekozen uit Η, I, W, S, R, K, Y, Cit of een derivaat daarvan.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat ten minste een van de peptide-eenheden een cycli- 30 sche peptide-eenheid is.

4. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het derivaat als zij keten een groep heeft met de formule (I) Q Y \ 11 c

5. Q K R H Cit G R S R A A H Q E R A Cit G S S R A A H Q E K M Cit G V S R A A H Q K R G Cit G W S R A A H Q R R V Cit G W S R A A

5. R Cit Y K Cit I T N R K F R H G R Q Cit Cit Cit Y I I Y A R F Q M Cit H Cit R L I R Q Cit Y K W Cit K I E R K R K P Y T V Cit K F M R K P

5. TYNRW - RTPTR - RIVW - HARPR - RGMCitR

5. RNMNR - RMGRP en homologe volgorden ervan; - Cit een citrullineresidu of een derivaat daarvan voorstelt, waarbij het derivaat als zij keten een groep heeft met de 10 formule (I) Q Y \ // c

5. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de peptide-eenheid met XG motief en de peptide-eenheid met XnonG motief deel uitmaken van een multi-peptide.

5 Z (I) (CH2)n waarbij

6. Peptide dat een volgorde omvat met de formule (II) : (A1-A2-A3-A4-A5) -Cit- (A6) - (A7-A8-A9-A10-A11) (II) waarbij - A1-A2-A3-A4-A5 een aminozuurvolgorde voorstelt gekozen uit

25. RHGRQ - IRCitYK - HGRQCit - GRQCitCit - FQMCitH

30. CitWRGM - ARFQM - QCitYKW - KPYTV - RNLRL

35. RRRCitY - RFKSN - RGKSN - RWVSQ 0 ·} :; 4· Ü - MKPRY - KSFVW - YSFVW - FQMRH

7. Peptide volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat A6 is gekozen uit Cit, Η, I, K, R, S, W en Y.

8. Peptide volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat het peptide een cyclisch peptide is waarvan de ring 35 ten minste 10 aminozuren omvat.

9. Peptide volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het peptide een cyclisch peptide is waarvan de ring ten minste 11 aminozuren omvat.

10. Q W N R Cit G W S R A A H Q Q R M Cit G W S R A A H Q S H R Cit G W S R A A H Q F R F Cit G W S R A A H Q K R R Cit G W S R A A

10. P Y T V Cit K F M R R P R N L R L Cit R E R N Η A R R R Cit Y Cit R A V I T A R F K S N Cit R T P N R W R G K S N Cit R T Y N R W

10. Peptide volgens één van de conclusies 6 tot 9, met het kenmerk, dat het een peptide-volgorde omvat gekozen uit R H G R Q Cit Cit K Y I I Y

10. IRFPV en homologe volgorden ervan; alsmede derivaten van het peptide met de formule (II) waarbij de term - "homologe volgorde", zoals gebruikt in samenhang met A1-A2-

10 Q = NH2, CH3, NHCH3 of N(CH3)2; Y = 0, NH, of NCH3; Z = 0, NH of CH2; en n = 2, 3 of 4; - onder de voorwaarde dat wanneer Q = NH2 en Z = NH, Y geen 15 NH is.

11. Peptide dat een volgorde omvat met de formule (III) 25 (B1-B2)-(B3-B4-B5)-X-G-B6-(B7-B8-B9-B10) (III) waarbij B1-B2 HQ, GF, EG of GV voorstelt;

30 B3-B4-B5 3 aminozuren voorstellen waarvan er ten minste 1, en bij voorkeur 2 onafhankelijk van elkaar, basisch, aromatisch of V zijn; B6 gelijk is aan een basisch of aromatisch aminozuur, of gelijk is aan A, Cit of derivaat daarvan, G, E, P, V of S; en 35 B7-B8-B9-B10 SRAA, SCitAA, RPLD, RWE of PGLD is; alsmede derivaten van het peptide met de formule (III) waarbij de term - 'derivaat' zoals gebruikt in samenhang met het peptide met \. e de formule (III) betekent dat optioneel - een of meer aminozuren de D-configuratie kunnen hebben, - een of meer zijketens (anders dan die van citrulline of een derivaat daarvan) of terminale uiteinden van het peptide 5 onafhankelijk van elkaar geacetyleerd, geglycosyleerd, ge-alkyleerd, of gefosforyleerd kunnen zijn, en een of meer aminozuren kunnen zijn vervangen door niet-natuurlijke aminozuren.

12. Peptide volgens conclusie 11, met het kenmerk, 10 dat het peptide een cyclisch peptide is waarvan de ring ten minste 10 aminozuren omvat.

13. Peptide volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het peptide een cyclisch peptide is waarvan de ring ten minste 11 aminozuren omvat.

14. Peptide volgens een van de conclusie 11 tot 13, met het kenmerk, dat het een volgorde omvat gekozen uit H Q R K W Cit G A S R A A H Q H W R Cit G A S R A A H Q F R F Cit G Cit S R A A 20 H Q E R R Cit G E S R A A H Q K W R Cit G F S R A A H Q R W K Cit G G S R A A H Q R R T Cit G G S R A A H Q R R G Cit G G S R A A

25 HQ Cit F R Cit G H S R A A G F F S A Cit G H R P L D H Q E R G Cit G K S R A A H Q E K R Cit G K S R A A H Q R W L Cit G K S R A A

30. Q K R N Cit G K S R A A E G G G V Cit G P R V V E H Q W R H Cit G R S R A A H Q K W N Cit G R S R A A H Q K F W Cit G R S R A A

35. Q K Cit K Cit G R S R A A H Q K W R Cit G R S Cit A A H Q A W R Cit G R S Cit A A H Q N Q W Cit G R S R A A H Q Ν S Κ Cit G R S R A A H Q K R R Cit G R S R A A H Q K R F Cit G R S R A A H Q K R Y Cit G R S R A A

15. Multipeptide, met het kenmerk, dat het een lineair of vertakt multipeptide is dat ten minste twee lineaire of cyclische peptidevolgorden onafhankelijk van elkaar geko-20 zen uit - een peptide-eenheid met de formule (II) en derivaten ervan; - een peptide-eenheid met de formule (III) en derivaten ervan, omvat.

15. V K G H Cit G Y P G L D of een derivaat ervan.

15. F K S N Cit R T Y N R W R G K S N Cit R T P N R W R W V S Q Cit R R T P T R Μ K P R Y Cit R R I V V V K S F V W Cit S H A R P R

20. S F V W Cit S H A R P R R N Μ N R Cit W R G M Cit R, en R M G R P Cit W I R F P V.

15 A3-A4-A5 en A7-A8-A9-A10-A11, betekent dat ten hoogste twee aminozuren van elke aminozuurvolgorde kunnen zijn vervangen door evenzoveel andere aminozuren (daaronder begrepen citrul-line of een derivaat daarvan) , ten hoogste twee aminozuren (daaronder begrepen citrulline of een derivaat daarvan) kun-20 nen zijn ingebracht, en ten hoogste twee aminozuren kunnen ontbreken; - 'derivaat' zoals gebruikt in samenhang met het peptide met de formule (II) betekent dat optioneel een of meer aminozuren de D-configuratie kunnen hebben, 25. een of meer zij ketens (anders dan die van citrulline of een derivaat daarvan) of terminale uiteinden van het peptide onafhankelijk van elkaar geacetyleerd, geglycosyleerd, ge-alkyleerd, of gefosforyleerd kunnen zijn, en een of meer aminozuren kunnen zijn vervangen door niet-30 natuurlijke aminozuren.

15 Z (I) (CH2)n waarbij

20 Q = NH2, CH3, NHCH3 Of N(CH3)2; Y = O, NH, Of NCH3; Z = 0, NH of CH2; en n = 2, 3 of 4; onder de voorwaarde dat wanneer Q = NH2 en Z = NH, Y geen NH 2. i s ; - A6 een aminozuur voorstelt anders dan glycine; - A7-A8-A9-A10-A11 een aminozuurvolgorde voorstelt gekozen uit - KYIIY

0. TNRKF - KWCitKI - CitRAVI - RCitGHS - CitGRSR

35. CitYIIY - CitRLIR - IERKR - FMRKP - FMRRP - ERNHA - AVITA - TPNRW

16. Assaykit voor het aantonen van auto-antilichamen tegen reumatoide artritis, met het kenmerk, dat het een peptide volgens een van de conclusies 6 tot 14, of een multipeptide volgens conclusie 15, of een mengsel daarvan bevat, tezamen met ten minste een verder reagens. 30 •I f '> ¥ l ' 1 ' ! O V. * ·„·