DE60212186T2 - Verfahren zum Erfassen von Autoimmunkörpern von Patienten, die an rheumatischer Arthritis leiden, ein Peptid und ein Prüfwerkzeug - Google Patents

Verfahren zum Erfassen von Autoimmunkörpern von Patienten, die an rheumatischer Arthritis leiden, ein Peptid und ein Prüfwerkzeug Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erfassen von Autoimmunkörpern bzw. Autoantikörpern von Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis leiden, wobei ein Peptid verwendet wird, welches ein Citrullin-Residuum oder etwas Analoges davon umfasst.
  • Ein derartiges Verfahren ist aus der internationalen Patentanmeldung PCT/NL97/00624 bekannt. Diese Veröffentlichung beschreibt die Verwendung von Peptiden, die aus Filaggrin abgeleitet werden und die Citrullin oder etwas Analoges davon für die Erfassung von Autoimmunkörpern von Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis leiden, umfassen. Die verwendeten Peptide sind deshalb passend für diagnostische Anwendungen, und verglichen damit machen sie eine zuverlässigere Erfassung möglich. Insbesondere betrifft dies eine Abnahme falscher positiver Tests (false-positives), d.h. eine höhere Spezifität. Zusätzlich ist die Sensitivität relativ hoch. Ein Peptid, welches als cfcl bezeichnet wird, wurde mit 36 %aus Sera bzw. Seren von Patienten erkannt, die an einer rheumatischen Arthritis leiden. Die zyklische Variante des Peptids schien sogar noch besser erkannt zu werden (63 %).
  • Ein Verfahren gemäß der Präambel ist auch aus der internationalen Patentanmeldung PCT/FR00/01857 bekannt. Diese Veröffentlichung beschreibt die Verwendung von Peptiden, die aus Fibrin oder Fibrinogen abgeleitet werden und welche Citrullin oder ein Analogon davon für die Erfassung von Autoimmunkörpern von Patienten umfassen, die an rheumatischer Arthritis leiden.
  • Die PCT/EP98/07714 beschreibt die Verwendung synthetischer Peptide, die aus (pro)-Fillagrin für die Diagnose rheumatischer Arthritis abgeleitet werden. Diese Anmeldung beschreibt auch synthetische Peptide, die von menschlichem Vimentin, Cytokeratin 1, Cytokeratin 9 und weiteren dazwischenliegenden Filamentproteinen abgeleitet wurden.
  • Schellekens et al., in J. Clin. Invest. 1998, 101(1), 273-281 offenbart Peptide, die verwendbar für die Erfassung von Autoimmunkörpern von Patienten sind, die an einer rheumatischen Arthritis leiden. Diese Peptide umfassen ein Citrullin-Residuum und zeigen eine verbesserte Spezifität und Sensitivität, wenn sie in einer diagnostischen Überprüfung für eine rheumatische Arthritis verwendet werden.
  • Jedoch erfassen die vorhergehend erwähnten Verfahren noch immer nur eine beschränkte Anzahl all jener Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis leiden. Deshalb besteht ein starker Bedarf für ein Verfahren, mittels welchem eine erhöhte Sensitivität erreicht werden kann, während eine im Wesentlichen gleiche oder sogar verbesserte Spezifität erhalten werden kann.
  • Um dieses Ziel zu erreichen, liefert die vorliegende Erfindung eine Peptideinheit bzw. einen Peptidabschnitt, der eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe gewählt ist, die bestehend ist aus einem Peptid 0002-27 HQKRGCitGWSRAA, einem Peptid 0002-29 HQRRVCitGWSRAA, einem Peptid 0002-31 HQRRTCitGGSRAA, einem Peptid 0002-32 HQRKWCitGASRAA, einem Peptid 0002-36 HQFRFCitGCitSRAA, einem Peptid 0002-37 HQKWRCitGRSCitAA und einem Peptid 0002-63 HQFRFCitGWSRAA. Eine derartige Peptideinheit wird nachfolgend als „eine Peptideinheit, die das Muster XG umfasst" oder kurzes „XG-Peptid" bezeichnet, wobei X ein Citrullin-Residuum oder ein Analogon davon ist und G ist die Aminosäure Glycin.
  • Die Erfindung liefert auch ein XG-Peptid, welches zusätzlich eine Peptideinheit umfasst, die eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe gewählt ist, die bestehend ist aus einem Peptid 0170-32 KPYTVCitKFMRRP, einem Peptid 0107-35 ARFQM CitHCitRLIR, einem Peptid 0170-45 YSFVWCitSHARPR, einem Peptid 0113-30 ARFQMRHCitRLIR und einem Peptid 0218-36 RNLRLCitRERNHA. Diese letzteren fünf Peptideinheiten werden hier nachfolgend als „eine Peptideinheit, die das Muster XnonG umfasst" oder kurz „XnonG-Peptid" bezeichnet, wobei nonG eine andere Aminosäure als Glycin ist.
  • Die nachfolgend beschriebenen Experimente zeigen, dass Sera, die von Patienten erhalten werden, die an einer rheumatischen Arthritis leiden, zwei unterschiedliche Populationen von Immunkörpern enthalten. Die eine Population ist reaktiv mit XG-Peptideinheiten. Die Population kann mit XG-Peptideinheiten gemäß der vorliegenden Erfindung erfasst werden. Die andere Population von Immunkörpern reagiert mit XnonG-Peptideinheiten. Bis jetzt wurde diese Population von Immunkörpern noch nicht in der vorveröffentlichten Literatur beobachtet. Wie nachfolgend genauer beschrieben wird, umfasst die Mehrheit an Seren von Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis leiden, beide Populationen von Immunkörpern. Infolgedessen können diese Sera mittels eines diagnostischen Tests erfasst werden, welche eine XG- oder eine XnonG-Peptideinheit umfasst. Es erscheint jedoch, dass ein signifikanter Anteil der Sera von Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis leiden, nur eine der zwei Populationen umfasst. Deshalb werden Sera, die nur Immunkörper der XnonG-Peptideinheit umfassen, nicht oder nur mit einem geringen Anteil mit den diagnostischen Tests erfasst, wie sie in der vorher erwähnten veröffentlichten Literatur beschrieben werden. Ein großer Anteil dieser Sera kann jetzt erfasst werden, falls der diagnostische Test eine XnonG-Peptideinheit umfasst. Ein verbessertes diagnostisches Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst daher mindestens ein XG- und ein XnonG-Peptid. Deshalb kann der diagnostische Test gemäß der Erfindung um 20 % empfindlicher als ein Test gemäß der veröffentlichten Literatur sein.
  • Überraschenderweise wurde gezeigt, dass, wenn derartige XnonG-Peptide mit XG-Peptiden gemäß der Erfindung kombiniert werden, ein weiter verbessertes diagnostisches Verfahren erhalten wurde. Insbesondere die Verwendung einer derartigen Kombination von Peptideinheiten in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung liefert ein diagnostisches Verfahren einer sehr großen Sensitivität, während eine exzellente Spezifität aufrechterhalten wird. Dies ist um so überraschender, da die vorhergehend erwähnte veröffentlichte Literatur auf der Idee basiert, dass Immunkörper von Patienten mit RA besonders gut mit Peptiden reagierten, die aus natürlich vorkommendem Protein, so wie (pro)-Filaggrin, Fibrin, Fibrinogen, Vimentin, Cytokeratin 1 oder Cytokeratin 9 abgeleitet wurden. PCT/EP98/07714 beschreibt beispielsweise ein Filaggrin-abgeleitetes XnonG-Peptid (IPG1249). Es ist mit 3,3 % der Sera von SLE-Patienten kreuz-reaktiv und weist eine Homologie von 82 % mit Filaggrin auf.
  • In diesem Zusammenhang wird eine Peptideinheit als ein Peptid verstanden, welches mindestens sieben Aminosäuren lang ist. Peptideinheiten können eine oder mehrere Seitenketten aufweisen. Ebenso können Peptideinheiten oder terminale bzw. endständige Enden der Peptideinheit acetyliert, glyosyliert, alkyliert oder phosphorylisiert unabhängig voneinander werden.
  • Die Peptideinheiten umfassen XG und XnonG und können oder können nicht Teil des gleichen Moleküls sein. Dies wird später ausgeführt. Zum Durchführen einer Erfassungsprüfung werden die Peptideinheiten an einen Träger gebunden und optional mit einem Label versehen. Der Komplex kann in irgendeiner für den gewöhnlichen Fachmann bekannten Weise erfasst werden. Der Komplex kann indirekt erfasst werden, beispielsweise in dem Fall einer Konkurrenzprüfung, in welcher der Komplex selbst nicht gelabelt wird. Die Reaktion mit den zwei Peptideinheiten kann simultan oder aufeinander folgend und in dem gleichen Behälter (so wie einer Röhre einer Mikrotiter-Platte) oder in unterschiedlichen Behältern stattfinden.
  • Diese Anmeldung ist nicht als eine pädagogische Veröffentlichung gedacht, wie man ein Fachmann wird. Sie ist deshalb darauf beschränkt, ausreichende Information zu liefern, um es dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung zu verstehen, sie nachzuvollziehen und den Schutzbereich zu verstehen.
  • Bevorzugt werden die Peptideinheiten durch mindestens zwei von 100 zufälligen Sera von erfassten RA-Patienten erkannt. Offensichtlich ist es bevorzugt, Peptideinheiten zu verwenden, die durch einen beträchtlich höheren Prozentsatz erkannt werden, bevorzugt mindestens 30 %. Die Zahl an Peptideinheiten in einem Verfahren gemäß der Erfindung ist bevorzugt 2 oder größer als 2.
  • Bevorzugt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren wie vorhergehend erwähnt, wobei die Peptideinheit mit dem XG-Muster und die Peptideinheit mit dem XnonG-Muster zusammen durch mindestens 10 % der Serie von Sera von Patienten erkannt werden. Selbstverständlich sind Kombinationen von Peptideinheiten, welche höhere Sensitivitäten ergeben, bevorzugt. Mit einigen Kombinationen von Peptideinheiten, wie sie in diesem Dokument beschrieben werden, können diagnostische Tests mit Sensitivitäten von 40, 60, 70, 80 oder sogar 85 und mehr als 90 % durchgeführt werden.
  • Es wurde gezeigt, dass die Sensitivität der Erfassung weiter erhöht werden kann, wenn mindestens eine der Peptideinheiten eine zyklische Peptideinheit ist.
  • Die Peptideinheit mit einem XG-Muster und die Peptideinheit mit einem XnonG-Muster sind bevorzugt Teil eines Multipeptids. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein Multipeptid ein Molekül, welches mindestens zwei Antigen-Peptid-Einheiten umfasst, d.h. Kombinationen von Peptideinheiten, welche mittels einer kovalenten Bindung gebunden sein oder nicht gebunden sein können. Derartige Multipeptide kön nen aus linearen, verzweigten, zyklischen Peptideinheiten oder einer Kombination dieser zusammengesetzt sein. Multipeptide können aus beiden, aus Peptideinheiten, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen und Peptideinheiten, die unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, zusammengesetzt sein. Ein Multipeptid gemäß der Erfindung umfasst mindestens 12 Aminosäuren, d.h. Peptideinheiten können überlappen. Es versteht sich von selbst, dass das XG- und XnonG-Muster nicht überlappen können.
  • Die Peptide gemäß der Erfindung sind bevorzugt zyklische Peptide, von welchen der Ring mindestens 12 Aminosäuren umfasst. Der Fachmann ist mit unterschiedlichen Verfahren für die Herstellung von zyklischen Peptiden vertraut und eine weitere Erklärung wird nicht benötigt.
  • Gemäß einem am meisten bevorzugten Verfahren der Erfindung wird ein XG-Peptid in Kombination mit mindestens einem XnonG-Peptid verwendet, wobei das XG-Peptid aus der Gruppe gewählt ist, die sich zusammensetzt aus:
    0002-27 H Q K R G Cit G W S R A A
    0002-29 H Q R R V Cit G W S R A A
    0002-31 H Q R R T Cit G G S R A A
    0002-32 H Q R K W Cit G A S R A A
    0002-36 H Q F R F Cit G Cit S R A A
    0002-37 H Q K W R Cit G R S Cit A A
    0002-63 H Q F R F Cit G W S R A A
    und das XnonG-Peptid wird aus der Gruppe gewählt, die sich zusammensetzt aus:
    0107-32 K P Y T V Cit K F M R R P
    0107-35 A R F Q M Cit H Cit R L I R
    0107-45 Y S F V W Cit S H A R P R
    0113-30 A R F Q M R H Cit R L I R
    0218-36 R N L R L Cit R E R N H A
  • Abhängig von der gewünschten Spezifität und Sensitivität des diagnostischen Tests und der entsprechenden Population rheumatischer Arthritis-Sera bei einer Prüfung wird eine bevorzugte Kombination von XG- und XnonG-Peptideinheiten aus der Gruppe gewählt, die sich zusammensetzt aus:
    0002-27 und 0107-32; 0002-27 und 0107-35;0002-27 und 0107-45;
    0002-27 und 0113-30; 0002-27 und 0218-36;0002-29 und 0107-32;
    0002-29 und 0107-35; 0002-29 und 0107-45;0002-29 und 0113-30;
    0002-29 und 0218-36; 0002-31 und 0107-32;0002-31 und 0107-35;
    0002-31 und 0107-45; 0002-31 und 0113-30;0002-31 und 0218-36;
    0002-32 und 0107-32; 0002-32 und 0107-35;0002-32 und 0107-45;
    0002-32 und 0113-30; 0002-32 und 0218-36;0002-36 und 0107-32;
    0002-36 und 0107-35; 0002-36 und 0107-45;0002-36 und 0113-30;
    0002-36 und 0218-36; 0002-37 und 0107-32;0002-37 und 0107-35;
    0002-37 und 0107-45; 0002-37 und 0113-30;0002-37 und 0218-36;
    0002-63 und 0107-32; 0002-63 und 0107-35;0002-63 und 0107-45;
    0002-63 und 0113-30; 0002-63 und 0218-36.
  • Die vorhergehend erwähnten Kombinationen zeigten, dass sie einen Durchschnitt in einer Sensitivität von 6 % erzeugen, was die Gesamtsensitivität eines derartigen Kombinationstests eines XG- und eines XnonG-Peptids auf 75 bis 78 % bringt.
  • Die nachfolgend in den Beispielen beschriebenen Ergebnisse zeigten weiter, dass die unterschiedlichen Peptideinheiten auch unterschiedliche Gruppen (cohorts) von Sera erfassten. Eine zusätzliche Erhöhung der Sensitivität wurde durch Hinzufügen einer dritten Peptideinheit oder sogar einer vierten oder mehrerer Peptideinheiten erreicht. Abhängig von der Kombination von Peptideinheiten, die aus den vorhergehend erwähnten Gruppen gewählt werden, erlaubte ein diagnostischer Test gemäß der Erfindung Sensitivitäten von 88 bis 92 % zu erreichen.
  • Ein Multipeptid ist sehr geeignet für eine Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung. Es erlaubt das Verfahren einfacher und zuverlässiger durchzuführen, da Peptide in dem gleichen bekannten Verhältnis bzw. Umfang verwendet werden und zusätzliche Schritte während der Prüfung oder während der vorübergehenden Arbeit (z.B. Beschichten einer Mikrotiter-Platte mit Multipeptid) vermieden werden.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein ex-vivo diagnostisches Werkzeug bzw. Kit zum Bestimmen des Vorhandenseins von Autoimmunkörpern von Patienten, die an rheumatischer Arthritis leiden, wobei das diagnostische Kit ein Peptid gemäß der Erfindung umfasst oder ein Multipeptid gemäß der Erfindung oder eine Mischung davon, zusammen mit mindestens einem weiteren Reagens.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren für die Auswahl eines Peptids, welches geeignet für die ex-vivo-Diagnose von rheumatischer Arthritis ist, wobei eine Peptid-Bibliothek mit Immunkörpern von Patienten mit rheumatischer Arthritis überprüft wird, und wobei die Peptidbibliothek aus einer Gruppe gewählt ist, die umfasst:
    • Lib (1): H Q E X X Cit X X S R A A wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein und Tryptophan ist
    • Lib (2): H Q X X X Cit G X S R/Cit A A wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein ist aber Citrullin beinhaltet
    • Lib (3): H Q E X X Cit X X S R/Cit A A wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein ist aber Citrullin beinhaltet
    • Lib (4): X X X X X X Cit X X X X X wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein ist aber Citrullin beinhaltend
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer Peptideinheit, umfassend eine Konsensus-Sequenz bzw. Übereinstimmungs-Sequenz HQXXXCitGXS[R/Cit]AA für die ex-vivo-Erfassung von Autoimmunkörpern, die spezifisch für rheumatische Arthritis sind, wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein aber Citrullin beinhaltend, und wobei Cit Citrullin ist.
  • Die Peptide gemäß der Erfindung können benannt bzw. gelabelt werden (radiaktiv, fluoreszent oder anders, wie im Stand der Technik gut bekannt) oder können mit einem Träger versehen sein. In dieser Form fallen auch derartige Peptide innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung. Beispielsweise kann ein Peptid an ein Trägerprotein gebunden sein, so wie Keyhole-Limpet-Hämocyanin oder Bovin-Serum-Albumin. Auch kann das Peptid gemäß der Erfindung nicht kovalent oder kovalent an einen festen Träger gebunden sein, so wie eine Mikrosphäre (Gold, Polystyren, etc.), Plättchen, Scheiben, oder eine Wand eines Reaktionsgefäßes bzw. Reaktorgefäßes oder eine Röhre einer Mikrotiter-Platte. Das Peptid kann mit einem direkten oder einem indirekten Label versehen sein. Beispiele beinhalten Biotin, Fluorescein und ein Enzym, so wie Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase). All dies ist im Allgemeinen dem Durchschnittsfachmann bekannt und benötigt keiner weiteren Erklärung.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Peptidsynthese
  • Citrullinierte Peptide wurden synthetisiert, wie es durch De Koster H.S. et al. (J. Immunol. Methods, 187, S. 177-188, (1995)) beschrieben wird. Ketten wurden verwendet, an welche die Peptidmoleküle mittels einer Amid-Bindung angefügt wurden, so dass nach der Entfernung protektiver Gruppen Peptidmoleküle noch immer an der Kette angefügt waren. Für die Synthese von Peptiden wurde einautomatisierter Synthetisierer für Mehrfachpeptide verwendet (Abimed AMS422, Abimed, Langenfeld, Deutschland). Die zugefügten Aminosäuren und das Peptid-Linker-6-Aminohexan-Säure wurde durch eine Fmoc-Gruppe geschützt und um die Bindung zu erleichtern, wurden die geschützten Aminosäuren durch PyBOP und N-Methylmorpholin aktiviert. Wo es notwendig war, wurden die Seitenketten mit Gruppen geschützt, die säureempfindliche Seitenketten schützen. Die verwendeten Ketten hatten einen Durchmesser von ungefähr 100 μm und umfassten ungefähr 100 pmol Peptid jeweils. Es wird geschätzt, dass ungefähr 0,5 % dieses Betrages zu der Außenseite gebunden wird und im Prinzip Immunkörpern zugänglich ist.
  • Für die Synthese in größeren Mengen wurden Ketten verwendet, die mit einem säuresensitiven Linker versehen waren. Die Chemie einer Peptidsynthese war großteils mit der bereits vorhergehend beschriebenen vergleichbar. Die Peptide wurden mit Trifluoracetatsäure abgespalten und mittels einer Ether-Präzipitation isoliert alles in Übereinstimmung mit im Stand der Technik bekannten Verfahren und für welche ein durchschnittlicher Fachmann keine weiteren Erklärungen benötigt. Es ist natürlich auch möglich, Peptide mit einer gewünschten Sequenz kommerziell zu erwerben. Die Reinheit und Identität der individuellen Peptide wurde mittels einer analytischen RP-HPLC und einer Flugzeit-Massenspektrometrie (time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF) überprüft.
  • Mit Hilfe des vorhergehenden Verfahrens wurden vier Peptidbibliotheken erzeugt, wobei jede eine große Anzahl (8 × 106) citrullinierte Peptide umfasst. Die nachfolgenden Formeln zeigen die Aminosäuresequenz der Peptide in jeder Bibliotheks
    • Lib (1): H Q E X X Cit X X S R A A wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein und Tryptophan ist
    • Lib (2): H Q X X X Cit G X S R/Cit A A wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein ist aber Citrullin beinhaltet
    • Lib (3): H Q E X X Cit X X S R/Cit A A wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein ist aber Citrullin beinhaltet
    • Lib (4): X X X X X X Cit X X X X X wobei X = irgendeine Aminosäure außer Cystein ist aber Citrullin beinhaltet
  • Diese Bibliotheken wurden in Übereinstimmung mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren überprüft, wobei Sera von Patienten, die unter einer rheumatischen Arthritis leiden, verwendet wurden.
  • Beispiel 2: Reaktion der kettengekoppelten Peptide mit Sera von Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis (RA) leiden
  • Mit der Hilfe des Proteins A-Sepharose, wurde IgG von einem Serum, von Patienten isoliert, von welchen klinisch diagnostiziert wurde, dass sie an RA leiden. Die Ketten wurden mit einer Lösung inkubiert bzw. ausreifen gelassen, umfassend i) Gesamtserum von dem Patienten, oder ii) IgG von einem Patienten, mit einem Reporter-Enzym konjugiert ist (alkalischer Phosphatase-Benennungskit; Roche/Boehringer, Mannheim, Deutschland). Für Serum (i) wurde eine zweite Inkubation bzw. Ausreifung mit einem alkalischen Phosphatase konjugierten anti-humanen IgG-Antikörper durchgeführt (Dako D0336; Dako Immunoglobulins, Glostrup, Dänemark). Nach jeder Inkubation wurden die Ketten gründlich mit Tris-HCl-Puffer gewaschen, pH 8,9 (50 mM Tris pH 8,9, 150 mM NaCl, 0,5 % Tween® 20).
  • Die Ketten mit Peptiden, die das meiste humane IgG gebunden hatten (nach einem Färben mit einem Substrat von alkalischer Phosphatase, die in ein unlösliches gefärbtes Produkt umgewandelt wird, dies werden die am meisten gefärbten Ketten), wurden mit der Hilfe eines Mikroskops ausgewählt.
  • Beispiel 3: ELISA
  • Die interessantesten Peptide wurden in einer leicht größeren Menge synthetisiert, um eine lineare und eine zyklische Variante zu bilden, und in den meisten Fällen in einer Citrullin- und Arginin(=Kontrolle)-Variante. Diese Peptide wurden auf eine Reaktivität mit einer Serie von Sera von RA-Patienten überprüft. Die Peptide wurden auf ELISA-Platten beschichtet und mit Sera von RA-Patienten inkubiert bzw. ausgereift. Jedes Serum wurde im Duplikat überprüft. Sera von gesunden Personen wurden als negative Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 4: Die Familie der XG-Peptide
  • Durch Verwenden von Sera, die eine positive Reaktion mit cfcl (siehe PCT/NL97/00624) ergaben, wurden Peptide mit Glycin auf einer Position +1 (d.h. C-Terminal) gefunden, in Relation zu dem Citrullin-Residuum. Ersetzen von G auf +1 durch beispielsweise A (Alanin) reduziert die Reaktivität um 65 %. In gewissen Peptiden wird das E (Glutaminsäure) auf Position -3 bevorzugt nicht durch A ersetzt (47 % Verlust an Aktivität). Ähnlich erwies sich das Q (Glutamin) auf -4, das H (Histidin) auf -5 und das S (Serin) auf +3 oft als vorteilhaft.
  • Somit wurde eine Zahl von Peptidsequenzen mit der Kombination -XG- gewählt, wobei alle mit RA-Sera reagierten. Spezifische Beispiele bevorzugter Mitglieder dieser XG-Familie sind Tabelle 1: Familie von XG-Peptiden:
    H Q R K W Cit G A S R A A (0002-32)
    H Q F R F Cit G Cit S R A A (0002-36)
    H Q R R T Cit G G S R A A (0002-31)
    H Q K W R Cit G R S Cit A A (0002-37)
    H Q K R G Cit G W S R A A (0002-27)
    H Q R R V Cit G W S R A A (0002-29)
    H Q F R F Cit G W S R A A (0002-63)
  • Alle diese Peptide zeigten gute bis exzellente Ergebnisse.
  • Insbesondere die Peptide 0002-36 und 0002-63 waren sehr zufriedenstellend. In den meisten Fällen reagierte die zyklische Variante eines derartigen Peptids sogar besser (siehe später). Anfänglich ist dies nicht immer der Fall. Wie erwartet, reagierten die Arginin-Varianten dieser Peptide (wobei das/die Citrullin(e) durch Arginin(e) ersetzt ist/sind) nicht mit den RA-Sera.
  • Beispiel 5: Zyklische Varianten von XG-Peptiden
  • Die nachfolgend beschriebenen Peptide wurden zyklisiert in Übereinstimmung mit dem Cystein-Bromsäureverfahren (cysteinebromoacetic acid method). Mehrere zyklische Varianten wurden getestet, insbesondere mit den zyklischen Varianten der Peptide 0002-27, 0002-29, 0002-31, 0002-36 und 0002-63, wobei festgestellt wurde, ob sie von Interesse sind.
  • Ringgröße: Eine Anzahl adäquat reagierender Peptide wurde verwendet, um zusätzliche zyklische Peptide zu synthetisieren, die jeweils eine unterschiedliche Ringgröße aufweisten. Von diesen wurden die 8-, 9-, 10-, 11- und 12-Mere entsprechend getestet. Alle diese Peptide wurden in ELISA mit 48 RA-Sera und entsprechend mit acht normalen Sera getestet. Die 8- und 9-Mere reagierten mit einigen der Sera (mit 22 % (Titer 0,47) und entsprechend 28 % (Titer 0,5), aber die Titer (die gefundenen OD-werte) waren viel geringer, wenn größere Ringe verwendet wurden (10-Mere 33 % mit einem Titer von 0,60; 11- und 12-Mere 50 % mit einem Durchschnittstiter von 0,74).
  • Tabelle 2: Ergebnisse aus Serum-Analysen, die das zyklische Peptid 0002-36 verwenden.
    Figure 00140001
  • Die obige Tabelle stellt ELISAs mit Sera dar, die von Patienten erhalten wurden, die an RA leiden und Patienten, die an unterschiedlichen anderen Autoimmunkrankheiten leiden. Dies zeigt die hohe Spezifität von RA-Sera für ein Peptid, so wie 0002-36. Praktisch keiner der Fälle zeigte Sera, die aus anderen Autoimmunkrankheiten und Material, das von normalen gesunden Personen erhalten wurde als positiv an. Die Arginin-Variante von Peptid 0002-36 (R auf Position 0 und +2, d.h. anstatt von Cit in der Formel) wurde ebenso getestet und hat sich als negativ mit allen getesteten RA und normalen Sera dargestellt.
  • Tabelle 3: ELISA mit 132 RA-Sera mit Peptid 36, verglichen mit Peptid cfcl aus [PCT/NL97/00624]:
    Figure 00150001
  • Durch Verwenden eines zyklischen cfcl wie auch als zyklisches 0002-36 kann eine zusätzliche 2%ige Sensitivität erreicht werden (insgesamt 73 %, siehe Tabelle 4), welche für diese Art von Anwendung eine willkommene Verbesserung ist, solange sie nicht mit einer abnehmenden Spezifität verbunden ist. Das Letztere scheint nicht der Fall zu sein. Somit gibt es innerhalb der XG-Gruppe von Peptiden eine Diversität in Bezug auf ihre Fähigkeit mit RA-Immunkörpern zu reagieren.
  • Tabelle 4: ELISA mit 186 RA-Sera und zyklische Varianten von cf1, 0002-36 und 0002-63
    Figure 00150002
  • Beim Vergleichen der linearen und zyklischen Varianten von 0002-36 in zwei Kohorten bzw. Scharen von RA-Sera (insgesamt 318 Sera) zeigte sich, dass die zyklische Variante häufiger (und besser) als die lineare Variante reagiert. Besser deshalb, weil die OD-Werte, die bei der zyklischen Variante gefunden wurden, ebenso höher als bei der linearen Zusammensetzung waren. Ob die zyklische Variante mittels -S-S-Bindungen zwischen zwei Cysteinen oder mittels eines gebildeten Thioethers, beispielsweise durch Reaktion eines Cysteins und ei ner Bromacetyl-Gruppe gebildet wurden (gebildet durch Reaktion eines Thiols in der Seitenkette eines Cysteins mit einer N-Terminal-Bromoacetyl-Gruppe, wobei ein Thioether gebildet wird) ist nebensächlich. Die N-Terminal-Bromacetyl-Gruppe wird gebildet nach der Synthese des Peptids indem dem Kettenbindungspeptid (Peptidyl-Harz) erlaubt wird, mit den N-Hydroxy-succinimid-ester der Bromsäure (bromoacetic acid) in dem gleichen Peptid zu reagieren. Der Ringschluss tritt in einer Phosphat-gepufferten wässrigen Acetonitril-Lösung auf, pH = 8.
  • Beispiel 6: Die Familie von XnonG-Peptiden
  • Überraschenderweise wurden auch Peptide gefunden, die nicht aus (pro)-Filaggrin, Fibrin, Fibrinogen, Vimentin, Cytokeratin 1 und Cytokeratin 9 hergeleitet wurden und die durch RA-Sera erkannt wurden, nicht oder nur gering mit Peptiden der XG-Familie, die vorhergehend beschrieben wurde, reagiert. Ein Charakteristikum dieser Peptide ist, dass die Aminosäure und die C-Termin-Seite des Cit basisch (R, K, H), aromatisch (W, Y, F), aliphatisch (M, I, V) oder Cit, S oder P (siehe Tabelle 5) aber nicht G ist. Daher stammt der Name XnonG-Familie. Beachtlicherweise umfassen XnonG-Peptide relativ viele positiv geladene Aminosäuren auf den -2-, -1-, +1- und +2-Positionen. Somit reagieren die Immunkörper dieser RA-Sera mit einem Citrullin in einem unterschiedlichen Peptidkontext.
  • Die erwähnten XnonG-Peptide reagierten alle mit einem oder mehreren XG-negativen Sera. Beispielsweise reagieren die Peptide 0107-32, 0107-35 und 0170-45 mit ungefähr 15-18 % der XG-negativen Sera. Ein ELISA-Test, basierend auf einem oder mehreren dieser Peptide, induzierte eine Sensitivitätszunahme von mindestens 5 % (von 73 % auf 78 %), verglichen mit der Kombination eines zyklischen cfcl und eines zyklischen 0002-36. Sehr wichtig ist, dass keines der erwähnten XnonG-Peptide mit Kontrollsera reagierte. Tabelle 5: Peptide der XnonG-Familie:
    A R F Q M Cit H Cit R L I R (0107-35)
    K P Y T V Cit K F M R R P (0107-32)
    Y S F V W Cit S H A R P R (0107-45)
    G V Y L V R Cit L Cit M M R (0218-36)
  • Experimente haben beispielsweise gezeigt, dass das Peptid 0107-35 in der zyklischen Form mit 18 % der Sera, die nicht reaktiv mit einem zyklischen 0002-36 sind, reagiert. Diese Sensitivität kann weiter durch andere Peptide erhöht werden. Beispielsweise können weitere 8 % durch ein zyklisches Peptid 0107-32 hinzugefügt werden. Dies erlaubt, die Sensitivität um 80 % zu erhöhen. Ein ähnlicher Wert wurde für das Peptid 0107-45 gefunden. Insgesamt wurde bei 17 von 52 (32 %) XG-negativen Sera gezeigt, dass sie mit einem oder mehreren XnonG-Peptiden reagieren. Dies bedeutet, dass bei Kombinationen von mehr als zwei XG- und XnonG-Peptiden, eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, eine Sensitivität von über 80 % erreicht werden kann. Dies ist deshalb besser als das was mittels Kombination der Peptide der Formel IV und jenen bekannten aus PCT/NL97/00624 erreicht werden kann.
  • Die Sensitivität kann noch weiter erhöht werden durch Verwenden weiterer Peptide. Wenn das RA-Serum mit einem zyklischen XG-Peptid (beispielsweise 0002-63 oder 0002-36) zusammen mit einem linearen oder zyklischen XnonG-Peptid (beispielsweise 0107-35) getestet wurde, wurde für 318 RA-Sera eine Sensitivität von 78 % erreicht. Das Hinzufügen eines dritten, vierten und möglicherweise fünften Peptids erhöhte die Sensitivität auf 85 % (Peptide 0107-32, 0107-42 entsprechend 0107-34). Lediglich 48 der 318 RA-Sera reagierten nicht mit einem der erwähnten Peptide.
  • Beispiel 7: Sensitivität und Spezifität diagnostischer Tests, umfassend XG- und XnonG-Peptideinheiten
  • Beim Verwenden der vorhergehend beschriebenen Verfahren wurden sieben XG-Peptideinheiten auf eine Reaktivität mit den 318 erwähnten Sera in Tabelle 2 getestet von Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis leiden. Die Spezifität wurde mit Hilfe der erwähnten Sera in Tabelle 2 von Kontrollpatienten und normalen Spendern bestimmt. Tabelle 6 zeigt die Spezifität und Sensitivität der individuellen Peptideinheiten.
  • Tabelle 6
    Figure 00180001
  • In Übereinstimmung mit den in diesem Dokument beschriebenen Verfahren, wurden fünf XnonG-Peptideinheiten auf eine Reaktivität mit den gleichen 318 erwähnten Sera in Tabelle 2 von Patienten getestet, die an einer rheumatischen Arthritis leiden. Eine Spezifität wurde wieder mit der Hilfe der erwähnten Sera in Tabelle 2 von Kontrollpatienten und normalen Spendern bestimmt. Tabelle 7 zeigt die Spezifität und Sensitivität der individuellen Peptideinheiten.
  • Tabelle 7
    Figure 00190001
  • Die Reaktivität der XnonG-Peptideinheiten, die in Tabelle 7 erwähnt wurden, wurde mit 80 Sera aus dem Feld (panel) von 318 Sera, die vorhergehend beschrieben wurden, die nicht mit irgendeinem XG-Peptid aus Tabelle 6 reagierten. Die erwähnten Prozentsätze in Tabelle 8 zeigen deshalb den Prozentsatz der Sera, die Immunkörper bei XnonG-Peptideinheiten umfassten, aber keine XG-reaktiven Immunkörper umfassten.
  • Tabelle 8
    Figure 00190002
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, dass eine erhöhte Sensitivität erwartet werden kann, falls jede der XG-Peptideinheiten aus Tabelle 6 mit jeder der Peptideinheiten aus Tabelle 7 kombi niert wird. Alle nachfolgend ergebenen Peptidkombinationen wurden mit einem entsprechenden Anteil des vorhergehend erwähnten Feldes von 318 Sera von Patienten getestet, die an einer rheumatischen Arthritis leiden. Dieses Experiment zeigt in der Tat, dass eine durchschnittliche Zunahme in einer Sensitivität von 6 % erreicht wurde, was die Gesamtsensitivität eines derartigen Kombinationstests von 75 auf 78 % bringt.
  • Die getesteten Kombinationen von Peptideinheiten bezogen sich auf: Peptideinheit 0002-27 mit 0107-32; 0002-27 mit 0107-35; 0002-27 mit 0107-45; 0002-27 mit 0113-30; 0002-27 mit 0218-36; 0002-29 mit 0107-32; 0002-29 mit 0107-35; 0002-29 mit 0107-45; 0002-29 mit 0113-30; 0002-29 mit 0218-36; 0002-31 mit 0107-32; 0002-31 mit 0107-35; 0002-31 mit 0107-45; 0002-31 mit 0113-30; 0002-31 mit 0218-36; 0002-32 mit 0107-32; 0002-32 mit 0107-35; 0002-32 mit 0107-45; 0002-32 mit 0113-30; 0002-32 mit 0218-36; 0002-36 mit 0107-32; 0002-36 mit 0107-35; 0002-36 mit 0107-45; 0002-36 mit 0113-30; 0002-36 mit 0218-36; 0002-37 mit 0107-32; 0002-37 mit 0107-35; 0002-37 mit 0107-45; 0002-37 mit 0113-30; 0002-37 mit 0218-36; 0002-63 mit 0107-32; 0002-63 mit 0107-35; 0002-63 mit 0107-45; 0002-63 mit 0113-30 und schließlich 0002-63 mit 0218-36.
  • Mit Bezug auf die Ergebnisse von Tabelle 6 und Tabelle 8 wird ebenso angemerkt, dass unterschiedliche Peptideinheiten auch unterschiedliche Kohorte von Sera erfassten. Aus diesem kann abgeleitet werden, dass die vorhergehend erwähnten Kombinationen von XG- und XnonG-Peptideinheiten es ebenso ermöglichen, eine weitere Verstärkung in der Sensitivität zu erzielen, falls eine dritte Peptideinheit oder sogar eine vierte oder weitere Peptideinheiten zugefügt werden. Abhängig von der gewählten Kombination von Peptideinheiten, machten es die diagnostischen Tests gemäß der Erfindung in der Tat möglich, eine Sensitivität von 88-92 % zu erreichen.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001
  • Figure 00240001
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  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001

Claims (9)

  1. Eine Peptideneinheit die eine Sequenz beinhaltet die selektiert wurde aus der Gruppe die besteht aus dem Peptid 0002-27 HQKRGCitGWSRAA, dem Peptid 0002-29 HQRRVCitGWSRAA, dem Peptid 0002-31 HQRRTCitGGSRAA, dem Peptid 0002-32 HQRKWCitGASRAA, dem Peptid 0002-36 HQFRFCitGCitSRAA, dem Peptid 0002-37 HQKWRCitGRSCitAA und dem Peptid 0002-63 HQFRFCitGWSRAA.
  2. Eine Peptideneinheit gemäss dem Anspruch 1, die außerdem eine Peptideneinheit enthält die eine Sequenz beinhaltet die selektiert wurde aus der Gruppe die besteht aus dem Peptid 0107-32 KPYTVCitKFMRRP, dem Peptid 0107-35 ARFQMCitHCitRLIR, dem Peptid 0107-45 YSFVWCitSHARPR, dem Peptid 0113-30 ARFQMRHCitRLIR und dem Peptid 0218-36 RNLRLCitRERNHA.
  3. Eine Peptideneinheit gemäss den Ansprüchen 1 und 2 die zyklisch ist.
  4. Eine Peptideneinheit gemäss dem Anspruch 3, die eine ringförmige Struktur hat, dessen Ring mindestens 8 Aminosäuren enthält.
  5. Eine Multipeptideneinheit die eine Peptideneinheit enthält gemäss den Ansprüchen 1 bis 4.
  6. Ein Ex-vivo-Verfahren zur Aufspürung von Autoimmunkörper von Patienten die leiden an rheumatoider Arthritis, wobei mindestens ein Reagenzpeptid das ein Residuum von Citrullin enthält, während einer genügend lange Zeit in Kontakt gebracht wird mit den obengenannten Autoimmunkörpern damit ein Komplex entsteht zwischen dem obengenannten Reagenzpeptid und den obengenannten Autoimmunkörpern, woraufhin der obengenannte Komplex aufgespürt wird, welches Verfahren sich dadurch kennzeichnet dass das obengenannte Reagenzpeptid eine Peptideneinheit gemäss den Ansprüchen 1 bis 5 enthält.
  7. Eine Ausrüstung für diagnostische Proben zur Ex-vivo-Feststellung der Präsenz von Autoimmunkörper von Patienten die leiden an rheumatoider Arthritis, dadurch gekennzeichnet dass sie ein Peptid gemäss den Ansprüchen 1 bis 5 enthält, zusammen mit mindestens einem anderen Reagenz.
  8. Ein Verfahren zur Selektion eines Peptids geeignet für die Ex-vivo-Diagnose rheumatoider Arthritis, wobei eine Peptidenbibliothek untersucht wird mit den Immunkörpern erhalten von Patienten die leiden an rheumatoider Arthritis und wobei die Peptidenbibliothek selektiert wird aus einer Gruppe die besteht aus: Bibliothek (1): H Q E X X Cit X X S R A A wobei X jede Aminosäure ist mit Ausnahme von Cystein und Tryptophan Bibliothek (2): H Q X X X Cit G X S R/Cit A A wobei X jede Aminosäure ist mit Ausnahme von Cystein, aber einschließlich Citrullin Bibliothek (3): H Q E X X Cit X X S R/Cit A A wobei X jede Aminosäure ist mit Ausnahme von Cystein, aber einschließlich Citrullin Bibliothek (4): X X X X X X Cit X X X X X wobei X jede Aminosäure ist mit Ausnahme von Cystein, aber einschließlich Citrullin.
  9. Benutzung einer Peptideneinheit die eine Konsensussequenz HQXXXCitGXS[R/Cit]AA enthält zur Ex-vivo-Aufspürung von Autoimmunkörper die spezifisch sind für rheumatoider Arthritis, wobei X jede Aminosäure ist mit Ausnahme von Cystein, aber einschließlich Citrullin und wobei Cit Citrullin ist.
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