CN1153530A

CN1153530A - 相关于类风湿性关节炎的msrv-1病毒和致病性和/或感染性msrv-2因子

Info

Publication number: CN1153530A
Application number: CN96190173A
Authority: CN
Inventors: H·普朗; B·曼德朗德; F·马莱特; F·比丁; F·比塞姆
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1995-03-09
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 1997-07-02

Abstract

本发明涉及一种病毒物质的应用，其为纯化态或分离态，有逆转录酶活性，涉及内源性逆转录病毒因子的一个家族，本发明还/或涉及一种致病和/或感染因子的应用，该因子处于纯化态或分离态，它不同于上述病毒物质，它们每一个都衍生于一种有逆转录酶活性的病毒株，该株选自被分别称为POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号V93010816)的两种病毒株及其变异株，这些毒株包括的病毒有至少一种抗原，它能被至少一种抗体所识别，该抗体能直接针对相关于上文提到的病毒株POL-2和MS7PG之一的至少一种抗原，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由相关于类风湿性关节炎的上述病毒物质和/或上述致病和/或感染因子引起的感染。

Description

相关于类风湿性关节炎的MSRV-1 病毒和致病性和/或感染性MSRV-2因子

类风湿性关节炎(RA)是最常见的人类炎性风湿病，其流行程度也特别高：3％⁽¹⁾。起初的诊断很困难：其临床异质性，及与某些时候重要的免疫学异常相关的关节外症状，使之更为复杂化。这是一种目前仍不知病因的疾病，它被归在自身免疫病一类，因为它有对自身抗原的加剧的免疫学反应。

有关RA的病毒性的和/或细菌性的病因学常常被提出来，但迄今为止仍不能成功地找到RA的致病因素⁽²⁾。

将RA定义为一种自身免疫病的概念以及那些支持病毒性或甚至细菌性病因学假说的概念很可能现已结合进对多种机制的理解中，就如由Fujinami R.S.和Oldstone M.B.A⁽³⁾所描述的，一种微生物可以在被感染的宿主体内诱发一种自身免疫反应。已知细菌性或病毒性来源的分子，或者甚至是内源性逆转录病毒来源的分子均具有所谓超抗原特性^{(4， 5)}。它们通过结合某些“T”受体的V区而直接刺激那些对不同的抗原具有专一性的T淋巴细胞，这一特点导致一种假说，即这些分子与自身免疫病理学的疾病发生过程是密切相关的⁽⁶⁾。然而，尚无任何特殊的细菌性或病毒性致病因素及可能的超抗原产生物，能明确地与类风湿性关节炎相关。

本申请人的寻找RA病因的工作现已导致发现了存在两种病理学和/或感染性因子，各自独立或是联合地，相关于RA的病理学状态。

由本申请人在研究多发性硬化症(MS)的某个相关因素的工作中所用到的、并在法国专利申请92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，9401530，94 01531和94 01532中描述过，以及H.Perron et al.⁽⁷⁾的发表文章中描述过的培养和检测逆转录病毒性物质的技术，使得有可能完全意外地证实MS的相关因素与那些构成本发明主题的RA相关因素之间的相似性。

假定，在RA中，该过程发生在关节处，而且更特别牵涉到滑膜，则培养物应该用从RA病人受感染的关节中穿刺得到的滑液中的细胞来制备。使用这样一种培养物，就有可能获得在体外增殖的成纤维细胞型的细胞，从而允许进行一些实验。该培养基质被用于对经超离心再经等密度梯度离心纯化而浓缩的感染性颗粒的有关逆转录酶活性进行研究。所用到的检测条件是从源自MA⁽⁷⁾的LM7株发展来的，它能检测该梯度的许多不同级份的有效逆转录酶活性。而后，用与有逆转录酶活性的酶分子的共有序列相似的简并引物经PCR(聚合酶链式反应)技术分析在这些级份中扩增的核酸序列，揭示了有效序列的存在，它与致病性和/或传染性因子MSRV1和MSRV2的序列相同，该序列事先已在得自多发性硬化症的病例的培养物中得到鉴定。

因此，本发明的各种主题如下：

I)使用一种病毒物质，该物质为纯化或分离状态，有逆转录酶活性，相关于某内源性逆转录病毒因子家族，得自某有逆转录酶活性的病毒株，而该株是从分别被称为POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申请且登录号为V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申请且登录号为V9310816)的两种病毒株及其变异株中选出来的，这些变异株由带至少一种抗原的病毒组成，该抗原能被至少一种抗体所识别，而该抗体又直接针对相关于上文提到的病毒株POL-2和MS7PG的病毒中任何一个的至少一种抗原，目的是获得诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述病毒物质或其一种再激活物(均是与类风湿性关节炎相关的)引起的感染。

ii)使用一种病毒物质，该物质为纯化或分离状态，有逆转录酶活性，相关于内源性逆转录病毒因子家族，由某个细胞系产生，该细胞系选自分别被称为PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号93010817)的细胞系，或由任一种能产生带至少一种抗原的病毒的受感染细胞培养物产生，该抗原能被至少一种抗体识别，该抗体又直接针对相关于由前述PLI-2和LM7PC细胞系产生的任何一种病毒的至少一种抗原，目的是获得诊断预防或治疗组合物以检测、防止或治疗由上述病毒物质或者该病毒物质的再激活物(其均与类风湿性关节炎有关)引起的感染。

iii)使用一种病毒物质，其基因组包括选自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列和等价序列的一段核苷酸序列，特别是该核苷酸序列，在任一段由100个相邻单体组成的序列上，与选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的一段核苷酸序列有至少50％、优选至少70％的同源性，为的是要获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或处理某感染，这种感染由上述病毒物质或其再激活物(均相关于类风湿性关节炎)引起。

iv)使用一种逆转录病毒物质，该逆转录病毒物质基因组的pol基因包括一段等价核苷酸序列，它与属于逆转录病毒ERV-9或HSERV-9的基因组的pol基因的一段核苷酸序列有至少50％、优选至少65％的同源性，目的是获得诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗一种感染，此感染由上述病毒物质或其再激活物(均相关于类风湿性关节炎)引起。

v)使用一种逆转录病毒物质，其基因组的pol基因编码一段肽序列，此肽序列与由逆转录病毒ERV-9或HSERV-9基因组的pol基因所编码的肽序列有至少50％、优选至少70％同源性，目的是获得诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗感染，该感染是由上述病毒物质及其再激活物(均与类风湿性关节炎有关)引起。

vi)使用一种逆转录病毒物质，其基因组的pol基因编码一段肽序列，对于该肽序列上任一段连续的至少带30个氨基酸的序列而言，该肽序列与由选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的一段核苷酸序列所编码的一段肽序列有至少50％、优选至少70％同源性，为的是获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗某感染，此感染由上述病毒物质及其再激活物(均与类风湿性关节炎相关)引起。

vii)使用一段核苷酸片段，其核苷酸序列包括选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，尤其是这样的核苷酸序列即其任一段含有100个紧邻单体的连续序列与选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的一段序列有至少50％、优选至少70％同源性，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗一种感染，它由上述病毒物质，及其再激活物(均与类风湿性关节炎相关)引起。

viii)使用一种特殊的引物，该引物包括一段核苷酸序列，该序列与vii)中所定义的片段的核苷酸序列至少部分相同或等价，尤其是这样的核苷酸序列，在其任一段带10个连续单体的序列上，与上述片段的至少一部分有至少70％同源性，目的是通过聚合作用对相关于类风湿性关节炎的一种病毒物质的DNA或RNA进行扩增，依照某一优选的应用，该引物包括一段选自SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO47，SEQ IDNO48和SEQ ID NO49及其互补序列的核苷酸序列。

ix)使用一探针，它包括一段核苷酸序列，其相同于或等价于vii)中定义的一个片段的至少一部分核苷酸序列，特别是一个核苷酸序列即在其任一段含10个连续单体的序列上与上述片段的至少某一部分具有至少70％的同源性，是为了获得一种组合物以检测、区分或鉴定一种生物学样品中与类风湿性关节炎相关的一种病毒物质或其激活物；按照一种优选的应用，该探针包含一个选自SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO16，SEQ IDNO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ IDNO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ IDNO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ IDNO33，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48和SEQ ID NO49及其互补序列的核苷酸序列。

x)使用一种致病性和/或感染性因子，其为纯化或分离状态，区别于从i)到vi)任一项中定义的病毒物质，它来自一种病毒株，而该病毒株选自分别被称为POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申请且录入号为V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号为V93010816)的病毒株及其变异株，组成病毒株的致病性和/或感染性因子包括至少一种抗原，该抗原能被至少一种抗体识别，而这种抗体是能直接针对相应于上文提到的POL-2和MS7PG病毒株的致病性和/或感染性因子中的任一种的至少一种抗原，这些因子均不同于上述病毒株的任一种逆转录病毒物质，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗一种感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均相关于类风湿性关节炎)引起。

xi)使用一种致病性和/或感染性因子，其为纯化或分离状态，不同于从i)到vi)中任一项定义的病毒物质，由一个选自被分别称为PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号为92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号为93010817)的两个细胞系中的一个细胞系产生以及由能产生至少任一种致病性和/或感染性因子的受感染细胞培养物产生，和/或由它们的变异物产生，或者由一种能产生带至少一种抗原的致病性和/或感染性因子的受染细胞培养物产生，这种抗原能被至少一种抗体所识别，该抗体则直接针对至少一种相应于由上文提到的PLI-2系和LM7PC细胞系产生的任一种致病性和/或感染性因子的抗原，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防治或治疗一种感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均相关于类风湿性关节炎)引起。

xii)使用一种带一种核酸的致病性和/或感染性因子，此核酸包括一段选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ IDNO40和SEQ ID NO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是与含有选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ IDNO40，SEQ ID NO41及其互补序列的一段序列的核苷酸序列有至少70％、优选至少90％同源性的核苷酸序列，以获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗一种感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均与类风湿性关节炎相关)引起。

xiii)使用一核苷酸片段，它带有一段选自SEQ ID NO 10，SEQ IDNO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这样的核苷酸序列即在其任一段含100个连续单体的序列上与选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ IDNO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列的一段序列至少有70％、优选至少90％同源性，以获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗某感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均与类风湿性关节炎相关)引起。

xiv)使用一种引物，它带有相同于或等价于xiii)中定义的一个片段的至少一部分核苷酸序列的一段核苷酸序列，尤其是在其任一段含10个连续单体的序列上与上述片段的至少某一部分有至少90％同源性的核苷酸序列，以通过聚合来对相关于类风湿性关节炎的致病性和/或感染性因子的一段RNA或DNA进行扩增；依照某较有利的用法，该引物包含一段选自SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ IDNO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ IDNO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ IDNO44，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46及其互补序列的核苷酸序列，

xv)使用一种探针，它含有一段相同于或等价于xiii)中定义的一个片段的至少一部分核苷酸序列的核苷酸序列，尤其是这样的核苷酸序列即在其任一段带10个连续单体的序列上与上述片段的至少一部分有至少90％同源性，以获得诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗某感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其激活物(均相关于类风湿性关节炎)引起；依照一种较有利的用法，该探针带有一段选自SEQ ID NO1 0， SEQ ID NO11， SE Q IDNO13，SE Q ID NO14，SEQ ID NO 15，SE Q ID NO27，SEQID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SE Q ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ IDNO44，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46及其互补序列的核苷酸序列，

xiv)使用一种带有两种致病性和/或感染性因子的组合物，其为分离或纯化状态，即，具有逆转录酶活性、并与内源性逆转录病毒因子家族有关的人病毒或其变异株组成的第一因子，以及第二因子或该第二因子的变异体，这两种致病性和/或感染性因子是来自相同的病毒株，该病毒株选自分别被称为POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号V93010816)的两株病毒株及其变异株，为的是获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗某感染，它由第一种致病性和/或感染性因子，以及第二种致病性和/或感染性因子(均相关于类风湿性关节炎)或是上述第一因子或上述第二因子的再激活物引起，

xvii)使用一种由两种致病性和/或感染性因子组成的组合物，是处于分离或纯化状态的，即，由一种带逆转录酶活性、并相关于内源性逆转录病毒因子家族的一种人类病毒或其变异体组成的第一因子，以及第二因子或其变异体，这两种致病性和/或感染性因子是由相同的细胞系产生，该细胞系选自被分别称为PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号93010817)的两个细胞系，这两种因子也可用一种能产生至少任一个致病性和/或感染性因子的一种受感染细胞培养物和/或其变异物产生，为的是获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗某感染，它由第一致病性和/或感染性因子，和第二致病性和/或感染性因子(它们均相关于类风湿性关节炎)或是上述第一因子或第二因子的再激活物引起。

xviii)使用一种含有两种致病性和/或感染性因子的组合物，其为分离或纯化态，就是说，由一种病毒或其变异物组成的第一因子，其基因组包括一个选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQID NO43及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，尤其是这样的核苷酸序列即在其任一段含100个连续单体的序列上，与选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的一个核苷酸序列有至少50％、优选至少70％的同源性，以及第二致病性和/或感染性因子，其基因组合有一个选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，尤其是这样的核苷酸序列即在其任一段带100个连续单体的序列上，与选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列的一个核苷酸序列有至少70％、优选至少90％的同源性，为的是获取一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗某感染，它由第一致病性和/或感染性因子，和第二致病性和/或感染性因子(均相关于类风湿性关节炎)或者上述第一因子或上述第二因子的一种再激活物引起，

xix)使用一种核苷酸片段组合物，该组合物包括第一片段和第二片段，第一片段含有一个选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQID NO43及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这样的核苷酸序列即在任一段含100个连续单体的序列上，与选自SEQ ID NO1，SEQID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，和SEQ ID NO43及其互补序列的一段核苷酸序列有至少50％、优选至少70％的同源性，第二片段含有一个选自SEQ IDNO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ IDNO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这样的核苷酸序列即在其任一段有100个连续单体的序列上，与选自SEQ ID NO10，SEQID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列的一个核苷酸序列有至少70％、优选至少90％的同源性，上述每个片段特别是一个探针，以获得一种诊断，预防或治疗组合物来检测第一致病性和/或感染性因子，和第二致病性和/或感染性因子(均相关于类风湿性关节炎)，或一种上述第一因子或上述第二因子的再激活物。

xx)使用一种含有ix)中定义的第一核苷酸片段部分地或全部地编码出的一种第一多肽，及由ix)中定义的第二核苷酸片段部分或全部地编码的一种第二多肽的组合物，以获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测第一致病性和/或感染性因子和第二致病性和/或感染性因子(均与类风湿性关节炎相关)；按一种优选的用法，这种组合物包括一个第一配体和一个第二配体，第一配体特别是能特异性针对第一多肽的一种抗体，第二配体特别是能特异性针对第二多肽的一种抗体，所述第一和第二多肽在上文中已有定义，

xxi)一种产生i)到vi)中任一项所定义的第一致病性和/或感染性因子和/或x)到xii)中任一项所定义的第二致病性和/或感染性因子的方法，这些因子均与类风湿性关节炎相关，其特征是来自滑液穿刺的细胞在体外培养，这些细胞特别是选自类风湿性关节炎病人关节液的脱皮成纤维细胞和滑膜成纤维细胞，

xxii)一种产生i)到vi)中任一项定义的第一致病性和/或感染性因子和/或x)到xii)中任一项定义的第二致病性和/或感染性因子的方法，各因子均与类风湿性关节炎相关，其特征是经Epstein-Barr病毒无限增殖化的B淋巴细胞经体外培养，这些细胞来自类风湿性关节炎患者，

xxiii)一种核苷酸片断，其核苷酸序列含有一段选自SEQ IDNO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这样的核苷酸序列即在其任一段含100个连续单体的顺序中，与选自SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互补序列的一段序列显示出至少50％、优选至少70％的同源性，

xxiv)一种用于扩增的特定引物，该扩增是通过聚合作用对按上述i)ii)iii)iv)v)或vi)描述的一种病毒物质的某段RNA或DNA进行的，这种引物包括一个相同于或等价于xxiii)中所述的一个片段的至少一部分核苷酸序列，特别是一个显示了与至少部分的上述片段在任一个含10个连续单体的顺序上有至少70％同源性的核苷酸序列；本发明的一个优选引物包括选自SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，以及他们的互补序列的一个核苷酸序列，

xxv)一种能与上面i)ii)iii)iv)v)或vi)中所述的一种病毒物质的RNA或DNA特异性杂交的探针，它包括一段等同于或等价于xxiii)中描述的一个片段的至少一部分核苷酸序列的核苷酸序列，特别是一段在其任一段含10个连续单体的顺序上与上述片段的至少一部分显示出70％同源性的核苷酸序列；本发明的一个优选探针包括选自SEQ ID NO47，SEQID NO48，SEQ ID NO49以及它们的互补序列的一个核苷酸序列，

xxvi)一个核苷酸片段，其核苷酸序列包括选自SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及它们的互补序列和等价序列的一个核苷酸序列，特别是在其任一个含100个连续单体的顺序上，与选自SEQ ID NO40，SEQ IDNO41及它们的互补序列的一个序列显示出至少70％、优选至少90％同源性的核苷酸序列，

xxvii)一个用于扩增的特定引物，扩增是通过聚合作用对上面x)xi)或xii)中所述的一种病毒物质的RNA或DNA进行的，该引物包括一个相同于或等价于xxvi)中描述的一个片段的至少部分核苷酸序列的核苷酸序列，特别是一个在其任一个含10个连续单体的顺序上与上述片段的至少一部分显示出至少90％同源性的核苷酸序列；本发明的一个优选引物包括选自SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46及它们的互补序列的一段核苷酸序列。

xxiii)一个能与上面x)xi)或xii)中描述的一种病毒物质的RNA或DNA进行特异性杂交的探针，它包括一段相同于或等价于xxvi)中描述的片段的至少部分核苷酸序列的核苷酸序列，特别是一个在其任一段含10个连续单体的顺序上与上述片段的至少一部分显示出至少90％同源性的核苷酸序列；本发明的一个优选探针包括一段选自SEQ ID NO44，SEQID NO45，SEQ ID NO 46及其互补序列的核苷酸序列。

在详细介绍本发明之前，现在先规定出在说明书和权利要求书中用到的各种术语：

-菌株或分离株被认为是指任何感染性和/或致病性生物学成分，例如，包括病毒和/或细菌和/或寄生虫，并产生一种致病性和/或抗原性能力，能包含于培养物或活性宿主体内；通过举例的方式，按上文所规定的一种病毒株可能会包括一个共感染因子，如一种致病性原生生物，

-本说明书中所用术语“MSRV”表示任一种致病性和/或感染性因子，相关于MS或RA，特别是一种病毒种，该病毒种的减毒株或从该种衍生出的缺损干扰颗粒。众所周知，病毒特别是含RNA的病毒具有一种变异性，尤其是出现相对高水平的自发突变之后⁽⁹⁾，下文中将考虑到这点以定义等价的概念。

-人类病毒这一术语指一种能感染人类的病毒，

-考虑到在实施本发明时可能遇到的所有天然的或诱导的变异，本发明的主题(包括上文规定的和权利要求书中有的)在文中均被表达为包括以下规定的各种生物学物质特别是核苷酸或多肽同源序列的等价物或衍生物，

-本发明的一种病毒或一种致病性和/或感染性因子的变异体包括至少一种抗原，它能被至少一种直接针对与上述病毒和/或上述致病性和/或感染性因子相应的至少一种抗原的抗体所识别，和/或包括一个基因组，其中任一部分都能用至少一种杂交探针来检测，和/或包括至少一种核苷酸扩增引物，比如象那些有选自SEQ ID NO13到SEQ ID NO38和SEQ ID NO44到SEQ ID NO49及其互补序列的一个核苷酸序列，在本领域的技术人员所熟知的特异性杂交条件下专一地针对上述病毒和/或致病性和/或感染性因子，

-按本发明，一个核苷酸片段或一个核苷酸或一个多聚核苷酸是单体的一种排列，或一种生物多聚体，有天然核酸的信息序列的特征，能在预定条件下与任何其他核苷酸片段杂交，这种排列有可能包容了不同化学结构的单体，而且可能来自一种天然核酸分子和/或通过遗传重组获得和/或通过化学合成而获得，

-因此，一种单体可能是核酸的一种天然核苷酸，其组成为一种糖、一种磷酸基团和一种含氮碱基；RNA中此糖为核糖，DNA中此糖为2-脱氧核糖；依据该核酸是DNA还是RNA，此含氮碱基则选自腺嘌呤、鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶；或者此核苷酸可能在三种组成成分中至少有一种被修饰；举例来说，修饰可能发生在碱基内，产生已修饰过的碱基如次黄嘌呤核苷，5-甲基脱氧胞嘧啶核苷，脱氧尿嘧啶核苷，5-(二甲基氨基)脱氧尿嘧啶核苷，2，6-二氨基嘌呤，5-溴脱氧尿嘧啶核苷和任何其它促进杂交的修饰碱基；就糖而言，修饰作用可包括用一种多聚酰胺取代至少一个脱氧核糖⁽¹⁰⁾，而考虑到磷酸基因，修饰作用可包括用酯类取代，特别是从二磷酸酯、烷基和芳基碳酸酯和硫代磷酸酯，

-“信息序列”是指任意有序的单体序列，其化学性质和在某参照方向中的顺序构成或不构成如同天然核酸一样性质的一条有用信息，

-杂交指一过程，在这过程中，在适当的操作条件下，有足够的互补序列的两种核苷酸片段配对到一起，形成一条复合链，尤其是一双链或三链，优选呈一螺旋形式。

-探针包括一段化学合成或是经消化或酶裂解某一较长的核苷酸片段而得的核苷酸片段，有至少6个单体，较有利的是从10到100个单体，优选10至30个单体，且在特殊条件下有杂交特异性；更可取的是，一种少于10个单体的探针并不单独使用，而是在有其他相同大小或不同大小的探针存在的情况下使用；在一种特殊条件下，使用较长的探针也可能有用，如超过100个单体的探针；一种探针有可能被特别用于诊断目的，而这样的探针就将是，举个例子来说，捕获和/或检测探针。

-这种捕获探针可用任何适当的方式，也就是说直接地或间接地，固定在一种固相支持物上，如可通过共价结合或被动吸附，

-这种检测探针可进行标记，用特别选自放射性同位素的标记物标记，用特别选自过氧化物酶和碱性磷酸酶，以及那些能水解一种产色、产荧光、或发光底物的酶来标记，还可用生色的化合物，产色、产荧光的或发光的化合物，核苷酸碱基的类似物以及生物素标记。

-本发明中用于诊断的探针可被用于所有已知的杂交技术，特别是“斑点印迹”⁽¹¹⁾、“Southern印迹”⁽¹²⁾、“Northern印迹”(是一种相同于“Southern印迹”但使用RNA作为靶子的技术)，及夹心技术⁽¹³⁾；本发明中较有利的是夹心技术的应用，它包括一种特异性的捕获探针和/或一种特异性的检测探针，应理解，这里的捕获探针和检测探针应具有至少是部分不同的一个核苷酸序列。

-本发明还包括一种能在体内或体外与RNA和/或DNA杂交的探针，以锁定复制现象，尤其是翻译和/或转录，和/或降解上述DNA和/或RNA，

-引物是带有至少6个单体、优选有10至30个单体、在特殊条件下有杂交专一性的探针，它是为了启动酶促聚合反应，如在诸如PCR(聚合酶链式反应)这样的扩增技术中，在象排序这样的延伸过程中，在逆转录方式或类似过程中，

-两种核苷酸或肽序列被说成是就它们相互间而言，就一参照序列而言是等价的或派生的，前提是如果就功能性来说，相应的生物聚合物即使不相同，考虑到应用或在它们所涉及的技术中，可能实质上扮演了相同的角色；特别等价的序列是在天然变异基础上得到的两个序列，尤其是从它们被鉴定出的生物种的自发突变或诱导而得序列以及具有下面定义的同源性的同源序列。

-变异性指对序列的任何自发或诱导的修饰，尤其是由取代和/或插入和/或缺失核苷酸和/或核苷酸片段而造成的，和/或在至少一个末端延长和/或缩短序列而造成的；非天然变异可能是由于使用遗传工程技术的结果，例如挑选简并或非简并合成引物来选择性地扩增某一核酸而造成的；这种变异可能会表现为对任一起始序列的修饰，作为参照来考虑，它也可能以相对于上述参照序列的同源性程度来表达，

-同源性表现了两种相比较的核苷酸或肽片段相似性的程度；它用相似性的百分率来计算，这特别是将核苷酸或肽序列与参照核苷酸或肽序列直接比较而得到的，

-这种相似性百分率已被专一地用于测定组成本发明的一个部分的核苷酸片段，它们与鉴定自SEQ ID NO1至SEQ ID NO9，SEQ IDNO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43的片段同源(MSRV-1)，这是一个方面，另一方面还有那些与鉴定自SEQ ID NO10至SEQ IDNO12，及SEQ ID NO40至SEQ ID NO43的片段同源的片段(MSRV-2)，就象测定与鉴定自SEQ ID NO16至SEQ ID NO26，SEQ IDNO31至SEQ ID NO33和SEQ ID NO47至SEQ ID NO49的探针和引物同源的探针和引物的相似性程度一样，这是其一，还有那些鉴定自SEQID NO13至SEQ ID NO15，SEQ ID NO27至SEQ ID NO30，SEQ IDNO34至SEQ ID NO37及SEQ ID NO44至SEQ ID NO46的探针和引物，这是其二；经实例论证，在得自MSRV-1的病毒RNA片段的核酸上各种通用共用序列之间所观察到的最低相似百分率在图2所描绘的区段中是67％，而MSRV-1则是根据稍后所要概括的步骤从LM7PG和PLI-2细胞系中衍生来的。

-任一个核苷酸片段若具有等价于参照序列的核苷酸序列，它就被说成是等价于或衍生于参照片段；根据上面的定义，以下片断特别等价于参照核苷酸片段：

a)任何能至少部分地与参照片断的互补片断杂交的片段

b)与参照片断对比时显示出数量上多于其它任何源于其它分类群的相同连续碱基的任何片断，

c)由其来源于的生物种的天然变异所产生或易于产生的任何片段

d)任何易于由对参照片段应用遗传工程技术而得到的片段

e)任何片段，包括至少8个紧邻的核苷酸，编码一种与参照片段所编码的肽同源或相同的肽

f)任何由于插入、缺失、取代至少一个单体，延长或缩短至少一个末端而区别于参照片段的片段；如，任一个相应于参照片段在至少其中一个末端上用不编码多肽的核苷酸序列填充的片段

-多肽一词特指一种至少有2个氨基酸的肽，特别是寡肽或蛋白质，通过人的干预而提取、区分或大体上分离出或合成的，特别是那些用化学合成或在重组有机物中表达而得到的，

-至少部分是由核苷酸片段编码出的表达多肽被理解为，有至少3个由包含于上述核苷酸片段的至少9个紧邻的单体编码的氨基酸的多肽

-一个氨基酸在如下情况中被说成另一个氨基酸的类似物：即当它们各自的理化性质，如极性、疏水性和/或碱性和/或酸性和/或中性，都基本上相同时；因此，亮氨酸是异亮氨酸的类似物

-一个多肽被说成是等价于或源自一个参照多肽，条件是进行比较的多肽具有大体相同的性质，而且特别是相同的抗原性、免疫学酶学和/或分子识别性质；特别是以下多肽均等价于一个参照多肽：

a)具有一个序列的任一个多肽，该序列中至少有一个氨基酸被一个类似氨基酸取代，

b)任一个有等价肽序列的多肽，它由上述参照多肽和/或编码上述多肽的核苷酸片段的自发变异或诱导变异而得到，

c)上述参照多肽的一个minotope，

d)任一个多肽，在其序列中一个或更多的来自L系列的氨基酸被一个来自D系列的氨基酸取代，反之亦然。

e)任一个多肽，其中，相应的亲代肽(其肽链上不含任何NH-CO键)的肽链上的至少一个CO-NH链、最好是所有CO-NH键被一个(或更多)NH-CO键所取代，

f)任一个多肽，其中相应的亲代肽(其肽链上不含任何NH-CO键)的肽链上的至少一个CO-NH链、最好是所有CO-NH链被一个(或更多)NH-CO键取代，每个氨酰残基的手性，不管它是否被牵涉进一个或更多上文提到的CO-NH键，相对于组成上述亲代肽的相应氨酰残基而被保留或被转化，这些肽类化合物还被表示为immunoretroids，

g)任一个多肽，其序列中对氨基酸侧链的修饰已经被导入，象胺功能的乙酰化，巯基功能的羧化或羧基功能的酯化，

h)任一个多肽，其序列中一个或多个肽键已被修饰，如卡巴、逆、反向，逆反，被还原和亚甲氧基键，

i)任一个多肽，它的至少一个抗原能被参照多肽的一抗原识别。

-两个相对照的肽段表现同源性特征的相似性百分率，按本发明，是至少50％，且优选至少是70％。

假定一种有逆转录酶酶活性的病毒可能被按遗传学的方式表示为RNA和DNA形式的特征，就应该同时提及病毒性DNA和病毒性RNA，以鉴定与有这样的逆转录酶活性的病毒(MSRV-1)有关的序列的特征。

假定在受染细胞中，这种致病性和/或感染性因子(MSRV-2)一起作为DNA和作为RNA被检测出来，它的特征也应表示成DNA或RNA形式。

本说明书及权利要求书中用到的“序列”一词，如“第一核苷酸序列”均不用于表达一个特殊的顺序，而是为了更清楚地解释本发明。

在阅读了下列详细说明后，将对本发明有较好的理解，同时也需参考附图，它们是：

-图1描述了根据shih的过程⁽⁸⁾得自LM7培养物的MSRV-2A型的序列；该序列在参考SEQ ID NO10之下被鉴定出来

-图2描述了经PCR技术在“pol”区扩增到的MSRV-1B序列的通用核酸共有序列，用的病毒性DNA来自LM7PC和PLI-2细胞系，被识别在SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5和SEQ IDNO6，带SEQ ID NO7的扩增引物的常见共有序列之下。

-图3描述了在shih⁽⁸⁾定义的“pol”区的PCR得到的MSRV-1B型的序列的系统树。

-图4给出了每个MSRV-1B/“PCR POL”型家族的功能性阅读框架的定义，上述家族A到D分别被图2中定义的核苷酸序列SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所定义，

-图5给出了MSRV-2B序列的共有序列的一个实例，鉴定为SEQ ID NO11，

-图6描述了PSJ17克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO9)，

-图7描述称为M003-P004的克隆的核苷酸序列SEQ ID NO8，

-图8描述了F11-1克隆的SEQ ID NO2核苷酸序列；在引物区两个箭头所指部分相应于在对用于克隆F11-1的引物进行选择时产生的变异；在这同一个图上还描述了翻译成氨基酸的结果。

-图9描述了SEQ ID NO1核苷酸序列，及可能将SEQ ID NO1读成氨基酸的一个功能性框架；在这个序列中，逆转录病毒性逆转录酶的序列下被划了线。

-图10描述了被称作MSRV2EL1的克隆的核苷酸序列SEQ IDNO12，

-图11，由三个连续页组成，它描述了按照6个可能的阅读框架将SEQ ID NO12(包括引物SEQ ID NO13)翻译为氨基酸，

-图12显示了在MSRV2-EL1序列(SEQ ID NO12)上MSRV2-A序列(SEQ ID NO10)的一种排列；引物杂交区识别在SEQ IDNO13参照下(除了克隆尾部以外)，在同一图中框出；识别在SEQ IDNO14参照下的引物杂交区则表示在方括号之间，

-图13描述了在实施例7所规定的条件下对逆转录酶活性的测定，测定是在蔗糖梯度的级分中进行的，该梯度已完成沉隆作用达到了存在于培养细胞上清液的感染性和/或致病性因子的平衡点，该细胞取自类风湿性关节炎病人的关节液，就如实施例7所描述的那样；该曲线描绘了在梯度的不同部分逆转录酶活性的变化；该活性以DPM(每分钟分解量)为单位表示在Y轴上；X轴代表在梯度上按密度递增顺序收集到的部分(从第1级分到第10级分)，

-图14，分为图14A，14B和14C，在图14A中显示被SEQ IDNO39识别的“MSRV-1 pol PR”克隆的序列，它是在实施例9规定的条件下得自一类风湿性关节炎样品；图14B和14C显示了分别带SEQID NO1和SEQ ID NO6的这个克隆的序列排列，它与得自多发性硬化症来源的样品的逆转录病毒MSRV-1的序列是一致的。

-图15，分成图15A，15B和15C，在图15A中，显示，被SEQID NO40识别的“MSRV2sPR”克隆的序列，它是按实施例9所规定的条件从类风湿性关节炎样品中得到的；图15B和15C显示这个分别带SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的克隆的序列排列，它与得自多发性硬化症来源的感染因子MSRV-2的序列一致，

-图16显示被SEQ ID NO41识别的“MSRV2cPR”克隆的序列，它按实施例10所规定的条件从类风湿性关节炎病人的关节液的细胞中得到，

-图17显示被SEQ ID NO41识别的“MSRV2cPR”克隆的序列，它是得自类风湿性关节炎的关节液的细胞，以及带SEQ ID NO10的该克降的序列末端部分(654-705)的排列，与得自多发性硬化症样品的MSRV-2感染因子的序列一致，

-图18显示被SEQ ID NO41识别的“MSRV2cPR”克隆的序列，得自类风湿性关节炎的关节液的细胞，以及这个带SEQ ID NO12的克隆的序列排列，与多发性硬化症来源样品的MSRV-2感染因子的一个序列一致，

-图19显示被SEQ ID NO42识别的“MSRV1nPR”克隆的序列，它是用类风湿性关节炎的关节液得出的，是按实施例10规定的条件进行的。

-图20显示被SEQ ID NO43识别的“MSRV1nPR”克隆的序列，得自类风湿性关节炎的关节液的细胞，而且这个带SEQ ID NO1的克隆的序列排列与来自多发性硬化症样品的MSRV-1逆转录病毒的一个序列一致。

实施例1

通过在来自LM7系细胞培养物的纯化感染因子制备物中扩增依赖RNA的DNA聚合酶基因保守区，来产生被称为MSRV-2A的MSRV-2克隆。

分子学方法在于使用PCR技术⁽⁸⁾，它使得有可能扩增外源及内源逆转录病毒的pol基因的相对保守区域，也可以是能编码有逆转录酶(RT)活性的酶的病毒，如特别是乙肝病毒，更可以说是任何依赖RNA的DNA聚合酶或酶基因的，只要在这一区段内有由扩增引物所规定的足够的序列同源性。这一PCT技术被用在抽提自感染因子的纯化制品的核酸上，该制品按程序⁽¹⁴⁾从最初的LM7培养物上清⁽⁷⁾得到后就保存在-80℃的深冷冰箱中。包含了LM7型RT活性峰的级分被置于一个体积的有硫氰酸胍⁽¹⁵⁾的缓冲液中，-80℃保存，直到按P.Chomzynski⁽¹⁵⁾描述的技术抽提核酸。

PCR反应之前，样品中的RNA用所谓“随机”引物(六核苷酸的混合物)在“DNA合成系统plus”试剂盒(Amersham)中转录或互补DNA，要按照厂家的建议并基于样品中存在的RNA量的近似值，最接近于对数因子(log factor)。

对cDNA作PCR扩增后得到的DNA用TA克隆盒(Britishbiotechnology)插入一质粒中。2μl DNA溶液与5μl无菌蒸馏水、1μl10倍浓度的连接缓冲液“10X LIGATION BUFFER”、2μl“pCR^TMVECTOR” (25ng/ml)和1μl“TA DNA LIGASE”一起混合。这一混合物12℃温育过夜。随后步骤的完成按TA Cloning Kit的说明书进行。在程序的最后，挑选出重组细菌的白色菌落以便进行培养和按所谓的“小量制备”程序⁽¹⁶⁾提取有关质粒。得自每个重组菌落的质粒制备物用适当的限制酶切割并在琼脂糖凝胶上分析。用溴化乙锭对疑胶染色后，质粒上带有插入序列可在紫外光下检测出来，这种质粒经与互补于“TA Cloning Kit”的克隆质粒上的Sp6启动子的引物杂交被选择来，对插入序列测序。测序前要按使用测序盒“Prism readyreaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit”(AppliedBiosystems提供，Ref.401384)所建议的方法进行反应，且自动测序是用“Automatic Seq uencer”373A型(Applied Biosystems提供)按其厂家说明进行的。

所得序列再用Mac Vector和关于核酸序列的计算化数据库基因库的Gene works软件，及Swiss Prot(为由核酸序列中已证实的阅读框架推断出的氨基酸序列而设)进行分析。对从源于解冻的LM7上清液的病毒样品得到、并在蔗糖梯度上的逆转录酶活性峰区纯化到的序列的分析，显示了克隆的一个主要群体(约42％克隆)，相对于其他序列的单个代表的范围(总是少于5％或在少数情况中甚至小于10％)，且与已知的逆转录病毒在预期的“pol”区有部分同源性。这个克隆被称为MSRV2-A，并被SEQ ID NO10鉴别(参看图1)。在PCR引物之间被扩增的区段与由SEQ ID NO11识别的MSRV2-B(参看图5)相应序列同源，在实施例2中有描述。在位于PCR引物上的序列中发现的不同之处被解释为是因为用了简并引物作混合物，并在不同技术条件下使用。对基因库数据库的询问迄今尚无可能揭示一完全相同的序列，或是有显著同源的序列。

这个序列示于图1中。图1所示序列有一开放性阅读框架，它位于两末端都发现有PCR引物的框架中，但它要短于已知的介于这些引物之间的预期区段内的一套逆转录病毒序列。在这个序列中发现相对于相应的逆转录病毒序列⁽⁸⁾有45个碱基对(15个氨基酸)的缺失，它跟在上游引物序列之后，而下游引物之前还有一些序列。然而，该阅读框架是开放的并且贯穿包括几个引物在内的整个序列而未被打断，由它推断出的氨基酸序列与已知的各种逆转录病毒的相应区域有显著同源性。位于PCR引物内部的序列中，谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和天冬氨酸(正常情况下它们在逆转录病毒和已知的其他有逆转录酶活性的病毒的这个pol区是相当保守的)⁽⁸⁾现都被保存在新序列的阅读框架里的正确位置上。

最后，如果这个序列明显不同于数据库中已描述过的逆转录病毒序列，就能提请大家注意这是个属于新的感染和/或致病因子的序列，称为MSRV-2a。根据对所得序列的分析，这种因子大体上与一种逆转录病毒相关，但考虑到为得到这个序列所使用的技术，它也有可能是一个带有DNA的病毒，其基因组能编码一种偶然带有逆转录酶活性的酶，例如，乙肝病毒(HBV)就属于这种情况⁽⁸⁾。更进一步考虑，在这一PCR扩增技术中用到的简并引物的随机特点，会由于无法预见的序列同源性或有关的酶的基因中的保守位点，而使得有可能扩增来源于原核或真核的致病和/或其感染因子(原生物)的一段核酸。

实施例2：通过在得自LM7PC和PLI-2系的毒粒制品中对逆转录病毒的保守性pol区进行“嵌套”PCR扩增，产生被称为MSRV-1B和MSRV-2B的克隆，其分别定义一种逆转录病毒MSRV-1和共感染因子MSRV2

这里使用了一种来自Shih所发表的技术⁽⁸⁾的PCR技术。这项技术通过用DNase处理反应基质中的所有成分，使得有可能去除所有痕量污染DNA。它同时还通过在PCR扩增循环的两个连续系列内应用不同但重叠的引物，使得有可能增加由一定量RNA合成的原本就较少，后来更因DNase对RNA的干扰作用而在样品中更为减少的cDNA进行扩增的机会。实际上，DNase在用时是处于过强活性的条件下，这样就能在这种酶经85℃加热10分钟被灭活之前去除所有污染的DNA的痕迹。由Shih⁽⁸⁾所描述的PCR技术的这一变化用在一段cDNA上，该cDNA是按H.Perron描述的技术⁽¹⁴⁾从蔗糖梯度纯化的感染颗粒的片段的核酸合成的，这些颗粒一方面来自PLI- 2细胞系(ECACCNO.92072201)产生的“POL-2”分离株(ECACC NO.V92072202)，另一方面来自LM7PC细胞系(ECACC NO.93010817)产生的MS7PG分离株(ECACC NO.V93010816)。这些培养物均按构成公布在Nos.WO 93/20188和WO 92/20189的专利申请的主题的方法来获得。

用TA Cloning Kit克隆经这一技术扩增的产物并用自动测序仪按实施例1的描述分析序列后，这些序列用基因库数据库的最新适用版本的Geneworks软件进行分析。

从这些样品中克隆并测序的序列特别与两个类型的序列相关：第一型序列，发现于大多数克隆中(55％的来自PLI-2培养物的POL-2分离株的克隆和67％的来自LM7PC培养物的MS7PG分离株的克隆)，这个序列相关于一个“pol”序列家族，后者相似于但又不同于被称为ERV-9或HSERV-9的内源性人类逆转录病毒；第二型序列，它相关于那些与属于上文所指MSRV-2的感染和/或致病因子的序列有很高同源性的序列。

出现在大多数克隆中的第一型序列由这样一些序列组成，它们的多变性使得有可能定义序列的四个亚家族。这些亚家族相互间很相似，因而可以把它们看作是来自同一个逆转录病毒的类似种，就象众所周知的HIV-1逆转录病毒的情形一样⁽¹⁷⁾或者可以把它们看作是与共调节于生产细胞内的多个内源性原病毒相互作用的结果。这些或多或少有缺陷的内源因子对可能是由一个复制原病毒产生的相同调节信号敏感，因为它们属于同一个内源逆转录病毒家族⁽¹⁸⁾。这个内源逆转录病毒新家族，或者换个说法，这个新的逆转录病毒种(其类似种后代在培养物中获得，且它包括下文所述的共有序列)被称为MSRV-1B。

图2表示出本实验中测定的各种MSRV-1B克隆的序列的通用共有序列，这些序列各自被鉴别为SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5和SEQ ID NO6。这些序列与Genebank数据库中的参考X57147和M37638的HSERV9序列有从70％至88％的核酸同源性。图3描述了这些序列的系统树。此图中，A，B，C和D亚家族代表了主要在随后重复的类似实验中发现的序列，它们存在于纯化自MS7PG和POL-2分离株的毒粒的纯RNA样品中。从序列的这些家庭中定义了代表不同的可能为外源性MSRV-1B逆转录病毒的类似种、或者代表MSRV-1B内源逆转录病毒的不同亚家族的四种“共有”核酸序列。图4表示这些代表性共有序列，并翻译成了氨基酸。这些MSRV-lB序列的每个亚家族都存在一个功能性阅读框架，而且显然每例中的功能性开放阅读框架均与核酸序列下第二行上的氨基酸序列相对应。被SEQ ID NO7识别的MSRV-1B序列的通用共有序列表示在图2中，它是通过在“pol”区的这种PCR技术获得的。

出现在大多数测序的克隆的第二型序列由图5中的MSRV-2B，并由SEQ ID NOll所识别。在PCR引物之间扩增的区段与实施例1所述的位于PCR引物内的MSRV2-A序列(图1上SEQ ID NO10)，在最邻近的碱基水平上有同源性。在相应于PCR引物的序列中发现的差别被解释成在各种技术条件下使用简并引物作为混合物的结果。

MSRV-2A(SEQ ID NO10)和MSRV-2B(SEQ ID NO11)这两种序列，从迹象看(它们是同源的，或甚至相同的)是衍生自同一种生物体，而且它们明显不同于数据库中已描述的逆转录病毒序列，这就使得有可能认为这是个属于一种新感染因子的序列区，称为MSRV-2。根据已获得的对第一序列的分析，这种感染因子看起来大体上相关于某逆转录病毒，但考虑到为获得这一序列而采用的技术，它也可能是一种DNA病毒，其基因组编码偶然地具有逆转录酶活性的酶，例如，乙酐病毒(HBV)就是这种情况⁽⁸⁾。而且，在这一PCR扩增技术中用到的简并引物的随机特性，会由于无法预见的序列同源性或由于有关酶的基因中保守的位点而使得有可能扩增一段来源于原核或真核致病和/或感染因子(原生生物)的核酸。

实施例3

通过内源逆转录酶与来自PLI-2系的毒粒制品作用来产生PSJl7克隆，它定义一种逆转录病毒MSRV-1。

这条途径直接涉及从分离株中假定的逆转录病毒RNA，用同样是这个分离株所具有的逆转录酶活性获得被逆转录成的DNA序列。理论上，这种逆转录酶活性仅能在有逆转录病毒RNA时才有功能，该RNA可连在一引物tRNA上或与已在逆转录病毒颗粒中被逆转录的DNA短链杂交⁽¹⁹⁾。这样，在被细胞核酸所污染的材料中特异性逆转录病毒序列的产生就被这些作者通过病毒逆转录酶活性对病毒的RNA部分进行专一性酶促扩增的方式来优化。为此，作者们确定了专门的理化条件，在这些条件下毒粒中所带的RNA上的这种逆转录酶促活性可在体外试验中生效。这些条件与下文所述程序的技术性描述(内源逆转录酶反应，纯化，克隆和测序)相关。

这条分子途径在于使用一种浓缩但未纯化的制品，毒粒从已备的PLI-2细胞系的培养物上清液根据以下方法获得：每周收集两次培养物上清液，10,000rpm预离心30分钟以除去细胞碎片，然后冻于-80℃或者直接用于下续步骤。4℃下，新鲜或解冻的上清液在30％PBS-甘油垫层上100,000g离心(或在一个LKB-HITACHI 45T型转子中30,000rpm)2小时。弃上清液，沉淀团用小体积PBS溶解并形成浓缩但未纯化的毒粒。这种浓缩但未纯化的病毒样品被用来进行一项称之为内源逆转录作用的反应，照如下进行：按上文描述的过程纯化的毒粒200μl(其中有逆转录酶活性约1-5百万dpm)在37℃解冻直到出现液相，再置于冰上。一种5倍浓度的缓冲液已预备好，其中有如下成分：Tris-HCl pH8.2，500mM；NaCl 75mM；MgCl₂ 25mM，DTT75mM和NP40 0.10％。100μl5倍浓度(5X)缓冲液+25μl dATP浓度为100mM的溶液+25μl dTTP浓度为100mM的溶液+25μl dGTP 100mM溶液+25μl dCTP 100ml溶液+100μl无菌蒸馏水+在PBS中的200μl毒粒悬浮液(逆转录酶活性为5百万dpm)混合到一起，42℃温育3小时。进行这种温育之后，反应混合物直接加入酚/氯仿/异戊醇缓冲混合物(Sigma ref.P3803)中；收集水相并加1倍体积的无菌蒸馏水到有机相以重新抽提剩余的核酸材料。水相收集物集中起来，其中所含核酸通过加3M乙酸钠(pH5.2)1/10体积，加2倍体积乙醇和1μl糖原(Boehringer-Mannheim ref.901 393)而沉淀下来，样品置于-20℃4小时或4℃过夜。离心后得到的沉淀物再用70％乙醇洗涤并重新悬浮于60ml蒸馏水中。这个反应的产物随后被纯化、克隆并测序，是按照如下程序进行：在其末尾处带有未成对的腺嘌呤的钝末端DNAs被进行增殖：先进应行一个“补平”反应，25μl预先纯化过的DNA溶液与2μl的一种2.5mM溶液(含有等摩尔量的dATP+dGTP+dTTP+dCTP/1μl DNA聚合酶T4(Boehringer-Mannheim ref.004 786)/5μl10X“限制性酶温育缓冲液”(Boehringer-Mannheim ref.417 975)/1μl 1％牛血清白蛋白溶液/16μl无菌蒸馏水)混合。该混合物在11℃温育20分钟。向其中加入5μl TE缓冲液和1μl糖原(Boehringer-Mannheim ref.901 393)，然后用酚/氯仿/异戊醇(Sigma ref，P3803)抽提核酸，再用乙酸钠按上文所述进行沉淀。将离心后沉淀下来的DNA重新悬浮于1μl 10mM Tris缓冲液(pH7.5)中。5μl这样的悬浮液再与20μl 5X Taq缓冲液、20μl 5mMdATP、1μl(5U)Taq DNA聚合酶(Amplitaq^TM)及54μl无菌蒸馏水混合。混合物75℃培育2小时，在溶液表面有一层油膜。培育后从油膜下提取的悬浮液水相溶液中的DNA照前述进行沉淀并重新悬浮于2μl无菌蒸馏水中。所得DNA用TA Cloning^TM Kit插入一质粒中。2μlDNA溶液与5μl无菌蒸馏水、1μl 10倍浓度连接缓冲液“10XLIGATION BUFFER”、2μl “pCR^TM VECTOR”(25ng/ml)及1μl“TA DNA LIGASE”混合。这个混合物于12℃温育过夜。后续步骤按TA Cloning Kit(British Biotechnology)的说明来进行。程序的最后，挑出重组细菌的白色菌落以便培养并能依据被称为“小量制备”的程序抽提经掺入的质粒⁽¹⁶⁾。每个重组菌落的质粒制备物用一适宜的限制性酶切割并在琼脂糖凝胶上分析。在与一种引物(该引物与TA CloningKit的克隆质粒上存在的Sp6启动子互补)之后，用溴化乙锭示踪凝胶后就能选择出带有在紫外光下能检测到的插入序列的质粒，从而用于对插入序列测序。测序前再按为应用“ Prism ready reaction Kit dyedeoxyterminator cycle sequencing kit”(Applied Biosystems，ref.40/384)而建议的方法进行一个反应，然后进行自动测序，用AppliedBiosystems的“自动测序仪，373A型”，按厂家建议进行测序。

在计算机化数据库上对克隆自反应混合物中存在的DNA片段的序列的鉴别分析使之能显示逆转录病毒型的一个序列。相关的PSJ17克隆得到完全测序，所得的描绘在图8中并由SEQ ID NO9识别的序列用最新“Genebank”数据库上的“Geneworks”软件进行分析。对数据库的分析未能发现任一段与已描述的序列完全相同的序列。只发现与某些已知的逆转录病毒因子有部分同源。根据参考文献⁽²⁰⁾，最引人关注的同源性是关于一种被称作ERV-9，或HSERV-9的内源性逆转录病毒。

实施例4

对含于“POL MSRV-1B”限定的5′区和PSJ17克隆限定的3′区之间的核酸序列的PCR扩增。

定义5种寡核苷酸M001，M002-A，M003-BCD，P004和P005，以扩增来自纯化的POL-2毒粒的RNA。进行对照反应以便检查是否有污染(与水反应)。扩增由一个RT-PCR步骤及随后的“嵌套”PCR组成，RT-PCR按实施例2的步骤进行，“嵌套”PCR按EP-A-0,569,272号文件中所述的PCR过程进行。在第一个RT-PCR循环中，用M001和P004或P005引物。在第二个PCR循环中，用M002-A引物或M003-BCD引物及P004引物，这些引物的位置如下：

M002-A

M003-BCD

M001 — P004 P005

— — — —————————————————————RNAPOL-2<----------> <--------------------->pol MSRV-1 PSJ17

它们的组成为：引物M001：GGTCITICCICAIGG(SEQ ID NO20)

引物 M002-A：TTAGGGATAGCCCTCATCTCT(SEQ ID NO21)

引物 M003-BCD：TCAGGGATAGCCCCCATCTAT(SEQID NO22)

引物 P004：AACCCTTTGCCACTACATCAATTT(SEQID NO23)

引物 P005：GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT(SEQID NO24)

所得到的被称为M003-P004的“嵌套”扩增产物，描绘在图7中，它相当于SEQ ID NO8这个序列。

实施例5

在逆转录酶活性峰处纯化到的病毒样品中，用一段已识别出的序列对MSRV-1逆转录病毒基因组的一部分进行扩增和克隆化。

这里用到一种来自Frohman⁽²¹⁾公布的PCR技术。它使得能用一个位于将被扩增的基因组3′端的物异性引物向待分析的基因组的5′区延长序列。这一技术上的变化被描述在来自the firm clontech LaboratoriesInc.，(Palo-Alto California USA)的文件中，同时提供的还有它的产品“5′-AmpliFINDER^TMRACE Kit”，这一产品如前所述被用于纯化的毒粒的某一部分。

在试剂盒操作中用到的用于合成cDNA和进行PCR扩增的特异性3′引物分别与下列MSRV-1序列互补：

cDNA： TCATCCATGTACCGAAGG(SEQ ID NO25)

扩增： ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT(SEQ ID

PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化后，再按常规方法纯化⁽¹⁶⁾，然后重新悬浮于10ml蒸馏水中。由于Taq聚合酶的特点之一在于将一个腺嘌呤加在两条DNA链的每一条的3′端，故所得的DNA用TA Cloning^TMKit(British Biotechnology)直接插入一质粒中。2μl DNA溶液混于5μl无菌蒸馏水、1μl 10倍浓度的连接缓冲液“10X LIGATIONBUFFER”、2μl“PCR^TMVECTOR”(25ng/ml)及1μl“TA DNALIGASE”中。该混合物12℃温育过夜。后继步骤按TA CloningKit(British Biotechnology)的说明进行。程序最后，挑出重组细菌的白色菌落以便培养并能按所谓的“小量制备”程序抽提有关的质粒⁽¹⁶⁾。每个重组菌落的质粒制备物被用一合适的限制性酶切割并在琼脂糖凝胶上进行分析。选择出带有用溴化乙锭标记凝胶后能在紫外光下检测到的插入序列的质粒以进行插入序列的测序，测序是通过与“ TA CloningKit”的克隆化质粒上的Sp6启动子的一种互补引物杂交后而完成的。测序前再按为应用“Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cyclesequencing kit”(Applied Biosystems，ref.401384)而建议的方法进行一个反应，然后用Applied Biosystems的“自动测序仪373A型”按厂家建议完成自动测序。

这一技术首先应用于如下述纯化的毒粒的两个部分，在来自PLI-2细胞系产生的“POL-2”分离株和LM7PC细胞系产生的MS7GP分离株的蔗糖上：每周两次收集培养物上清液，10,000rpm预离心30分钟以除去细胞碎片，再冻存于-80℃或直接用于后续步骤。4℃下将新鲜的或解冻的上清液在30％PBS-甘油的垫层上于100,000g(或在LKB-HITACHI 45T型转子上30,000rpm)离心2小时。去上清液后，沉淀团用小体积PBS溶解并组成浓缩好但未经纯化的毒粒部分。这种浓缩的病毒随后在一个蔗糖梯度上在无菌的PBS缓冲液(15至50％重量比)中沉降并在4℃以35,000rpm(100,000g)在一带盖的转子中超速离心12小时。10个部分均被收集，匀化后从每部分取出20μl，以便按H.Perron⁽⁷⁾的技术分析逆转录酶活性。包括了“属于LM7型”的RT活性峰的部分随后被稀释在无菌PBS缓冲液中并于35,000rpm(100,000g)超速离心1小时以沉降病毒颗粒。由此得到的纯化了的病毒团块再溶解于小体积的一种适宜缓冲液以提取RNA。在这种抽提自纯化的胞外毒粒的RNA上进行上文提到的cDNA合成反应。按前述技术进行的PCR扩增使得能获得F1-11克隆，它的序列可被SEQ ID NO2识别，在图8中有描绘。

这个克隆使得用事先已测序的各种克隆来定义代表MSRV-1逆转录病毒的“pol”基因(如图9描述的那样)的区段成为可能。这个称为SEQ ID NO1的序列，可从在其末端重叠的各种不同克隆中重新构成，方法是纠正由引物和扩增作用或克隆技术带来的人为现象，因为这种假象将作为一个整体人为地干扰系统中的阅读框架。

图9中，在核酸序列下描述了潜在的阅读框架及由它翻译成的氨基酸。

实施例6

在一种被MSRV-2感染的培养物中，用一个已鉴定的序列捕捉、扩增并克隆MSRV-2基因组的一个部分。

连续几星期定期收集类似于H.Perron⁽⁷⁾所描述的能表达“LM7型的”逆转录酶活性的细胞培养上清液，在加10％甘油之后存于-80℃的低温冰箱中。再解冻全部上清以便经超速离心浓缩感染颗粒并经在蔗糖梯度上离心以达到其平衡点而纯化感染颗粒，按H.Perron⁽¹⁴⁾描述的方法在收集于梯度上的各种不同部分中测定逆转录酶活性。

表现出逆转录酶活性峰的不同部分被收集在一起以便按一种用于纯化RNA的程序⁽¹⁵⁾从中抽提核酸，但抽提到的核酸不用DNase处理。一种源于Shin⁽⁸⁾所述技术的PCR扩增过程被直接施于这种未经DNase处理的核酸样品上，按EP-A-0,569,272号文件中描述的一种RNA扩增过程，在100μl的总体积中，含有200ng DNA，1μl RNA Guard，33μmol Shih⁽⁸⁾描述的与那些用于直接(DNA)PCR的完全相同的引物(MOP)的每种混合物；0.25mM每种dNTP、10μl 10X缓冲液、2.5μTag酶和0.4μl RT酶(RT-AMV；10μ)也加入样品中。扩增循环如下进行：RNA变性65℃/10分钟，合成cDNA 50℃/8分钟，然后就与Shih⁽⁸⁾描述的PCR循环一样了。进行对照反应以便检查是否没有污染(在水中反应)。产物在10％丙烯酰胺凝胶上分析。

RT-PCR扩增的样品随后按实施例1所述的技术被克隆和测序。

从RT-PCR产物中测序到的大部分克隆与MSRV-2A序列及与其等价序列MSRV-2B(预先描述在实施例1和2中)相一致。

且去除人工序列后，证实其它被测序的克隆与实施例1和2所述的MSRV-1型的序列一致。

检验了这种核酸材料(来自那些纯化的带感染颗粒的部分)中存在的序列之后，其中至少有一些与逆转录酶活性有关，所剩核酸材料被用于在带MSRV2序列(预先已识别并描述在实施例1和2)的核酸上进行一种特殊的捕捉。

在早先的一个步骤中，带MSRV2序列的遗传材料通过一个50循环的单向PCR技术采用一个单独引物进行了扩增。这个引物与生物素的一个分子在其3′端配对，从而允许从3′到5′进行单向扩增，而且它与以下被鉴定为SEQ ID NO38的序列一致：

5′TAAAGATCTAGAATTCGGCTATAGGCGGCATCCGGCAACT 3′

随后在连接了亲和素的磁珠(Dynabeads)的溶液中按厂家(Dynal)建议进行捕捉，经室温下一系列洗涤后(它能去除未与生物素连接的核酸)后，直接在磁珠上进行PCR，在3′端有个特殊引物，5′端也有个引物，它们由10个碱基(10体)的随机序列的寡核苷酸溶液提供。

这种从3′到5′的特异性扩增引物与SEQ ID NO13所识别的序列一致：

5′ GCATCCGGCAACTGCACG 3′

用这些引物在35℃进行超过40循环的PCR使经第一步PCR特异性地扩增生物素化的基因材料并捕捉到Dynabeads磁珠上成为可能。在用“TA Cloning”kit对经第二步PCR扩增的DNA进行克隆化并测定重组克隆的序列后，按实施例1所描述的技术，得到一个748碱基对的序列。这一核酸序列SEQ ID NO12表示在图10中。这个被延长的序列将在下文中称作MSRV-2EL1。

与SEQ ID NO13这个引物互补的反向序列出现在3′末端，在图10中用框表示。在该引物的上游区段发现了已在MSRV-2A和MSRV-2B克隆中识别出的序列。

图11表现了按6个可能的阅读框架将此序列翻译成氨基酸的过程。

MSRV2-A序列(SEQ ID NO10)在MSRV-2EL1(SEQ IDNO12)序列上的排列呈现于图12。值得注意的是，除了在相应于简并引物(用来获得MSRV-2A)的区段内有少数差别之外， MSRV-2A序列严格等同于延长的序列。图上这一区段下面划了线；且SEQ ID NO13这一引物(除了克隆尾巴以外)的杂交区段也在图上用框表示出来，而SEQ ID NO14引物的杂交区段则表示在方括号内。这个区段中真正的MSRV-2基因组的序列很可能就是MSRV-2EL1的，其中并没有象MSRV-2A的情形那样(或类似MSRV-2B)受严格性低的杂交引物的影响。

因此MSRV-2EL1序列相应于MSRV-2基因组的一个新序列区。当使用定义在MSRV-2EL1和MSRV-2A中的新PCR引物时，这种结果也得到检验，而这个新引物允许在本实施例描述的克隆过程中所用的核酸上进行一个特殊的扩增。

Genebank数据库查询的结果(1994年8月进行)，就是MSRV-2EL1序列显示出与至今所知的基因序列没有明显的同源性。然而，查询根据这个MSRV-2EL1序列的6个潜在阅读框架可能进行的翻译成氨基酸的过程，其结果显示MSRV-2EL1与细菌、病毒或细胞的序列有部分同源性。

不能用特异性引物在正常人DNA上做PCR扩增显示这不是一段细胞来源的序列。因此MSRV-2对人而言是一种外源性感染因子。然而，引物混合物的简并特点，在对Shih⁽⁸⁾所述的技术作了变动的应用中，能促使识别称为MSRV-2A和MSRV-2B的第一序列因子，这样的引物特点有可能促使对一个基因组的无法预见的扩增作用，而该基因组既不属于一种逆转录病毒，甚至也不属于一个编码一种RNA依赖性DNA聚合酶的基因。

实施例7

对类风湿性关节炎(RA)患者的关节液中取出的细胞进行培养并检测与LM7培养物产生的转录酶活性相似的酶活性。

关节液(AF)在无菌条件下取自类风湿性关节炎患者的一个有炎症的膝关节。该液体在4℃1800rpm离心10分钟。移去上清液并将上清等分成若干份存于-80℃后，将细胞碎片溶解于RPMI培养基中，RPMI培养基的组成如下：RPMI 1640培养基补加青霉素(200,000U/L)，链霉素(200mg/L)、L-谷氨酰胺(6mM/L)，丙酮酸盐(1％)，非必需氨基酸(1％)，可选择加入一种抗人β干扰素多克隆抗体(10U/ml)，还有20％胎牛血清(56℃温育30分钟灭活补体)。这些悬浮的细胞被转移至一个小培养瓶(25cm³)中并用上述培养基把体积补足5ml，其中的细胞将在一个温箱中在5％CO₂和37℃条件下维持体外培养过程。

4天后，用新鲜的组分相同的培养基换掉培养瓶中的培养基，后者吸出后在1800rpm离心10分钟。上清等分后存于-80℃；含有未粘附在培养瓶上的细胞的碎片溶解于培养基中，并转移到另一个培养瓶中。这些细胞将作为一种细胞悬液在培养中维持下去。

培养基至少每星期换两次。

培养3周后，在装有来自病理学关节液的第一代细胞的培养瓶中含有巨噬细胞型的和其它的成纤维细胞型的粘附细胞，它们都存在一种“行式”(ranges)有丝分裂增殖现象。这些增殖行逐渐覆盖了培养瓶的较低的表面，而且在融合期，这些成纤维细胞被刮拭分离并用5ml培养基分到2个25cm³的瓶中。这些贴壁细胞随后按其增殖能力所允许的潜力多次地传代并分瓶。实际上，在传6代后，即培养了约2个月后，成纤维细胞停止增殖，瓶则存放起来直至细胞退化。

在用于传代悬浮细胞、主要是淋巴样型细胞的培养瓶中，巨噬细胞型或成纤维细胞型的贴壁细胞有时在某一后期贴壁。悬浮的淋巴样细胞未有增殖就退化，且不能在培养中维持到三周后。

所有这些培养瓶的上清均被集中起来，等分后保存于-80℃。

对由某RA病人的病理性关节液细胞产生的一种可能为逆转录病毒因子的搜寻工作在于，按各种不同的理化条件寻找逆转录酶活性，这些条件允许非选择性检测这种由事先未知的逆转录病毒编码的酶，就象H.Perron等人所做的工作一样(他们研究了从多发性硬化症的神经系统中得到的细胞培养上清中的逆转录酶活性)⁽⁷⁾。对检测来自本例RA病人AF的细胞培养上清中逆转录酶活性的特异性信号的条件随后证实非常类似于那些构成检测某多发性硬化症病例来源的培养物LM7产生的逆转录酶病毒的最佳方案。因此需要验证这种酶活性是否可以在相同于MS中分离出的逆转录病毒MSRV1/LM7的检测条件下被测出，这是在类风湿性关节炎病人关节液的培养物上清中得到的病毒颗粒浓缩后在一蔗糖梯度上沉降平衡的)。

得自本例RA的AF贴壁细胞的一系列培养上清被解冻以便使总体积能达至少100ml。将这些上清混合，预离心以便去除细胞碎片，再超速离心以便沉淀可能有的病毒颗粒，这样沉淀到的碎片置于一蔗糖梯度上，在100，000g离心以便达到在超速离心碎片中存在的因子的分离并在收集等体积的部分并收集递增的蔗糖密度的部分后，对这些部分中的每一部分的逆转录酶活性进行分析。所有这些操作是在H.Perron⁽¹⁴⁾描述的条件下进行的。

用在LM7株上最佳化的条件分析“RA”梯度的收集部分中逆转录酶活性的结果示于图13。可以看出，显著的逆转录酶活性(大于界值2000dpm)出现在部分2到部分5，及部分9中。在最不密集部分发现的活性很不集中，这可能是由于梯度上装载的材料过多造成的(5ml管)。在较密部分第二峰(No.9)很可能由那些已失去包膜(衣壳)的较大密度毒粒组成，就象已在用LM7系产生的毒粒制备的梯度上发现病毒失去衣壳的现象⁽¹⁴⁾。

在RA来源的AF细胞培养上进行的工作的这一阶段，看起来这些细胞产生了病毒颗粒，该病毒颗粒带有与从MS的柔脑脊膜LM7细胞产生的毒粒中检测到的是同一类型的逆转录酶。

实施例8

来自类风湿性关节炎(RA)患者的原始淋巴样B细胞的培养。

根据本领域技术人员熟知的程序，从RA病人外周血B淋巴细胞中建立了原始淋巴样细胞系，(该细胞系经体外加EB病毒(EBV)的B95株或经病人B淋巴细胞具有的自体株而无限增殖化)。

简而言之，在Ficoll-Hypaque梯度(Flow/ICN)中离心而分离出单核血细胞，经RPMI 1640中离心洗涤，再溶于一种培养基质中，该基质中含有RPMI 1640并加了青霉素(200,000U/L)、链霉素(200mg/L)、L-谷氨酰胺(2mM/L)、丙酮酸盐(1％)、非必需氨基酸(1％)、HEPES缓冲液(1％)及20％胎牛血清(56℃培育30分钟灭活了补体的)。这些悬浮细胞被转入一个小培养瓶(25cm³)，体积用上述培养基质补足5ml，其中的细胞将在温箱中在5％CO₂和37℃条件下维持体外培养。

更新一半培养基，每周进行两次：将瓶子垂直放置至少2小时后，移走一半的培养上清(只要建立一个细胞系，就立刻将上清存于一个-80℃低温冰箱中)，并代之以新鲜培养基，其中沉淀的淋巴细胞均被乳化。当建立了一个细胞系而且瓶中的细胞密度足够时，经移液管乳化的细胞就被分在两个瓶中而培养基也就被平分。

在Ficoll中分离后，淋巴样细胞在有环孢菌素A存在时被放置10至20天，以便能从培养物中抑制并除去T淋巴细胞。其原因就是这些T淋巴细胞有阻止培养物中的B淋巴细胞被EBV病毒无限增殖的能力。

根据单个病例的具体情况，培养物可在经环孢菌素A处理后就这样保存，以等待可能出现的B淋巴细胞被病人自身所带的EBV病毒株无限增殖化的现象(如果他是此病毒的血清阳性)，或者另一种情况下把1ml产EBV毒粒的B95系的上清(先用佛波醇的丁酸酯诱导)加到培养瓶中以便在有EBV B95株的情况下产生大规模的B淋巴细胞感染，并也就更可能产生少数B克隆的无限增殖化。

有悬浮细胞的培养瓶维持至少3个月，这期间出现无限增殖化的B淋巴细胞克隆(以飘浮在培养基中的细胞“群”的形式增殖，)用光学显微镜监控。

当原始淋巴样细胞系被建立后(它们来自RA)，它们定期被平分并被维持在连续培养中。每周两次换培养基时收集的上清被冻在-80℃以便后续分析：逆转录酶活性，由培养中B细胞表达的致病和/或感染性因子的基因组的PCR检测，等等。应用这些培养物来发现并鉴定与RA相关的致病和/或感染性因子将在后面的实施例中描述。

实施例9

通过对纯化自RA的一滑液细胞培养或原始淋巴样细胞系细胞培养的致病和/或感染性因子制品上依赖于RNA的DNA聚合酶基因的保守的pol区进行扩增来生产MSRV-2和MSRV-1克隆。

就象在实施例1中一样，分子途径在于应用Shin的PCR技术⁽⁸⁾，它有可能扩增外源和内源逆转录病毒的pol基因的保守区，也可以扩增能编码有逆转录酶(RT)活性的一种酶的病毒的pol基因的保守区。如特别是乙肝病毒，或更广地说有任何依赖于RNA的DNA聚合酶或在所用的扩增引物定义的区域内有足够的序列同源性的酶基因的病毒。这一PCR技术用在抽提出的核酸上，核酸是从按Perron H.⁽¹⁴⁾描述的过程在一梯度上纯化得到的感染因子制品中抽提的，感染因子来自一例类风湿性关节炎(RA)的病理性关节液(AF)的细胞培养上清，是按实施例7所描述的过程得到的。带有按照为LM7株优化的条件⁽⁷⁾测得的RT活性峰的部分用一倍体积的含硫氰酸胍的缓冲液溶解并存于-80℃直到核酸按Chomzynskip.⁽¹⁵⁾的技术提取出为止。

在PCR反应之前，用“cDNA合成系统plus”盒(Amersham)把样品中的RNA转录成带“随机”引物(一种6核苷酸的混合物)的互补DNA(cDNA)，按厂家建议进行，并根据样品中有的RNA总重的一个近似值，达到最接近的log factor。另外，，cDNA的合成可以直接在有引物的情况下进行，该引物用于按EP-A-0,569,272号文件中描述的一步“RT-PCR”法进行PCR。

把用PCR扩增cDNA后得到的DNA用TA Cloning Kit(Britishbiotechnology)插入一质粒，选择出来，提取出并测序，均按实施例1和2所述过程进行。

所得序列然后用Mac Vector和Genebank计算机化数据库上的Geneworks软件(用于分析核酸序列)，及Swiss Prot计算机化数据库(用于分析由核酸序列中出现的阅读框架推断出的氨基酸序列)进行分析。RA之AF的解冻的细胞培养上清在逆转录酶活性峰沉淀得到的病毒颗粒样品中获得的序列，经分析显示出两种序列：第一型序列，发现于少数克隆，相关于与事先从MS病人分离到并定性的MSRV-1逆转录病毒的等价“pol”区(法国专利申请92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，94 01530，94 01531 and 9401532)有显著同源性的一段序列，第二型序列，发现于大多数克隆，相关于与一段被称为MSRV-2的致病和/或感染性因子的序列有高度同源性的序列，MSRV-2是事先从MS病人中分离并定性到的(法国专利申请92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，9401530，94 01531 and 94 01532)。

将从RA的AF细胞培养产生的病毒材料中扩增并克隆的MSRV-1型的序列(克隆“ MSRV1 polPR”，SEQ ID NO39)与从MS病人的细胞产生的毒粒中克隆到的MSRV-1参照序列的比较示于图14。

从RA的AF细胞培养产生的感染物质中扩增并克隆的MSRV-2型的序列(克隆“MSRV2sPR”，SEQ ID NO40)与从MS病人细胞产生的感染物质中得到的MSRV-2参照序列的比较示于图15。

两种类型的被发现有Shih等人⁽⁸⁾的“逆转录酶活性”简并引物的序列因此准确相当于在相似条件下发现的序列，它们在柔脑脊膜细胞培养物中，属于源自各种MS病人的脉络丛或B原始淋巴样细胞系(法国专利申请92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，94 01530，94 01531 and 94 01532)。

实施例10

用特异性PCR引物及依ELOSA技术的特异性杂交检验细胞培养物上清中以及直接在RA病人的生物学液体中MSRV-1和MSRV-2序列的存在。

有好几种PCR技术被用于检测RA病人和其他风湿病人(非RA)的细胞、血浆和关节液培养物上清中的MSRV-1和MSRV-2基因组。

根据P.Chomzynski⁽¹⁵⁾描述的技术，提取质粒的及培养物上清的RNA，在这之前要在1ml培养上清或质粒(收集后存于-80℃低温冰箱)中加入一定体积的含硫氰酸胍的缓冲液。

从关节液(AF)中及从单核血细胞(淋巴细胞和单核细胞)中抽提RNA的过程按以下程序进行：

所有溶液均在用DEPC处理过的蒸馏水中配制以去除所有痕量RNA酶；

解冻500μl到1ml的AF，往里面加入1/100体积的20％SDS溶液，同时按每mlAF加7μl的比例加入蛋白酶K溶液；将液体轻微摇匀，加RNAsin(B0ehringer)或RNA guard(Pharmacia)后于37℃温育；1小时后，1倍体积的GUT缓冲液(按Chomzynski⁽¹⁵⁾)被加入，迅速摇匀混合物。混合物中的RNA随后按上文提到的由Chomzynski描述的程序⁽¹⁵⁾提取出来。

为检测MSRV2，MSRV-2EL1(SEQ ID NO12)序列使得定义几对寡核苷酸引物成为可能，这些引物可用于通过PCR技术扩增特异性的DNA或RNA。

下文定义的第一对MSRV2引物使得对不同人类细胞中MSRV-2基因组完成特异性测定成为可能，方法是按EP-A-0,569,272号文件中描述的一种RNA扩增过程进行PCR或RT-PCR步骤。

所用的引物如下：

5′引物，由SEQ ID NO14识别：

5′GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3′

3′引物，由SEQ ID NO15识别：

5′GCATCCGGCAACTGCACG 3′

cDNA合成的步骤之后，PCR进行连续35个成链循环，每个循环均1分钟在94℃，1分钟在54℃，1分钟在72℃。

对本实施例而言，从不同类型的细胞中抽提出的未经DNase处理的全部RNA被用于这个RT-PCR反应，因而就能检测对RNA富集的核酸提取物中的致病原具特异性的RNA和DNA。实际上，我们的试验显示对MSRV2具特异性的DNA很容易在抽提到的核酸中检测出来，所述核酸是按上述通常用于RNA提取的方法提取到的。

按这一技术用SEQ ID NO14和SEQ ID NO15作PCR引物扩增到的一个“MSRV2cPR”克隆的序列描绘在图16，其中引物序列来自RA病人关节液的细胞培养。图17和18描述了分别带有得自MS病人的克隆的MSRV2核苷酸序列SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的“MSRV2cPR”克隆的序列的排列。可以看到，源于RA样品或MS样品的序列有显著同源性。

以下定义的新的MSRV2引物对使得有可能完成对病人来源的不同生物学液体中的MSRV-2基因组的检测，用的是两步连续的PCR(“嵌套”PCR)，或两步连续的RT-PCR，按EP-A-0,569,272号文件所述的一个RNA扩增程序进行，根据它就有可能检测到在生物学样品中以RNA或DNA形式存在的MSRV-2序列。

这一“嵌套”PCR按已描述的方式在未径DNase处理的抽提核酸样品上进行。

用于第一步40个循环并在48℃的杂交温度下的引物如下：

5′引物，由SEQ ID NO44识别：

5′GCCGATATCACCCGCCATGG 3′

3′引物，由SEQ ID NO15识别：

5′GCATCCGGCAACTGCACG 3′

这步之后，取出10μl扩增产物用于进行第二步的所谓“嵌套”PCR扩增，用的引物位于已扩增的区段内。该第二步骤进行了35至40循环，于50℃的引物杂交温度(“退火”)下进行。反应体积为100μl。

第二步所用引物如下：

5′引物，由SEQ ID NO45识别：

5′CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3′

3′引物，由SEQ ID NO46识别：

5′TCTCCACTCCGAATATTCCG 3′

按上述“嵌套PCR”进行的一系列MSRV-2 PCR所得结果呈现在附于本说明书的表II中。

对MSRV-1，扩增进行两步(“嵌套”PCR)，但先进行一步cDNA合成。而且，核酸样品要先用DNase预处理，并在两个扩增步骤中进行一个没有RT(AMV逆转录酶)的PCR对照，以便检验RT-PCR扩增仅来源于MSRV-1 RNA。至于无阳性RT的对照，分成等分的RNA起始样品再用DNase处理并重新扩增。

用缺乏DNase活性的DNase进行处理的过程如下：抽提的RNA在有“RNase抑制剂”(Boehringer-Mannheim)存在下在经DEPC处理的水中等分至终浓度为10μl中1μg；向这些10μl的等份中加入1μl“无RNase的DNase”(Boehringer-mannheim)和1.2μl缓冲液(pH5，含0.1M/l乙酸钠和5mM/l MgSO₄)；混合物20℃温育15分钟，在一个“热循环仪”中95℃保持1.5分钟。

第一步MSRV-1RT-PCR可以按EP-A-0,569,272号文件所描述的RNA扩增程序的一种变动方法进行。特别是，cDNA合成这一步在42℃进行1小时，但cDNA合成的进行更好地是按以下程序：把用DNaase处理过并保存在冰中的RNA在65℃加热10分钟，然后迅速插入冰中；再加入到一个维持在42℃的在准备进行PCR的热循环仪中的混合物内，混合物含1倍PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，250mM每种dNTP，300-400nM的每种引物(PCR第一步的5′和3′端引物)，10个单位的RT-AMV和2.5个单位的Tag，终体积为100μl；该混合物42℃保持1到2小时，再于95℃保持5分钟，以便使RT-AMV变性。然后开始PCR扩增循环，并持续超过40个循环，其中引物的杂交期(退火)在53℃进行1分钟，延伸期在72℃进行2至3分钟，DNA变性期在95℃进行1分钟。

这第一步所用引物如下：

5′引物

5′AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3′SEQ ID NO16

3′引物

5′TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3′SEQ ID NO17

这一步后，10μl扩增产物被取出并用于进行第二步所谓“嵌套”PCR扩增，用位于已扩增的区段内的引物。PCR扩增循环超过35至40循环，引物的杂交期在53℃进行1分钟，延长期在72℃进行1至2分钟，DNA变性期在95℃进行1分钟。反应混合物的组分与前一步一样，只是这次不加RT-AMV。

这第二步所用引物如下：

5′引物，由SEQ ID NO18识别：

5′TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3′

3′引物，由SEQ ID NO19识别：

5′AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3′

按上述技术用PCR引物SEQ ID NO16和SEQ ID NO17，并随后用SEQ ID NO18和SEQ ID NO19从RA病人关节液的RNA扩增得的“MSRV1nPR”克隆的序列呈现在图19。图20描述了有参照克隆的MSRV1核苷酸序列SEQ ID NO01的“MSRV1nPR”克隆序列的排列，参照克隆得自MS病人。同样可以看出，源自RA或MS的序列有显著同源性。

到目前为止，按这些PCR技术从RA样品中扩增到的其他MSRV1和MSRV2序列也显露出与得自MS病人的序列一致或同源。

在一系列按上述嵌套“RT-PCR”技术进行的MSRV-1 PCR中，所得结果示于本说明书所附的表I中。

这样，确实发现MSRV-1逆转录病毒基因组和MSRV-2基因组存在于RA病人的生物学液体样品中。在更为广泛的系列研究中得到的其他结果更肯定了这些结果。

而且，经这些PCR技术扩增的序列的特异性可以检验并估价，采用F.Mallet⁽²²⁾描述的和FR-2,663,040号文件中所述的“ELOSA”技术。

对MSRV-1，上述嵌套PCR产物可以在两个ELOSA系统中测试，这样就可能分别检测MSRV-1的共有序列A及共有序列B+C+D，它们分别相应于实施例2和图2，3，4中描述的亚家族。实际上，类似于共有序列B+C+D的序列主要发现于MSRV-1毒粒来源的RNA样品，该毒粒纯化自培养物或扩增自RA或MS病人的胞外生物学液体，而类似于共有序列A的序列主要发现于正常人细胞DNA中。

这个用于亚家族A的PCR产物的捕捉和特异性杂交的ELOSA/MSRV-1系统使用了带有一个5′胺键的一段捕捉寡核苷酸cpV1A(按FR-A-2,663,040号文件中所述技术)，还使用了偶联过氧化物酶的一个检测用寡核苷酸dpV1A(按FR-A-2,663,040号文件所述技术)(或者偶联生物素)，该cpV1A和dpV1A分别有下列序列：

cpV1A 5′GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3′SEQ ID NO47

dpV1A 5′CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3′SEQ ID NO48

用于捕捉和特异性杂交亚家族B+C+D的PCR产物的ELOSA/MSRV-1系统使用了同样的偶联过氧化物酶的检测用寡核苷酸dpV1A(按上述技术)(或偶联生物素)，还使用了带一个5′胺键的捕捉用寡核苷酸cp1VB(按上述技术)，它有这样的序列：

cpV1B 5′CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3′S EQ ID NO49

就如表I可看到的，这样一种技术被用于不同风温病患者生物学液体中得来的扩增PCR产物：所有RA病人(在用BET标记的琼脂糖凝胶上可检测到预期大小的一个扩增过的DNA带)均对B+C+D型MSRV1呈阳性反应而对MSRV1-A呈阴性反应；只有一个单一的非RA对照在用BET标记的凝胶上有一个明显正确的大小的可见扩增带；相应的PCR产物被证明在ELOSA MSRV1-A和MSRV1-BCD上呈阴性反应，与其他非RA对照的所有PCR产物一样；对这种扩增产物进行克隆和测序后，发现它与一段无关于MSRV1的人工序列一致。

因此，与上面定义的嵌套RT-PCR联合应用的ELOSA MSRV1技术使得有可能对病人生物液体中的一种逆转录病毒进行一种非常灵敏也非常特异的检测。

也可以设想，依靠由发明者在与类风湿关节炎有关的领域内的发现及开发的方法，可以对MSRV-1和/或MSRV-2的感染作用和/或重新活化作用进行诊断，并基于该治疗使对病人生物学液体中这些因子的检测变得“阴性”的程度，估价它在RA病人身上的治疗效果。而且，对尚未表现出风湿病症状的个体进行早期检测可以设置一种治疗方案，它越先于与关节病现象有关的损伤期，就越在以后的临床进展中从一种程度上更有效果。现在，至今尚不能在有炎症以前或甚至在损伤症状以前建立一种RA诊断方法，因此也无法在已出现值得注意的关节病的临床指征之前建立起治疗方案。

因此，诊断人体内MSRV-1和/或MSRV-2感染作用和/或再活化作用就成为一种决定因素，而本发明对包括神经性指征(MS)或风湿性指征(RA)，或换种说法，包括了作为前症状或尚未相关于一个性质明确的临床症状的感染作用和/或再活化作用，提供了一种诊断方法。

除了进行MSRV-1和/或MSRV-2感染和/或再活化的诊断外，由此还可能估计MS、RA或任何其他相关临床症状的治疗效果，这是基于它对使病人生物学液体中这些因子的检测变“阴性”的有效性。

表I

对类风湿性关节炎及其他风湿病病人的生物学液体中MSRV-1基因组用PCR，再经所谓“ELOSA”技术杂交而检测出的结果。诊断测试例数样品 MSRV-1 MSRV-1 MSRV-1

嵌套 ELOSA ELOSA

RT-PCR 亚型A 亚型B

(BET带)

(B+C+D)

10 10- 10- 10-风湿性而关节液细非类风湿关胞培养基质 0+ 0+ 0+节炎的对照类风湿关节炎 10 5- 10- 5-

关节液细 5+ 0+ 5+

胞培养基质风湿性而 8 关节液 8- 8- 8-非类风湿关 0+ 0+ 0+节炎的对照类风湿关节炎 5 关节液 3- 5- 3-

2+ 0+ 2+

7 血浆 6- 7- 7-风湿性而非类风湿关 1+ 0+ 0+节炎的对照类风湿关节炎 6 血浆 4- 6- 4-

2+ 0+ 2+

4 单核血细胞 4- 4- 4-风湿性而非 (干性团块)类风湿关节 0+ 0+ 0+炎的对照类风湿关节炎 2 单核血细胞 0- 2- 0-

(干性团块)

表II

对类风湿性关节炎及其他风湿病病人生物学液体中MSRV-2基因组用PCR及随后的所谓“ELOSA”技术杂交而检测出的结果。诊断测试例数样品

MSRV-2 注释

嵌套

RT-PCR

(BET带)风湿性而非类风 4 关节液 4-湿关节炎的对照 0+类风湿关节炎 5 关节液 1-

4+

风湿性而非类风 5 血浆 4- 阳性病人湿关节炎的对照 1+ 被多次输；

类风湿关节炎 8 血浆 6- 血的病人

2+

序列表1 一般资料：(i) 申请人：

(A)姓名：BIOMERIEUX

(B)街道：NONE

(C)城市：MARCY L′ETOILE

(E)国家：FRANCE

(F)邮编：69280(ii) 发明名称：SEP延伸(iii) 序列数：49(iv) 计算机可读形式(A) 介质类型：软盘(B) 计算机：IBM PC兼容机(C) 操作系统：：PC-DOS/MS-DOS(D) 软件：PatentIn Release#1.0，版本 #1.30(EPO) 2 SEQ ID NO：1的资料(i) 序列特征：(A) 长度：1158碱基对(C) 链型：单性(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补DNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：1CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG 60CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT 240CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAGGGATAGC 300CCCCATCTAT TTGGCCAGGC ATTAGCCCAA GACTTGAGTC AATTCTCATA CCTGGACACT 360CTTGTCCTTC AGTACATGGA TGATTTACTT TTAGTCGCCC GTTCAGAAAC CTTGTGCCAT 420CAAGCCACCC AAGAACTCTT AACTTTCCTC ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCCAAACCA 480AAGGCTCGGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTNAGGGC TAAAATTATC CAAAGGCACC 540AGGGCCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGCTT ATCCTCATCC CAAAACCCTA 600AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TGGCATAACA GGTTTCTGCC GAAAACAGAT TCCCAGGTAC 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CCCAAGGGTT CAAGGGA 2972 SEQ ID NO：3的资料(i) 序列特征：(A) 长度：85碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：3GTTTAGGGAT ANCCCTCATC TCTTTGGTCA GGTACTGGCC CAAGATCTAG GCCACTTCTC 60AGGTCCAGSN ACTCTGTYCC TTCAG 852 SEQ ID NO：4的资料(i) 序列特征：(A) 长度：86碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：4GTTCAGGGAT AGCCCCCATC TATTTGGCCA GGCACTAGCT CAATACTTGA GCCAGTTCTC 60ATACCTGGAC AYTCTYGTCC TTCGGT 862 SEQ ID NO：5的资料(i) 序列特征：(A) 长度：85碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：5GTTCARRGA TAGCCCCCATC TATTTGGCCW RGYATTAGCC CAAGACTTGA GYCAATTCTC 60ATACCTGGA CACTCTTGTCC TTYRG 852 SEQ ID NO：6的资料(i) 序列特征：(A) 长度：85碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：6GTTCAGGGAT AGCTCCCATC TATTTGGCCT GGCATTAACC CGAGACTTAA GCCAGTTCTY 60ATACGTGGAC ACTCTTGTCC TTTGG 852 SEQ ID NO：7的资料(i) 序列特征：(A) 长度：111碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：7GTGTTGCCAC AGGGGTTTAR RGATANCYCY CATCTMTTTG GYCWRGYAYT RRCYCRAKAY 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(基因组)(xi) 序列描述：SEQ ID NO：9CAAGCCACCC AAGAACTCTT AAATTTCCTC ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCCAAACCA 60AAGGCTCAGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTTAGGGT TAAAATTATC CAAAGGCACC 120AGGGGCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGGTT ATCCTCATCC CAAAACCCTA 180AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TAGCATGATC AGGTTTCTGC CGAAAACAAG ATTCCCAGGT 240ACAACCAAAA TAGCCAGACC ATTATATACA CTAATTAAGG AAACTCAGAA AGCCAATACC 300TATTTAGTAA GATGGACACC TAAACAGAAG GCTTTCCAGG CCCTAAAGAA GGCCCTAACC 360CAAGCCCCAG TGTTCAGCTT GCCAACAGGG CAAGATTTTT CTTTATATGG CACAGAAAAA 420ACAGGAATCG CTCTAGGAGT CCTTACACAG GTCCGAGGGA TGAGCTTGCA ACCCGTGGCA 480TACCTGAATA AGGAAATTGA TGTAGTGGCA AAGGGTTGGC CTCATNGTTT ATGGGTAATG 540GNGGCAGTAG CAGTCTNAGT ATCTGAAGCA GTTAAAATAA TACAGGGAAG AGATCTTNCT 600GTGTGGACAT CTCATGATGT GAACGGCATA CTCACTGCTA AAGGAGACTT GTGGTTGTCA 660GACAACCATT TACTTAANTA TCAGGCTCTA TTACTTGAAG AGCCAGTGCT GNGACTGCGC 720ACTTGTGCAA CTCTTAAACC C 7412 SEQ ID NO： 10的资料(i) 序列特征：(A) 长度：93碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补cDNA(基因组)(xi) 序列描述：SEQ ID 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拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：18TCAGGGATAG CCCCCATCTA T 212 SEQ ID NO：19的资料(i) 序列特征：(A) 长度：24碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型： cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：19AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT 242 SEQ ID NO：20的资料(i) 序列特征：(A) 长度：15碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA(ix) 特点：(B) 位置：5，7，10，13(D) 其它资料：G代表肌苷(i)(xi) 序列描述：SEQ ID NO：20GGTCGTGCCG CAGGG 152 SEQ ID NO：21的资料(i) 序列特征：(A) 长度：21碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：21TTAGGGATAG CCCTCATCTC T 212 SEQ ID NO：22的资料(i) 序列特征：(A) 长度：21碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA (基因组)(xi) 序列描述：SEQ ID NO：22TCAGGGATAG CCCCCATCTA T 212 SEQ ID NO：23的资料(i) 序列特征：(A) 长度：24碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA (基因组)(xi) 序列描述：SEQ ID NO：23AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT 242 SEQ ID NO：24的资料(i) 序列特征：(A) 长度：23碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：24GCGTAAGGAC TCCTAGAGCT ATT 232 SEQ ID NO：25的资料(i) 序列特征：(A) 长度：18碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：互补cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID 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SEQ ID NO：43的资料(i) 序列特征：(A) 长度：648碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：43CAGGGTATAG CCCCCATCTA TTTGGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGC CAGTTCTCAT 60ACCTGGACAC TCTTGTCCTT CAGTATATGG ATGATTTACT TTTAGTGACC CATTCAGAAA 120CCTTGTGATG TCAAGCCACA CAAGTGCTCT TAACTTTCCT CTTTACCTCT GGCTACAAGG 180TTTTCAAACC AAAGGCTCAG CTCTGCTCAC AGCAGGTTAA ATATTTAGGG CTAAAATTAT 240CCAAAGGCAC CAGGGCCCTC AGTGAGGAAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCTTCATC 300CCAAAACCCT AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC AGGCTTCTGC TGAATATGGA 360TTCCCAGGTT YGGTGAAATA GCCAGGCCAT TAAATACACT AATTAAGGAA ACTCAGAAAG 420CCAATACCCA TTTAGTAAGA TGGACATCTG AAGCACAATC AGCTTTCCAG GCACTAAAGA 480AAGCCCTAAC CCAAGCCCCA GTGTTAAGCT TGCCAACAGG GCAAGACTTT TCTTTATATG 540TCACAGAAAA AATAGGAATA GCTCTAGGAG TCCTTACACA GGTCTGAGGG ACAAGCTTGC 600AACCCGTGGC ATATCTGAGT AAGGARRCTG ATGTAGTGGC AAAGGGTT 6482 SEQ ID NO：44的资料(i) 序列特征：(A) 长度：20碱基对(B) 类型：核酸(C) 链型：单链(D) 拓朴构型：线性(ii) 分子类型：cDNA(xi) 序列描述：SEQ ID NO：44GCCGATATCA CCCGCCATGG 202 SEQ ID NO：45的资料(i) 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参考文献(1)Sauvezio B.等，“类风湿性关节炎，现状与前景”，Sany J.，1-13，Collection Médecine-Sciences Flammarion，巴黎，1987。(2)Kahen A.，病毒和类风温性关节炎，见“类风湿性关节炎，现状与前景”，Sany J.，1-13，Collection Me decine-Sciences Flammarion，巴黎，1987。(3)Fujinami R.S.和Oldstone M.B.A.编，微生物学和免疫学中的前沿课题，145，柏林，Springer Verlag，1989。(4)Acha-Orbea H.和Palmer E.，Mls-一种利用免疫系统的逆转录病毒-今日免疫学1991；12，271-276。(5)Cole B.C.和Atkin C.L，支原体关节炎T-细胞分裂素，MAM：一种模型超级抗原，今日免疫学1991；12，271-276(6)Posnet D.N.，超级抗原在自身免疫中起作用吗？免疫学探讨，1993；5，65-72。(7)Perron H.等，病毒学研究，1989；140，551-561。(8)Shih A.，Misra R.和Rush M.G.，病毒学研究，1989；63，64-75。(9)Fields和Knipe，基础病毒学，1986，Rev Press N.Y.(10)Nielsen P.E.等，科学1991；254，1497-1500(11)Maniatis等，分子克隆，Cold Spring Harbor，1982。(12)Southern.E.M.，分子生物学杂志，1975；98，503(13)Dunn A.R.和Hassel J.A.，细胞1977；12，23(14)Perron H.等，病毒学研究，1992；143，337-350(15)Chomzynski P.和Sacchi N.，分析生物化学，1987；162，156-159。(16)Sambrook.J.，Fritsch E.F.，和Maniatis T.，分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，1989.(17)Meyerhans等，细胞1989；58，901-910。(18)Linial M.L.和Miller A.D.，“微生物学和免疫生物学中的前沿课题。逆转录病毒，复制方法”157卷，125-152；Swanstrom R.和VogtP.K.编，Springer-Verlag，Heidelberg 1990(19)Lori F.等，病毒学杂志，1992；66，5067-5074(20)La Mantia等，核酸研究，1991；19，1513-1520(21)Frohman等，美国国家科学院院报1988；85，8998-9002(22)Mallet F.等，临床微生物学杂志，1993；31，1444-1449。

Claims

1.使用一种病毒物质，其为纯化状态或分离状态，有逆转录酶活性，相关于一内源性逆转录病毒因子的一个家族，来自有逆转录酶活性的一病毒株，该病毒株选自分别被称为POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号V93010816)的病毒株及其变异株，组成这些病毒株的病毒带有至少一种抗原，它能被至少一种抗体识别，该抗体直接针对至少一种相关于上述病毒株POL-2和MS7PG的任一个病毒的抗原，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述与类风湿性关节炎相关的病毒物质，或上述物质的再激活物导致的感染。

2.使用一种病毒物质，其为纯化或分离状态，有逆转录酶活性，相关于内源性逆转录病毒因子的一个家族，由选自被分别称为PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号93010817)的细胞系的一个细胞系产生，或由能产生如下病毒的任何受感染细胞培养物产生，该病毒带有至少一种抗原，它能被至少一种抗体识别，该抗体直接针对相关于由上述PLI-2和LM7PC系产生的任一种病毒的至少一种抗原，以获得一种诊断、预防或治疗组合物以检测、防止或治疗由上述与类风湿性关节炎相关的病毒物质或上述物质的一种再激活物导致的感染。

3.使用一种病毒物质，其基因组含有选自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列和等价序列的一段核苷酸序列，特别是那种核苷酸序列，即在其任一段含100个连续单体的序列上与选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的一段核苷酸序列有至少50％、优选至少70％同源性，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述相关于类风湿性关节炎的病毒物质，或上述物质的一种再激活物所导致的感染。

4.使用一种逆转录病毒物质，其基因组的pol基因含有一等价核苷酸序列，并特别与属于逆转录病毒ERV-9或HSERV-9的基因组的pol基因的一段核苷酸序列有至少50％、优选至少65％同源性，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述相关于类风湿性关节炎的病毒物质，或上述物质的一种再激活物导致的感染。

5.使用一种逆转录病毒物质，其基因组的pol基因编码一个肽序列，该序列与逆转录病毒ERV-9或HSERV-9的基因组的pol基因所编码的一个肽序列有至少50％、优选至少70％同源性，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述与类风湿性关节炎相关的病毒物质，或上述物质的一种再激活物引起的感染。

6.使用一种病毒物质，其基因组的pol基因编码的一段肽序列，该肽序列在其任一段有至少30个氨基酸的连续序列上与由选自SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ IDNO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的一段核苷酸序列所编码的一段肽序列有至少50％、优选至少70％的同源性，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述与类风湿性关节炎相关的病毒物质，或上述物质的一种再激活物引起的感染。

7.使用一段核苷酸片段，其核苷酸序列包括选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列和等价序列的一段核苷酸序列，特别是选自这样的核苷酸序列，其任一段含100个连续单体的序列至少有50％、优选至少70％同源于选自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的一段序列，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述相关于类风湿性关节炎的病毒物质，或上述病毒物质的一种再激活物所引起的感染。

8.使用一种特异性引物，它包括一段核苷酸序列，该序列完全相同于或等价于权利要求7中定义的一个片段的至少一部分核苷酸序列，特别是这样一段核苷酸序列，在其任一段含10个连续单体的序列上有至少70％同源于上述片段的至少一个部分，以用聚合作用扩增相关于类风湿性关节炎的一种病毒物质的一段RNA或DNA。

9.按照权利要求8的用途，其特征在于：引物带有一个核苷酸序列，此序列选自SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，EQ要ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO47，SEQ IDNO48和SEQ ID NO49及其互补序列。

10.使用一种探针，它带有一段核苷酸序列，该序列相同于或等价于权利要求6中定义的一个片段的至少一部分核苷酸序列，特别是这样一段核苷酸序列，在其任一段有10个连续单体的序列上有至少70％同源于上述片段的至少一部分，以获得一种组合物以检测、分离或鉴定某生物学样品中与类风湿性关节炎相关的一种病毒物质。

11.按照权利要求10的用途，其特征在于该引物带有选自SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ IDNO7，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，EQ要ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO47，SEQ IDNO48和SEQ ID NO49及其互补序列的一段核苷酸序列。

12.使用一种致病和/或感染因子，其为纯化或分离状态，不同于权利要求1～6任一项中定义的病毒物质，其来自一病毒株，该病毒株选自分别被称为POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号V93010816)的病毒株及其变异株，所包括的致病和/或感染因子带有至少一种抗原，它能被至少一种抗体识别，该抗体直接针对相关于上述病毒株POL-2和MS7PG的任一种致病和/或感染因子的至少一种抗原，这些因子各自不同于上述毒株的任一种逆转录病毒物质，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述相关于类风湿性关节炎的致病和/或感染因子，或上述因子的一种再激活物引起的感染。

13.使用一种致病和/或感染因子，其为纯化或分离态的，不同于权利要求1～6任一项定义的病毒物质，产自一细胞系，该系选自分别被称为PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号93010817)的两种细胞系，以及产自任何能产生至少任一种致病和/或感染因子的感染细胞培养物和/或其变异体，或产自任一种感染细胞培养，该细胞培养能产生一种致病和/或感染因子。该因子带有至少一种抗原，该抗原能被至少一种抗体识别，该抗体能直接针对相应于上述PLI-2和LM7PC产生的任一种致病和/或感染因子的至少一种抗原，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述相关于类风湿性关节炎的致病和/或感染因子，或上述因子的一种再激活物引起的感染。

14.使用一种带一种核酸的致病和/或感染因子，该核酸带有一段选自SEQ ID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40，SEQID NO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，它与含有一段选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ IDNO12，SEQ 1D NO40，SEQ ID NO41及其互补序列的序列的一段核苷酸序列有至少70％、优选至少90％的同源性，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述相关于类风湿性关节炎的致病和/或感染因子，或上述因子的一种再激活物引起的感染。

15.使用一核苷酸片段，其含有选自SEQ ID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及其互补序列和等价序列的核苷酸片断，特别是这样一种核苷酸序列，它在其任一段有100个连续单体的序列上有至少70％、优选至少90％同源于选自SEQ ID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列的一段序列，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述相关于类风湿性关节炎的致病和/或感染因子，或上述因子的再激活物引起的感染。

16.使用一种引物，其含有一段核苷酸序列，该序列相同于或等价于权利要求15中定义的一个片段的至少一部分核苷酸序列，特别是一核苷酸序列，在其任一段有10个连续单体的序列上有至少90％同源于上述片段的至少一部分，以通过聚合来扩增与类风湿性关节炎相关的致病和/或感染因子的一段RNA或DNA。

17.按权利要求16的用途，其特点在于该引物带有一段选自SEQ IDNO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO27，SEQ IDNO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO34，SEQ IDNO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO44，SEQ IDNO45和SEQ ID NO46及其互补序列的核苷酸序列。

18.使用一种引物，其含有一核苷酸序列，该序列相同于或等价于权利要求15的一片段的至少一部分核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含10个连续单体的序列上有至少90％同源于上述片段的至少一部分，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由上述与类风湿性关节炎相关的致病和/或感染因子，或上述因子的再激活物引起的感染。

19.按照权利要求18的用途，其特点在于，该探针包括一段选自SEQID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ IDNO30，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ IDNO37，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46及其互补序列的核苷酸序列。

20.使用由两种致病和/或感染因子组成的一种组合物，其为分离态或纯化态的，即，第一因子，包括人病毒，有逆转录酶活性，相关于内源逆转录病毒因子的一个家族，或是上述病毒的一个变异株；以及第二因子，或上述第二因子的一种变异，这两种致病和/或感染因子象那些衍生于相同病毒株的因子一样，这里的病毒株选自被分别称为POL-2(1992年7月22 ECACC提出申请，登录号为V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号V93010816)的两种毒株及其变异株，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由相关于类风湿性关节炎的第一致病和/或感染因子和第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或上述第二因子的一种再激活物所致的感染。

21.使用由两种致病和/或感染因子组成的组合物，其为分离态或纯化态的，即，第一因子，由带逆转录酶活性的一种人病毒构成，它相关于内源逆转录病毒因子的一个家族，或由上述病毒的一种变异体组成；以及第二因子，或上述第二因子的一种变异体，这两种致病和/或感染因子就象那些产自同样的细胞系的因子，该细胞系选自被分别称为PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申请，登录号92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申请，登录号93010817)的两种细胞系，这两种因子也产自受感染细胞培养和/或其变异，该培养能产生其中至少一种致病和/或感染因子，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由与类风湿性关节炎相关的第一致病和/或感染因子，第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或第二因子的再激活物引起的感染。

22.使用由两种致病和/或感染因子组成的组合物，其为分离或纯化态的，即，第一因子，包括一种病毒或其变异体，其基因组包括一段选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6，EQ要ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这样一种核苷酸序列，其任一段含100个连续单体的序列上有至少50％，优选至少70％同源于一段选自SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互补序列的核苷酸序列；第二致病和/或感染因子，其基因组有一段选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含100个连续单体的序列上有至少70％、优选至少90％同源于选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列的一段核苷酸序列，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由相关于类风湿性关节炎的第一致病和/或感染因子和由第二致病和/或感染因子，或由上述第一因子或第二因子任一种的再激活物引起的感染。

23.使用一种核苷酸片段组合物，其中有第一片段，其核苷酸序列有一段选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含100个连续单体的序列上有至少50％、优选至少70％同源于一段选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互补序列的核苷酸序列；以及第二片段，其核苷酸序列包括一段选自SEQ IDNO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ IDNO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含100个单体的序列上有至少70％、优选至少90％同源于选自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互补序列的一核苷酸序列，上述每个片段都尤其是一个探针，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由与类风湿性关节炎相关的第一致病和/或感染因子，第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或第二因子任一种的再激活物引起的感染。

24.使用一种组合物，它包括第一多肽，其部分或全部地由权利要求23中定义的第一核苷酸片段编码；以及第二多肽，其部分或全部地由权利要求23中定义的第二核苷酸片段编码，以获得一种诊断、预防或治疗组合物来检测、防止或治疗由相关于类风湿性关节炎的第一致病和/或感染因子，第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或第二因子任一种的再激活物引起的感染。

25.按权利要求24的用途，其特点在于该用途包括第一配基，特别是一抗体，它特异性针对第一多肽，以及第二配基，特别是一抗体，它特异性针对第二多肽，所述第一多肽和第二多肽是权利要求24中定义的。

26.按权利要求1至6之一产生第一致病和/或感染因子，和/或，按权利要求13和15之一产生第二致病和/或感染因子的方法，这些因子相关于类风湿性关节炎，其特点在于来自滑液穿刺的细胞均经体外培养，这些细胞特别选自类风湿性关节炎病人关节液的去皮成纤维细胞和滑膜成纤维细胞。

27.按权利要求1至6之一产生第一致病和/或感染因子，和/或，按权利要求13和14之一产生第二致病和/或感染因子的方法，这些因子相关于类风湿性关节炎，其特点是由EB病毒无限增殖化的B淋巴细胞在体外培养，这些细胞来自类风湿性关节炎病人。

28.核苷酸片段，其核苷酸序列包括一段选自SEQ ID NO39，SEQID NO42，SEQ ID NO43，及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含100个连续单体的序列上显示出至少50％、优选至少70％同源于选自SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互补序列的一段序列。

29.通过聚合作用对权利要求1至6任一项的病毒物质的一段RNA或DNA进行扩增所用的特异性引物，其特点是该引物带有一段核苷酸序列，该序列相同于或等价于权利要求28的一个片段的至少一部分核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含10个连续单体的顺序上显示至少70％同源于上述序列的至少一部分。

30.按权利要求29的引物，其特征在于，它包括一段选自SEQ IDNO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49及它们的互补序列的核苷酸序列。

31.能与权利要求1至6中任一项的病毒物质的RNA或DNA特异性杂交的探针，其特征在于它包括一段核苷酸序列，该序列相同于或等价于权利要求28的一片段的至少一部分核苷酸序列，特别是这样一种核苷酸序列，在其任一段含10个连续单体的顺序上显示至少70％同源于上述片段的至少一部分。

32.按权利要求31的探针，其特征在于它含有一段选自SEQ IDNO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49及它们的互补序列的核苷酸序列。

33.核苷酸片段，其核苷酸序列包括一段选自SEQ ID NO40，SEQID NO41及其互补序列和等价序列的核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含100个连续单体的序列上显示至少70％、优选至少90％同源于选自SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及其互补序列的一段序列。

34.用于通过聚合作用对权利要求12至14任一项的致病和/或感染因子的RNA或DNA进行扩增的特异性引物，其特征在于它包括一段核苷酸序列，该序列相同于或等价于权利要求33的片段的至少一部分核苷酸序列，特别是这种核苷酸序列，在其任一段含10个连续单体的顺序上显示至少90％同源于上述片段的至少一部分。

35.按权利要求34的引物，其特征在于它包括一段选自SEQ IDNO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46及其互补序列的核苷酸序列。

36.能与权利要求12至14任一项的致病和/或感染因子的RNA或DNA特异性杂交的探针，其特点在于它包括一段核苷酸序列，该序列相同于或等价于权利要求33的片段的至少一部分核苷酸序列，特别是这样一段核苷酸序列，在其任一段含10个连续单体的顺序上显示至少90％同源于上述片段的至少一部分。

37.按权利要求36的探针，其特征在于它包括一段选自SEQ IDNO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47及其互补序列的核苷酸序列。