CN1259957A - 产生由多个亚单位组成的aslv逆转录酶的方法 - Google Patents

产生由多个亚单位组成的aslv逆转录酶的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1259957A
CN1259957A CN98806006A CN98806006A CN1259957A CN 1259957 A CN1259957 A CN 1259957A CN 98806006 A CN98806006 A CN 98806006A CN 98806006 A CN98806006 A CN 98806006A CN 1259957 A CN1259957 A CN 1259957A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aslv
nucleic acid
reversed transcriptive
transcriptive enzyme
rsv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN98806006A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1259957B (zh
Inventor
G·F·格拉德
M·D·史密斯
D·K·查特吉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Life Technologies Inc
Original Assignee
Life Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Life Technologies Inc filed Critical Life Technologies Inc
Publication of CN1259957A publication Critical patent/CN1259957A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1259957B publication Critical patent/CN1259957B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus

Abstract

本发明一般涉及用于逆转录核酸分子,尤其是信使RNA分子的组合物和方法。本发明具体涉及含有具有逆转录酶(RT)活性之多肽的混合物的组合物,并涉及使用这些组合物或多肽,在高于约55℃的温度下产生、扩增或测序核酸分子(尤其是cDNA分子)的方法。本发明还涉及由这些方法产生的核酸分子,含有这些核酸分子的载体和宿主细胞,以及所述核酸分子用于产生所需多肽的用途。本发明还涉及产生Rous肉瘤病毒(RSV)和禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT或其它禽肉瘤－白血病病毒(ASLV)RT(其α和/或β亚单位)的方法,涉及编码所述RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT亚单位的分离的核酸分子,涉及含有这些分离的核酸分子的载体和宿主细胞,并涉及由这些方法产生的RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT亚单位。本发明还涉及编码重组异二聚体RT全酶,尤其是异二聚体RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT(可以是αβRT,ββRT或αRT)的核酸分子,涉及含有这些核酸分子的载体(尤其是杆状病毒载体)和宿主细胞(尤其是昆虫和酵母细胞),并涉及产生这些异二聚体RT的方法和由这些方法产生的异二聚体RT。本发明还涉及含有本发明的组合物,多肽或者RSV RT,AMV RT或其它ASLV RT的试剂盒。

Description

产生由多个亚单位组成的ASLV逆转录酶的方法
发明领域
本发明为分子和细胞生物学领域。本发明一般涉及逆转录酶和逆转录核酸分子、尤其是信使RNA分子的方法。本发明具体涉及含有逆转录酶混合物的组合物，并涉及使用这些逆转录酶或其组合物产生、或扩增核酸分子(尤其是cDNA分子)或者测定其序列的方法。本发明还涉及由这些方法产生的核酸分子，并涉及使用这种核酸分子产生所需的多肽。本发明还涉及含有上述组合物的试剂盒。
发明背景cDNA和cDNA文库
在检查生物体、组织或细胞的结构和生理时，经常需要测定其遗传组成。生物体细胞和生殖细胞中所含脱氧核糖核酸(DNA)中的双链核苷酸碱基序列编码了该生物体的基因构架。只有产生基因编码的蛋白质才能显示特定DNA区段或基因的遗传组成。为了产生蛋白质，通过聚合酶产生了一条DNA双螺旋链(“编码”链)的互补拷贝，即特定的核糖核酸(RNA)序列。由于这种特定类型的RNA含有来自DNA、用于产生蛋白质的遗传信息，因而被称为信使RNA(mRNA)。
在给定细胞、组织或生物体中，存在很多种mRNA，各编码独立的和特定的蛋白质。这一事实为致力于研究组织或细胞中基因表达的研究者提供了强有力的工具，即通过多种分子生物学技术可分离和进一步操作mRNA分子，籍此阐明细胞、组织或生物体的全部功能性遗传组成。
研究基因表达的常用方法之一是产生互补的DNA(cDNA)克隆。在此技术中，生物体的mRNA分子分离自生物体细胞或组织的提取物。分离中经常使用固体层析基质，如纤维素或琼脂糖，其上络合有胸苷(T)寡聚体。由于大多数真核mRNA分子的3’末端含有一段腺苷(A)碱基序列，而A可与T结合，因此可快速地将mRNA分子与组织或细胞提取物中的其它分子和物质分离开。使用逆转录酶(RT)，可由这些纯化的mRNA分子制备cDNA拷贝，从而产生单链cDNA分子。然后通过DNA聚合酶的作用可将单链cDNA转变为原始mRNA的(因而是生物体基因组中所含的编码此mRNA的原始双链DNA序列的)完全双链DNA拷贝(即双链cDNA)。然后可将蛋白质特异性的双链cDNA插入质粒或病毒载体，再将所述载体导入宿主细菌、酵母、动物或植物细胞。通过在培养基中培养宿主细胞可产生含有(在很多情况下为表达)所需基因的宿主细胞群体。
从分离mRNA到将cDNA插入质粒或载体中、再培养含分离基因的宿主细胞群体的整个过程被称为“cDNA克隆”。如果cDNA制备自大量不同的mRNA，则所得的一套cDNA被称为“cDNA文库”，这一术语是恰当的，因为此套cDNA代表含有来源细胞、组织或生物体中存在的功能性遗传信息的基因“群体”。对这些cDNA文库的基因型分析产生了很多有关其来源生物体之结构和功能的信息。逆转录病毒的逆转录酶
已深入研究了3种原型形式的逆转录病毒RT，Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)RT含有一个78KDa亚单位，它具有依赖于RNA的DNA聚合酶和RNA酶H的活性。在大肠杆菌中克隆并表达了完全活性形式的此酶(参见Prasad，V.R.，逆转录酶，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，p.135(1993))。人免疫缺损病毒(HIV)RT是p66和p51亚单位的异二聚体，其中较小的亚单位通过蛋白酶水解衍生自较大的亚单位。p66亚单位具有依赖于RNA的DNA聚合酶和RNA酶H结构域，而p51亚单位仅具有DNA聚合酶结构域。活性HIV p66/p51 RT已在包括大肠杆菌的很多表达宿主中成功地被克隆和表达(参见Le Grice，S.F.J.，逆转录酶，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，p.163(1993))。在HIVp66/p51异二聚体中，51-KD亚单位无催化活性，66-KD亚单位具有DNA聚合酶和RNA酶H的活性(Le Grice，S.F.J.，等，EMBO J10：3905(1991)；Hostomsky，Z.，等，病毒学杂志，66：3179(1992))。禽肉瘤-白血病病毒(ASLV)RT包括但不限于Rous肉瘤病毒(RSV)RT，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT，禽红白血病病毒(AEV)辅助病毒MCAV RT，禽髓细胞瘤病毒MC29辅助病毒MCAV RT，禽网状内皮细胞瘤病毒(REV-T)辅助病毒REV-A RT，禽肉瘤病毒UR2辅助病毒UR2AV RT，禽肉瘤病毒Y73辅助病毒YAV RT，Rous伴随病毒(RAV)RT和成髓细胞瘤伴随病毒(MAV)RT，它们也是由两个亚单位α(约62KDa)和β(约94KDa)构成的异二聚体，其中α通过蛋白酶水解衍生自β(参见Prasad，V.R.，逆转录酶，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，p.135(1993))。ASLV RT可以另外两个催化活性结构形式ββ和α存在(Hizi，A.和Joklik，W.K.，生物化学杂志，252：2281(1977))。沉降分析表明αβ和ββ是二聚体，α形式以等量的单体和二聚体形式存在(Grandgenett，D.P.，等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70：230(1973)；Hizi，A.和Joklik，W.K.，生物化学杂志，252：2281(1977)；和Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：3372(1988))。ASLV αβ和ββ RT是已知的在相同蛋白质复合物中包括3种不同活性：DNA聚合酶，RNA酶H和DNA内切核酸酶(整合酶)活性的唯一一个例子(参见Skalka，A.M.，逆转录酶，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，p.193(1993))。α形式缺乏整合酶结构域和活性。
ASLV RT多种形式的各个亚单位已被克隆和表达。它们包括一般被蛋白酶水解加工成β的98-KDa前体多肽和得自β羧基末端的4-KDa多肽(Alexander，F.，等，病毒学杂志，61：534(1987)和Anderson，D等，Focus 17：53(1995))，和成熟的β亚单位(Weis，J.H.和Salstrom，J.S.，美国专利4,663,290(1987)；和Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：3372(1988))。异二聚体形式的RSV αβRT也可纯化自表达克隆的RSV β基因的大肠杆菌细胞(Chernov，A.P.等，Biomed.Sci，2：49(1991))。然而，迄今为止未报道过同时表达克隆的ASLV RT α和β基因，形成异二聚体形式的αβ RT。逆转录效率
如上所述，通过RT介导的逆转录使mRNA转变为cDNA是研究由克隆基因表达的蛋白质的必需步骤。然而，使用未经修饰的RT催化逆转录是无效的，原因至少有两个。首先，在逆转录开始之前，RT有时会破坏RNA模板，这主要是RT中存在的内在RNA酶H活性所致。第二，在逆转录过程开始之后，RT经常不能完成逆转录(Berger，S.L.，等，生物化学，22：2365-2372(1983)；Krug，M.S.，和Berger，S.L.酶学方法，152：316(1987))。除去RT的RNA酶H活性可消除第一个问题，并改善逆转录效力(Gerard，G.F.，等，FOCUS 11(4)：60(1989)；Gerard，G.F.，等，FOCUS 14(3)：91(1992))。然而，RT，包括其缺乏RNA酶H活性的形式(“RNA酶H-”形式)仍趋向于在核酸模板中某些二级结构(Gerard，G.F.，等，FOCUS 11(4)：60(1989)；Myers，T.W.，和Gelfand，D.H.，生物化学，30：7661(1991))和序列(Messer，L.I.，等，病毒学，146：146(1985)；Abbotts，J.，等，生物化学杂志，268：10312-10323(1993))屏障处过早终止DNA合成。
甚至在目前最有效的、使用RNA酶H- M-MLV RT的逆转录系统中，总cDNA产物的量一般不超过mRNA投入量的50％，全长的产物组分不超过50％。经常在一段同聚体序列中出现(Messer，L.I.，等，病毒学，146：146(1985)；Huber，H.E.，等，生物化学杂志，264：4669-4678(1989)；Myers，T.W.，和Gelfand，D.H.，生物化学，30：7661(1991))、如上所述可引起这些局限性的mRNA模板中二级结构和序列的屏障，更常见的是序列屏障而非二级结构屏障(Abbotts，J.，等，生物化学杂志，268：10312-10323(1993))，对不同RT而言，所述屏障经常各不相同(Abbotts，J.，等，生物化学杂志，268：10312-10323(1993))。如果这些屏障能被克服，逆转录反应中总的和全长的cDNA产物的量即可增加。
发明简述
本发明提供了逆转录酶，含有此酶的组合物和用于克服上述cDNA长度限制的方法。一般地说，本发明提供了可用于逆转录核酸分子的组合物，所述组合物含有两种或多种不同的、具有逆转录酶活性的多肽。这种组合物中还可包括一种或多种核苷酸，适当的缓冲液，和/或一种或多种DNA聚合酶。本发明的组合物中也可包括一个或多个寡核苷酸引物。本发明组合物中所用的各个逆转录酶在给定mRNA分子上可能具有不同的转录停顿位点。优选这些组合物中逆转录酶的RNA酶H活性降低或大大降低，最优选逆转录酶选自Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)H-逆转录酶，Rous肉瘤病毒(RSV)H-逆转录酶，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)H-逆转录酶，Rous伴随病毒(RAV)H-逆转录酶，成髓细胞瘤伴随病毒(MAV)H-逆转录酶，和人免疫缺损病毒(HIV)H-逆转录酶或其它ASLV H-逆转录酶。在优选的组合物中，逆转录酶以工作浓度存在。
本发明也涉及制备一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括将一种或多种核酸模板(优选为一种或多种RNA模板，最优选为一种或多种信使RNA模板)与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽混合，并在足以制备与所述一种或多种核酸模板之全部或部分互补的第一核酸分子的条件下，保温上述混合物。在优选的实施方案中，该第一核酸分子是单链cDNA。根据本发明的此方面适于逆转录的核酸模板包括任何核酸分子或核酸分子群体(优选为RNA，最优选为mRNA)，尤其是得自细胞或组织的核酸分子或其群体。根据本发明，在优选的方面，mRNA分子群体(一般为得自细胞或组织的大量不同的mRNA分子)被用于制备cDNA文库。核酸模板的细胞来源优选为细菌细胞，真菌细胞，植物细胞和动物细胞。
本发明也涉及制备一种或多种双链核酸分子的方法，所述方法包括(a)将一种或多种核酸模板(优选为RNA或mRNA，更优选为mRNA模板群体)与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽混合；(b)在足以制备与所述一种或多种模板之全部或部分互补的第一核酸分子的条件下，保温上述混合物；和(c)在足以制备与第一核酸分子之全部或部分互补的第二核酸分子的条件下，保温第一核酸分子，从而形成一个或多个含有第一和第二核酸分子的双链核酸分子。这种方法将使用一种或多种DNA聚合酶作为制备该一种或多种双链核酸分子之方法的一部分。本发明也涉及可用于制备这种双链核酸分子的组合物，所述组合物含有两种或多种逆转录酶，并任选含有一种或多种DNA聚合酶，还含有适当的缓冲液和一种或多种核苷酸。
本发明还涉及扩增核酸分子的方法，所述扩增方法包括将如上述产生的双链核酸分子与一种或多种DNA聚合酶混合，并在足以扩增该双链核酸分子的条件下保温混合物。在第一个优选的实施方案中，本发明涉及扩增核酸分子的方法，该方法包括(a)将一种或多种核酸模板(优选为一种或多种RNA或mRNA模板，更优选为mRNA模板群体)与两个或多个具有逆转录酶活性的不同多肽，和一种或多种DNA聚合酶混合；和(b)在足以扩增与所述一种或多种模板之全部或部分互补的核酸分子的条件下，保温混合物。优选逆转录酶的RNA酶H活性降低或大大降低，DNA聚合酶含有具有3’外切核酸酶活性的第一种DNA聚合酶和3’外切核酸酶活性大大降低的第二种DNA聚合酶。本发明还涉及含有两种或多种逆转录酶和一种或多种DNA聚合酶的组合物，该组合物可用于扩增反应。该组合物中还可含有一种或多种核苷酸和适用于扩增的缓冲液。本发明的组合物也可含有一个或多个寡核苷酸引物。
根据本发明，可使用至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，或更多种逆转录酶。优选在本发明的组合物和方法中使用2至6种，2至5种，2至4种，2至3种逆转录酶，最优选使用2种逆转录酶。在本发明的组合物和方法中，可同时或以任何次序依次加入多种逆转录酶。或者，可分开进行使用不同酶的多个不同反应，再混合反应产物。因此，本发明涉及通过本发明的方法合成核酸分子，所述方法中同时或依次或分开使用多种逆转录酶。具体地说，本发明涉及制备一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括在足以制备与所述一种或多种模板之全部或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下，将所述一种或多种核酸模板(优选为一种或多种RNA模板或mRNA模板，更优选为mRNA模板群体)与第一种逆转录酶保温。根据本发明，可在足以制备与模板之全部或部分互补的其它核酸分子或足以增加先前制备的核酸分子之长度的条件下，将一种或多种核酸分子(包括mRNA模板和/或合成的核酸分子)与第二种逆转录酶保温。根据本发明，可以用本发明所述的相同或不同逆转录酶将此方法重复任意次。例如，第一种和第二种逆转录酶可以是相同的，或不同的。另外，第一种和第三种逆转录酶(在本发明的此方面，此时使用第一，第二和第三种逆转录酶将上述方法重复了3次)可以是相同的，而第二种逆转录酶可以与第一种和第三种逆转录酶不同。因此，在本发明的此方面，可联合使用任何相同和/或不同的逆转录酶。当使用多种逆转录酶时，优选至少两种逆转录酶是不同的。
在本发明相关的方面，反应中所用的逆转录酶在随后的反应步骤中可保留其全部或部分活性。或者，在与其它逆转录酶一起保温之前，可使用任何方法灭活反应中所用的逆转录酶。所述灭活包括但不限于热灭活，有机抽提(如用苯酚和/或氯仿)，乙醇沉淀等。
通过同时或依次或分开加入逆转录酶制备的合成核酸分子可被用于制备双链核酸分子。这种合成核酸分子可用作模板，当它在适当条件下(如优选在一种或多种DNA聚合酶的存在下)保温时可制备与合成核酸分子之全部或部分互补的核酸分子，从而形成大量双链核酸分子，然后可根据本发明扩增双链分子。
本发明还涉及根据上述方法产生的核酸分子(尤其是单链或双链cDNA分子)或扩增的核酸分子，还涉及含有这些核酸分子或扩增的核酸分子的载体(尤其是表达载体)。
本发明还涉及含有上述核酸分子、扩增的核酸分子或载体的重组宿主细胞。优选这种宿主细胞包括细菌细胞，酵母细胞，植物细胞和动物细胞(包括昆虫细胞和哺乳动物细胞)。
本发明还涉及产生多肽的方法，所述方法包括培养上述重组宿主细胞并分离多肽，本发明还涉及通过这种方法产生的多肽。
本发明还涉及使用本发明的组合物或酶测定一种或多种核酸分子的序列的方法，所述方法包括(a)将一种或多种待测序的核酸分子(如一种或多种RNA或DNA分子)与一个或多个引物，一种或多种具有逆转录酶活性的多肽，一种或多种核苷酸和一种或多种终止试剂(如一个或多个双脱氧核苷三磷酸)相混合；(b)在足以合成与所述一种或多种待测序之核酸分子的全部或部分互补的核酸分子群体的条件下保温混合物；和(c)分离核酸分子群体以测定该一种或多种待测序之核酸分子的全部或部分核苷酸序列。在本发明的这些测序方法中，所述一种或多种具有逆转录酶活性的多肽可被同时，依次或分开加入到上述反应混合物中。
本发明还涉及本发明方法所用的试剂盒，可使用该试剂盒制备，测序或扩增核酸分子(单链或双链)。本发明的试剂盒中含有载体，如盒或纸盒，密闭的载体中含有一个或多个容器，如小管，试管，瓶等。在本发明的试剂盒中，第一个容器中含有一种或多种逆转录酶(优选为RNA酶H活性降低或大大降低的逆转录酶)或一种或多种本发明的组合物。另一方面，试剂盒可含有一个或多个容器，其中含有2或多种，3或多种，4或多种，5或多种，6或多种等逆转录酶，优选一个或多个容器中含有2至6，2至5，2至4，2至3或更优选2种逆转录酶。本发明的试剂盒也可在相同或不同容器中含有一种或多种DNA聚合酶(优选为热稳定性的DNA聚合酶)，核酸分析所用的适当缓冲液和一种或多种核苷酸。或者，组合物的组分可分开放在不同的容器中(如每个容器中放一种酶)。在本发明优选的试剂盒中，逆转录酶的RNA酶H活性降低或大大降低，最优选逆转录酶选自M-MLV H-逆转录酶，RSV H-逆转录酶，AMV H-逆转录酶，RAV H-逆转录酶，MAV H-逆转录酶，和HIV H-逆转录酶。在本发明其它优选的试剂盒中，容器中的酶(逆转录酶和/或DNA聚合酶)以工作浓度存在。
本发明也涉及产生RSV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。具体地说，本发明涉及产生具有RNA酶H活性之RSV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。还涉及产生RNA酶H活性有所降低或大大降低的RSV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。还涉及由这些方法产生的RSV逆转录酶(和/或其亚单位)。
本发明还涉及使用这种逆转录酶的方法，并涉及含有这种逆转录酶的试剂盒。具体地说，在测序，扩增和(经由例如逆转录)产生核酸分子的方法中可使用本发明的RSV逆转录酶(和/或其亚单位)。
本发明还涉及产生AMV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。具体地说，本发明涉及产生具有RNA酶H活性之AMV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。还涉及产生RNA酶H活性有所降低或大大降低的AMV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。还涉及由这些方法产生的AMV逆转录酶(和/或其亚单位)。
本发明还涉及使用这种逆转录酶的方法，并涉及含有这种逆转录酶的试剂盒。具体地说，在测序、扩增和(经由例如逆转录)产生核酸分子的方法中可使用本发明的AMV逆转录酶(和/或其亚单位)。
本发明一般涉及产生ASLV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。具体地说，本发明涉及产生具有RNA酶H活性之ASLV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。还涉及产生RNA酶H活性有所降低或大大降低的ASLV逆转录酶(和/或其亚单位)的方法。还涉及由这些方法产生的ASLV逆转录酶(和/或其亚单位)。
本发明还涉及使用这种逆转录酶的方法，并涉及含有这种逆转录酶的试剂盒。具体地说，在测序、扩增和(经由例如逆转录)产生核酸分子的方法中可使用本发明的ASLV逆转录酶(和/或其亚单位)。
本发明还涉及升温或高温逆转录核酸分子的方法，所述方法包括(a)将一种或多种核酸模板(优选为一种或多种RNA分子(如一个或多个mRNA分子或polyA+RNA分子，更优选为mRNA分子群体)或一个或多个DNA分子)与一种或多种具有逆转录酶活性的多肽混合；和(b)在足以制备与所述一种或多种核酸模板之全部或部分互补的第一核酸分子(如全长cDNA分子)的条件下，于50℃或更高温度下保温混合物。在优选的方面，于升高的温度下或高温下使用mRNA分子群体制备cDNA文库。另一方面，用多种逆转录酶(即2或多种，3或多种，4或多种，5或多种，6或多种等，更优选为2至6，2至5，2至4，2至3或更优选2种逆转录酶)进行升温或高温下的核酸合成，可按上述将所述逆转录酶同时或依次或分开加入到反应混合物中。在优选的此方法中，保温混合物的温度为约51℃或更高，约52℃或更高，约53℃或更高，约54℃或更高，约55℃或更高，约56℃或更高，约57℃或更高，约58℃或更高，约59℃或更高，约60℃或更高，约61℃或更高，约62℃或更高，约63℃或更高，约64℃或更高，约65℃或更高，约66℃或更高，约67℃或更高，约68℃或更高，约69℃或更高，约70℃或更高，约71℃或更高，约72℃或更高，约73℃或更高，约74℃或更高，约75℃或更高，约76℃或更高，约77℃或更高，约78℃或更高；或为以下温度范围：约50℃至约75℃，约51℃至约75℃，约52℃至约75℃，约53℃至约75℃，约54℃至约75℃，约55℃至约75℃，约50℃至约70℃，约51℃至约70℃，约52℃至约70℃，约53℃至约70℃，约54℃至约70℃，约55℃至约70℃，约55℃至约65℃，约56℃至约65℃，约56℃至约64℃或约56℃至约62℃。本发明另外涉及的方法进一步包括在足以制备与第一核酸分子之全部或部分互补的第二核酸分子的条件下，保温第一核酸分子。根据本发明，通过这些方法产生的第一和第二核酸分子可以是DNA分子，并可形成双链DNA分子，该双链DNA分子可以是全长的cDNA分子，如cDNA文库。优选地，这些方法中所用的一种或多种具有逆转录酶活性之多肽的RNA酶H活性降低或大大降低，优选所述多肽选自ASLV逆转录酶(和/或其亚单位)，如AMV逆转录酶的一个或多个亚单位和/或RSV逆转录酶的一个或多个亚单位和/或MAV逆转录酶的一个或多个亚单位，和/或RAV逆转录酶的一个或多个亚单位，尤其优选所述亚单位的RNA酶H活性降低或大大降低。
本发明还涉及升温或高温下合成核酸的试剂盒，其中含有一种或多种选自下列的组分：一种或多种逆转录酶(优选为一种或多种ASLV逆转录酶，如AMV或RSV逆转录酶(或其一个或多个亚单位)，更优选为一种或多种RNA酶H活性降低或大大降低了的AMV或RSV逆转录酶(或其一个或多个亚单位)，一种或多种核苷酸，一个或多个引物和一种或多种适当的缓冲液。
本发明还涉及由上述方法产生的核酸分子，它们可以是全长的cDNA分子，还涉及含有这些核酸分子的载体(尤其是表达载体)，并涉及含有这些载体和核酸分子的宿主细胞。
本领域技术人员参照下列附图、发明描述和权利要求书中所述的内容，会很明了本发明其它优选的实施方案。
图的简述
图1-6以图的形式(为了简明起见省略了细微处)描述了表达载体(pDABH-His)的构建，该载体将RSV RT α和β基因置于昆虫病毒启动子的控制之下：
图1：pJD100，pAMP18，pAMP18N，pAMP1，pAMP1C，pAMP18NM和pAMP18B。
图2：M13，M13RT，pAMP18BH-和M13RTH-。
图3：pAMP1A。
图4：pDBH-Kpn，pDABH-，pDBH-KpnHis。
图5：pFastBacDUAL，pFastBacDUAL Nde，pDBH-和pDA。
图6：pDABH-His。
图7-21是图1-6所述质粒更详细的图谱：
图7：pJD100。
图8：pAMP18N。
图9：pAMP1C。
图10：pAMP18NM。
图11：pAMP18B。
图12：M13RT。
图13：M13RTH-。
图14：pAMP18BH-。
图15：pDBH-。
图16：pAMP1A。
图17：pDBH-Kpn。
图18：pDBH-KpnHis。
图19：pDA。
图20：pDABH-。
图21：pDABH-His。
图22-25以图的形式(为了简明起见省略了细微处)描述了表达载体(pDAMVAH-BH-)的构建，该载体将AMV RT α和β基因置于昆虫病毒启动子的控制之下：
图22：由RNA克隆AMV RT基因；pSPORT8。
图23：构建His标记的AMV RT β基因；pAMVN，pAMVNM，pAMVNMH-，pAMVC和pAMVBH-。
图24：通过PCR构建AMV RT α亚单位的克隆；pAMVA和pAMVAH-。
图25：构建含有AMV RT α和β基因的载体；pD，pDAMVAH-，pDAMVA，pAMVH-BH-，pDAMVABH-和pJAMVBH-。
图26-38是图22-25所述质粒的更详细图谱：
图26：pAMVN。
图27：pAMVC。
图28：pAMVNM。
图29：pAMVNMH-。
图30：pAMVBH-。
图31：pAMVA。
图32：pAMVAH-。
图33：pFastBacDual(pD)。
图34：pDAMVA。
图35：pDAMVAH-。
图36：pDAMVABH-。
图37：pJAMVBH-。
图38：pDAMVAH-BH-。
图39是阐明在所示温度下保温所示时间的多种RT之RT活性的半对数图。
图40是在所示温度(℃)下，在50分钟的反应时间内，通过多种RT由1.4-，2.4-，4.4-和7.5-kb mRNA合成的cDNA产物的放射自显影图。M：32P标记的1Kb DNA梯度标志。
图41是在所示温度(℃)下，在30分钟的反应时间内，通过RSV H-RT和SS II RT由1.4-，2.4-，4.4-和7.5-kb mRNA合成的cDNA产物的放射自显影图。M：32P标记的1Kb DNA梯度标志。
图42是图41中通过SS II和RSV H- RT合成的全长cDNA的量作为保温温度之函数的图。
图43是质粒pBP-RT(PCR)的限制性图谱。
图44是质粒pBP-RT(ATG)的限制性图谱。
图45是质粒pBK-RT15(ATG)的限制性图谱。
图46是质粒pFBBH-His的限制性图谱。
图47是质粒pJB-His的限制性图谱。
图48是质粒pJBD110E-His的限制性图谱。
图49是质粒pDAD110E的限制性图谱。
图50是质粒pFBBD110E-His的限制性图谱。
图51是质粒pDABHis的限制性图谱。
图52是质粒pDABD110EHis的限制性图谱。
图53是质粒pDAD110EBHis的限制性图谱。
图54是质粒pDAD110EB110E的限制性图谱。
发明详述概论
本发明提供了可用于克服核酸分子逆转录过程中经常观察到的长度限制的组合物和方法。因此，本发明便于产生以前不可能产生的全长cDNA分子。
一般地说，本发明提供了可用于逆转录核酸分子的组合物，其含有2或多种，3或多种，4或多种，5或多种，6或多种等具有逆转录酶活性的不同的多肽。本发明的组合物优选含有2至6，2至5，2至4，2至3种，更优选含有2种具有逆转录酶活性的多肽。这些组合物中的酶优选以工作浓度存在，并且其RNA酶H活性降低或大大降低，但本发明组合物中也可使用这样的酶混合物，其中的一些酶具有RNA酶H活性，一些酶的RNA酶H活性降低或大大降低。或者，本发明组合物中所用的逆转录酶可具有RNA酶H的活性。优选的逆转录酶包括M-MLV H-逆转录酶，RSV H-逆转录酶，AMV H-逆转录酶，RAV H-逆转录酶，MAV H-逆转录酶，和HIV H-逆转录酶或其它ASLV H-逆转录酶。
本发明还涉及逆转录一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括将一种或多种核酸模板，优选为RNA或信使RNA(mRNA)，更优选为mRNA分子群体，与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽(或与本发明的组合物)混合；并在足以制备与所述一种或多种模板之全部或部分互补的核酸分子的条件下保温混合物。可通过依次或同时或分开加入多种逆转录酶完成上述核酸合成。优选使用2或多种，3或多种，4或多种，5或多种，6或多种等逆转录酶，或使用2至6，2至5，2至4，2至3种，更优选使用2种逆转录酶。为了制备与所述一种或多种模板互补的核酸分子，使用一种引物(如oligo(dT)引物)和一种或多种核苷酸以3’至5’的方向合成核酸。根据本发明的此方面，适用于逆转录的核酸分子包括任何核酸分子，特别是那些得自原核或真核细胞的核酸分子。所述细胞包括正常细胞，患病细胞，转化细胞，建系细胞，祖细胞，前体细胞，胎儿细胞，胚胎细胞，细菌细胞，酵母细胞，动物细胞(包括人细胞)，禽细胞，植物细胞等，或分离自植物或动物(如人，牛，猪，小鼠，绵羊，马，猴，狗，猫，大鼠，兔，鸟，鱼，昆虫等)的组织。这种核酸分子也可以分离自病毒。
本发明还提供了扩增或测序核酸分子的方法，所述方法包括将核酸分子与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽(或与本发明的组合物)接触。通过在反应混合物中依次或同时或分开加入两种或多种具有逆转录酶活性的多肽可完成此反应。优选此方法包括一个或多个聚合酶链反应(PCR)。
本发明还提供了根据上述方法产生的cDNA分子或扩增的核酸分子，含有这些cDNA分子或扩增的核酸分子的载体(尤其是表达载体)，含有所述cDNA分子、扩增的核酸分子或载体的重组宿主细胞。本发明还提供了产生多肽的方法，所述方法包括培养上述重组宿主细胞并分离多肽，本发明还提供了由这种方法产生的多肽。
本发明还提供了用于本发明的试剂盒，该试剂盒中含有载体，如盒或纸盒，在密闭的载体中含有一个或多个容器，如小管，试管，瓶等，其中试剂盒也可在相同或不同容器中含有两种或多种具有逆转录酶活性的多肽。本发明的试剂盒也可在相同或不同容器中含有一种或多种DNA聚合酶、适当缓冲液和/或一种或多种核苷酸(如脱氧核苷三磷酸(dNTP))。
本发明还涉及基本上纯化的RSV逆转录酶(RSV RT)，其RNA酶H活性可以降低也可以不降低。这种RSV RT可含有一个或多个亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)，所述亚单位选自一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位和一个或多个βp4亚单位，其中的任何一个或全部亚单位的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低。在本发明的一个优选方面，RSV RT可含有RNA酶H活性降低或大大降低的α亚单位和具有RNA酶H活性的β亚单位(即RSV αH-βH+ RT)。在此实施方案的优选方面，已对编码α亚单位的基因进行了修饰或突变以降低RNA酶H活性，而未以此方式突变或修饰编码β亚单位的基因。优选在α亚单位的RNA酶H结构域中进行这种突变或修饰。出乎意料的是，此构建体的表型显示出大大降低(即相对于野生型而言为5％)的RNA酶H活性。在另一个优选的方面，RSV RT可含有RNA酶H活性也降低或大大降低的α亚单位和RNA酶H活性降低或大大降低的β亚单位(即RSV αH-/βH- RT)。在另一个优选的方面，RSV RT可含有两个β亚单位，其中的任一个或两个的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(即RSV βH-/βH- RT；RSV βH-/βH+RT；或RSV βH+/βH+ RT)。另一优选的方面，RSV RT可含有单个α亚单位，其RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(即RSV αH- RT或RSV αH+ RT)。另一优选的方面，RSV RT可含有一个或多个βp4亚单位，其中的任一个或所有亚单位的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(如RSV βp4H/βp4H-RT；RSV βp4H-/βp4H+RT；RSV βp4H+/βp4H+RT；RSV αH-/βp4H+RT；RSV αH+/βp4H+RT；RSV αH-/βp4H- RT；RSV αH+/βp4H- RT；RSV βH-/βp4H+RT；RSV βH-/βp4H- RT；RSV βH+/βp4H- RT；RSV βH+/βp4H+ RT等)。应理解，本发明也可以使用上述任一或所有亚单位的衍生物，变体，片段或突变体。
在本发明相关的方面，若RSV RT含有两个或多个亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)，优选含有两个亚单位(如二聚体)，则其中至少一个，但优选不是所有亚单位可被修饰或突变以降低、大大降低或消除至少一个亚单位的聚合酶活性(如pol-)。在优选的方面，对含有α和β亚单位的RSV RT而言，β亚单位经修饰或突变(优选通过重组技术)而降低、大大降低或消除了聚合酶活性，而未对α亚单位的聚合酶活性进行这种形式的突变或修饰。优选此RSV RT的α亚单位经修饰或突变而降低或大大降低了RNA酶H活性，而未对β亚单位进行这种形式的突变或修饰。将此构建体称为αH-/βH+ pol-。可制备任何数目亚单位的组合，其中对两个亚单位酶中的一个亚单位进行了突变或修饰，这些构建体可与例如降低或大大降低了RNA酶H活性的其它修饰或突变联合。例子包括但不限于RSV αH-/βH- pol-；RSV αH+/βH+ pol-；RSV αH- pol-/βH+；RSV αH- pol-/βH-；RSV αH+pol-/βH+；RSV βH-/βH-pol-；RSV βH-/βH+pol-；RSV βH+/βH+pol-；RSV βp4H-/βp4H-pol-；RSVβp4H-/βp4H+ pol-；RSV βp4H+/βp4H+ pol-；RSV αH-/βp4H- pol-；RSVαH+/βp4H+ pol-；RSV αH+/βp4H- pol-；RSV βH-/βp4H+pol-；RSV βH-/βp4H+pol-；RSV βH+/βp4H-pol-等。在优选的方面，经重组技术修饰或突变(一个或多个点突变，缺失突变和/或插入突变)了亚单位的聚合酶结构域。另一方面，修饰或突变了聚合酶结构域的核苷酸结合位点。在优选的方面，核苷酸结合位点内的一个或多个酸性氨基酸被不同的氨基酸取代。核苷酸结合位点内供突变或修饰的特别优选的氨基酸包括但不限于Asp107，Leu108，Lys109和Asp110或相应的氨基酸序列。
本发明还涉及产生本发明RSV RT的方法，所述方法包括得到宿主细胞，该细胞中含有编码一个或多个α亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的核酸序列和/或编码一个或多个β亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的核酸序列和/或编码一个或多个βp4亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的核酸序列，并在足以产生本发明的RSV RT的条件下培养宿主细胞。编码这样的α亚单位和/或β亚单位和/或βp4亚单位的核酸序列可包含在相同或不同的载体中。根据本发明，可分开产生这样的α亚单位和/或β亚单位和/或βp4亚单位，并在分离各亚单位之前或之后将它们混合以形成本发明的RSV RT。或者，可在同一宿主细胞中同时表达(即共表达)上述α和/或β亚单位和/或βp4亚单位，从而产生含有α和β亚单位，仅含α亚单位，仅含β亚单位，仅含βp4亚单位，含有β亚单位和βp4亚单位，含有两个β亚单位或两个βp4亚单位，或其衍生物、变体、片段或突变体的RSV RT。在优选的方面，在宿主细胞中同时表达α亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)和β亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)。在本发明相关的方面，β或βp4亚单位(或其衍生物，片段或突变体)可在宿主或宿主细胞中表达，所述宿主或宿主细胞在体内完成一些或全部β或βp4亚单位的加工以形成相应的α亚单位。β和α亚单位的同时存在允许体内形成含有α和β亚单位的RSV RT。优选通过在宿主细胞中表达β和/或βp4亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)来完成上述体内加工，所述宿主细胞可以是原核或真核细胞，它们具有适当的加工酶或蛋白质可裂解β或βp4亚单位以形成相应的α亚单位。通过重组方法可将这种加工酶或蛋白质导入宿主系统中并在其中表达，它们也可以天然存在于宿主系统中。用于体内加工的优选宿主包括真核细胞或细胞器，如酵母，真菌，植物，动物，昆虫，鱼等。可克隆β或βp4亚单位(或其衍生物，片段或突变体)以进行体内加工的重组系统(载体，表达载体，启动子等)是本领域技术人员熟知的。如上所述，通过这些重组技术产生的RSV RT的任何或所有α和/或β和/或βp4亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的RNA酶H活性可能已降低或大大降低了。
然后可从宿主细胞中分离这些RSV RT或其亚单位，并通过本领域技术人员熟知的任何蛋白质纯化方法(如层析，电泳，透析，高盐沉淀或其组合)基本上纯化之。本发明还涉及含有一种或多种本发明RSV RT的试剂盒。
本发明还涉及基本上纯的禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV RT)，其RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低。这种AMV RT可含有一个或多个亚单位，所述亚单位选自一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位和一个或多个βp4亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)，其中的任一个或全部亚单位的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低。在本发明一个优选的方面，AMV RT可含有RNA酶H活性降低或大大降低的α亚单位，和具有RNA酶H活性的β亚单位(即AMV αH-/βH+RT)。在此实施方案特别优选的方面，编码α亚单位的基因已经修饰或突变而降低了RNA酶活性(优选在RNA酶H结构域内)，而编码β亚单位的基因未经修饰或突变以影响RNA酶H活性。出乎意料的是，此构建体显现的表型中含有α亚单位和β亚单位之AMV RT的RNA酶H活性大大降低(即约为野生型的5％)。在另一个优选的方面，AMV RT可含有RNA酶H活性也降低或大大降低的α亚单位和RNA酶H活性降低或大大降低的β亚单位(即AMVαH-/βH-RT)。在另一个优选的方面，AMV RT可含有两个β亚单位，其中之一或两者的RNA酶H活性可降低或大大降低，也可不降低或基本上不降低(即AMV βH-/βH-RT；AMV βH-/βH+ RT；或AMV βH+/βH+ RT)。在另一个优选的方面，AMV RT可含有单个α亚单位，其RNA酶H活性可降低或大大降低，也可不降低或基本上不降低(即AMV αH- RT或AMVαH+RT)。在另一个优选的方面，AMV RT可含有一个或多个βp4亚单位，其中之一或两者的RNA酶H活性可以降低或大大降低，也可以不降低或基本上不降低(如AMV βp4H-/βp4H- RT；AMV βp4H-/βp4H+ RT；AMVβp4H+/βp4H+ RT；AMV αH-/βp4H+ RT；AMV αH-/βp4H- RT；AMV αH+/βp4H-RT；AMV βH-/βp4H- RT；AMV βH+/βp4H- RT等)。
在本发明相关的方面，AMV RT含有两个或多个亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)，优选含有两个亚单位(如二聚体)，其中可以有至少一个、但优选不是所有亚单位被修饰或突变以降低、大大降低或消除至少一个亚单位的聚合酶活性(如pol-)。在优选的方面，对含有α和β亚单位的AMV RT而言，β亚单位已经修饰或突变(优选通过重组技术)而降低、大大降低或消除了聚合酶活性，而未对α亚单位的聚合酶活性进行这种形式的突变或修饰。优选此AMV RT的α亚单位也已经修饰或突变而降低或大大降低了RNA酶H活性，而未对β亚单位进行这种形式的突变或修饰。将此构建体称为αH-/βH+ pol-。可制备任何数目亚单位的组合，其中两亚单位酶中的一个亚单位具有突变或修饰，这些构建体可与例如降低或大大降低RNA酶H活性的其它修饰或突变联合。例子包括但不限于AMV αH-/βH- pol-；AMV αH+/βH+ pol-；AMV αH- pol-/βH+；AMV αH- pol-/βH-；AMV αH+pol/βH+；AMV βH-/βH-pol-；AMV βH-/βH+pol-；AMV βH+/βH+pol-；AMV βp4H-/βp4H- pol-；AMVβp4H-/βp4H+ pol-；AMV βp4H+/βp4H+ pol-；AMV αH-/βp4H- pol-；AMVαH+/βp4H+ pol-；AMV αH+/βp4H- pol-；AMV αH-/βp4H+pol-；AMV βH-/βp4H+pol-；AMV βH+/βp4H-pol-等。在优选的方面，经重组技术修饰或突变(一个或多个点突变，缺失突变和/或插入突变)了亚单位的聚合酶结构域。另一方面，修饰或突变了聚合酶结构域的核苷酸结合位点。在优选的方面，核苷酸结合位点内的一个或多个酸性氨基酸被不同的氨基酸取代。核苷酸结合位点内供突变或修饰的特别优选的氨基酸包括但不限于Asp107，Leu108，Lys109和Asp110或相应的氨基酸序列。
本发明还涉及产生本发明AMV RT的方法，所述方法包括得到宿主细胞，该细胞中含有编码一个或多个α亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的核酸序列和/或编码一个或多个β亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的核酸序列和/或编码一个或多个βp4亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的核酸序列，并在足以产生AMV RT的条件下培养宿主细胞。编码上述α亚单位和/或β亚单位和/或βp4亚单位的核酸序列可包含在相同载体或不同的载体中。根据本发明，可分开产生上述α亚单位和/或β亚单位和/或βp4亚单位，并在分离各亚单位之前或之后将它们混合以形成本发明的AMV RT。或者，可在同一宿主细胞中同时表达(即共表达)上述α和/或β亚单位和/或βp4亚单位，从而产生含有α和β亚单位，仅含α亚单位，仅含β亚单位，仅含βp4亚单位，含有β亚单位和βp4亚单位，含有两个β亚单位或两个βp4亚单位，或其衍生物、变体、片段或突变体的AMV RT。在优选的方面，宿主细胞中同时表达了α亚单位和β亚单位。在本发明相关的方面，β或βp4亚单位(或其衍生物，片段或突变体)可在宿主或宿主细胞中表达，所述宿主或宿主细胞可在体内完成上述加工以形成RSV RT。因此，通过在具有适当加工酶或蛋白质的宿主系统中表达β和/或βp4亚单位(或其衍生物，片段或突变体)，可产生相应的α亚单位，以形成含有α和β亚单位，α和βp4亚单位等的AMV RT。如上所述，AMV RT的任何或所有α和/或β和/或βp4亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)的RNA酶H活性可能有所降低或大大降低。然后可从宿主细胞中分离这些AMV RT或其亚单位，再通过上述纯化RSV RT的方法基本上纯化之。本发明还涉及含有本发明的一种或多种AMV RT的试剂盒。
本发明还涉及其它基本上纯的ASLV逆转录酶，其RNA酶H活性可降低或大大降低，也可不降低或基本上不降低。这种ASLV RT可含有一个或多个亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)，与上述RSV RT和AMV RT相同，所述亚单位选自一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位和一个或多个βp4亚单位。与上述RSV RT和AMV RT相同，本发明还涉及产生本发明之ASLV RT的方法。
本发明还涉及具有功能活性的RSV逆转录酶和AMV逆转录酶或其它ASLV逆转录酶及其亚单位(及其衍生物，变体，片段和突变体)，这种活性通过诸蛋白质由mRNA模板产生第一条cDNA链的能力即可测定出。根据本发明，基于合成反应过程中制备的总的全长逆转录产物，可测定出上述功能活性。优选基于所产生产物的质量(如纳克)测定产物的量，但其它测定产物量的方法也是本领域技术人员熟知的。另外，功能活性可测定为cDNA合成反应过程中产生的全长产物的百分比。例如，通过用全长产物的量除以cDNA合成反应过程中产生的总产物的量，再将结果乘以100即得到百分比，从而测定出全长功能活性百分比。本发明的RSV和AMV逆转录酶及其亚单位(及其衍生物，变体，片段和突变体)在核酸合成反应中产生的全长cDNA约大于4％，优选约大于5％，更优选约大于7.5％，更优选约大于10％，更优选约大于20％，最优选约大于25％。上述百分比的优选范围包括约5％至约100％，约7.5％至约75％，约7.5％至约50％，约10％至约50％，约15％至约40％，约20％至约40％，和约20％至约50％。根据本发明，也可通过测定合成反应过程中总cDNA产物相对于mRNA投入量的百分比来测定功能活性。因此，用cDNA产物总量除以mRNA投入量，再将结果乘以100即测定出功能活性的百分比，该百分比与相对于所用模板量所产生的产物量相关。优选本发明的逆转录酶在cDNA合成反应过程中相对于投入的mRNA产生了约大于15％的cDNA，更优选约大于20％，更优选约大于25％，更优选约大于30％，最优选约大于40％的cDNA。上述百分比的优选范围包括约5％至约100％，约10％至约80％，约15％至约80％，约15％至约75％，约20％至约75％，约20％至约70％，约25％至约75％，约25％至约70％，约25％至约60％和约25％至约50％。优选本发明的AMV和RSV逆转录酶及其亚单位(及其衍生物，变体，片段和突变体)具有的比活性约大于5个单位/mg，更优选约大于50个单位/mg，更优选约大于100个单位/mg，250个单位/mg，500个单位/mg，1000个单位/mg，5000个单位/mg或10,000个单位/mg，最优选大于约15,000个单位/mg，大于约16,000个单位/mg，大于约17,000个单位/mg，大于约18,000个单位/mg，大于约19,000个单位/mg和大于约20，000个单位/mg。本发明的AMV和RSV逆转录酶及其亚单位(及其衍生物，变体，片段和突变体)的优选比活范围包括约5个单位/mg至约140,000个单位/mg的比活，约5个单位/mg至约125,000个单位/mg的比活，约50个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约100个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约250个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约500个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约1000个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约5000个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约10,000个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约25,000个单位/mg至约75,000个单位/mg的比活。其它优选的比活范围包括约20,000个单位/mg至约140,000个单位/mg的比活，约20,000个单位/mg至约130,000个单位/mg的比活，约20,000个单位/mg至约120,000个单位/mg的比活，约20,000个单位/mg至约110,000个单位/mg的比活，约20,000个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约20,000个单位/mg至约90,000个单位/mg的比活，约25,000个单位/mg至约140,000个单位/mg的比活，约25,000个单位/mg至约130,000个单位/mg的比活，约25,000个单位/mg至约120,000个单位/mg的比活，约25,000个单位/mg至约110,000个单位/mg的比活，约25,000个单位/mg至约100,000个单位/mg的比活，约25,000个单位/mg至约90,000个单位/mg的比活。优选比活范围的低端值为30,000，35,000，40,000，45,000，50,000，55,000，60,000，65,000，70,000，75,000和80,000个单位/mg，而比活范围的高端值为150,000，140,000，130,000，120,000，110,000，100,000和90,000个单位/mg。根据本发明，比活是蛋白质或酶相对于反应所用蛋白质或酶之总量的酶活性(以单位计)测定结果。通过本领域技术人员熟知的标准技术可测定比活。下列实施例中详细描述了测定酶或蛋白质之比活的优选实验。
可使用本发明的RSV RT和AMV RT或其它ASLV RT及其亚单位(及其衍生物，变体，片段或突变体)，由一种或多种模板制备核酸分子。所述方法包括将一种或多种核酸模板(如mRNA，更优选为mRNA分子群体)与本发明的一种或多种RSV RT和/或一种或多种AMV RT和/或其它ASLV RT混合，并在足以制备与所述一种或多种核酸模板之全部或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下保温混合物。
本发明还涉及扩增一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括将一种或多种核酸模板与本发明的一种或多种RSV RT和/或一种或多种AMV RT和/或其它ASLV RT和任选与一种或多种DNA聚合酶混合，并在足以扩增与所述一种或多种核酸模板之全部或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下保温混合物。
本发明还涉及测序一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括(a)将一种或多种待测序的核酸分子与一个或多个引物核酸分子、本发明的一种或多种RSV RT和/或一种或多种AMV RT和/或其它ASLV RT、一种或多种核苷酸和一种或多种终止试剂混合；(b)在足以合成与所述一种或多种待测序的核酸分子之全部或部分互补的核酸分子群体的条件下保温混合物；和(c)分离核酸分子群体以测定该一种或多种待测序之核酸分子的全部或部分的核苷酸序列。
本发明还涉及升温或高温逆转录核酸分子的方法，所述方法包括(a)将核酸模板(优选为RNA(如mRNA分子或polyA+RNA分子)或DNA分子)与一种或多种具有逆转录酶活性的多肽混合；和(b)在足以制备与所述核酸模板之全部或部分互补的第一核酸分子(如全长cDNA分子)的条件下，于50℃或更高温度下保温混合物。在优选的此方法中，保温混合物的温度为约51℃或更高，约52℃或更高，约53℃或更高，约54℃或更高，约55℃或更高，约56℃或更高，约57℃或更高，约58℃或更高，约59℃或更高，约60℃或更高，约61℃或更高，约62℃或更高，或为以下温度范围：约50℃至约70℃，约51℃至约70℃，约52℃至约70℃，约53℃至约70℃，约54℃至约70℃，约55℃至约70℃，约55℃至约65℃，约56℃至约65℃，约56℃至约64℃或约56℃至约62℃。本发明另外涉及这样的方法，其中进一步包括在足以制备与第一核酸分子之全部或部分互补的第二核酸分子的条件下，保温第一核酸分子。根据本发明，通过这些方法产生的第一和第二核酸分子可以是DNA分子，并可形成双链DNA分子，该双链DNA分子可以是全长的cDNA分子。优选地，这些方法中所用的一种或多种具有逆转录酶活性之多肽的RNA酶H活性可能有所降低或大大降低，优选所述多肽选自AMV逆转录酶的一个或多个亚单位和RSV逆转录酶的一个或多个亚单位和其它ASLV逆转录酶的一个或多个亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)。如上所述，AMV RT或RSV RT或其它ASLV RT可包括一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位和/或一个或多个βp4亚单位，其中的任一个或全部亚单位的RNA酶H活性降低或大大降低。特别优选用于这些方法中的具有RT活性的聚合酶是上述RSV RT和AMVRT或其它ASLV RT及其亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)。
本发明还涉及由上述方法产生的核酸分子(可以是全长cDNA分子)，含有这些核酸分子的载体(尤其是表达载体)，和含有这些载体和核酸分子的宿主细胞。酶的来源
可用于本发明组合物、方法和试剂盒的酶包括任何具有逆转录酶活性的酶。所述酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶，逆转录转座子逆转录酶，乙肝病毒逆转录酶，花椰菜花叶病毒逆转录酶，细菌逆转录酶，Tth DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶(Saiki，R.K.等，科学，239：487-491(1988)；美国专利4,889,818和4,965,188)，Tne DNA聚合酶(WO 96/10640)，Tma DNA聚合酶(美国专利5,374,553)及其突变体，片段，变体或衍生物(例见1996年9月9日提交的共同拥有的待审美国专利申请08/706,702和08/706,706，其全文列入本文作为参考)。本领域技术人员应懂得：通过本领域常规的和众所周知的重组或基因工程技术可得到经修饰的逆转录酶。例如，通过使用定点或随机诱变使编码所需逆转录酶的一个或多个基因发生突变，可得到突变的逆转录酶。所述突变包括点突变，缺失突变和插入突变。优选使用一个或多个点突变(如用一个或多个不同的氨基酸取代一个或多个氨基酸)构建本发明突变的逆转录酶。通过本领域常规的和众所周知的重组技术进行缺失突变，或通过使用多种众所周知的蛋白酶中的任一种酶解消化所需的逆转录酶，可得到逆转录酶片段。
优选用于本发明的酶包括RNA酶H活性降低或大大降低的酶。通过突变所需逆转录酶内的RNA酶H结构域，优选如上所述通过一个或多个点突变、一个或多个缺失突变和/或一个或多个插入突变，可得到RNA酶H活性降低或大大降低的酶。“RNA酶H活性大大降低”的酶指的是所述酶的RNA酶H活性只占相应野生型或RNA酶H+酶[如野生型Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)逆转录酶]之RNA酶H活性的约30％以下，约25％、20％以下，更优选约15％以下，约10％以下，约7.5％以下，或约5％以下，和最优选约5％以下或约2％以下。通过多种检测法可测定任何酶的RNA酶H活性，所述方法例见美国专利5,244,797，Kotewicz，M.L.等，核酸研究，16：265(1988)，Gerard，G.F，等，FOCUS 14(5)：91(1992)和美国专利5,668,005(皆全文列入本文作为参考)中所述。
特别优选用于本发明的酶包括但不限于M-MLV H-逆转录酶，RSV H-逆转录酶，AMV H-逆转录酶，RAV H-逆转录酶，MAV H-逆转录酶和HIV H逆转录酶。然而，本领域技术人员应理解：本发明的组合物、方法和试剂盒中同样可以使用任何能由核糖核酸分子产生DNA分子(即具有逆转录酶活性)、且其RNA酶H活性大大降低的酶。
针对模板核酸的不同，本发明所用的酶可具有不同的逆转录停顿位点。通过多种检测法，包括例如电泳分析由两种酶产生的DNA分子的链长度(Weaver，D.T和DePamphilis，M.L.，生物化学杂志，257(4)：2075-2086(1982)；Abbots，J等，生物化学杂志，268(14)：10312-10323(1993))，或通过本领域技术人员熟知的其它检测法，可测定两种酶是否具有不同的逆转录停顿位点。如上所述，这些不同的转录终止位点可能代表了核酸模板中的二级结构和序列屏障，所述屏障常出现在一段同聚体序列中。因此，第二种酶可逆转录至模板核酸上的某位点(如发夹序列)，该位点处于第一种酶逆转录模板核酸所至位点的近端或远端(即位于其3’或5’端)。具有不同逆转录停顿位点的两种或多种酶的组合便于产生全长的cDNA分子，因为二级结构和序列屏障可被克服。另外，本发明的升温或高温逆转录也可能有助于克服核酸合成过程中的二级结构和序列屏障，因此，升温或高温合成可与两种或多种逆转录酶联合使用(优选使用AMV RT，RSV RT或其它ASLVRT)，以便于全长cDNA的合成。
本发明可使用多种DNA聚合酶，所述聚合酶包括但不限于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶，水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Tap)DNA聚合酶，那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)(Tne)DNA聚合酶，海栖热袍菌(Thermotogamaritima)(Tma)DNA聚合酶，Thermococcus litoralis(Tli或VENTTM)DNA聚合酶，激烈热球菌(Pyrococcus furiosis)(Pfu)DNA聚合酶，DEEPVENTTM DNA聚合酶，沃氏热球菌(Pyrococcus woosii)(Pwo)DNA聚合酶，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus sterothermophilus)(Bst)DNA聚合酶，Bacillus caldophilus(Bca)DNA聚合酶，嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)DNA聚合酶，嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)(Tac)DNA聚合酶，黄栖热菌(Thermusflavus)(Tfl/Tub)DNA聚合酶，红栖热菌(Thermus ruber)(Tru)DNA聚合酶，Thermus brockianus(DYNAZYMETM)DNA聚合酶，热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)DNA聚合酶，分枝杆菌(Mycobacterium)DNA聚合酶(Mtb，Mlep)，及其突变体，变体和衍生物。
本发明中所用的DNA聚合酶可以是能由核酸模板合成DNA分子(一般以5’至3’方向合成)的任何酶。所述聚合酶可以是嗜中温的，也可以是嗜热的，但优选是嗜热的。嗜中温的聚合酶包括T5 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，Klenow片段DNA聚合酶，DNA聚合酶III等。优选的DNA聚合酶是耐热的DNA聚合酶，如Taq，Tne，Tma，Pfu，VENTTM，DEEPVENTTM，Tth及其突变体，变体和衍生物(美国专利5,436,149；美国专利5,512,462；WO92/06188；WO92/06200；WO96/10640；Barnes，W.M.，基因，112：29-35(1992)；Lawyer，F.C等，PCR Meth.Appl.2：275-287(1993)；Flaman，J.M.等，核酸研究，22(15)：3259-3260(1994))。扩增长核酸分子(如长度约大于3-5Kb的核酸分子)时，一般至少使用两种DNA聚合酶(一种基本上缺乏3’外切核酸酶活性，另一种具有3’外切核酸酶活性)。见美国专利5,436,149；美国专利5,512,462；Barnes，W.M.，基因，112：29-35(1992)；和1997年2月14日提交的共同拥有的待审美国专利申请08/801,720(皆全文列入本文作为参考)。基本上缺乏3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的例子包括但不限于Taq，Tne(exo-)，Tma，Pfu(exo-)，Pwo和Tth DNA聚合酶及其突变体，变体和衍生物。具有3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的非限制性例子包括Pfu/DEEPVENTTM和Tli/VENTTM及其突变体，变体和衍生物。
本发明可用的具有逆转录酶活性的多肽可以商购得到，例如可购自Life Technologies公司(Rockville，Maryland)，Pharmacia(Piscataway，New Jersey)，Sigma(Saint Louis，Missouri)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)。或者，可根据本领域技术人员熟知的分离和纯化天然蛋白质的标准方法，可以从其天然的病毒或细菌来源中分离具有逆转录酶活性的多肽(例见Houts，G.E等，病毒学杂志，29：517(1979))。另外，也可通过本领域技术人员熟知的重组DNA技术制备具有逆转录酶活性的多肽(例见Kotewicz，M.L等，核酸研究，16：265(1988)；Soltis，D.A和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3372-3376(1988))。
本发明可用的DNA聚合酶可以商购得到，例如可购自LifeTechnologies公司(Rockville，Maryland)，Perkin-Elmer(Branchburg，NewJersey)，New England BioLabs(Beverly，Massachusetts)或BoehringerMannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)。酶组合物的配制
为了形成本发明的组合物，优选将两种或多种逆转录酶混合于缓冲盐溶液中。可任选加入一种或多种DNA聚合酶和/或一种或多种核苷酸以制备本发明的组合物。更优选以溶于稳定的缓冲盐溶液中的工作浓度提供酶。本文所用术语“稳定的”和“稳定性”一般指的是酶或含酶组合物在约4℃的温度下保存约1周、在约-20℃的温度下保存约2-6个月、在约-80℃的温度下保存约6个月或更长时间之后，组合物(如酶组合物)仍能保留原始酶活性(以单位计)的至少70％，优选至少80％，最优选至少90％。本文所用术语“工作浓度”指的是酶浓度为溶液行使特定功能(如逆转录核酸)所用的最适浓度或接近该最适浓度。
用于形成本发明组合物的水优选为蒸馏水，去离子水和无菌过滤水(通过0.1-0.2微米的滤膜)，且不含DNA酶和RNA酶。这种水可以商购，如购自Sigma Chemicals公司(Saint Louis，Missouri)，需要时也可根据本领域技术人员熟知的方法制备之。
除了酶组分外，本发明的组合物优选含有一种或多种缓冲液和合成核酸分子(如cDNA分子)所必需的辅因子。用于形成本发明组合物的特别优选的缓冲液是醋酸盐，硫酸盐，盐酸盐，磷酸盐或游离酸形式的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)，但使用大致离子强度和pKa与TRIS相同的其它缓冲液也可得到同样的结果。除了缓冲盐外，组合物中还包括辅因子盐，如钾盐(优选为氯化钾或醋酸钾)和镁盐(优选为氯化镁或醋酸镁)。在组合物和/或合成反应混合物中加入一种或多种碳水化合物和/或糖也是有利的，因为储存时它们可增强组合物和/或反应混合物的稳定性。本发明的组合物和/或合成反应混合物中可包含的碳水化合物或糖优选包括但不限于蔗糖，海藻糖等。另外，可将这种碳水化合物和/或糖加入生产本发明酶组合物和试剂盒所用的酶的储存缓冲液中。可从多种来源购得上述碳水化合物和/或糖，包括Sigma(St.Louis，MO)。
经常优选先将缓冲盐、辅因子盐和碳水化合物或糖以工作浓度溶于水中，并在加入酶之前调节溶液pH。以此方式，pH敏感的酶在本发明组合物的配制过程中就会较少遇到酸或碱介导的灭活。
为了配制缓冲盐溶液，将缓冲盐，优选为三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的盐，最优选为其盐酸盐，与足够量的水混合，以产生TRIS浓度为5-150mM、优选为10-60mM、最优选约为20-60mM的溶液。在此溶液中，可加入镁盐(优选为氯化镁或醋酸镁)以使其工作浓度为1-10mM，优选为1.5-8.0mM，最优选为3-7.5mM。也可在溶液中加入钾盐(优选为氯化钾或醋酸钾)以使其工作浓度为10-100mM，最优选为约75mM。溶液中也可加入如二硫苏糖醇的还原剂，优选其终浓度约为1-100mM，更优选其浓度约为5-50mM或约7.5-20mM，最优选其浓度约为10mM。本发明组合物中可含的碳水化合物和/或糖的优选浓度范围为约5％(w/v)-约30％(w/v)，约7.5％(w/v)-约25％(w/v)，约10％(w/v)-约25％(w/v)，约10％(w/v)-约20％(w/v)，优选为约10％(w/v)-约15％(w/v)。也可加入少量的乙二胺四乙酸(EDTA)盐，如EDTA二钠盐(优选约为0.1mM)，但EDTA的加入对本发明组合物的功能或稳定性似乎并不是必需的。加入所有的缓冲液和盐之后，将缓冲的盐溶液充分混合直至所有的盐溶解为止，使用本领域已知的方法将pH调节至pH7.4-9.2，优选为pH8.0-9.0，最优选约为pH8.4。
在这些缓冲盐溶液中加入酶(逆转录酶和/或DNA聚合酶)以产生本发明的组合物。优选在溶液中以工作浓度加入M-MLV RT，所述浓度为约1,000-50,000单位/ml，约2,000-30,000单位/ml，约2,500-25,000单位/ml，约3,000-22,500单位/ml，约4,000-20,000单位/ml，最优选以工作浓度约5,000-20,000单位/ml加入。优选在溶液中以工作浓度加入AMV RT，MAV RT，RSV RT和RAV RT，包括本发明上述的那些酶，所述浓度为约100-5000单位/ml，约125-4000单位/ml，约150-3000单位/ml，约200-2500单位/ml，约225-2000单位/ml，最优选以工作浓度约250-1000单位/ml加入。优选在溶液中以工作浓度加入嗜热DNA聚合酶组中的酶(Taq，Tne，Tma，Pfu，VENTTM，DEEPVENTTM，Tth及其突变体，变体和衍生物)，所述浓度为约100-1000单位/ml，约125-750单位/ml，约150-700单位/ml，约200-650单位/ml，约225-550单位/ml，最优选以工作浓度约250-500单位/ml加入。向溶液中加入酶的次序是任意的，也可以同时加入酶。
本发明的组合物还可含有一种或多种核苷酸，优选为脱氧核苷三磷酸(dNTP)或双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。本发明组合物的dNTP组分作为新合成之核酸的“组建模块”，其通过聚合酶的作用掺入核酸中，根据本发明，ddNTP可用于测序方法中。适用于本发明组合物的核苷酸的例子包括但不限于dUTP，dATP，dTTP，dCTP，dGTP，dITP，7-脱氮-dGTP，α-硫代-dATP，α-硫代-dTTP，α-硫代-dGTP，α-硫代-dCTP，ddUTP，ddATP，ddTTP，ddCTP，ddGTP，ddITP，7-脱氮-ddGTP，α-硫代-ddATP，α-硫代-ddTTP，α-硫代-ddGTP，α-硫代-ddCTP或其衍生物，上述核苷酸都可以商购，其来源包括Life Technologies公司(Rockville，Maryland)，New England BioLabs(Beverly，Massachusetts)和Sigma Chemicals公司(Saint Louis，Missouri)。核苷酸可以不标记，也可以通过本领域已知的方法使其与放射性同位素(如3H，14C，32P或35S)、维生素(如生物素)、荧光组成成分(如荧光素，罗丹明，德克萨斯红或藻红蛋白)、化学发光标记(如使用PHOTO-GENETM或ACESTM化学发光系统，可购自Life Technologies公司Rockville，Maryland)，地高辛等偶联以可测地标记之。经标记的核苷酸也可商购，如得自Life Technologies公司(Rockville，Maryland)或Sigma Chemicals公司(Saint Louis，Missouri)。在本发明的组合物中，加入核苷酸以使每种核苷酸的工作浓度为约10-4000μM，约50-2000μM，约100-1500μM，或约200-1200μM，最优选浓度约为1000μM。
为了降低组分变质的程度，优选在约4℃下储存试剂组合物不超过1天，或最优选于-20℃储存不超过1年。
另一方面，可在一种或多种碳水化合物、糖或合成聚合物的存在下，以干燥剂型制备和储存本发明的组合物和逆转录酶。用于制备干组合物或逆转录酶的优选碳水化合物、糖或聚合物包括但不限于蔗糖，海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其混合物，例见美国专利5,098,893，4,891,319和5,556,771(皆全文列入本文作为参考)。可以将这种干燥的组合物和酶于多种温度下储存更长时间而不会使本发明组合物的酶或组分显著变质。优选于4℃或-20℃储存干燥的逆转录酶或组合物。cDNA分子的产生核酸分子的来源
根据本发明，可由多种核酸模板分子制备cDNA分子(单链或双链)。用于本发明的核酸分子优选包括单链或双链DNA和RNA分子，以及双链DNA：RNA杂合体。更优选的核酸分子包括信使RNA(mRNA)，转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)分子，但本发明优选的模板是mRNA分子。
可以根据本领域技术人员熟知的标准有机化学合成法合成制备本发明方法中用于制备cDNA分子的核酸分子。更优选核酸分子得自天然来源，如多种细胞、组织、器官或生物体。可用作核酸分子来源的细胞可以是原核细胞(细菌细胞，包括但不限于下列属的种：埃希氏菌，芽孢杆菌，沙雷氏菌，沙门氏菌，葡萄球菌，链球菌，梭菌，衣原体，奈瑟氏球菌，密螺旋体，枝原体，疏螺旋体，军团菌，假单胞菌，分枝杆菌，螺杆菌，欧文氏杆菌，土壤杆菌，根瘤菌，黄单胞菌和链霉菌)或真核细胞(包括真菌(尤其是酵母)，植物，原生动物和其它寄生虫，和动物，包括昆虫(尤其是果蝇细胞)，线虫(尤其是Caenorhabditiselegans细胞)和哺乳动物(尤其是人细胞))。
可用作核酸来源的哺乳动物体细胞包括血细胞(网织红细胞和白细胞)，内皮细胞，上皮细胞，神经元细胞(得自中枢或外周神经系统)，肌肉细胞(包括骨骼肌、平滑肌或心肌的肌细胞和成肌细胞)，结缔组织细胞(包括成纤维细胞，脂肪细胞，软骨细胞，成软骨细胞，骨细胞和成骨细胞)和其它基质细胞(如巨噬细胞，树突细胞，神经膜细胞)。哺乳动物生殖细胞(精母细胞和卵母细胞)也可用作本发明所用核酸的来源，能产生上述体细胞和生殖细胞的祖细胞、前体细胞和干细胞也可使用。其它适用的核酸来源是哺乳动物组织或器官，它们可得自例如脑，肾脏，肝脏，胰腺，血液，骨髓，肌肉，神经，皮肤，泌尿生殖系统，循环系统，淋巴，胃肠道和结缔组织，以及哺乳动物(包括人)胚胎或胎儿。
上述任何原核或真核细胞，组织和器官可以是正常的，患病的，经转化的，已建成的，祖代的，前体的，胎儿的或胚胎的。患病细胞包括例如涉及传染病(由细菌，真菌或酵母，病毒(包括AIDS，HIV，HTLV，疱疹病毒，肝炎病毒等)或寄生虫引起)的细胞，涉及基因或生化病理学(如胆囊纤维样变性，血友病，Alzheimer’s病，肌营养不良或多发性硬化)的细胞或者涉及癌症进程的细胞。经转化的或已建成的动物细胞系包括例如COS细胞，CHO细胞，VERO细胞，BHK细胞，HeLa细胞，HepG2细胞，K562细胞，293细胞，L929细胞，F9细胞等。适用于本发明所用核酸之来源的其它细胞、细胞系、组织、器官和生物体对本领域技术人员而言是显而易见的。
一旦得到起始细胞、组织、器官或其它样品，可通过本领域众所周知的方法从中分离核酸分子(如mRNA)(例见Maniatis，T等，细胞，15：687-701(1978)；Okayama，H和Berg，P，分子细胞生物学，2：161-170(1982)；Gubler，U和Hoffman，B.J，基因，25：263-269(1983))。然后可使用所分离的核酸分子制备本发明的cDNA分子和cDNA文库。
在实施本发明的过程中，通过在适于经酶或组合物的作用逆转录核酸分子以形成cDNA分子(单链或双链)的条件下，将上文所得的一种或多种核酸分子，优选为一个或多个mRNA分子(如mRNA分子群体)，与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽，或与一种或多种本发明的组合物，或与一种或多种本发明的RSV RT和/或AMV RT和/或其它ASLV RT混合即可产生cDNA分子或cDNA文库。因此，本发明的方法包括(a)将一种或多种核酸模板(优选为一种或多种RNA或mRNA模板，如mRNA分子群体)与一种或多种本发明的逆转录酶混合，和(b)在足以制备与所述一种或多种模板的全部或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下保温混合物。该方法还包括使用一种或多种DNA聚合酶。本发明也可与cDNA合成法联合使用以产生cDNA分子或文库，所述cDNA合成法如下文实施例中所述的方法，或为本领域众所周知的其它方法(例见Gubler，U和Hoffman，B.J，基因，25：263-269(1983)；Krug，M.S和Berger，S.L.，酶学方法，152：316-325(1987)；Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，p8.60-8.63(1989))。
本发明还特别地涉及升温下逆转录核酸分子的方法。如实施例5所述，在高于37℃至42℃的温度下，一般不使用逆转录病毒RT来拷贝核酸模板(如RNA分子)，因为这些嗜中温酶的热稳定性是有限的。然而，在这些温度下，mRNA的二级结构会干扰逆转录(Gerard，G.F等，FOCUS 11：60(1989)；Myers，T.W和Gelfand，D.H.，生物化学，30：7661(1991))，在基因特异性逆转录方法(如RT-PCR)的过程中引物结合的特异性可能会降低，导致高背景信号(Myers，T.W和Gelfand，D.H.，生物化学，30：7661(1991)；Freeman，W.N等，生物技术，20：782(1996))。为了帮助解决这些问题，本发明提供了在更高的温度下，即50℃以上进行RNA逆转录的方法。
因此，本发明涉及逆转录核酸分子的方法，所述方法包括(a)将核酸模板与一种或多种具有逆转录酶活性的多肽混合；和(b)在足以制备与所述核酸模板之全部或部分互补的第一核酸分子的条件下，于约50℃或更高的温度下保温混合物。根据本发明可被拷贝的核酸模板包括但不限于RNA分子(如mRNA分子或poly+RNA分子)和DNA分子(如单链或双链DNA分子)。根据本发明，由所述方法产生的第一核酸分子可以是全长的cDNA分子。尽管约50℃或更高的任何保温温度都可以用于本发明，但特别优选的保温温度包括但不限于约51℃或更高，约52℃或更高，约53℃或更高，约54℃或更高，约55℃或更高，约56℃或更高，约57℃或更高，约58℃或更高，约59℃或更高，约60℃或更高，约61℃或更高，约62℃或更高，约63℃或更高，约64℃或更高，约65℃或更高，约66℃或更高，约67℃或更高，约68℃或更高，约69℃或更高或者约70℃或更高。在其它这种方法中，保温温度为一个温度范围，所述范围包括但不限于：约50℃至约70℃，约51℃至约70℃，约52℃至约70℃，约53℃至约70℃，约54℃至约70℃，约55℃至约70℃，约55℃至约69℃，约55℃至约68℃，约55℃至约67℃，约55℃至约66℃，约55℃至约65℃，约56℃至约65℃，约56℃至约64℃或约56℃至约62℃。本发明另外涉及这样的方法，其中进一步包括在足以制备与第一核酸分子之全部或部分互补的第二核酸分子的条件下，保温第一核酸分子。根据本发明，通过这些方法产生的第一和第二核酸分子可以是DNA分子，并可形成双链DNA分子，该双链DNA分子可以是全长的cDNA分子。如上文方法所述，优选这些高温方法中使用的一种或多种具有逆转录酶活性之多肽的RNA酶H活性有所降低或大大降低，所述多肽可选自一种或多种AMV逆转录酶或其亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)，一种或多种RSV逆转录酶或其亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)，或者其它ASLV RT或其亚单位(或其衍生物，变体，片段或突变体)。特别优选的AMV RT和RSV RT和其它ASLV RT包括本发明提供的和上文详述的那些。更优选的是基因型为AMV αH-/βH+ RT或RSV αH-/βH+ RT的AMV RT和RSV RT。优选通过突变或修饰编码α亚单位的基因以使RNA酶H活性降低或大大降低，而编码β亚单位的基因未经突变或修饰，由此制得这种构建体。所得多肽(共表达产生)的RNA酶H活性将会有所降低或大大降低。
利于使用本发明的其它cDNA合成法对本领域技术人员而言是显而易见的。
根据本发明得到cDNA分子或文库后，分离这些cDNA以进一步分析或处理。纯化cDNA的详细方法学可参见GENETRAPPERTM手册(LifeTechnologies公司；Rockville，Maryland)(其全文列入本文作为参考)，但也可使用如下文实施例所述或本领域已知的其它标准cDNA分离技术(例见Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，p8.60-8.63(1989))。
在本发明的其它方面，本发明可用于扩增和测序核酸分子的方法中。根据本发明此方面的核酸扩增方法可以是一步(如一步RT-PCR)或两步(如两步RT-PCR)反应。根据本发明，一步RT-PCR型反应可在一个试管中完成，从而降低了污染的可能性。这种一步反应包括(a)将核酸模板(如mRNA)与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽和一种或多种DNA聚合酶混合，和(b)在足以扩增与模板之全部或部分互补的核酸分子的条件下保温混合物。或者，可通过将模板与两种或多种具有逆转录酶活性(和任选具有DNA聚合酶活性)的多肽混合来完成扩增。在允许扩增与模板之全部或部分互补的核酸分子的适当条件下保温这种反应混合物。这种扩增可仅通过逆转录酶活性完成，或与DNA聚合酶活性联合来完成。两步RT-PCR可由两个独立的步骤完成。所述方法包括(a)将核酸模板(如mRNA)与两种或多种逆转录酶混合，(b)在足以制备与模板之全部或部分互补的核酸分子(如DNA分子)的条件下保温混合物，(c)将核酸分子与一种或多种DNA聚合酶混合，和(d)在足以扩增核酸分子的条件下保温步骤(c)的混合物。扩增长核酸分子(即长度约大于3-5Kb的核酸分子)时，可联合使用多种DNA聚合酶，如一种DNA聚合酶具有3’外切核酸酶活性，另一种DNA聚合酶的3’外切核酸酶活性大大降低。其它两步法包括使用两种或多种具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽(如Tth，Tma或Tne DNA聚合酶等)，而不是分开加入逆转录酶和DNA聚合酶。
根据本发明此方面的核酸测序方法包括循环测序(测序与扩增联合)和标准测序反应。因此，本发明的测序方法包括：(a)将待测序的核酸分子与一个或多个引物、两个或多个逆转录酶、一种或多种核苷酸和一种或多种终止试剂混合；(b)在足以合成与待测序之分子的全部或部分互补的核酸分子群体的条件下保温混合物；和(c)分离群体以测定待测序之分子的全部或部分核苷酸序列。根据本发明，可将一种或多种DNA聚合酶(优选为耐热DNA聚合酶)与逆转录酶联合使用或分开使用。
可根据本发明使用的扩增方法包括PCR(美国专利4,683,195和4,683,202)，链置换扩增(SDA；美国专利5,455,166；EP 0684 315)，基于核酸序列的扩增(NASBA；美国专利5,409,818；EP 0329 822)。可利用本发明组合物的核酸测序技术包括如美国专利4,962,022和5,498,523所述的双脱氧测序法以及更复杂的基于PCR的核酸指纹分析技术，如随机扩增多态DNA(RAPD)分析(Williams，J.G.K等，核酸研究，18(22)：6531-6535，1990)，任意引物PCR(AP-PCR；Welsh，J和McClelland，M，核酸研究，18(24)：7213-7218，1990)，DNA扩增指纹分析(DAF；Caetano-Anolles等，Bio/Technology 9：553-557，1991)，微卫星PCR或小卫星区DNA的定向扩增(DAMD；Heath，D.D等，核酸研究，21(24)：5782-5785，1993)，和扩增片段长度多态性(AFLP)分析(EP 0534 858；Vos，P等，核酸研究，23(21)：4407-4414，1995；Lin，J.J和Kuo，J，FOCUS 17(2)：66-70，1995)。在特别优选的方面，本发明也可用于包括一个或多个聚合酶链反应(PCR)的扩增或测序核酸分子的方法中，如上述任一基于PCR的方法中。试剂盒
在另一个实施方案中，本发明的组合物可被装入试剂盒中以用于逆转录或扩增核酸分子，或装入试剂盒中以用于测序核酸分子。根据本发明此方面的试剂盒中含有载体，如盒、纸盒、管等，密闭的载体中含有一个或多个容器，如小管、试管、安瓿、瓶等，其中第一个容器中含有一种或多种具有逆转录酶活性的多肽。这些具有逆转录酶活性的多肽可以作为两种或多种多肽的混合物放在一个容器中，也可以分开放在各自的容器中。本发明的试剂盒也可在相同或不同容器中含有一种或多种DNA聚合酶，适当缓冲液，一种或多种核苷酸和/或一个或多个引物。
在本发明具体的方面，逆转录和扩增试剂盒中可含有(分开或混合的)一种或多种组分，所述组分包括一种或多种、优选为两种或多种具有逆转录酶活性的本发明多肽，一种或多种合成核酸分子所需的核苷酸，和/或引物(如逆转录所用的oligo(dT))。这种逆转录和扩增试剂盒中可进一步含有一种或多种DNA聚合酶。本发明的测序试剂盒中可含有一种或多种、优选为两种或多种具有逆转录酶活性的本发明多肽，任选含有一种或多种DNA聚合酶，一种或多种测序核酸分子所需的终止试剂(如双脱氧核苷三磷酸分子)，一种或多种核苷酸和/或一个或多个引物。适用于本发明的逆转录、扩增和测序试剂盒的优选的具有逆转录酶活性的多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物和其它组分包括上述的那些。本发明此方面包含的试剂盒可进一步含有进行标准的核酸逆转录、扩增或测序方案所必需的其它试剂和化合物。具有逆转录酶活性的本发明多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物和其它试剂、组分或化合物可放在一个或多个容器中，或以两种或多种上述组分的混合物形式放在容器中，或分开放在不同的容器中装入本发明的试剂盒。核酸分子的用途
由本发明方法制备的核酸分子或cDNA文库可通过本发明的测序方法或通过本领域已知的其它标准方法(例见涉及DNA测序方法的美国专利4,962,022和5,498,523)克隆和测序(即测定核酸分子的核苷酸序列)而进一步鉴定。或者，可在工业方法中使用这些核酸分子制备多种物质，如通过本领域熟知的方法制备杂交探针。由cDNA产生杂交探针使得医学领域的人员能够检查患者细胞或组织中特定基因标记的存在，所述标记如癌症的标记，传染病或遗传疾病的标记或胚胎发育的标记。另外，也可使用这种杂交探针从制备自不同细胞、组织或生物体的基因组DNA或cDNA文库中分离DNA片段以进一步鉴定。
也可使用本发明的核酸分子制备组合物以用于重组DNA方法学。因此，本发明涉及含有本发明cDNA或扩增的核酸分子的重组载体，用重组载体转化的宿主细胞，使用所述载体和宿主细胞产生重组多肽的方法和使用这些方法产生的重组多肽。
根据本发明的此方面，可使用本领域熟知的方法将根据本发明方法制备的一种或多种cDNA分子或扩增的核酸分子插入载体中，由此制备重组载体。本发明的此方面使用的载体可以是例如噬菌体或质粒，优选为质粒。优选载体含有编码所需多肽之核酸的顺式作用调控区。适当的反式作用因子可由宿主提供，由互补载体提供，或通过导入宿主而由载体自身提供。
在此方面，某些优选的实施方案中，载体提供了特异性的表达(因此被称为“表达载体”)，该表达可以是诱导型的和/或细胞类型特异性的。其中特别优选的载体是能由易操作的环境因素(如温度和营养物添加剂)诱导的载体。
可用于本发明的表达载体包括衍生自染色体、附加体和病毒的载体，如衍生自细菌质粒或噬菌体的载体，和衍生自这两者的载体，如粘粒和噬菌粒，所述表达载体优选包括至少一个选择标记，如四环素或氨苄青霉素抗性基因，以在细菌宿主细胞中培养。将本发明的cDNA或扩增的核酸分子插入这种表达载体之前，应将其与适当启动子可操作地连接，所述启动子如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp和tac启动子。其它适当的启动子是本领域技术人员已知的。
本发明优选使用的载体包括可得自Qiagen的pQE70，pQE60和pQE-9；可得自Stratagene的pBS载体，Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A；可得自Invitrogen的pcDNA3；可得自Pharmacia的pGEX，pTrxfus，pTrc99a，pET-5，pET-9，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5；和可得自Life Technologies公司的pSPORT1，pSPORT2和pSV·SPORT1。其它适当的载体对本领域技术人员而言是显而易见的。
本发明还提供了含有本发明的cDNA分子、扩增的核酸分子或重组载体的重组宿主细胞的生产方法，以及由该方法产生的宿主细胞。根据本发明可产生的代表性宿主细胞(原核或真核细胞)包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。优选的细菌宿主细胞包括大肠杆菌细胞(最优选大肠杆菌菌株DH10B和Stb12，它们可购自LifeTechnologies公司；Rockville，Maryland)，枯草芽孢杆菌细胞，巨大芽孢杆菌细胞，链霉菌细胞，欧文氏菌细胞，克雷伯氏菌细胞和鼠伤寒沙门氏菌细胞。优选的动物宿主细胞包括昆虫细胞(最优选草地夜蛾Sf9和Sf21细胞和Trichoplusa High-Five细胞)和哺乳动物细胞(最优选CHO，COS，VERO，BHK和人细胞)。可通过本领域技术人员熟知的转化、电穿孔或转染技术来制备上述宿主细胞。
另外，本发明提供了生产重组多肽的方法和由该方法生产的多肽。根据本发明的此方面，通过在利于宿主细胞产生多肽和分离多肽的条件下培养任何上述重组宿主细胞即可产生重组多肽。培养重组宿主细胞、从中产生和分离多肽的方法是本领域技术人员熟知的。
相关领域的技术人员清楚地知道：可对本文所述的方法和应用作其它适当的修饰和变化，这一点是显而易见的，并可在本发明或其任何实施方案的范围内进行这种修饰和变化。本文详细描述了本发明，参照下列实施例会更清楚地理解本发明，以下实施例只是为了阐明、而不是限制本发明。实施例1：克隆和表达RSV RNA酶H- RT一般方法
RSV H- RT是逆转录病毒RT的克隆形式，其中α和β亚单位因单个氨基酸的改变被突变，从而消除了RNA酶H活性。只突变了α亚单位从而大大降低RNA酶H活性(β亚单位的RNA酶H结构域未突变)时，也产生了RNA酶H活性大大降低的RSV RT。使用按下述改进的标准分子生物学方法(例见Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：实验室出版社(1989))进行突变和质粒构建。
质粒制备。通过碱裂解法(Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：实验室出版社(1989))从1ml大肠杆菌培养物中制备质粒。将由10ml培养物得到的质粒制品经苯酚-氯仿处理，乙醇沉淀，并重新悬浮于50μl Tris-EDTA(TE)缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中。对杆粒制品要小心操作以避免处理过程中发生DNA剪切作用(即不要涡流旋转；苯酚氯仿提取时应缓慢转动而不是振荡；缓慢移液)。
PCR。在Perkin-Elmer 9600热循环仪上进行聚合酶链反应。反应混合物(各50μl)含有0.5个单位Taq DNA聚合酶，1μM各种寡核苷酸，各50μM的dCTP，dGTP，dTTP和dATP和约100ng靶DNA，该混合物处于由50mM KCl，20mM Tris-HCl(pH8.3)和5mM MgCl2组成的反应缓冲液中。除非另有说明，每次PCR的循环条件是94℃5分钟，接着是55℃ 15秒/72℃ 30秒/94℃ 15秒共8轮循环，然后是72℃ 1分钟。
凝胶电泳和DNA片段分离和克隆。在溶于含0.3μg/ml溴化乙锭的Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液的琼脂糖凝胶中，以约10V/cm电泳DNA(Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：实验室出版社(1989))。用紫外灯观察片段并通过GlassMAX法从凝胶切片中分离片段(Simms，D等，Focus 13：99(1991))。在标准条件下使用T4 DNA连接酶进行DNA连接反应(King，P.W，和Blakesley，R.W，Focus 8：1(1986))，使用经改良的CaCl2法(Lorow，D和Jessee，J，Focus 12：19(1990))转化大肠杆菌DH10B细胞。
昆虫细胞培养和杆状病毒的产生。根据已知方法(Anderson，D等，Focus 16：53(1995))，用溶于0.2ml SF900-II无血清昆虫细胞培养基(Life Technologies公司；Rockville，Maryland；见Godwin，G和Whitforg，W，Focus 15：44(1993))中的1μg杆粒DNA和8μlCellfectin混合物转染5×105个细胞/ml的Sf21昆虫细胞样品(1ml)。为了培养和增殖，于27℃，在振荡温箱中以100rpm(针对600ml培养物)或130rpm(针对所有其它的培养物)，在SF900-II培养基中传代Sf9和Sf21昆虫细胞。应尽量避免培养物在培养过程中超过4×106个细胞/ml或在稀释过程中降到0.5×106个细胞/ml以下。为了扩展病毒群体，用足够的病毒储存液(约0.2％(v/v)病毒/培养物)感染约为1×106个细胞/ml的Sf21细胞以使其生长为约2×106个细胞/ml，但不超过4×106个细胞/ml。72小时之后，离心培养物(2,000rpm，10分钟)，倾析上清液，将其储存于4℃，黑暗中。为了感染细胞以产生蛋白质，用足够的病毒感染约为1.5×106个细胞/ml的Sf21昆虫细胞以使其不生长或生长为约2.5×106个细胞/ml以下。72小时之后，以1,000rpm离心5分钟以收获培养物，每500ml培养物中的细胞以15ml PBS(0.2g/l KCl，0.2g/l KH2PO4，8g/l NaCl，1.15g/l Na2HPO4，2.16g/l Na2HPO4·7H2O)重新悬浮。克隆和表达编码RSV RT α和β亚单位的基因
RSV RT α和β亚单位都是通过蛋白酶水解加工较大的多肽前体产生的(Gerard，G.F：核酸合成和修饰酶，第I卷：DNA酶，Jacob，S.T编，Boca Raton，FL：CRC出版社，p1-38(1983))。为了免除对蛋白酶水解加工的需求，可诱变RSV RT的编码序列并亚克隆之以使α和β亚单位都由具有标准起始和终止翻译信号的基因编码。两个基因的RNA酶H区域都被诱变，但也可以相同的方法构建任何亚单位组合(如α RNA酶H-/β RNA酶H+；α RNA酶H+/β RNA酶H+；α RNA酶H+/β RNA酶H-；αRNA酶H-/β RNA酶H-)。已发现RSV RT α RNA酶H-/β RNA酶H+的RNA酶H活性大大降低(约为野生型的5％)。在β亚单位的羧基末端添加了编码亲和标记物的序列。
诱变和亚克隆RSV RT β亚单位的氨基末端，羧基末端和中间部分。诱变RSV RT基因以在编码成熟RT多肽之序列的氨基末端添加ATG密码子和NdeI位点。这一诱变是使用pJD100靶(图1，7)(Wilkerson，V.W等，病毒学杂志，55：314-321(1985))和下列寡核苷酸经PCR完成的：AUG GAG AUC UCU CAT ATG ACT GTT GCG CTA CAT CTG GCT(SEQ ID NO：1)AAC GCG UAC UAG U GTT AAC AGC GCG CAA ATC ATG CAG(SEQ ID NO：2)
按上述进行PCR，纯化PCR产物，通过UDG克隆(Buchman，G.W等，Focus 15：36(1993))将PCR产物克隆至pAMP18中以形成质粒pAMP18N(图1，8)。
诱变并克隆了氨基末端之后，使用下列寡核苷酸经PCR诱变pJD100中RSV β亚单位基因的羧基末端，并经UDG克隆法将PCR产物亚克隆至pAMP1(图1)：CUA CUA CUA CUA GGT ACC CTC TCG AAA AGT TAA ACC(SEQ ID NO：3)CAU CAU CAU CAU CTC GAG TTA TGC AAA AAG AGG GCT CGC CTCATC(SEQ ID NO：4)
这些寡核苷酸被设计成可在β基因中于“p4”区域从βp4多肽上裂解下来的位点处导入翻译终止密码子，以及在基因末端之后添加XhoI位点。通过凝胶电泳纯化PCR产物并通过UDG克隆克隆至pAMP1，形成了pAMP1C(图1，9)。注意此羧基末端没有His标记物，该标记物在稍后的时间添加，从而形成最终的构建体。
为了添加RSV RT β亚单位的中间区域，将pJD100(图1)中编码RSVRT β亚单位中间区域的2.3kb HpaI-KpnI片段克隆至pAMP18N的HpaI-KpnI位点，形成pAMP18NM(图1，10)。为了添加RSV RT β亚单位的羧基末端，将pAMP1C中编码β亚单位基因羧基末端的113bpKpnI-EcoRI片段克隆至pAM18NM的KpnI-EcoRI位点，形成pAMP18B(图2，11)。
构建了含有RNA酶H活性的RSV RT β亚单位之后，通过定点诱变诱变此基因，以产生编码RNA酶H活性大大降低了(即“RNA酶H-”)的RSV RT β亚单位的构建体。将pJD100(图2)中含有整个RT基因的3Kb PstI片段克隆至M13mp19中，形成M13RT(图2，12)。用含有PstI片段的M13RT噬菌体感染之后，从大肠杆菌菌株CJ236(Bio-Rad；Hercules，CA和Cathy Joyce，Yale University，New Haven，CT)中分离含尿嘧啶的单链DNA。为了突变RNA酶H区域和导入SstII位点，使用了下列寡核苷酸：GGA CCC ACT GTC TTT ACC GCG GCC TCC TCA AGC ACC(SEQ ID NO：5)
此寡核苷酸诱导RT第450位的天冬氨酸残基被丙氨酸残基取代，形成M13RTH-(图2，13)。在产生RNA酶H- RSV RT的另一个方法中，Glu484可被突变为谷氨酰胺和/或Asp505可被突变为天冬酰胺。为了使β亚单位回复成RNA酶H+，可使用具有野生型序列的寡核苷酸引物。或者，可在RNA酶H区域进行缺失或插入以大大降低RNA酶H活性。使用DNA测序以进一步证实Asp450至Ala450的突变，将M13RTH-中的426bp BglII-BstEII片段克隆至pAMP18B的BglII-BstEII位点，替代RNA酶H区域并形成pAMP18BH-(图2，14)。
诱变和亚克隆编码RSV RT α亚单位的基因。为了产生编码RSV RTα亚单位的基因，使用两个寡核苷酸诱变pDBH-中RNA酶H-突变型RSV RT基因的氨基末端(图3，15)，并在禽逆转录病毒的蛋白酶p15正常地裂解前体聚蛋白质得到α亚单位的位点处导入翻译终止密码子：CAU CAU CAU CAU CCC GGG TTA ATA CGC TTG GAA GGT GGC(SEQ ID NO：6)CUA CUA CUA CUA TCA TGA CTG TTG CGC TAC ATC TG(SEQ ID NO：7)
PCR循环条件为：94℃ 5分钟，接着是55℃ 15秒/72℃ 2分钟/94℃15秒共8轮循环，然后是72℃ 2分钟。如上所述，通过UDG克隆法将PCR产物克隆至pAMP1中，形成pAMP1A(图3，16)。
在RSVβ亚单位的羧基末端添加His6标记物。通过定点诱变将His6标记物添加至RSV RT β亚单位的羧基末端，如上所述，使用下列寡核苷酸通过PCR和UDG克隆法从pJD100中亚克隆突变的序列：CUA CUA CUA CUA GGT ACC CTC TCG AAA AGT TAA(SEQ ID NO：8)CAU CAU CAU CAU GAG GAA TTC AGT GAT GGT GAT GGT GAT GTGCAA AAAG AGG(SEQ ID NO：9)
这些寡核苷酸被设计为可在基因中导入翻译终止密码子，并在蛋白质的末端添加组氨酸标记物。因此，基因产物是羧基末端添加有6个组氨酸的多肽。通过凝胶电泳纯化PCR产物，并通过UDG克隆法插入pAMP1，形成pAMPChis。
为了除去RSV RT β基因的羧基末端，并用含His6标记物的羧基末端取代之，不得不减少含RSV RT β基因的杆状病毒载体中KpnI位点的数目。用AflIII裂解质粒pDBH-(图4)，用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段使位点成为平端，经热处理灭活聚合酶，用PvuII进一步裂解载体(图4)。然后通过凝胶电泳纯化缺失的载体(5.9kb)，自身连接后用于转化大肠杆菌菌株DH10B，形成pDBH-Kpn(图4，17)。将pAMPChis中含有带His6标记物的β羧基末端的KpnI-SstI片段克隆至pDBH-Kpn的KpnI-SstI位点，形成pDBH-KpnHis(图4，18)。
将RSV α和β亚单位克隆至杆状病毒表达载体。在此项工作的过程中，制备其中RSV RT β基因在杆状病毒载体中被表达成氨基末端具有His6标记物形式的构建体。然而，在构建过程中导入的突变使得标记物的阅读框架与β基因的不同。由于使用了此构建体的部分来构建最终的杆状病毒表达载体，本文描述了其构建过程。
为了在杆状病毒载体中导入His6标记物和NdeI位点，将下列寡核苷酸退火并克隆至pFastBac Dual(Harris，R和Polayes，D.A，Focus 19：6-8(1997)；图5)中：ACTG GAA TTC ATG CCA ATC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CCG T(SEQ ID NO：10)ACGT GTC GAC CAT ATG GAT GAC TAG GTG AAA CGG GTG ATG G(SEQ ID NO：11)
将两种寡核苷酸配制于TE缓冲液中，使其浓度为100μM，在单个管中将5μl各种寡核苷酸制剂与15μl水和2μl 10倍React2缓冲液(500mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH8.0)混合。将此试管置于65℃水浴中加热，在60分钟内缓慢冷却至25℃。所得产物为5+末端具有EcoRI位点(下划线)、3’末端具有SalI位点(斜体)的双链DNA分子：5′-ACTG  GAA TTC ATG CCA ATC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CCGTTT CAC CTA GTC ATC CAT ATG GTC GAC ACGT-3′(SEQ ID NO：12)
用EcoRI和SalI裂解此产物，通过标准技术(Harris，R和Polayes，D.A.，Focus 19：6-8(1997))将所需片段克隆至载体pFastBac Dual的EcoRI-SalI位点，形成质粒pFastBac Dual Nde(图5)。将pAMP18BH-的NdeI-XhoI B片段克隆至pFastBac Dual Nde的NdeI-SalI位点，产生pDBH-(图5，15)。
为了将RSV RT α基因克隆至杆状病毒载体中，用SmaI和BspHI从pAMP1A上切下α基因并亚克隆至pFastBac Dual的NcoI-SmaI位点，产生pDA(图5，19)。这样将RSV RT α基因置于杆状病毒P10启动子的下游。用RsrII和SmaI切下RSVα肽基因和P10启动子，克隆至pDBH-的RsrII-SmaI位点，形成pDABH-(图4，20)。
为了用pDBH-KpnHis中羧基末端经His6标记的β基因取代pDABH-中的RSV RT β基因，用NdeI裂解pDBH-KpnHis，用Klenow片段使位点成为平端，然后用SstI释放羧基末端具有His6标记物的β基因(图6)。用EcoRI裂解pDABH-，用Klenow片段使位点成为平端，然后通过用SstI消化除去β基因。将pFastBac Dual中于p10启动子前克隆了α基因的平端SstI片段，即载体片段，与pDBH-KpnHis中含羧基末端经His标记的β基因的平端SstI片段连接。用此构建体转化大肠杆菌DH10B细胞，选择含有pDABH-His的转化子(图6，21)。
于1997年4月15日将含有质粒pDABH-His的重组宿主细胞大肠杆菌DH10B(pDABH-His)保藏于美国农业研究培养物保藏中心(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604 USA，保藏号为NRRL B-21679。
本领域技术人员使用保藏的质粒和标准的基因工程技术(如上述的定点诱变等)，可以很容易制备编码RSV RT之多种形式的α和/或β亚单位(如αRNA酶H-/β RNA酶H+；αRNA酶H+/β RNA酶H+；αRNA酶H+/βRNA酶H-；和αRNA酶H-/β RNA酶H-)的质粒。
转染昆虫细胞以产生病毒和RSV RT。为了制备转染昆虫细胞所用的载体，首先必需将RSV RT基因构建体插入杆状病毒基因组中。一种插入方法是使用位点特异性的转座子Tn7(Luckow，V.A：重组DNA技术和应用，Prokop，A等编，纽约：McGraw-Hill(1991))。在DH10Bac宿主细胞中，大多数杆状病毒基因组显现在低拷贝质粒(“杆粒”)上，该质粒在基因内还含有Tn7插入位点(Harris，R和Polayes，D.A，Focus 19：6-8(1997))。DH10Bac宿主细胞中的另一种质粒产生的Tn7转座酶利于Tn7的转座，构建在启动子和克隆位点侧翼有Tn7“右”和“左”区域的pFastBac DUAL。
为了将此构建体插入杆粒表达载体，用pDABH-His转化DH10Bac细胞，编码RSV RT β基因(其合成由杆状病毒多角体蛋白启动子介导)和RSV RT α基因(其合成由杆状病毒P10启动子介导)的序列转座之后，筛选转座至杆粒上编码β半乳糖苷酶α肽之位点后β-半乳糖苷酶活性的缺失(Harris，R和Polayes，D.A，Focus 19：6-8(1997))。然后，通过稍加改动的标准微量制备法(Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：实验室出版社(1989))从10ml转化子培养物中制备杆粒DNA。使用阳离子脂质Cellfectin(Anderson，D等，Focus 16：53(1995))，用约1μg杆粒DNA转染Sf21昆虫细胞。
为了扩展原代病毒，转染后约72小时时从转染细胞中取上清液，用1ml上清液感染35ml Sf21昆虫细胞(约1.2×105个细胞/ml)。72小时之后，离心培养物(2,000rpm，10分钟)，倾析上清液以用作继代病毒原种。类似地，通过用0.1ml继代储液感染35ml Sf21细胞以扩展继代病毒原种。
然后使用病毒原种感染Sf21细胞以表达RSV RT。在预备实验中，发现感染后约72小时时，感染细胞表达的RT活性最高。为了检测表达，用5ml病毒原种感染70ml Sf21细胞，感染后72小时，以1,000rpm离心5分钟以收获细胞，将细胞重新悬浮于PBS(占培养物体积的2.5％)中，以1,000rpm再离心5分钟。除去上清液，将细胞储存于-70℃待用。为了进行大规模生产，用2ml病毒原种感染2.8升Fernbach烧瓶中的600ml细胞，感染72小时后收获细胞。实施例2：分离RSV RNA酶H- RT
为了提供纯化的重组RSV H- RT，如实施例1所述在培养的昆虫细胞中过量表达克隆的RSV H- RT，并通过亲和和离子交换层析纯化，所得RSV RT含有α和β亚单位。RSV RT分离提供了基本上纯的RSV RT，其中已基本上除去了污染的酶和其它蛋白质，但不必完全除去这种污染物。
缓冲液。所有缓冲液的pH都是在23℃时测定的，将缓冲液储存于4℃待用。Crack缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH7.9)，0.5M KCl，0.02％(v/v)曲通X-100和20％(v/v)甘油。使用前以所示终浓度将下列蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN)加入Crack缓冲液中：亮抑蛋白酶肽(2μg/ml)，Pefabloc(48μg/ml)，胃酶抑制剂A(2μg/ml)，苄脒(800μg/ml)和PMSF(50μg/ml)。缓冲液A含有20mMTris-HCl(pH7.9)，0.25M KCl，0.02％(v/v)曲通X-100和10％(v/v)甘油。缓冲液B是其中加入1M咪唑的缓冲液A。缓冲液S含有50mMTris-HCl(pH8.2)，0.02％(v/v)曲通X-100，10％(v/v)甘油，0.1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇(DTT)。缓冲液T是其中加入1M KCl的缓冲液S。缓冲液H含有20mM磷酸钾(pH7.1)，0.02％(v/v)曲通X-100，20％(v/v)甘油，0.1mM EDTA和1mM DTT。缓冲液J是其中加入1M KCl的缓冲液H。储存缓冲液含有200mM磷酸钾(pH7.1)，0.05％(v/v)NP-40，50％(v/v)甘油，0.1mM EDTA，1mM DTT和10％(w/v)海藻糖。
制备提取物。融化冷冻的昆虫细胞(25g)，4℃下，用50ml Crack缓冲液+抑制剂制备细胞悬浮液。4℃下，用Fisher 550超声处理仪，以最大功率的25％超声处理破碎细胞。4℃下，以27,000×g离心30分钟以澄清破碎的粗提取物。
分离RSV RT。澄清后，于4℃，通过柱层析分级分离提取物并纯化RSV RT。按照厂商的说明，用NiSO4使30ml Chelating Sepharose FastFlow柱(Pharmacia；Piscataway，NJ)带电，并用99.5％缓冲液A+0.5％缓冲液B平衡该柱，再将澄清的粗提取物上样于该柱。用1倍柱体积的99％缓冲液A+1％缓冲液B洗涤该柱，再用10个柱体积的98.5％缓冲液A+1.5％缓冲液B洗涤该柱。用10倍柱体积的98.5％缓冲液A+1.5％缓冲液B至75％缓冲液A+25％缓冲液B的线性梯度洗脱RT。
在纯化过程中，用特异于逆转录酶的poly(C)-oligo(dG)检测逆转录酶活性(Gerard G.F等，生物化学13：1632-1641(1974))。按文献所述(Houts，G.E等，病毒学杂志，29：517-522(1979))定义和检测RT单位活性。使用poly(C)-oligo(dG)检测法，集中ChelatingSepharose Fast Flow柱的RT活性峰级分(10至17％缓冲液B)，用等体积的缓冲液S稀释，上样于5ml已用缓冲液S平衡过的AF-Heparin-650M柱(TosoHaas；Montgomeryville，PA)中。用12倍柱体积的90％缓冲液S+10％缓冲液T洗涤之后，用15倍柱体积的缓冲液S至30％缓冲液S+70％缓冲液T的线性梯度洗脱该柱。集中RT活性峰级分(43至50％缓冲液T)，用2.5倍体积的缓冲液H稀释，上样于已用缓冲液H平衡过的Mono S HR 5/5柱(Pharmacia；Piscataway，NJ)中。用20倍柱体积的85％缓冲液H+15％缓冲液J洗涤之后，用20倍柱体积的85％缓冲液H+15％缓冲液J至50％缓冲液H+50％缓冲液J的线性梯度洗脱该柱，集中RT峰级分，对储存缓冲液透析过夜，储存于-20℃。
纯化之后，经SDS-PAGE检测发现RSV H- RT均质程度在95％以上。还发现纯化的酶基本上没被RNA酶和DNA酶污染，其RNA酶H活性大大降低。实施例3：制备全长的cDNA分子
酶。SuperScript II RT(SS II RT)是缺乏可测的RNA酶H活性的Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)RT(即“RNA酶H- RT”)的克隆形式，它得自Life Technologies公司(Rockville，Maryland)。M-MLV RT是具有完整的RNA酶H活性的克隆的鼠RT(即“RNA酶H+ RT”)，它也得自Life Technologies公司。AMV RT是禽成髓细胞瘤病毒RT的RNA酶H+非克隆形式，它得自Seikagaku America公司。按实施例1和2所述制备RSV H- RT。重组的Tth DNA聚合酶得自嗜热栖热菌，它具有逆转录酶活性，是克隆的嗜热DNA聚合酶，它得自Perkin Elmer。
合成的mRNA。将具有120-核苷酸3’poly(A)尾的7.5千碱基(Kb)长的合成mRNA(Life Technologies公司；Rockville，Maryland)用作模板以检测多种酶单独或组合的效力。
cDNA合成反应混合物。除非另有说明，反应混合物(各20μl)含有下列组分：50mM Tris-HCl(24℃下pH为8.4)，75mM KCl，10mM二硫苏糖醇，各为1mM的[3PP]dCTP(300cpm/pmole)，dGTP，dTTP和dATP，25μg/ml(p(dT)25-30)，125μg/ml 7.5Kb mRNA和35个单位的克隆大鼠RNA酶抑制剂。仅含RT或含有RT组合的反应混合物含有下列成分：
仅含SS II RT 0.5mM dNTP，3mM MgCl2和200单位SS II RT
仅含RSV H- RT 7.5mM MgCl2和7单位RSV H- RT
仅含AMV RT 50mM KCl，10mM MgCl2 4mM焦磷酸钠和14单位AMV RT
SS II RT + RSV H-RT 5mM MgCl2，200单位SS II RT和7单位RSVH- RT
仅含Tth DNA聚合酶 0.5mM dNTP，1mM MnCl2和5单位Tth DNA聚合酶
仅含M-MLV H+ RT 0.5mM dNTP，3mM MgCl2，50μg/ml放线菌素D和200单位M-MLV H+ RT
Tth DNA聚合酶+SS II RT或RSV H- RT 与仅含Tth DNA聚合酶的相同，另加有200单位SS II RT或7单位RSV H- RT
M-MLV H+ RT + SSII RT 与仅含M-MLV H+ RT的相同，另加有200单位SS II RT
M-MLV H+ RT +AMV RT或RSV H-RT 5mM MgCl2，50μg/ml放线菌素D，200单位M-MLV H+ RT，和14单位AMV RT或7单位RSVH- RT
AMV RT + SS IIRT或RSV H- RT 5mM MgCl2，50μg/ml放线菌素D，14单位AMVRT，和200单位SS II RT或7单位RSV H- RT
当联合使用RT时，首先加入一种酶，紧接着加入第二种酶的等分试样。在使用一种酶的情况下，加入相同酶的第二个等分试样作为对照以评估一种酶的量加倍后的作用。
于45℃将所有cDNA合成反应进行50分钟，通过由RT催化32P-通过用酸沉淀cDNA产物部分并用闪烁计数器计数以测定cDNA总量。通过碱性琼脂糖凝胶电泳(Carmichael，G.G和McMaster，G.K，酶学方法，65：380-385(1980))分级分离其余反应混合物中32P-标记的cDNA产物。使凝胶干燥，通过放射自显影确定cDNA产物的大小分布。使用放射自显影胶片作为模板，切下干燥的凝胶，通过闪烁计数分析之以确定所合成的全长(7.5Kb)产物的级分。
表1和2分别显示出通过单独一种酶或多种酶的组合由7.5Kb mRNA所合成的cDNA和全长cDNA的总量。可得出下列结论：
1.当使用一种RT时，用RT的RNA酶H-形式得到最高产量的总产物和全长产物。用RSV H- RT或SS II RT时，总量几乎双倍于用RNA酶H+酶所得的最高产量(分别为1011和946ng对607ng)。当检查全长产量时，从反应中除去RNA酶H的作用甚至更加显著。在这种情况下，产量至少增加到3倍(分别为RSV H-和SS II RT的234和208ng对M-MLVH+ RT和AMV RT的79和26ng)。这些结果显示出从RT中除去RNA酶H具有显著的积极作用。
2.当使用多种RT的组合时，观察到几种效果。混合不同来源的RT(RNA酶H-或RNA酶H+)会增加总产量和全长产量。这与具有不同中止位点的第二种RT可减少在第一种酶的独特位点处的中止这一假说一致。然而，当联合使用两种不同的RNA酶H- RT时，得到最高产量的总产物和全长cDNA产物(见表1和2中的阴影部分)。这些结果表明两种RNA酶H-酶协作合成全长的cDNA分子：第一种酶合成截短的cDNA分子，然后经由第二种酶的活性将该分子延伸为全长，因此，本发明的组合物和方法便于合成全长的cDNA分子。 1总cDNA产物的量(ng)；2未测。
Figure A9880600600612
1全长(7.5kb)cDNA产物的量；2未测
在表1和2概述的混合实验中，在可能对一种给定的RT而言为亚最适的条件下，将两种逆转录酶同时加入反应中。这是同时使用禽和鼠RT时的情况，因为MgCl2的浓度被设置为5mM，介于鼠和禽RT的最适值3mM和7.5mM之间。另外，在这些实验中，在含有热稳定性较差的鼠RT的反应中无法再利用禽RNA酶H- RT的热稳定性。
为了使用多种酶，且顾及到不同酶可能具有不同的最适条件这一事实，根据本发明可以依次加入或分开使用酶。例如，可在对各种RT为最适的反应条件下，在含不同RT的不同反应管中由相同RNA的不同等分试样合成cDNA。随后，在进行其它操作之前混合各个反应中得到的cDNA。或者，可在一个反应管中单独和连续使用RT以进行cDNA合成。即首先可在最适反应条件下使用SuperScript II来拷贝RNA群体，然后将同一反应管中的条件调节为对RSV H- RT而言为最适，并在升高的温度下用禽RT进行进一步合成。实施例4：克隆和表达禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT和AMV RNA酶H-(AMVH-)RT一般方法
本发明的AMV RT是禽逆转录病毒RT的克隆形式，AMV H-RT是克隆的AMV RT的变体，其中α和β亚单位因单个氨基酸的改变被突变，从而消除了RNA酶H活性。只突变了α亚单位(β亚单位的RNA酶H结构域未突变)时，也产生了RNA酶H活性大大降低的AMV RT。使用按下述改良的标准分子生物学方法(例见Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：实验室出版社(1989))进行突变和质粒构建。完全按照实施例1中RSV RT克隆和表达一节中所述进行质粒制备、PCR、凝胶电泳、DNA片段的分离和克隆，昆虫细胞培养和杆状病毒制备。克隆和表达编码AMV RT α和β亚单位的基因
为了克隆AMV RT，由得自Life Science(St.Petersburg，Florida)的纯化的AMV(Grandgenett，D.P等，应用微生物学，26：452(1973))制备AMV病毒RNA(Strauss，E.M等，病毒学方法杂志，1：213(1980))。根据试剂盒手册中的说明，用cDNA合成和质粒克隆所用的SuperScript质粒系统(Life Technologies公司：Rockville，Maryland)由AMV病毒RNA制备AMV RT cDNA。使用特异于AMV RT的引物在cDNA中添加NotI位点。制备之后，将AMV RT cDNA克隆至已用SalI和NotI处理的pSPORT1中，产生含有AMV RT基因的载体(pSPORT8)(图22)。
通过蛋白酶水解加工较大的多肽前体产生AMV RT的α和β亚单位(Gerard，G.F：核酸合成和修饰酶，第I卷：DNA酶，Jacob，S.T编，Boca Raton，Florida：CRC出版社，p1-38(1983))。为了免除对蛋白酶水解加工的需求，可诱变AMV RT的编码序列并亚克隆之，以使α和β亚单位都由具有标准起始和终止翻译信号的基因编码。为了制备RNA酶H-构建体，α和β基因的RNA酶H区域都被诱变，以相同的方法也可构建任何亚单位组合(如α RNA酶H-/β RNA酶H+；αRNA酶H+/β RNA酶H+；α RNA酶H+/β RNA酶H-；α RNA酶H-/β RNA酶H-)。已发现AMVRT α RNA酶H-/β RNA酶H+的RNA酶H活性大大降低(约为野生型的5％)。在β亚单位的羧基末端添加编码亲和标记物的序列。
由AMV RNA合成cDNA。使用与AMV RT基因3’末端互补的3’引物将AMV RNA拷贝成DNA，该引物将在基因的3’末端添加NotI位点(图22)。通过加入SalI衔接子将所得cDNA的5’末端制成SalI末端。然后将此cDNA克隆至经SalI-NotI裂解的载体(pSPORT1)中。使用Superscript II RT(Gerard，G.F等，FOCUS 11：66(1989))，并用基因特异性的引物(寡核苷酸#1)代替NotI引物-衔接子来合成cDNA的第一链cDNA：寡核苷酸#1(SEQ ID NO：13)：5′GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCATTAACTCTCGTTGGCAGC 3′
于16℃，联合使用DNA聚合酶I与大肠杆菌RNA酶H和DNA连接酶，随后用T4 DNA聚合酶处理末端以合成第二条链。将cDNA去蛋白化，并用乙醇沉淀，再与由寡核苷酸#2和#3组成的SalI衔接子连接：寡核苷酸#2(SEQ ID NO：14)：5′TCGACCCACGCGTCCG 3′寡核苷酸#3(SEQ ID NO：15)：5′CGGACGCGTGGG 3′
添加衔接子之后，用NotI消化。在由cDNA克隆试剂盒提供的1ml预装柱上对cDNA进行大小分级分离。由掺入的32P标记物的比活计算各个级分中cDNA的量，通过琼脂糖凝胶上的放射自显影测定cDNA的大小。选择大于3Kb的那些级分用于克隆。
将AMV cDNA克隆至载体中。将cDNA连接至经SalI-NotI裂解的pSPORT1载体中，然后使用连接的cDNA转化大肠杆菌MAX EFFICIENCYDH10BTM感受态细胞(Life Technologies公司，Rockville，Maryland)。转化后，将细胞等分试样铺于含氨苄青霉素的LB平板上。挑选12个菌落，培养1ml培养物用于微量制备。用限制性酶SalI，MluI，PstI，ApaI，DraIII，SphI和BglII消化之后，进行凝胶电泳以检查某些片段。选择出一个质粒pSPORT8，因为其中的插入物大得足以编码AMV RT基因(3Kb)，并且其中存在PstI位点，这表明存在AMV RT基因的5’末端(图22)。
诱变和亚克隆AMV RT β亚单位的氨基末端，羧基末端和中间部分。诱变AMV RT基因以在编码成熟RT多肽之序列的氨基末端添加ATG密码子和EcoRI位点。这一诱变是使用pSPORT8作为靶和下列寡核苷酸经PCR完成的：
寡核苷酸#4(SEQ ID NO：16)：5′AUG GAG AUC UCU GAA TTC ATG ACT GTT GCG CTA CAT CTGGCT 3′
寡核苷酸#5(SEQ ID NO：2)：5′AAC GCG UAC UAG U GTT AAC AGC GCG CAA ATC ATG CAG 3′
按上述进行PCR，纯化PCR产物，用DpnI处理PCR反应产物以破坏靶，通过UDG克隆法(Buchman，G.W等，Focus 15：36(1993))将PCR产物克隆至pAMP18中以形成质粒pAMVN(图23，26)。
诱变并克隆了氨基末端之后，使用下列寡核苷酸，经PCR在pSPORT8中AMV RT β亚单位基因的羧基末端添加His6亲和标记物、XhoI位点和翻译终止密码子：
寡核苷酸#6(SEQ ID NO：3)：5′CUA CUA CUA CUA GGT ACC CTC TCG AAA AGT TAA ACC 3′
寡核苷酸#7(SEQ ID NO：9)：5′CAU CAU CAU CAU GAG GAA TTC AGT GAT GGT GAT GGT GATGTG CAAA AAG AGG 3′
按上述进行PCR，纯化PCR产物，用DpnI处理PCR反应产物以破坏靶，通过UDG克隆法(Buchman，G.W等，Focus 15：36(1993))将PCR产物克隆至pAMP18中以形成质粒pAMVC(图23，27)。
为了加入AMV RT β亚单位的中间部分，将pSPORT8中编码AMV RTβ亚单位中间部分的2.3kb HpaI-KpnI片段克隆至pAMVN的HpaI-KpnI位点，形成pAMVNM(图23，28)。为了加入AMV RT β亚单位的羧基末端，因pAMVC具有两个KpnI位点(图27)，故用KpnI部分裂解，再用ScaI完全裂解，然后分离出含有AMV RT羧基末端的3Kb片段，将此片段与pAMVNMH-(图29)的3.5Kb ScaI-KpnI片段连接，形成pAMVBH-(图23，30)。
将β亚单位诱变为RNA酶H-。RSV RT和AMV RT基因是相关的(RSV-C的GenBank序列为J02342，J02021和J02343；AMV的为L10922，L10923，L10924)。在RNA酶H区域的一段短距离内，这些基因编码相同的氨基酸序列。如上文实施例1所述，在克隆和诱变RSV RT基因的过程中，通过定点诱变制备了RSV RT β基因的RNA酶H-衍生物。所用寡核苷酸(寡核苷酸#8)将氨基酸Asp450改变为Ala450，并导入了SstII位点(下划线)。寡核苷酸#8GGA CCC ACT GTC TTT A CC GCG GCC TCC TCA AGC ACCRSV RT β基因中具有RNA酶H-突变的质粒为pAMP18BH-(图2，14)。将pAMP18BH-中129bp的BsrGI-BstEII片段克隆至pAMVNM的BsrGI-BstEII位点，取代此质粒中的RNA酶H+区域，形成pAMVNMH-(图23，29)。这一取代是通过将AMV β基因中的Asp450改变为Ala450而达到的，而未改变任何其它氨基酸。为了将β亚单位恢复为RNA酶H+，可使用具有野生型序列的寡核苷酸引物。
诱变和亚克隆编码AMV RT α亚单位的基因。为了产生编码AMV RTα亚单位的基因，使用寡核苷酸#9和#10诱变pAMVNM中AMV RT基因的氨基末端，以在禽逆转录病毒的蛋白酶p15正常地裂解前体聚蛋白质得到α亚单位的位点处导入翻译终止密码子：
寡核苷酸#9(SEQ ID NO：6)：5′CAU CAU CAU CAU CCC GGG TTA ATA CGC TTG GAA GGT GGC 3′
寡核苷酸#10(SEQ ID NO：7)：5′CUA CUA CUA CUA TCA TGA CTG TTG CGC TAC ATC TG 3′
PCR循环条件为：94℃ 5分钟，接着是55℃ 15秒/72℃ 2分钟/94℃15秒共8轮循环，然后是72℃ 2分钟。用DpnI处理PCR反应产物以破坏靶，通过UDG克隆法(Buchman，G.W等，Focus 15：36(1993))将PCR产物克隆至pAMP18中以形成质粒pAMVA(图24，31)。为了制备AMV RT α亚单位的RNA酶H-等位基因，使用pAMVBH-作为靶，根据上述方法形成质粒pAMVAH-(图24，32)。
将AMV RT α和β基因克隆至pFastBac Dual中。用SmaI和BspHI从pAMVA上切下α基因，并亚克隆至pFastBac Dual(pD；图33)的NcoI-PvuII位点，产生pDAMVA(图25，34)。类似地，由pAMVAH-克隆RNA酶H- AMV RT α基因，形成质粒pDAMVAH-(图25，35)。在这两个质粒中，AMV RT α基因均位于杆状病毒P10启动子的下游。用EcoRI从pAMVBH-切下RNA酶H- AMV RT β基因，并克隆至pDAMVA的EcoRI位点。选择克隆，所述克隆中EcoRI插入物的定向使得AMV RT β基因位于多角体蛋白启动子的下游，形成质粒pDAMVABH-(图25，36)。在此构建体中，AMV RT α基因为RNA酶H+，而β基因为RNA酶H-。用RsrII和NotI从pDAMVABH-上切下AMV RNA酶H- RT β基因和多角体蛋白启动子，克隆至pSPORT1的RsrII-NotI位点，形成质粒pJAMVBH-(图25，37)。用RsrII和NotI从pJAMVBH-上切下AMV RNA酶H- RT β基因和多角体蛋白启动子，克隆至pDAMVAH-的RsrII-NotI位点，形成质粒pDAMVAH-BH-(图25，38)。
于1997年6月17日将含有质粒pDAMVABH-的重组宿主细胞大肠杆菌DH10B(pDAMVABH-)保藏于美国农业研究培养物保藏中心(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604 USA，保藏号为NRRL B-21790。
本领域技术人员使用保藏的质粒，和标准的基因工程技术(如上述的定点诱变等)，可很容易制备编码AMV RT之多种形式的α和/或β亚单位(如α RNA酶H-/β RNA酶H+；αRNA酶H+/β RNA酶H+；αRNA酶H+/βRNA酶H-；和α RNA酶H-/β RNA酶H-)的质粒。
转染昆虫细胞以产生病毒和AMV RT。为了制备转染昆虫细胞所用的载体，首先必需将AMV RT基因构建体插入杆状病毒基因组中。使用位点特异性的转座子Tn7，按照实施例1中所述的将RSV RT基因构建体插入杆粒的方法，进行插入。用质粒pDAMVABH-转化DH10Bac细胞，编码AMV RT β基因(其合成由杆状病毒多角体蛋白启动子介导)和AMV RTα基因(其合成由杆状病毒P10启动子介导)的序列转座之后，筛选转座至杆粒上编码β半乳糖苷酶α肽之位点后β-半乳糖苷酶活性的缺失(Harris，R和Polayes，D.A，Focus 19：6-8(1997))。然后，按实施例1所述，通过稍加改动的标准微量制备法，从转化子(10ml培养物)制备杆粒DNA。使用阳离子脂质Cellfectin(Anderson，D等，Focus16：53(1995))，用约1μg杆粒DNA转染Sf21昆虫细胞。
为了扩展原代病毒，转染后约72小时时从转染细胞中取上清液，用1ml上清液感染35ml Sf21昆虫细胞(约1.2×105个细胞/ml)。72小时之后，离心培养物(2,000rpm，10分钟)，倾析上清液以用作继代病毒原种。类似地，通过用0.1ml继代原种感染35ml Sf21细胞以扩展继代病毒原种。
然后使用病毒原种感染Sf21细胞以表达AMV RT。在预备实验中，发现感染后约72小时时，感染细胞表达的RT活性最高。为了检测表达，用5ml病毒原种感染70ml Sf21细胞，感染后72小时时，以1,000rpm离心5分钟收获细胞，将细胞重新悬浮于PBS(占培养物体积的2.5％)中，以l,000rpm再离心5分钟。除去上清液，将细胞储存于-70℃待用。为了进行大规模生产，用2ml病毒原种感染2.8升Fernbach烧瓶中的600ml细胞，感染72小时后收获细胞。然后按实施例2所述分离RSV RT的方法分离AMV RT。实施例5：在高于55℃的温度下用逆转录病毒RT进行逆转录
以前曾使用逆转录病毒的逆转录酶，在37℃至42℃的温度范围内催化mRNA逆转录(见RT供货商LTI，Pharmacia，Perkin Elmer，Boehringer Mannheim和Amersham等的科技文献)。人们普遍相信，在这些温度下，mRNA的二级结构会干扰逆转录(Gerard，G.F等，FOCUS11：60(1989)；Myers，T.W和Gelfand，D.H.生物化学30：7661(1991))，并且在基因特异性逆转录过程(如RT-PCR)中，引物结合的特异性会降低，导致高的背景信号(Myers，T.W和Gelfand，D.H.生物化学30：7661(1991)；Freeman，W.N等，生物技术20：782(1996))。因此需要在更高的温度下，即高于55℃的温度下进行RNA逆转录，以便减轻这些问题。
如上所述，一般不在高于37℃至42℃的温度下使用逆转录病毒RT拷贝RNA，因为这些嗜中温酶的热稳定性是有限的。然而，最近据报道可在50℃，最高至55℃的温度下使用AMV RT进行小扩增子(＜500个碱基)的RT-PCR(Freeman，W.N等，生物技术20：782(1996)；Mallers，F等，生物技术18：678(1995)；Wang，R.F等，生物技术12：702(1992))。因除去了RNA酶H区域(Gerard，G.F等，FOCUS11：60(1989))或因RT基因中的点突变(Gerard，G.F等，FOCUS14：91(1992))而缺乏RNA酶H活性的M-MLV RT形式也可在50℃时使用以催化cDNA合成，但不能在55℃时使用。
因此，检查了RNA酶H- RSV RT的热稳定性及其在较高温度(即高于50℃)下进行逆转录反应以合成较大cDNA的能力。方法
酶和RNA。SuperScript RT(SS RT)，SuperScript II RT(SS II RT)和Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)RT均得自LTI。AMV RT得自SeikagakuAmerica公司，或按上文实施例4中所述制备之。SS RT是通过除去RT多肽的RNA酶H区域，使酶分子量为57KDa而不是78KDa，从而消除了RNA酶H活性的RNA酶H-型M-MLV RT(Gerard，G.F等，FOCUS11：66(1989)；Kotewicz，M.L等，核酸研究16：265(1988))。SS IIRT是通过在M-MLV RT的RNA酶H区域内导入三个点突变，从而消除了RNA酶H活性的RNA酶H-型M-MLV RT(Gerard，G.F等，FOCUS14：91(1992))。Rous相关病毒(RAV)RT得自Amersham。按实施例1和2所述克隆、表达和纯化RSV RNA酶H- RT和RSV RNA酶H+ RT。用作模板的RNA是得自LTI的1.4，2.4，4.4和7.5Kb的合成RNA，它们的3’末端各含有120个核苷酸长的poly(A)尾。合成的CAT mRNA得自LTI。
测定逆转录酶功能性热稳定性的模型系绕。使用1.4，2.4，4.4和7.5Kb的mRNA混合物检测多种RT在不同温度下合成全长cDNA拷贝的能力。由RT催化32P-标记的脱氧核糖核苷三磷酸前体的掺入来放射性标记所合成的cDNA产物。通过碱性琼脂糖凝胶电泳(Carmichael，G.G和McMaster，G.K，酶学方法，65：380-385(1980))分级分离32P-标记的cDNA产物。使凝胶干燥，通过放射自显影确定cDNA产物的大小分布。使用放射自显影胶片作为模板，从干燥的凝胶上切下1.4，2.4，4.4和7.5Kb的全长cDNA带，通过闪烁计数确定所合成的各个全长产物的量。
cDNA合成反应条件。所有cDNA合成反应都在所示温度下进行30或50分钟。除非另有说明，所有反应混合物都为20μl并含有下列组分：50mM Tris-HCl(24℃下pH为8.4)，75mM KCl，10mM二硫苏糖醇，各为1mM的[32P]dCTP(300cpm/pmole)，dGTP，dTTP和dATP，25μg/mlp(dT)25-30，各为12.5μg/ml的1.4，2.4，4.4和7.5Kb mRNA和35个单位克隆的大鼠RNA酶抑制剂。另外，反应混合物各含有下列成分：
SS II RT 0.5mM dNTP(替代1mM)，3mM MgCl2和200单位SS II RT
RSV H- RT 7.5mM MgCl2和21单位RSV H- RT
AMV RT 50mM KCl，10mM MgCl2，4mM焦磷酸钠和29单位AMV RT
RSV H+ RT 50mM KCl，10mM MgCl2，4mM焦磷酸钠和24单位RSV H+ RT
RAV RT 50mM KCl，10mM MgCl2，4mM焦磷酸钠和24单位RAV RT
含有除酶以外的所有组分的该反应混合物预先置于所需温度下保温3分钟，然后加入RT起始cDNA合成。
半寿期测定。通过将各管RT置于所需温度下保温适当长的时间并通过将管置于冰上终止保温来测定RT的半寿期。在20μl含有50mMTris-HCl(pH8.4)，75mM KCl，7.5mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，50μg/mlCAT mRNA，25μg/ml p(dT)12-18，和350-700单位/ml RT的等分试样中保温RSV RT，RAV RT和AMV RT。在除MgCl2为3mM，酶为2,500个单位/ml外，其余组分相同的混合物中保温鼠RT(SS RT，SS II RT，M-MLV RT)。检测各管等分试样(禽RT为5μl，鼠RT为1μl)在单位检测反应混合物中的RT活性以测定残留的RT活性。
单位检测试验。单位检测反应混合物(50μl)含有50mMTris-HCl(pH8.4)，40mM KCl，6mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，500μM[3H]dTTP(30cpm/pmol)，0.5mM poly(A)和0.5mM(dT)12-18。将反应混合物置于37℃保温10分钟，在GF/C玻璃纤维上用酸沉淀经标记的产物，在闪烁计数器中计数。结果和讨论
除了极少数情况外，测定了RSV H+ RT，RAV RT，AMV RT，RSV H-RT，M-MLV H+ RT，SS RT和SS II RT在模板引物的存在下，于45℃，50℃，55℃和60℃时的半寿期。结果示于图39和表3。表3.逆转录酶的半寿期1
酶           在指示温度下的半寿期(分钟)
   45℃    50℃    55℃     60℃
RSV H- RT    440    138    5     0.75
RSV H+ RT    ND2    30    ND2     ND3
RAV RT    159    37    3.8     ND3
AMV RT    96    16    1.3     ND3
SuperScript II RT    105    7    ND3     ND3
SuperScript RT    120    3    ND3     ND3
M-MLV RT    65    2.5    ND3     ND3
1半寿期是由图39所示数据测定的。2ND：未测定。3ND：未测定，因为此反应混合物中的半寿期太短以致于不能被精确测定。
图39和表3所示的结果清楚地表明RNA酶H+ RT(RSV，RAV和AMV)比M-MLV RT更加稳定，在50℃时有较长的半寿期。另外，突变这些RT以产生其相应的RNA酶H-型进一步增加了其半寿期。最显著的是，45℃，50℃和55℃时，RNA酶H- RSV RT比任何其它逆转录病毒RT的半寿期都高很多。因此，在RSV RT各个亚单位的RNA酶H区域中导入单个氨基酸的变化会使其在50℃时的半寿期增加约5倍。
热稳定性的增加对于高于50℃的温度下cDNA合成的影响是显著的。图40显示出45℃，50℃，55℃和60℃下，这些RT拷贝长度为1.4至7.5Kb之mRNA的能力的比较结果。除了RSV H- RT外，任何RT都不能在55℃或60℃时产生大量长度大于2.4Kb的产物。与之相比，RSVH- RT于55℃持续产生全长的7.5Kb cDNA，于60℃产生4.4Kb cDNA。图41和42显示出在图40中表现最好的两种RT(即SS II RT和RSV HRT)更详细的比较。在高于55℃的温度下，RSV H- RT能持续合成所有长度的cDNA，而SS II RT对于长度大于1Kb的cDNA仅产生低水平的量。
总之，这些结果表明RNA酶H- RSV RT比任何其它可商购的逆转录病毒RT的热活性均高很多，可在60℃时用于合成较长(长达4Kb)的cDNA。50℃至60℃时RNA酶H- RSV RT热活性增强是相对于RNA酶H+ RT而言其热稳定性增加所致，这使RSV H- RT成为50℃至60℃时逆转录mRNA可使用的理想的酶。实施例6：升温时用禽RT进行逆转录
在实施例5中(表3和图39)中显示出多种RT的半寿期。特别是报道了其中各个亚单位的RNA酶H区域经突变消除了RNA酶H活性的克隆RSV RT的半寿期(实施例1；α和β亚单位中均发生Asp450→Ala)。
为了进一步检查这些突变对RT半寿期的作用，按上述产生构建体，其中一次仅突变两个亚单位中的一个，得到多个突变体组合(如αRNA酶H-/β RNA酶H+；和αRNA酶H+/β RNA酶H-)。按实施例5方法一节所述，测定这些RSV RT以及克隆的AMV α RNA酶H-/β RNA酶H+ RT的半寿期。
如表4所示，当RSV或AMV RT中的α亚单位被突变，而β亚单位为完整的野生型时，所得RT表现出比其它禽RT更强的热稳定性。使用实施例5方法一节中所述的模型系统检查这些RT突变体功能性的热稳定性。对各个酶而言，发现其增加的热稳定性与改善的功能表现相关，例如α RNA酶H-/β RNA酶H+禽RT在55℃时显示出最高的热稳定性(表4)，也表现出在多个升高的温度下具有最高的功能活性(表5)。表4.RSV和AMV逆转录酶的半寿期
酶   55℃时的半寿期(分钟)
RSV αH-βH-RTRSV αH-βH+RTRSV αH+βH-RTRSV αH+βH+RTAMV αH-βH+RT天然AMV RT天然RAV RT          5721.961.33.8
表5.升温下RSV RT的功能活性
酶    温度℃            产生的全长产物的量(pMole)
  1.4Kb   2.4Kb   4.4Kb   7.4Kb
RSV αH-βH-RT     45.0   132.9   80.5   56.7   28.1
    55.0   115.4   70.7   40.8   12.5
    57.5   81.9   43.2   17.2   3.1
    60.0   7.0   1.8   0   0
    62.5   0   0   0   0
RSV αH-βH+RT     45.0   145.2   85.3   57.9   31.8
    55.0   161.3   83.0   53.3   21.5
    57.5   140.1   77.7   41.1   11.6
    60.0   67.6   30.0   7.5   0.1
    62.5   4.1   0.8   0   0
实施例7：产生禽逆转录酶的其它方法及其特性的鉴定
如上文相关技术一节中所述，已详细研究了3个逆转录病毒RT原型，它们是M-MLV RT，HIV RT和ASLV RT(包括RSV和AMV RT)。尽管这些逆转录病毒RT各以α和β亚单位异二聚体形式存在，但迄今为止仍无报道表明可以同时表达克隆的ASLV RT α和β基因，导致形成二聚体形式的αβ RT。
上文实施例1-4描述了能有效拷贝mRNA的αβ型RSV和AMV RT的克隆、表达和纯化。通过在被杆状病毒感染的昆虫细胞中从双启动子载体共表达α和β基因，即可形成αβ RT。本实施例中提供的研究被设计为通过多种其它方法产生RSV αβ RT，所述方法已被成功用于克隆和表达HIV p66/p51 RT。另外，如下文所述，目前已克隆、表达和纯化了RSV RT的各个亚单位，包括βp4，、β和α，还鉴定了这些亚单位拷贝mRNA的能力。材料和方法一般方法
使用按下述改进的标准分子生物学方法(例见Sambrook，J等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约：实验室出版社(1989))进行突变和质粒构建。按照实施例1中RSV RT克隆和表达一节中所述进行质粒制备，PCR，凝胶电泳，DNA片段的分离和克隆，昆虫细胞培养和杆状病毒制备。在大肠杆菌中克隆和表达RSV RT
在大肠杆菌中，尝试多种方法由RSV RT βp4产生RSV αβ RT。
NdeI-XbaI片段的PCR。使用下列寡核苷酸，通过pJD100(图7)的PCR(94℃5分钟1个循环；94℃10秒，55℃15秒，72℃15秒15个循环；72℃5分钟1个循环)诱变RSV RT βp4基因的氨基末端以导入NdeI位点：寡核苷酸#11(SEQ ID NO：17)：5′-ATT ATT CAT ATG  ACT GTT GCG CTA CAT CTG GC-3′
寡核苷酸#12(SEQ ID NO：18)：5′- TAC GAT CTC TCT CCA GGC CAT TTT C-3′
上述寡核苷酸#11中的NdeI位点以黑体和斜体表示，而寡核苷酸#11和#12中下划线的碱基得自真正的RT基因序列。具有这两个寡核苷酸的PCR产物在基因的开始处含有NdeI位点，并保留了RT基因中存在的XbaI位点。将PCR产物克隆至pUC18的NdeI和XbaI位点之间，形成pUC18#3。
定点诱变导入SmaI位点以克隆p15。将pJD100中含有整个RSV RT基因的3Kb PstI片段克隆至M13mp19中。使用下列诱变寡核苷酸，经定点诱变(见实施例1)在RSV RT βp4基因的羧基末端导入SmaI位点，产生克隆RF-SmaI：寡核苷酸#13(SEQ ID NO：19)：5′-ACT CGA GCA GCC CGG GAA CCT TTG-3′
重构RT基因。将RF-SmaI中2.8Kb的SmaI-PstI片段克隆至pUC18的SmaI/PstI位点，将此克隆称为pUC18-PstI-SmaI。将pUC18#3中的NdeI-XbaI片段导入pUC18-PstI-SmaI中，以再现起始密码子处具有NdeI位点的整个RSV RT βp4基因，将此克隆称为pUC18-RT。
将整个RT基因克隆至pRE2中。将pUC18#3中的NdeI-XbaI片段克隆至表达载体pRE2中，产生pRE2-Nde-Xba。pRE2含有可诱导的λpL启动子。将pUC18-PstI-SmaI中RSV RT βp4基因的其余部分作为NdeI-SstI片段克隆至经XbaI和SstI消化的pRE2-Nde-Xba中，产生pRE2-RT。
将p15克隆至pRE2-RT中。通过RSV p15蛋白酶将RSV RT由RSV RTβp4加工为αβ异二聚体。为了制备出真正的αβ，按下述用RSV RT βp4基因克隆和表达p15蛋白酶基因。使用pJD100作为靶，通过上述方法进行PCR，以产生RSV p15蛋白酶基因。PCR所用的寡核苷酸如下：寡核苷酸#14(SEQ ID NO：20)：5′-AT TAC CCG  GGA GG A TAT  CAT ATG TTA GCG ATG ACA ATGGAA CAT AAA G-3′寡核苷酸#15(SEQ ID NO：21)：5′-A TAT GTC GAC TCA CAG TGG CCC TCC CTA TAA ATT TG-3′
在上述寡核苷酸#14和#15中，黑体字母表示的是限制性位点(SmaI，NdeI和SalI)，而下划线的碱基区域是核糖体结合位点。使用这些寡核苷酸的PCR产生了约450bp长的片段，用SmaI和SalI消化之并克隆至pUC19中，将此克隆称为pUC19-p15。通过将450bp的SmaI-SalI片段亚克隆至SmaI/SalI位点而使p15基因导入pRE2-RT中。将最终的质粒称为pRE2-RT.p15。
由pRE2-RT和pRE2-RT.p15表达RT。于30℃，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(30μg/ml)的EG肉汤中将含有pRE2-RT或pRE2-RT.p15的大肠杆菌CJ374培养至A590为0.5。于42℃将一半培养物诱导45分钟，再于30℃快速生长2小时。将另一半置于30℃培养作为未诱导的对照。经SDS-PAGE检查未发现任何培养物产生任何可见的诱导蛋白质，细胞提取物无一显示出任何RT活性。
重新将RT.p15克隆至pRE1中。上述构建体中未表达RT这一现象说明，可能(i)在PCR的过程中，RT基因中已导入突变使其失活，或(ii)在克隆过程中，λpL启动子中产生了突变，因为据认为RT对大肠杆菌是有毒的。因此，将完整的RT.p15基因作为NdeI-SalI片段重新克隆至pRE1中，pRE1与pRE2相同，只是多克隆位点的方向相反，然后将构建体导入大肠杆菌CJ374。另外，用pJD100中相同的HpaI-KpnI片段取代所得克隆中2269bp的HpaI-KpnI片段。取代后仅剩下约200bp的氨基末端区域得自PCR。另外，测序此区域(NdeI位点至HpaI位点)以进一步证实PCR未导致突变。此质粒被称为pRE1-RT.15。将此质粒导入蛋白酶缺损的大肠杆菌菌株BL21。通过用XhoI和SalI消化质粒pRE1-RT.15，重新环化质粒，从而缺失掉上面的p15基因。所得质粒被称为pRE1-RT。
在携有pRE1-RT和pRE1-RT.15的大肠杆菌CJ374和BL21中表达RT。按上述进行培养，检测可溶性细胞提取物的RT活性。尽管活性非常低，但经诱导的细胞提取物的RT活性显然比未经诱导的细胞提取物的高10倍。CJ374和BL21中的活性水平相似。pRE1-RT和pRE1-RT.15中的RT表达水平相似。
克隆RT基因，使其处于tac启动子控制下。由于RSV RT βp4处于λpL启动子之下不能被很好地表达，因此尝试了在不同启动子控制之下进行表达。克隆具有和不具有p15基因的RSV RT βp4基因，使其在tac启动子的控制下。为了克隆RT基因，用NsiI消化pRE1-RT，用T4 DNA聚合酶使其成为平端，最后用XhoI消化。从琼脂糖凝胶中纯化RT片段。为了克隆RT.15基因，用NsiI消化pRE1-RT.15，用T4DNA聚合酶使其成为平端，最后用SalI消化。从琼脂糖凝胶中纯化RT.15基因组合片段。用NcoI消化载体pTrc99A(Pharmacia)，用Klenow片段使其成为平端，最后用SalI消化。纯化大的载体片段并与纯化的RT或RT.15片段连接。将所得构建体导入大肠杆菌DH10B，筛选具有正确插入物的克隆，将所得克隆称为pTrcRT和pTrcRT.15。
在tac启动子控制下表达RT基因。于37℃，在缓冲加富的培养基中将携有pTrcRT或pTrcRT.15的大肠杆菌细胞培养至A590为0.1或0.6，然后加入IPTG(1mM)以诱导RSV RT βp4表达。诱导后2小时收集细胞，不加入任何诱导物以类似的方法培养未经诱导的培养物。可溶性细胞提取物中的RT酶活性等同于含λpL启动子的构建体中的RT酶活性。
表达蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。RSV RT由分子量为94KD(β)和62KD(α)的两个亚单位组成。α亚单位是得自β亚单位的蛋白酶水解片段。蛋白酶水解是通过RSV p15蛋白酶在体内完成的。然而，当检查携有所述质粒的经诱导大肠杆菌提取物时，检测到两种诱导的蛋白质，分子量为75KD和62KD。这两种蛋白质主要在大肠杆菌提取物的不可溶级分中。大肠杆菌中表达之后存在75KD而不是预期的94KD蛋白质，这表明(i)在羧基末端附近具有突变，导致翻译提前终止，(ii)在大肠杆菌的胞质溶胶中具有蛋白酶水解，或(iii)具有RT内部翻译起始。当测序RT基因的羧基末端区域时，未发现可能会导致翻译提前终止的突变。为了检查是否有内部翻译起始，将RT基因作为HpaI-XhoI片段克隆至经SmaI和SalI消化的pTrc99中。未检测到诱导的蛋白质，这表明没有内部起始产生75KD或62KD的蛋白质。
在多种大肠杆菌宿主中表达RT。如上所述，在大肠杆菌DH10B，CJ374和BL21中检查RSV RT的表达。这些大肠杆菌宿主都不产生αβRT，每种宿主中的RT活性水平都很低。由于M-MLV RT能在大肠杆菌N4830中很好地表达，HIV RT能在大肠杆菌RR1中很好地表达，因此检查RSV RT在这两个宿主中的表达水平。未发现其中任何一个宿主表达活性RT的能力比其它受试的宿主更好，它们也都不能产生任何全长的94KD蛋白质。
将RT表达为融合蛋白。目前已很清楚，不能在大肠杆菌中很好表达的一些蛋白质作为翻泽融合蛋白能较好地表达，其中能很好表达的基因编码的蛋白质形成融合蛋白的氨基末端。一个这种融合配对物，即硫氧还蛋白的基因位于载体pTrxfus(Genetics Institute；Cambridge，MA)中。因此检查了与硫氧还蛋白融合的RSV RT βp4的表达水平。
在杆状病毒系统中表达RSV RT的过程中，将RSV RT基因片段作为SmaI-XhoI片段克隆至pBacPAK9中以构建pBacPak-RT(见下文)。为了制备硫氧还蛋白融合物，用XmaI(与SmaI识别位点相同)和PstI消化pBacPak-RT，在琼脂糖凝胶上纯化RT片段。用XmaI和PstI消化载体pTrxfus，纯化大的载体片段。连接纯化的片段，用连接物转化大肠杆菌CJ374和GI724或GI698(Genetic Institute，MA)。筛选具有正确插入物的克隆。当诱导培养物并检测细胞提取物的酶活性时，未检测到RT活性。然而，经提取物的SDS-PAGE判断，两个经诱导的培养物均产生了大量预期大小的不溶性融合蛋白。也检测到其它融合蛋白。RSV RT β基因与GST(谷胱甘肽S转移酶)基因融合，RSV RT α基因与λCRO蛋白质基因融合。在大肠杆菌菌株DH10B中，任一融合蛋白在trc启动子的控制之下表达都会产生大量不可溶的适当分子量的蛋白质，但在诱导细胞的提取物中几乎检测不到RT活性。构建具有两种融合(GST-β和CRO-α)的表达载体，其中通过诱导trc启动子共表达融合蛋白。在大肠杆菌菌株DH10B中两种融合蛋白的共表达产生了大量适当分子量的不可溶蛋白质，但几乎检测不到RT活性。在杆状病毒系统中分开克隆和表达编码RSV RTα、β和βp4亚单位的基因在杆状病毒系统中克隆RSV RT βp4
为了在杆状病毒转移载体pBacPAK9(Clontech)中克隆RSV RT βp4基因，通过PCR产生RSV RT基因片段。为了便于进行PCR，设计了下列寡核苷酸，其中在RSV βp4基因的开始处具有BamHI位点(黑体)和ATG起始密码子：寡核苷酸#16(SEQ ID NO：22)：5′-TAT TAG GAT CCC  ATG ACT GTT GCG CTA CAT CTG GC-3′
使用pJD100作为模板，用寡核苷酸#12和#16(分别为SEQ ID NO：18和22)进行PCR。用BamHI和XbaI消化PCR产物，再与经BamHI和XbaI消化的pBacPAK9连接。其中一个克隆pBP-RT(PCR)(图43)被用于进一步克隆。为了重建完整的RT基因，用pRE1-RT.15中2500bp的HpaI-XhoI片段取代pBP-RT(PCR)中小的HpaI-XhoI片段，重建的质粒被称为pBP-RT(ATG)(图44)。
将p15克隆至pBacPAK-RT(ATG)中。通过三步克隆法将RSV p15蛋白酶基因置于pBP-RT(ATG)中。首先，将pUC19-p15(见上文)中的p15基因片段作为KpnI-SalI片段亚克隆至pSport1(LTI)中，产生pSport-p15。然后，将pSport-p15中的p15片段作为NotI-SmaI片段亚克隆至杆状病毒转移载体pAcUW43中，产生pAcUW43-p15。进行此克隆的目的是将p15基因置于p10启动子的控制之下。最后，将pAcUW43-p15中包括p10启动子的p15基因作为XhoI-NotI片段亚克隆至pBP-RT(ATG)中，产生pBP-RT15(ATG)(图45)。
在昆虫细胞产表达RSV RT βp4。用pBP-RT15(ATG)和线性化杆状病毒载体DNA(BaculoGold，Pharmingen)的混合物转染昆虫细胞(SF9)。在此系统中，pBP-RT15(ATG)质粒和杆状病毒DNA之间的重组产生了重组病毒基因组，基因组中含有位于多角体蛋白启动子下游的RSV RT βp4基因。通过标准技术从上清液中分离重组病毒，制备病毒原种，选择其中一个供进一步研究。用纯的病毒原种感染昆虫细胞，在感染后不同时间收获感染细胞。在感染细胞中可很容易检测到RT活性。
产生RNA酶H- RSV RT。实施例1中详细描述了在RSV RT βp4基因的RNA酶H区域产生突变的过程。为了在pBP-RT(ATG)中导入突变，用M13RTH-(图13)的HpaI-KpnI片段取代pBP-RT(ATG)中的HpaI-KpnI片段，新构建的质粒被称为pBP-RT(H-)ATG。用pBP-RT(H-)和线性化杆状病毒载体DNA(BaculoGold，Pharmingen)的混合物转染昆虫细胞(SF9)。pBP-RT(H-)质粒和杆状病毒DNA之间的重组产生了重组病毒基因组，其中含有位于多角体蛋白启动子下游的RSV RT βH-p4基因。通过标准技术从上清液中分离重组病毒。用病毒原种感染昆虫细胞，在感染后不同时间收获感染细胞，在感染细胞中可很容易检测到RT活性。
将组氨酸标记物结合于RSV RT βp4上。用BamHI和XbaI裂解pBP-RT(H-)，将具有RSV RT βp4基因氨基末端的0.9kb片段克隆至pFastBacHT的BamHI-XbaI位点，(通过翻译融合)产生氨基末端具有组氨酸标记物的βp4部分构建体(pFBHTβp4)。将pBP-RT(H-)中具有RSVRT βH-p4羧基末端的2kb XbaI-XhoI片段插入pFBHTβp4的XbaI-XhoI位点，产生pFBH-Tβp4。将pFBH-Tβp4转化至大肠杆菌DH10Bac细胞中，组氨酸标记的RSV RT βH-p4基因被转座至杆粒中。分离杆粒DNA，将其转染至SF9感染细胞中。使用由昆虫细胞培养物制备的病毒制品感染SF21细胞，分离并鉴定感染细胞中组氨酸标记的RSV RT βH-p4。
转染昆虫细胞。使用Baculogold病毒(Pharmingen，CA)和pBP-RT(H-)ATG产生重组病毒以转染Sf9细胞。在两个6孔(60mm)组织培养板的10个孔中接种1×106个Sf9细胞(LTI)。于27℃使细胞贴壁30分钟，当细胞贴壁时，取10个小管，各加入200μl Sf-900II SFM培养基(LTI)，在管1中加入500ng Baculogold和2μg pBP-RT(H-)ATG，管2中加入250ng Baculogold和1μg pBP-RT(H-)ATG，管3中加入125ngBaculogold和500ng pBP-RT(H-)ATG。管6至管9中含有36μlLipofectin(LTI)。将管1，管2，管3，管4和管5中的内容物分别转移到管6，7，8，9和10中。在各个管中加入2ml Sf-900 II SFM。除去各个孔中的培养基，将2ml DNA/lipofectin混合物分散到两个孔中，各加1ml。因此，含有管1和6，2和7，和3和8之混合物的孔中含有不同量的DNA混合物；含有管4和9之混合物的孔是含有lipofectin但不含DNA的对照；含有管5和10之混合物的孔是既不含lipofectin也不含DNA的对照。将培养板置于27℃保温4小时，除去培养基，换入4ml新鲜的Sf-900 II SFM，将培养板置于27℃再保温72小时。取出含DNA孔中的噬菌体上清液，标记为原代噬菌体原种。通过用1ml原代噬菌体原种感染1×106个Sf9细胞进行第二次感染，以扩增重组噬菌体。将培养板置于27℃保温48小时，收集噬菌体原种。
注射昆虫幼虫。按文献所述(Medin，J.A等，分子生物学方法39：26(1995))，用携有pBP-RT(H-)ATG的重组病毒注射粉纹夜蛾幼虫并收获幼虫。在杆状病毒系统中表达RSV RT αH-
将pDA(图19)转化至大肠杆菌DH10Bac细胞中，RT αH-基因被转座至杆粒中。纯化杆粒DNA，将其转染至SF21昆虫细胞中。使用由感细胞培养物制备的病毒制品感染SF21细胞，分离并鉴定感染细胞中的RSV RT αH-。在杆状病毒系统中表达RSV RT βH- His
用RsrII和PstI裂解pDABH-His(图21)，将含有βH-His基因的2.6kb片段克隆至pFastBac的RsrII-PstI位点。将pFBBH-His转化至大肠杆菌DH10Bac细胞中，RT βH-His基因被转座至杆粒，纯化杆粒DNA，将其转染至SF21昆虫细胞中。使用由感染细胞培养物制备的病毒制品感染SF21细胞，分离并鉴定感染细胞中的RSV RT βH-His。克隆和表达编码其中聚合酶活性位点突变了的RSV αβ RT的基因
产生聚合酶结构域被突变的RSV RT。将RSV RT肽序列与HIV RT，M-MLV RT的序列和其它RT基因的序列进行排列对比，结果表明RSV RT聚合酶结构域中可能存在一个催化残基D110(第110位的天冬氨酸残基)。根据文献，HIV RT较大链中相应氨基酸由D(天冬氨酸)至E(谷氨酸)的突变会使聚合酶活性几乎完全丧失。通过用M13KO7感染大肠杆菌DH5αF’IQ/pJB-His细胞从pJB-His中分离出单链DNA，用下列寡核苷酸经定点诱变(详细方法见实施例1)突变此DNA：寡核苷酸#17(SEQ ID NO：23)：5′-GCAATCCTTGAGCTCTAAGACCATCAGGG 3′
此寡核苷酸诱导第110位或RSV RT催化结构域中的天冬氨酸突变为谷氨酸(D110E)，并添加了SstI位点(黑体)，形成质粒pJBD110E-His(图48)。通过将pJBD110E-His中460bp的NheI-Eco47III片段插入经NheI-Eco47III裂解的pDA的6.5kb片段中，将此突变位点导入RSV RT α基因，形成pDAD110E(图49)。通过将460bp的NheI-Eco47III片段插入经NheI-Eco47III裂解的pFBBH-His(图46)中，将D110E突变导入β基因，形成pFBBD110E-His(图50)。将pFBBD110E-His中2.6kbRSV RT βD110E基因作为2.6kb的RsrII-EcoRI片段克隆至pDABHis(图51)中替代RSV RT β-His基因，形成pDABD110EHis(图52)。用XhoI+PvuI裂解pDABHis，将4.6kb含β基因的片段与4.9kb pDAD110E XhoI-PvuI片段连接，形成pDAD110EBHis(图53)。将4.6kb含βD110E基因的pDAD110EBHis XhoI-PvuI片段与4.9kb pDAD110E XhoI-PvuI片段连接，形成pDAD110EBD110E(图54)(尽管其名称变短了，但仍具有组氨酸标记物)。用pDAD110EBHis，pDABD110EHis和pDAD110EBD110E转化大肠杆菌DH10B-Bac细胞，RT基因被转座至杆粒中，纯化杆粒DNA，将其转染至SF21昆虫细胞中。使用由感染细胞培养物制备的病毒制品感染SF21细胞，分离并鉴定感染细胞中的RSV RT。
下表概述了3个突变体质粒，其中“w.t.”指的是第110位的野生型氨基酸(D，天冬氨酸)，D110E指的是第110位的突变(D至E，谷氨酸)：质粒                        α                              βpDABHis                     w.t.            w.t.pDABD110EHis                w.t.            D110EpDAD110EBHis                D110E           w.t.pDAD110EB110E               D110E           D110E在酵母中克隆和表达RSV βp4 RT
克隆RSV βp4 RT基因。用EcoRI消化得自InVitrogen(CA)的pHIL-D2载体，用Klenow片段使其成为平端并用碱性磷酸酶处理。用NdeI消化pRE1-RT.15并用Klenow片段使其成为平端。NdeI消化产生了不含p15蛋白酶基因的完整RSV RT基因。连接片段，用连接混合物转化大肠杆菌DH10B，选择有以适当方向插入的插入物的正确克隆。8个受试克隆中有2个具有正确方向的RT基因片段。将其中一个克隆pHILD2-RT用于进一步实验。为了在此质粒中导入RNA酶H-结构域，用BamHI和XhoI消化pHILD2-RT，用pBacPAK-RT(H-)ATG中的BamHI-XhoI片段替代野生型片段。用SstII筛选最终的克隆，将克隆称为pHILD2-RT(H-)。
转化Pichia pastoris。根据InVitrogen推荐的方法，将Pichiapastoris GS115(InVitrogen)用于转化。转化之前，用NotI消化质粒pHILD2-RT和pHILD2RT(H-)，并用苯酚氯仿提取和乙醇沉淀。转化后在再生平板上产生了20个野生型RSV RT克隆和12个RSV H- RT克隆。筛选能在含甲醇的平板上生长的克隆，从最初的20个克隆(野生型RT)中选择两个推定的克隆，其中一个，即H1完全不能在甲醇中生长，另一个，即H2能在甲醇中非常缓慢地生长。对RSV H- RT克隆而言，从筛选的12个克隆中选择3个，其中一个克隆，即H-3能在甲醇中非常缓慢地生长。另两个，即H-4和H-5能在甲醇中中度生长。选择克隆H1和H-3进行表达研究。
Pichia pastoris中的RSV βp4 RT表达。基本上按厂商(InVitrogen)提供的用户手册所述培养和诱导克隆H1和H-3。同时培养和诱导含有β-半乳糖苷酶基因(InVitrogen)的GS115作为对照。在GS115/β-gal细胞中未检测到RT活性，但在H1(野生型RT)和H-3(H-RT)细胞中都可检测到可测水平的活性。另外，活性随诱导时间的增加而增加。分离RSV ββ，α和βp4βp4
分离RSV ββ RT。按实施例2纯化RSV αβ RT的方法纯化RSV ββ RT，不同之处在于：用55-62％缓冲液T从AF-肝素-650M柱，和用58-62％缓冲液J从Mono S HR 5/5柱上洗脱RSV ββ RT。经SDS-PAGE检测，RSV ββ RT为90％均质。
分离RSV α RT。按实施例2纯化RSV αβ RT的方法纯化RSV α RT，不同之处在于：用100％缓冲液A平衡Chelating Sepharose Fast Flow柱，并在澄清的粗提取物流过柱之后用100％缓冲液A洗涤。用10倍柱体积的100％缓冲液A至75％缓冲液A+25％缓冲液B的线性梯度洗脱RSV α RT。收集Chelating Sepharose Fast Flow柱上RT活性的峰级分(10-12％缓冲液B)，在收集物中加入二硫苏糖醇和EDTA以使终浓度分别为1mM和0.1mM，将收集物对95％缓冲液S+5％缓冲液T透析过夜。将经透析的收集物上样于22ml用缓冲液S平衡的AF-肝素-650M柱中，用9倍柱体积的95％缓冲液S+5％缓冲液T洗涤之后，用9倍柱体积的95％缓冲液S+5％缓冲液T至60％缓冲液S+40％缓冲液T的线性梯度洗脱柱，收集RT活性的峰级分(11-20％缓冲液J)，对97.5％缓冲液H和2.5％缓冲液J透析3至4小时。将经透析的收集物上样于3.5ml用100％缓冲液H平衡过的磷酸纤维素柱(Whatman)中，用12倍柱体积的97.5％缓冲液H+2.5％缓冲液J洗涤之后，用14倍柱体积的97.5％缓冲液H+2.5％缓冲液J至60％缓冲液H+40％缓冲液J的线性梯度洗脱柱，收集RT活性的峰级分(12-20％缓冲液J)，对99％缓冲液S+1％缓冲液T透析过夜。将经透析的收集物上样于用缓冲液S平衡过的Mono SHR 5/5柱中，用10倍柱体积的100％缓冲液S洗涤之后，用20倍柱体积的100％缓冲液S至75％缓冲液S+25％缓冲液T的线性梯度洗脱柱，收集RT峰级分(15-17％缓冲液T)，对储存缓冲液透析过夜，储存于-20℃。经SDS-PAGE判断，RSV α RT为80％均质。
分离RSV βp4βp4 RT。按实施例2纯化RSV αβ的方法纯化RSVβp4βp4 RT，不同之处在于：将从Chelating Sepharose Fast Flow柱中收集的RT级分对90％缓冲液H+10％缓冲液J透析过夜。RSV βp4βp4RT在此缓冲液中沉淀。离心回收RT，溶解于含0.5M KCl的储存缓冲液中，储存于-20℃。经SDS-PAGE判断，RSV βp4βp4 RT均质程度在95％以上。估计杆状病毒感染的昆虫细胞α，αβ和ββ RSV RT的量
可以使用实施例2所述的层析方法分离病毒感染的昆虫细胞的粗提取物中存在的任何α，αβ和ββ RSV RT。通过在Chelating SepharoseFast Flow柱上进行层析能将RSV RT α与其它两种类型的酶分开，其中咪唑浓度＜30mM时，α不能结合或被洗脱出来，咪唑浓度＞50mM时，αβ和ββ一起被洗脱出来。这可能利用了β而不是α上存在的His6标记物。随后，通过在肝素-650M上进行层析可将RSV αβ和ββ RT分开(αβ在0.45M KCl中洗脱，ββ在0.58M KCl中洗脱)。通过用poly(C)·oligo(dG)检测定量逆转录酶(Gerard，G.F等，生物化学13：1632(1974))。用poly(C)·oligo(dG)测得RSV RT α，αβ和ββ的比活分别为140,000，90,000和6,000个单位/mg蛋白质。克隆、表达、纯化和使用RSV病毒蛋白酶p15
在大肠杆菌中以连接的二聚体形式克隆和表达RSV病毒蛋白酶，并按文献所述从包函体中纯化该蛋白酶(Bizub，D等，生物化学杂志，266：4951(1991))。
用RSV蛋白酶消化RSV βp4 RT所用的反应混合物(25μl)含有100mMNaPO4(pH6.0至7.0)，1mM 2-巯基乙醇，0.01％(w/v)曲通X-100，2.4MNaCl，5μg RSV βp4 RT和5μg RSV蛋白酶。4℃下保温1至16小时。通过SDS-PAGE分析消化产物，并检测其RT活性的回复。检测RSV RT的RNA酶H活性
通过监测[3H]poly(A)在[3H]poly(A)·poly(dT)中的溶解情况来测定RSV RT的RNA酶H活性。反应混合物(50μl)含有50mMTris-HCl(pH8.4)，20mM KCl，10mM MgCl2，溶于[3H]poly(A)·poly(dT)中的各10μM[3H]poly(A)(300cpm/pmole)和poly(dT)，和10mM二硫苏糖醇。将反应混合物置于37℃保温20分钟，加入80μl 20％(w/v)TCA和10μl 1mg/ml tRNA以终止保温，离心后，通过在含水闪烁液中计数上清液测定溶解的[3H]poly(A)量。一个单位的RNA酶H活性是于37℃，在20分钟内溶解1nmole[3H]poly(A)的酶量。用poly(C)·oligo(dG)12-18检测DNA聚合酶活性
通过监测不溶于酸的[3H]poly(dG)型poly(C)·oligo(dG)的合成，测定RSV RT的RNA依赖性DNA聚合酶活性。反应混合物(50μl)含有50mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM poly(C)，0.2mMoligo(dG)12-18，0.5mM[3H]dGTP(40cpm/pmole)和10mM二硫苏糖醇。将反应混合物置于37℃保温10分钟，将标记产物酸沉淀于GF/C玻璃纤维上，用闪烁计数器计数。一个单位的DNA聚合酶活性是于37℃，在10分钟内掺入1nmole[3H]dGTP的酶量。结果和讨论产生RSV αβ RT的其它方法
实施例1至6阐明了RNA酶H-型禽RT比RNA酶H+型RT能更有效地拷贝mRNA。这些实施例中描述的研究被设计成用于测定RSV RNA酶H- αβ RT拷贝mRNA的效力，所述RT是通过在几个表达系统中共表达RSV α和β基因产生的。
在大肠杆菌中表达。已从大肠杆菌中纯化出少量可溶性的和具有活性的α，ββ，βp4βp4和αβ RSV RT(Alexander，F等，病毒学杂志61：534(1987)；Weis，J.H和Salstrom，J.S，美国专利4,663,290(1987)；Soltis，D.A和Skalka，A.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：3372(1988)；和Cherhov，A.P等，生物医学科学2：49(1991))。然而，这些报道中由大肠杆菌表达的RSV RT大多数为不溶性的。
本实施例中的材料和方法一节记载了在大肠杆菌中表达大量易于纯化的RSV RT蛋白的尝试。一般说来，得到了与文献所述类似的结果；即在大肠杆菌表达的RSV RT蛋白大多数为不溶性的，仅可观察到少量的RT活性。由于RT水平低，故未尝试纯化大肠杆菌中表达的RSV RT。
在培养的昆虫细胞中表达RSV RT βp4或β基因。当HIV p66的克隆基因被表达时，在大肠杆菌和酵母宿主细胞中产生了异二聚体形式的p66/p51 HIV RT(Lowe，D.M等，生物化学27：8884(1988)；Muller，B等，生物化学杂志264：13975(1989)；和Barr，P.J等，生物技术5：486(1987))。通过内源性的宿主蛋白酶酶解加工p66/p66即可形成异二聚体。与之形成对照的是，在培养的昆虫细胞中表达HIV RT p66基因仅产生了p66/p66同二聚体(Kawa，S等，蛋白质的表达和纯化4：298(1993))。
在本发明的研究中，类似地发现在培养的昆虫细胞中表达RSV RTβp4基因时仅产生了βp4/βp4同二聚体(结果未附)；几乎观察不到加工为αβ或α。然而，当在这些细胞中表达RSV RT β基因时，产生了RSV RT所有3种形式(表6)。细胞中存在的RT大多数为ββ(50-80％)；产生了少量αβ(约10％)；甚至还得到了α(10-40％)。这些结果表明培养的昆虫细胞中的内源性宿主蛋白酶水解ββ成为αβ，但不水解βp4βp4。通过蛋白酶水解ββ产生的RSV αβ RT与通过共表达RSV RT α和β基因产生的αβ的功能活性相比低得多(表7)。
表6.被RSV RT β基因感染的昆虫细胞中RSV RT的表达水平
  感染号                每30g昆虫细胞中存在的RT量
    RSV ββ RT     RSV αβ RT      RSV α  RT
    mg      ％     mg       ％      mg      ％
    1     0.7     54     0.1      8      0.5     38
    2     0.12    79     0.017    11      0.015   10
    3     0.55    83     0.05     8      0.06    9
在昆虫幼虫中表达RSV RT βp4。通过体内注射病毒，用携有RSV RTβp4基因的杆状病毒感染活的幼虫。幼虫和幼虫提取物中存在的蛋白酶水平比培养的昆虫细胞中的高很多。观察到βp4被加工成多种形式的蛋白酶解RT，包括加工为α。可从这些提取物中纯化的RT的主要种类在SDS-PAGE上迁移后显示出4条主要的带，即97KDa(组氨酸标记的β)，87KDa(蛋白酶解的β)，67KDa(部分加工的组氨酸标记的α)和62KDa(通过蛋白酶解除去了组氨酸标记物的α)。此RSV RT的比活为55,000个单位/mg蛋白质，和RSV αβ RT的差不多。然而，在功能活性检测中(实施例3)，从幼虫中纯化的RT具有的总产物和全长产物功能活性分别为由共表达α和β产生的RSV αβ RT的85％和60％(表7)。表7.昆虫细胞表达的多种形式RSV RT的比活和功能活性
表达的基因                                                                   分离的RT形式
            RSV αβ RT RSV ββ RT  RSV α RT RSV βp4βp4 RT
比活a(U/mg) 功能活性b 比活(U/mg) 功能活性 比活(U/mg) 功能活性 比活(U/mg) 功能活性
总产物(ng/μg)c 全长产物(ng/μg)d 总产物(ng/μg) 全长产物(ng/μg) 总产物(ng/μgg) 全长产物(ng/μg) 总产物(ng/μg) 全长产物(ng/μg)
α和β 53,191 4,092 874 NPc NP NP NDf ND ND NP NP NP
β 25,113 1,098 116 15,819 584 41 ND ND ND NP NP NP
βp4 NP NP NP NP NP NP NP NP NP 15,984 450 67
α NP NP NP NP NP NP 48,759 272 6 NP NP NP
a比活＝poly(A)·oligo(dT)试验中RT活性单位(U)数/mg RT蛋白质(Houts等，病毒学杂志29：517(1979))。b如实施例3中所述用7.5Kb RNA确定的功能活性。c总的逆转录产物量，使用每μg RT产生的产物ng数。d全长逆转录产物量，使用每μg RT产生的产物ng数。e“NP”＝表达所示基因的昆虫细胞不产生的RT形式。f“ND”＝由昆虫细胞产生的RT形式，但在本发明的研究中未分析。
在培养的昆虫细胞中共表达RSV RT βp4和RSV蛋白酶p15。通过在大肠杆菌中共表达HIV蛋白酶和HIV RT p66能有效产生了异二聚体p66/p51 HIV RT(Mizuahi，V等，Arch.Biochem Biophys.273：347(1989)和Le Grice，S.F.J和Gruninger-Leitch，F，欧洲生物化学杂志，187：307(1990))。共表达病毒蛋白酶使p66/p66转变为异二聚体的效力全面增加。如本文实施例材料和方法一节中所述，在大肠杆菌中共表达RSV RT β和RSV蛋白酶p15基因不会使RSV αβ RT的产量增加。类似地，在培养的昆虫细胞中共表达RSV RT βp4和RSV蛋白酶p15也不会可测地增加RSV αβ RT的产量。
在体外用RSV蛋白酶p15加工RSV RT βp4。通过在体外用HIV蛋白酶处理，由纯化自大肠杆菌的p66产生异二聚体形式的p66/p51 HIVRT(Chattopodhyay，D等，生物化学杂志267：14227(1992))。用RSV蛋白酶p15处理纯化的RSV RT βp4以产生RSV αβ RT。根据SDS-PAGE分析，此方法已由βp4成功产生了一些αβ，但也遇到几个困难。首先，与用病毒蛋白酶处理HIV p66 RT所观察到的结果相反，由βp4至αβ的加工不会总停止在αβ阶段，因为蛋白酶解进行的过程中形成了比β过量的α。第二，在蛋白酶解的过程中观察到DNA聚合酶活性的显著损失，这表明RSV蛋白酶所需的酸性pH反应条件使RSV RT部分失活。
在体外用胰凝乳蛋白酶加工RSV RT βp4。通过用α胰凝乳蛋白酶进行限制性蛋白酶解，由p66也产生了异二聚体形式的p66/p51 HIVRT(Lowe，D.M等，生物化学27：8884(1988))。此方法未能成功用于RSV RT βp4，我们发现用α胰凝乳蛋白酶消化βp4难以控制，并观察到蛋白酶解不会停止在αβ阶段，而会继续将βp4转变为α。
在体外混合RSV RT α和β以产生αβ。通过将仅含有p51和仅含有p66的分开的粗细胞裂解物混合可产生异二聚体形式的p66/p51 HIVRT(Stahlhut，M等，蛋白质表达和纯化5：614(1994))。混合分开的亚单位形成了摩尔比为1∶1的p66/p51复合物。与之形成对照的是，将纯化的RSV α RT与纯化的RSV β RT按1∶1摩尔比混合时不会形成αβ复合物。这些结果与RSV亚单位一旦独自折叠成活性构象后，再混合时则优选保持分开状态这一假设一致。多种RSV RT形式拷贝RNA的相对能力
比较4种不同形式的RSV RT(αβ，ββ，α和βp4βp4)拷贝RNA的能力。突变这些酶中各个亚单位的RNA酶H活性位点以消除RNA酶H活性。通过上述方法和实施例1中所述的方法在培养的昆虫细胞中表达各种RT并纯化之。利用两种RNA作比较：合成的同聚物poly(A)和7.5KbmRNA。以poly(A)·oligo(dT)为模板-引物，通过测定以有限浓度的酶催化的poly(dT)合成初速度，然后根据反应中RT的量(mg)使速度标准化，从而计算出比活。该比活仅显示了给定RT用人工模板掺入单个脱氧核苷酸的能力，而不必显示酶拷贝异聚体RNA的能力。以7.5Kb RNA作为模板，评估RT制备长的异聚体RNA的全长拷贝的能力(详见实施例3)，结果示于上表7。
表7中鉴定了两种不同形式的αβ，一种形式是在宿主昆虫细胞中表达RSV RT β基因，随后进行蛋白酶解加工产生的，它的比活和功能活性降低，另一种αβ形式是通过共表达RSV RT α和β基因产生的。这一αβ形式具有与α类似的比活，约50,000个单位/mg，其比活比ββ或βp4βp4(约16,000个单位/mg)的高。αβ形式与其它RT形式之间功能活性的比较显示出更加显著的反差。与ββ、βp4βp4和α相比，RSV αβ RT每个单位酶由7.5Kb RNA产生的总cDNA分别增加7，9和15倍。当评估全长产物的产量时，甚至观察到更大的差别：与ββ、βp4βp4和α相比，RSV αβ RT每个单位酶产生的全长产物分别增加21，13和146倍。因此，通过共表达RSV RT α H-和βH-基因产生的RSV αβ RT比通过类似方法制备的任何其它RSV RT形式能更有效地拷贝mRNA。RSV αβ RT中只有α亚单位具有活性的证据
对HIV RT异二聚体形式的p66/p51进行选择性DNA聚合酶活性位点诱变，结果表明只有p66的DNA聚合酶活性位点对其DNA聚合酶活性是必不可少的(LeGrice，S.F.J等，EMBO J 10：3905(1991)和Hostomsky，Z等，病毒学杂志66：3179(1992))。HIV p66/p51异二聚体中的p51亚单位显然采取一种不具有底物结合裂口、因此不直接参与dNTP结合和掺入的构象(Jacob-Molina，A等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：6320(1993))。
在本发明的研究中，针对RSV αβ RT提出了相同的问题。此时，由于各个亚单位均含有DNA聚合酶和RNA酶H活性位点，因此鉴定了DNA聚合酶单突变体和RNA酶H单突变体的联合，结果示于表8。表8.多种形式RSV RT的DNA聚合酶和RNA酶H活性
RSV RT形式       比活(单位/mg)   DNA聚合酶/RNA酶H的比例
    DNA聚合     RNA酶H
αH+/βH+     52,095     924      56.4
αH-/βH-     53,191     ＜0.1      -
αH+/βH-     48,250     760      64.5
αH-/βH+     50,909     4.5      11,313
βH-/βH-     15,819     ＜0.1      -
αH-     48,759     ＜0.1      -
αpol+/βpol+     52,095     924      56.4
αpol-/βpol-     50     600      0.08
αpol+/βpol-     57,500     900      63.9
αpol-/βpol+     1,143     629      1.82
如表8所示，当两个亚单位中的RNA酶H活性位点都被突变以消除RNA酶H活性时，纯酶中的RNA酶H活性降低到可测水平之下，而DNA聚合酶活性未变。当用相同的突变改变β中的RNA酶H活性位点而α RNA酶H活性位点为野生型时，酶的聚合酶和RNA酶H活性类似于野生型。与之形成对照的是，α亚单位而不是β亚单位的RNA酶H发生突变时，会使RNA酶H活性降低200倍。因此，对RSV αβ RT而言，大亚单位(β)的RNA酶H结构域折叠为无活性的构象。对RSV αβ RT中DNA聚合酶活性位点突变体的检查揭示出相同结果(表8)。α亚单位而不是β亚单位提供了DNA聚合酶催化活性，因此，与HIV p66/p51 RT相反，较小的RSV αβ RT亚单位，而不是较大的亚单位维持酶活性。两种酶共同之处是具有DNA聚合酶和RNA酶H结构域的亚单位折叠成活性构象，而缺乏RNA酶H结构域或具有其它结构域(整合酶)的亚单位折叠为无活性的构象。
总之，这些结果表明只有αβ型ASLV RT能有效拷贝mRNA。另外，本文的结果表明在大肠杆菌中表达ASLV RT很少或不产生有活性的RT，而通过在昆虫细胞和酵母中克隆和表达ASLV RT能显著增加表达和活性。最后，通过在RSV αβ RT α或β亚单位的DNA聚合酶或RNA酶H活性位点导入点突变，发现RSV RT αβ异二聚体的DNA聚合酶和RNA酶H催化活性仅存在于α亚单位中。
为了清楚地理解本发明，通过附图和实施例详细完整地描述了本发明，在不影响本发明范围或其任何具体的实施方案的前提下、在条件，配比和其它参数宽的和等价的范围内修饰或改变本发明，也可达到本发明的目的，这一点对于本领域技术人员而言是显而易见的，这样的修饰或改变意欲包括在所附权利要求书的范围之内。
说明书中提及的所有文献、专利和专利申请显示出本发明所涉及领域中技术人员的水平，将它们以相同的程度列入本文作为参考，就象各篇文献、专利或专利申请被特别地，单独地列出作为本文参考文献一样。
                       序列表1)一般资料：(i)申请人：
(A)姓名：Life Technologies公司
(B)街道：9800 Medical Center Drive
(C)城市：Rockville
(D)州：Maryland
(E)国家：美国
(F)邮政编码：20850(ii)发明题目：逆转录核酸分子的组合物和方法(iii)序列数：23(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)目前的申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：(vi)优选权申请资料：
(A)申请号：US 60/049,874
(B)申请日：17-JUN-1997(vi)优选权申请资料：
(A)申请号：US 60/044,589
(B)申请日：22-APR-1997(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AGGAGACCCA TATGACTGTT GCGCTACATC TGGCT                       35(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AACGCGACAG GTTAACAGCG CGCAAATCAT GCAG                        34(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CACACACAGG TACCCTCTCG AAAAGTTAAA CC                          32(2)SEQ ID NO：4的资料：  (i)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：CACACACACT CGAGTTATGC AAAAAGAGGG CTCGCCTCAT C               41(2)SEQ ID NO：5的资料：(i)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GGACCCACTG TCTTTACCGC GGCCTCCTCA AGCACC                     36(2)SEQ ID NO：6的资料：(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CACACACACC CGGGTTAATA CGCTTGGAAG GTGGC                      35(2)SEQ ID NO：7的资料：  (i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CACACACATC ATGACTGTTG CGCTACATCT G                           31(2)SEQ ID NO：8的资料：(i)序列特征：
(A)长度：29个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CACACACAGG TACCCTCTCG AAAAGTTAA                              29(2)SEQ ID NO：9的资料：(i)序列特征：
(A)长度：48个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CACACACAGA GGAATTCAGT GATGGTGATG GTGATGTGCA AAAAGAGG         48(2)SEQ ID NO：10的资料：  (i)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：ACTGGAATTC ATGCCAATCC ATCACCATCA CCATCACCCG T                        41(2)SEQ ID NO：11的资料：(i)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：ACGTGTCGAC CATATGGATG ACTAGGTGAA ACGGGTGATG G                        41(2)SEQ ID NO：12的资料：(i)序列特征：
(A)长度：71个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：ACTGGAATTC ATGCCAATCC ATCACCATCA CCATCACCCG TTTCACCTAG TCATCCATAT    60GGTCGACACG T                                                         71(2)SEQ ID NO：13的资料：(i)序列特征：
(A)长度：48个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GACTAGTTCT AGATCGCGAG CGGCCGCCCA TTAACTCTCG TTGGCAGC       48(2)SEQ ID NO：14的资料：(i)序列特征：
(A)长度：16个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：TCGACCCACG CGTCCG                                          16(2)SEQ ID NO：15的资料：(i)序列特征：
(A)长度：12个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CGGACGCGTG  GG                                             12(2)SEQ ID NO：16的资料：(i)序列特征：
(A)长度：42个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：AUGGAGAUCU CUGAATTCAT GACTGTTGCG CTACATCTGG CT             42(2)SEQ ID NO：17的资料：(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：ATTATTCATA TGACTGTTGC GCTACATCTG GC                        32(2)SEQ ID NO：18的资料：(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TACGATCTCT CTCCAGGCCA TTTT                                 24(2)SEQ ID NO：19的资料：(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：ACTCGAGCAG CCCGGGAACC TTTG                                 24(2)SEQ ID NO：20的资料：(i)序列特征：
(A)长度：48个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：ATTACCCGGG AGGATATCAT ATGTTAGCGA TGACAATGGA ACATAAAG       48(2)SEQ ID NO：21的资料：(i)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA  (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：ATATGTCGAC TCACAGTGGC CCTCCCTATA AATTTG                    36(2)SEQ ID NO：22的资料：(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：TATTAGGATC CCATGACTGT TGCGCTACAT CTGGC                     35(2)SEQ ID NO：23的资料：(i)序列特征：
(A)长度：29个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：两种
(D)拓扑结构：两种(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：GCAATCCTTG AGCTCTAAGA CCATCAGGG                            29

Claims (115)

1.用于逆转录核酸分子的组合物，所述组合物含有两种或多种具有逆转录酶活性的多肽。
2.权利要求1的组合物，其中所述多肽得自不同的来源。
3.权利要求1的组合物，其中各个所述多肽的转录停顿位点与所述组合物中各个其它多肽的转录停顿位点不同。
4.权利要求1的组合物，其中所述多肽的RNA酶H活性降低或大大降低。
5.权利要求4的组合物，其中所述多肽选自M-MLV H-逆转录酶，RSV H-逆转录酶，AMV H-逆转录酶，RAV H-逆转录酶，MAV H-逆转录酶，和HIV H-逆转录酶，及其衍生物、变体、片段或突变体。
6.权利要求5的组合物，其中所述AMV H-逆转录酶选自AMV αH-/βH-逆转录酶，AMV αH-/βH+逆转录酶，AMV βH-/βH-逆转录酶，AMV βH+/βH-逆转录酶，AMV βp4/βp4逆转录酶和AMV αH-逆转录酶，及其衍生物、变体、片段或突变体。
7.权利要求5的组合物，其中所述RSV H-逆转录酶选自RSV αH-/βH-逆转录酶，RSV αH-/βH+逆转录酶，RSV βH-/βH-逆转录酶，RSV βH+/βH-逆转录酶，RSV βp4/βp4逆转录酶和RSV αH-逆转录酶，及其衍生物、变体、片段或突变体。
8.权利要求1的组合物，其中所述多肽选自Taq，Tne，Tma，Pfu，VENTTM，DEEPVENTTM，Tth DNA聚合酶，及其突变体、片段、变体和衍生物。
9.权利要求1的组合物，其中所述多肽以工作浓度存在于所述组合物中。
10.逆转录一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括
(a)将一种或多种核酸模板与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽混合；和
(b)在足以制备与所述一种或多种模板之全部或部分互补的一种或多种第一核酸分子的条件下保温所述混合物。
11.权利要求10的方法，其中所述核酸模板是信使RNA分子或mRNA分子群体。
12.权利要求10的方法，所述方法还包括在足以制备与所述一种或多种第一核酸分子之全部或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下，保温所述一种或多种第一核酸分子。
13.根据权利要求10的方法制备的cDNA分子。
14.根据权利要求12的方法制备的cDNA分子。
15.扩增一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括
(a)将一种或多种核酸模板与两种或多种具有逆转录酶活性的多肽和一种或多种DNA聚合酶混合；和
(b)在足以扩增与所述一种或多种核酸模板之全部或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下保温所述混合物。
16.扩增一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括
(a)将一种或多种核酸模板与两种或多种具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的多肽混合；和
(b)在足以扩增与所述一种或多种核酸模板之全部或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下保温所述混合物。
17.根据权利要求15或权利要求16的方法扩增的核酸分子。
18.含有权利要求14之cDNA分子的载体。
19.权利要求18的载体，其中所述载体是表达载体。
20.含有权利要求14之cDNA分子的宿主细胞。
21.对一种或多种核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：
(a)将一种或多种待测序的核酸分子与一个或多个引物、两种或多种具有逆转录酶活性的多肽、一种或多种核苷酸和一种或多种终止试剂混合；
(b)在足以合成与所述一种或多种待测序之分子的全部或部分互补的分子群体的条件下保温混合物；和
(c)分离所述群体以测定所述一种或多种待测序之分子的全部或部分核苷酸序列。
22.用于逆转录、扩增或测序核酸分子的试剂盒，所述试剂盒含有两种或多种具有逆转录酶活性的多肽。
23.权利要求22的试剂盒，所述试剂盒还含有一种或多种选自下列的组分：一种或多种核苷酸，一种或多种DNA聚合酶，适当的缓冲液，一个或多个引物和一种或多种终止试剂。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述终止试剂是双脱氧核苷酸。
25.权利要求23的试剂盒，其中所述试剂盒中两种或多种组分以混合物的形式存在或以独立的组分存在。
26.产生ASLV逆转录酶的方法，所述方法包括：
(a)得到含有编码ASLV逆转录酶一个或多个亚单位的一种或多种核酸序列的宿主细胞；和
(b)在足以产生所述ASLV逆转录酶亚单位的条件下培养所述宿主细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述编码ASLV逆转录酶一个或多个亚单位的一种或多种核酸序列包含在一个或多个载体中。
28.权利要求26的方法，其中所述ASLV逆转录酶亚单位选自一种或多种ASLV逆转录酶的一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位和一个或多个βp4亚单位，及其衍生物、变体、片段或突变体。
29.权利要求26的方法，其中所述亚单位是一个或多个α亚单位。
30.权利要求26的方法，其中所述亚单位是一个或多个β亚单位。
31.权利要求26的方法，其中所述亚单位是一个或多个βp4亚单位。
32.权利要求26的方法，其中所述亚单位是一种或多种ASLV逆转录酶的一个α亚单位和一个β亚单位。
33.权利要求26的方法，其中所述亚单位被共表达以形成ASLV逆转录酶，并且从所述宿主细胞分离所述ASLV逆转录酶。
34.权利要求26的方法，其中对所述ASLV逆转录酶亚单位进行分离并混合以形成ASLV逆转录酶。
35.权利要求30的方法，其中所述β亚单位形成含有两个β亚单位的ASLV逆转录酶。
36.权利要求32的方法，其中所述α和β亚单位形成含有α和β亚单位的ASLV逆转录酶。
37.权利要求26的方法，其中一个或多个所述亚单位经修饰后降低或大大降低了所述亚单位的RNA酶H活性。
38.权利要求26的方法，其中所述亚单位由相同或不同载体中所含的一种或多种核苷酸序列编码。
39.权利要求26的方法，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
40.权利要求26的方法，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
41.根据权利要求26的方法产生的ASLV逆转录酶。
42.权利要求41的ASLV逆转录酶，其中所述ASLV逆转录酶选自ASLV αβ逆转录酶，ASLV ββ逆转录酶，ASLV βp4βp4逆转录酶和ASLV α逆转录酶。
43.权利要求41的ASLV逆转录酶，其中所述ASLV逆转录酶的RNA酶H活性有所降低或大大降低。
44.权利要求41的ASLV逆转录酶，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
45.权利要求41的ASLV逆转录酶，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
46.一种分离的核酸分子，所述分子含有编码ASLV逆转录酶一个或多个亚单位的核苷酸序列。
47.权利要求46的核酸分子，其中所述分子编码ASLV逆转录酶的一个或多个α亚单位，或其衍生物、变体、片段或突变体。
48.权利要求46的核酸分子，其中所述分子编码ASLV逆转录酶的一个或多个β亚单位，或其衍生物、片段或突变体。
49.权利要求46的核酸分子，其中所述分子编码ASLV逆转录酶的一个或多个βp4亚单位，或其衍生物、片段或突变体。
50.权利要求46的核酸分子，其中所述分子编码ASLV逆转录酶的α和β亚单位，或其衍生物、片段或突变体。
51.含有权利要求46之核酸分子的载体。
52.含有权利要求46之核酸分子的宿主细胞。
53.权利要求51的载体，其中所述载体是质粒pDABH-His。
54.权利要求52的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌DH10B(pDABH-His)。
55.权利要求46的分离的核酸分子，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
56.权利要求46的分离的核酸分子，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
57.通过逆转录一种或多种核酸模板产生一种或多种cDNA分子的方法，所述方法包括：
(a)将一种或多种核酸模板与含有一个或多个亚单位的ASLV RT混合；和
(b)在足以制备与所述一种或多种模板之全部或部分互补的一种或多种第一核酸分子的条件下保温所述混合物。
58.权利要求57的方法，其中所述亚单位是一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位和一个或多个βp4亚单位或其组合。
59.权利要求57的方法，其中所述ASLV逆转录酶选自ASLV αβ逆转录酶，ASLV ββ逆转录酶，ASLV βp4βp4逆转录酶和ASLV α逆转录酶。
60.权利要求57的方法，其中所述核酸模板是mRNA分子或mRNA分子群体。
61.权利要求57的方法，其中所述方法还包括在足以制备与所述一种或多种第一核酸分子之全部或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下，保温所述一种或多种第一核酸分子。
62.权利要求61的方法，其中所述第一和第二核酸分子形成双链DNA分子。
63.权利要求62的方法，其中所述双链DNA分子是全长的cDNA分子。
64.根据权利要求57的方法制备的cDNA分子。
65.根据权利要求61的方法制备的cDNA分子。
66.含有权利要求65的cDNA分子的载体。
67.权利要求66的载体，其中所述载体是表达载体。
68.含有权利要求65的cDNA分子的宿主细胞。
69.权利要求61的方法，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
70.权利要求61的方法，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
71.扩增一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括
(a)将一种或多种核酸模板与一种或多种含有一个或多个亚单位的ASLV RT和任选与一种或多种DNA聚合酶混合；和
(b)在足以扩增与所述一种或多种模板之全部或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下保温所述混合物。
72.权利要求71的方法，其中所述亚单位是一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位，一个或多个βp4亚单位或其组合。
73.权利要求71的方法，其中所述ASLV逆转录酶选自ASLV αβ逆转录酶，ASLV ββ逆转录酶，ASLV βp4βp4逆转录酶和ASLV α逆转录酶。
74.权利要求71的方法，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
75.权利要求71的方法，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
76.对一种或多种核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：
(a)将一种或多种待测序的核酸分子与一个或多个引物、含有一个或多个亚单位的ASLV RT、一种或多种核苷酸和一种或多种终止试剂混合；
(b)在足以合成与所述一种或多种待测序之核酸分子的全部或部分互补的核酸分子群体的条件下保温所述混合物；和
(c)分离所述核酸分子群体以测定所述一种或多种待测序之核酸分子的全部或部分核苷酸序列。
77.权利要求76的方法，其中所述亚单位是一个或多个α亚单位，一个或多个β亚单位，一个或多个βp4亚单位或其组合。
78.权利要求76的方法，其中所述ASLV逆转录酶选自ASLV αβ逆转录酶，ASLV ββ逆转录酶，ASLV βp4βp4逆转录酶和ASLV α逆转录酶。
79.权利要求76的方法，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
80.权利要求76的方法，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
81.一种试剂盒，其中含有一个或多个ASLV RT亚单位，或其一种或多种衍生物、变体、片段或突变体。
82.权利要求81的试剂盒，其中所述ASLV RT亚单位是一个或多个ASLV RT α亚单位，一个或多个ASLV RT β亚单位，一个或多个ASLVRT βp4亚单位或其组合。
83.权利要求81的试剂盒，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
84.权利要求81的试剂盒，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
85.含有ASLV RT的试剂盒，其中所述ASLV RT选自ASLV αβ RT，ASLV ββ RT，ASLV βp4βp4 RT和ASLV α RT，或者其衍生物、片段或突变体。
86.权利要求85的试剂盒，其中所述ASLV RT含有α和β亚单位。
87.权利要求85的试剂盒，其中所述ASLV逆转录酶是RSV逆转录酶。
88.权利要求85的试剂盒，其中所述ASLV逆转录酶是AMV逆转录酶。
89.通过逆转录一种或多种核酸模板产生一种或多种cDNA分子的方法，所述方法包括：
(a)将一种或多种核酸模板与一种或多种具有逆转录酶活性的多肽混合；和
(b)在约50℃或更高的温度下，在足以制备与所述一种或多种模板之全部或部分互补的一种或多种第一核酸分子的条件下保温所述混合物。
90.权利要求89的方法，其中所述温度是60℃或更高。
91.权利要求89的方法，其中所述温度范围是约50℃至约70℃。
92.权利要求89的方法，其中所述温度范围是约55℃至约65℃。
93.权利要求89的方法，其中所述核酸模板是RNA或DNA分子。
94.权利要求93的方法，其中所述RNA分子是mRNA分子或poly(A)+RNA分子。
95.权利要求89的方法，其中所述核酸模板是mRNA分子群体。
96.权利要求94的方法，其中所述第一核酸分子是全长cDNA分子。
97.权利要求89的方法，其中所述方法还包括在足以制备与所述一种或多种第一核酸分子之全部或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下，保温所述一种或多种第一核酸分子。
98.权利要求97的方法，其中所述第一和第二核酸分子是DNA分子。
99.权利要求98的方法，其中所述第一和第二DNA分子形成双链DNA分子。
100.权利要求99的方法，其中所述双链DNA分子是全长的cDNA分子。
101.权利要求89的方法，其中所述一种或多种具有逆转录酶活性的多肽的RNA酶H活性有所降低或大大降低。
102.权利要求89的方法，其中所述一种或多种具有逆转录酶活性的多肽是含有一个或多个亚单位的一种或多种ASLV逆转录酶。
103.权利要求102的方法，其中所述一种或多种ASLV逆转录酶是一种或多种RSV逆转录酶。
104.权利要求102的方法，其中所述一种或多种ASLV逆转录酶是一种或多种AMV逆转录酶。
105.权利要求102的方法，其中所述ASLV RT亚单位是一个或多个ASLV RT α亚单位，一个或多个ASLV RT β亚单位，一个或多个ASLVRT βp4亚单位或其组合。
106.权利要求102的方法，其中所述ASLV RT选自ASLV αβ RT，ASLV ββ逆转录酶，ASLV βp4βp4 RT和ASLVαRT，及其衍生物、变体、片段或突变体。
107.权利要求102的方法，其中所述ASLV RT是ASLV αβ RT或者其衍生物、变体、片段或突变体。
108.权利要求102的方法，其中所述一个或多个亚单位的RNA酶H活性有所降低或大大降低。
109.根据权利要求89的方法产生的核酸分子。
110.根据权利要求97的方法产生的核酸分子。
111.权利要求110的核酸分子，其中所述核酸分子是全长的cDNA分子。
112.含有权利要求110的核酸分子的载体。
113.权利要求112的载体，其中所述载体是表达载体。
114.含有权利要求109的核酸分子的宿主细胞。
115.含有权利要求110的核酸分子的宿主细胞。
CN98806006XA 1997-04-22 1998-04-22 产生由多个亚单位组成的aslv逆转录酶的方法 Expired - Lifetime CN1259957B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4458997P 1997-04-22 1997-04-22
US60/044,589 1997-04-22
US4987497P 1997-06-17 1997-06-17
US60/049,874 1997-06-17
PCT/US1998/008072 WO1998047912A1 (en) 1997-04-22 1998-04-22 Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1259957A true CN1259957A (zh) 2000-07-12
CN1259957B CN1259957B (zh) 2012-08-22

Family

ID=26721734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN98806006XA Expired - Lifetime CN1259957B (zh) 1997-04-22 1998-04-22 产生由多个亚单位组成的aslv逆转录酶的方法

Country Status (9)

Country Link
US (7) US6989259B2 (zh)
EP (3) EP2184289A1 (zh)
JP (1) JP2001523098A (zh)
CN (1) CN1259957B (zh)
AT (1) ATE445630T1 (zh)
AU (1) AU7360198A (zh)
CA (1) CA2287542A1 (zh)
DE (1) DE69841241D1 (zh)
WO (1) WO1998047912A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1308690C (zh) * 2000-07-25 2007-04-04 宝洁公司 多肽测序的新方法和试剂盒
CN100537756C (zh) * 2004-01-13 2009-09-09 中国科学院生物物理研究所 重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法
CN104072561B (zh) * 2007-06-19 2017-12-22 路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会 信使rna帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途
WO2020132966A1 (zh) * 2018-12-26 2020-07-02 深圳华大生命科学研究院 酶活性提高的逆转录酶及其应用

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5244797B1 (en) * 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
US5861295A (en) 1997-01-02 1999-01-19 Life Technologies, Inc. Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof
ES2355739T3 (es) * 1997-04-03 2011-03-30 Life Technologies Corporation Composiciones y métodos para la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (rt-pcr).
WO1998047912A1 (en) 1997-04-22 1998-10-29 Life Technologies, Inc. Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
US20040185493A1 (en) * 1997-05-12 2004-09-23 Invitrogen Corporation Methods for production and purification of nucleic acid molecules
JP4854853B2 (ja) 1998-11-12 2012-01-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション トランスフェクション薬剤
EP2119788A1 (en) 1999-03-02 2009-11-18 Life Technologies Corporation Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids
US6630333B1 (en) * 1999-03-23 2003-10-07 Invitrogen Corporation Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof
NZ515673A (en) * 1999-05-21 2004-03-26 Invitrogen Corp Compositions and methods for labeling of nucleic acid molecules
NZ530816A (en) 1999-12-10 2005-10-28 Invitrogen Corp Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
EP1266024A4 (en) 2000-03-15 2003-07-30 Invitrogen Corp HIGH FIDELITY INVERTED TRANSCRIPTASES AND USES THEREOF
US7078208B2 (en) * 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US9771565B2 (en) 2000-05-26 2017-09-26 Life Technologies Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
JP2004511211A (ja) * 2000-05-26 2004-04-15 インヴィトロジェン　コーポレーション 耐熱性逆転写酵素およびその使用
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
DE10046960A1 (de) * 2000-09-22 2002-04-11 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung einer aktiven, heterodimeren AMW-RT in prokaryotischen Zellen
AU2002227153B2 (en) 2000-12-08 2008-01-24 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20030021799A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-30 Wilkinson Jonathan Frome Reverse transcriptase formulations
CA2460546A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-27 Invitrogen Corporation Dna polymerases and mutants thereof
US20040152072A1 (en) * 2002-07-30 2004-08-05 Invitrogen Corporation Reverse transcription
EP2325303B1 (en) 2002-09-13 2013-11-06 Life Technologies Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US7141398B2 (en) * 2002-12-30 2006-11-28 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for recycling mRNA for linear cRNA amplification
US20040157213A1 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Kennell John C. Fungal reverse transcriptases with enhanced capabilities
US20040259115A1 (en) * 2003-01-29 2004-12-23 Schuster David M. Methods and compositions for RNA detection and quantitation
US20040265870A1 (en) * 2003-04-09 2004-12-30 Invitrogen Corporation Methods of synthesizing and labeling nucleic acid molecules
US7727752B2 (en) * 2003-07-29 2010-06-01 Life Technologies Corporation Kinase and phosphatase assays
US7619059B2 (en) * 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
CA2445420A1 (en) * 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
DE602004025592D1 (de) * 2003-09-12 2010-04-01 Life Technologies Corp Anwendungen des Resonanzenergietransfers zwischen Terbium und GFP
EP2287341B1 (en) 2003-12-01 2013-02-13 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US7566532B1 (en) 2004-07-02 2009-07-28 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting retroviruses
US9505846B2 (en) 2005-01-28 2016-11-29 Life Technologies Corporation Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases
US20060234360A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Paola Branduardi Ascorbic acid production from D-glucose in yeast
WO2007002655A2 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Sands Alexander P System & method for concurrently downloading digital content & recording to removable media
GB0806562D0 (en) 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid
EP2208785A1 (en) 2009-01-15 2010-07-21 Newbiotechnic, S.A. Methods and kits to generate miRNA- and smallRNA-expressing vectors, and its application to develop lentiviral expression libraries
DK2582839T3 (en) 2010-06-21 2016-08-29 Life Technologies Corp Compositions, methods and kits for nucleic acid synthesis and amplification by RT
EP2582850B1 (en) 2010-06-21 2016-11-09 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids
KR101818126B1 (ko) 2011-02-09 2018-01-15 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
EP3081937B1 (en) 2011-07-18 2019-11-13 President and Fellows of Harvard College Engineered microbe-targeting molecules and uses thereof
JP2013126402A (ja) * 2011-12-19 2013-06-27 Tosoh Corp 逆転写酵素の製造方法
JP2013165669A (ja) * 2012-02-15 2013-08-29 Kyoto Univ 変異型逆転写酵素
AU2013225823A1 (en) 2012-02-29 2014-09-18 President And Fellows Of Harvard College Rapid antibiotic susceptibility testing
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
EP3260558B1 (en) 2012-11-02 2020-05-13 Life Technologies Corporation Novel compositions and methods for enhancing pcr specificity
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
EP3097190A2 (en) 2014-01-22 2016-11-30 Life Technologies Corporation Novel reverse transcriptases for use in high temperature nucleic acid synthesis
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
CN107429296B (zh) 2015-03-13 2022-01-28 生命技术公司 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒
WO2017100177A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Dimeric reverse transcriptase
KR20160045656A (ko) 2016-04-11 2016-04-27 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
KR20170016422A (ko) 2017-02-03 2017-02-13 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
WO2019118978A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for the amplification of mrna
WO2022265965A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
WO2023114473A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Recombinant reverse transcriptase variants for improved performance

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US198944A (en) * 1878-01-08 Improvement in apparatus for refining raw sugars
US90618A (en) * 1869-05-25 Improvement in pruning-imflement
US60618A (en) * 1866-12-18 Improvement in potato digger
US28447A (en) * 1860-05-29 Improvement in machines for picking curled hair
US32086A (en) * 1861-04-16 Wagon-lock
US4663290A (en) 1982-01-21 1987-05-05 Molecular Genetics, Inc. Production of reverse transcriptase
US4748233A (en) 1982-03-23 1988-05-31 Bristol-Myers Company Alpha-interferon Gx-1
WO1987000196A1 (en) 1985-07-09 1987-01-15 Quadrant Bioresources Limited Protection of proteins and the like
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5407800A (en) 1986-08-22 1995-04-18 Hoffmann-La Roche Inc. Reverse transcription with Thermus thermophilus polymerase
US5618711A (en) 1986-08-22 1997-04-08 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant expression vectors and purification methods for Thermus thermophilus DNA polymerase
US5561058A (en) 1986-08-22 1996-10-01 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for coupled high temperatures reverse transcription and polymerase chain reactions
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5322770A (en) 1989-12-22 1994-06-21 Hoffman-Laroche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription
US5310652A (en) 1986-08-22 1994-05-10 Hoffman-La Roche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerase-high temperature reverse transcription
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5693517A (en) 1987-06-17 1997-12-02 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for coupled high temperature reverse transcription and polymerase chain reactions
US4962022A (en) 1986-09-22 1990-10-09 Becton Dickinson And Company Storage and use of liposomes
US5618702A (en) 1988-08-19 1997-04-08 City Of Hope PCR amplification of mRNA
SU1490961A1 (ru) 1987-06-17 1994-07-15 Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср Способ получения обратной транскриптазы вируса саркомы рауса
US5244797B1 (en) * 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5498523A (en) 1988-07-12 1996-03-12 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing with pyrophosphatase
US5219989A (en) 1988-12-13 1993-06-15 Mcgill University Bifunctional protein for the isolation of capped mRNA
GB8903593D0 (en) 1989-02-16 1989-04-05 Pafra Ltd Storage of materials
EP0894860B1 (en) 1990-09-28 2012-12-12 F. Hoffmann-La Roche AG Thermostable DNA polymerases and deletion mutants thereof
AU8906091A (en) 1990-10-05 1992-04-28 Wayne M. Barnes Thermostable dna polymerase
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
WO1993006239A1 (en) 1991-09-24 1993-04-01 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: a general method for dna fingerprinting
FR2690691B1 (fr) * 1992-04-29 1999-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'arn necessitant une seule etape de manipulation.
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
JPH0739378A (ja) 1993-07-30 1995-02-10 Takara Shuzo Co Ltd 逆転写酵素遺伝子
US5556772A (en) 1993-12-08 1996-09-17 Stratagene Polymerase compositions and uses thereof
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US5912155A (en) 1994-09-30 1999-06-15 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
JPH08131171A (ja) 1994-11-11 1996-05-28 Asahi Chem Ind Co Ltd 逆転写酵素の安定化組成物
US5556771A (en) 1995-02-10 1996-09-17 Gen-Probe Incorporated Stabilized compositions of reverse transcriptase and RNA polymerase for nucleic acid amplification
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US6013488A (en) 1996-07-25 2000-01-11 The Institute Of Physical And Chemical Research Method for reverse transcription
US6060240A (en) 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
ES2355739T3 (es) 1997-04-03 2011-03-30 Life Technologies Corporation Composiciones y métodos para la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (rt-pcr).
WO1998047912A1 (en) * 1997-04-22 1998-10-29 Life Technologies, Inc. Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
PT981609E (pt) 1997-05-13 2002-03-28 Azign Bioscience A S Metodo para clonar arnm e para exibir transcritos expressos diferencialmente (dodet)
US7074556B2 (en) * 1999-03-02 2006-07-11 Invitrogen Corporation cDNA synthesis improvements
US6630333B1 (en) * 1999-03-23 2003-10-07 Invitrogen Corporation Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof
US7078208B2 (en) 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
JP3925124B2 (ja) * 2000-09-20 2007-06-06 株式会社村田製作所 弾性表面波装置の製造方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1308690C (zh) * 2000-07-25 2007-04-04 宝洁公司 多肽测序的新方法和试剂盒
CN100537756C (zh) * 2004-01-13 2009-09-09 中国科学院生物物理研究所 重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法
CN104072561B (zh) * 2007-06-19 2017-12-22 路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会 信使rna帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途
WO2020132966A1 (zh) * 2018-12-26 2020-07-02 深圳华大生命科学研究院 酶活性提高的逆转录酶及其应用
CN113785053A (zh) * 2018-12-26 2021-12-10 深圳华大生命科学研究院 酶活性提高的逆转录酶及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20020081581A1 (en) 2002-06-27
JP2001523098A (ja) 2001-11-20
WO1998047912A1 (en) 1998-10-29
EP2251347A3 (en) 2011-02-23
EP2184289A1 (en) 2010-05-12
CA2287542A1 (en) 1998-10-29
EP1005481A4 (en) 2005-03-16
CN1259957B (zh) 2012-08-22
US7115406B2 (en) 2006-10-03
US20030198944A1 (en) 2003-10-23
US20030032086A1 (en) 2003-02-13
EP2251347A2 (en) 2010-11-17
US6989259B2 (en) 2006-01-24
US6518019B2 (en) 2003-02-11
US20030186270A1 (en) 2003-10-02
US20110008770A1 (en) 2011-01-13
AU7360198A (en) 1998-11-13
US20070269878A1 (en) 2007-11-22
US6835561B1 (en) 2004-12-28
EP1005481A1 (en) 2000-06-07
ATE445630T1 (de) 2009-10-15
EP1005481B1 (en) 2009-10-14
DE69841241D1 (de) 2009-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1259957A (zh) 产生由多个亚单位组成的aslv逆转录酶的方法
CN1197962C (zh) 用于测序的改变的热稳定dna聚合酶
CN1273611C (zh) 使用突变dna聚合酶的高温逆转录
CN1254548C (zh) 核酸扩增方法
CN1633505A (zh) 核酸扩增方法
CN1373812A (zh) 用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物
CN1422336A (zh) 高保真逆转录酶及其用途
CN1177640A (zh) 改进的热稳定dna聚合酶
WO1998047912A9 (en) Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
CN1590543A (zh) 热稳定的Taq聚合酶片断
CN1430670A (zh) 热稳定逆转录酶及其用途
CN1031251A (zh) T7脱氧核糖酸聚合酶
CN87105787A (zh) 纯化的热稳定性酶以及用其进行扩增、检测和/或克隆核酸顺序的方法
CN100351393C (zh) 核苷酸多态性的检测方法
CN1552869A (zh) 新型dna聚合酶
CN1109260A (zh) 转导醛脱氢酶-1基因的反转录病毒载体及其应用
CN1483082A (zh) 测定核酸碱基序列的方法
CN1701124A (zh) 检测hbv复制和测试药物敏感性的方法
CN1216990C (zh) 植物启动子及使用所说的启动子用于基因表达的方法
CN1671841A (zh) 基因多态性分型方法
CN100343388C (zh) 热稳定的核糖核酸酶h
CN1910288A (zh) 整合酶融合蛋白及其在整合基因治疗中的用途
CN1141398C (zh) 一种多基因扩增芯片及其制备方法
CN1163604C (zh) 减毒水痘病毒冈株的基因62和利用基因62的减毒水痘活疫苗用病毒株的鉴定方法
CN1552905A (zh) 一类茶树胱硫醚-γ-合成酶特异表达序列标签及其生物芯片

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20120822