CN1633505A - 核酸扩增方法 - Google Patents

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Abstract

以高灵敏度和特异性扩增样品中的目标核酸的目标核酸扩增方法;以及这些方法中所用到的组合物和试剂盒。

Description

核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及一种可有效地应用于临床医学领域的检测目标核酸的方法以及一种可有效地应用于基因工程领域的DNA合成方法。本发明涉及一种扩增模板核酸的方法以及一种检测上述方法扩增所得的目标核酸的方法。
背景技术
在基因工程领域,DNA合成用于多种不同目的。除了短链DNA的合成(如寡核苷酸)之外,大多数的DNA合成都是通过利用DNA聚合酶的酶促方法来进行的。典型的方法就是聚合酶链式反应(PCR)法,具体内容如美国专利4,683,195号、4,683,202号和4,800,159号所述。另外一个例子就是反转录PCR(RT-PCR)法,它是PCR和逆转录酶反应的组合,如Trends in Biotechnology,10:146-152(1992)中所介绍。上述方法的发展使得由DNA或RNA扩增的目标区变为可能。
上述DNA合成方法是通过例如由三个步骤组成的反应来实施的。这三个步骤是:作为模板的双链DNA解链(变性)为单链DNAs的步骤;使引物与单链DNA退火的步骤;从引物开始合成(延伸)互补链的步骤,由此扩增目标区的步骤。或者采用有人设计的一种叫“穿梭PCR”(“PCR法最前线”(Recent advances in PCR methodology),蛋白质核酸酶,别册(Proteien,NIUcleic Acid and Enzyme,Supplement),41(5):425-428(1996))的反应来实施,其中上述三个步骤中的两个步骤即引物退火步骤和延伸步骤是在相同的温度下进行的。
也可以选择使用1989年6月14日公开的欧洲专利EP 320,308中所描述的连接酶链式反应(LCR)法或在PCR Protocals,Academic PressInc.,1990,245-252页中所描述的基于转录的扩增系统(TAS)方法。上述四种方法需要在高温下和低温下重复多次反应,以产生用于下一个扩增循环的单链目标分子。反应系统必须在不连续相或循环下进行,因为如上所述反应是受温度控制的。
因此,上述方法需要使用昂贵的热循环控制仪,以可以在宽温度范围随时严格地调节温度。另外,反应时需要时间来调整温度到两个或三个预定值。该时间的浪费与循环次数成正比。
已经发展了可在等温条件下进行核酸扩增的方法以解决上述问题。其中的例子包括JP-B 7-114718号所述的链置换扩增(SDA)法、自动维持序列扩增(3SR)法、日本专利2650159号所描述的基于核酸序列的扩增(NASBA)法、转录介导的扩增反应(TMA)法、日本专利2710159号所描述的Qβ复制酶法以及美国专利5,824,517、WO 99/09211、WO95/25180和WO 99/49081中所描述的各种改进的SDA法。美国专利5,916,777中介绍了一种寡核苷酸等温酶促合成的方法。在该等温核酸扩增或寡核苷酸合成方法的反应中,从引物延伸和/或引物与单链延伸产物(或原始目标序列)的退火、紧跟着的引物延伸是在恒温下保温的反应混合液中并行进行的。
在上述的等温核酸扩增方法中,SDA法是最终使DNA得到扩增的系统的例子。SDA方法是一种通过使用DNA聚合酶和限制性内切核酸酶的双链置换反应来扩增样品中目标核酸序列(和其互补链)的方法。这种方法需要使用四种用于扩增的引物,其中两种要设计成包含限制性内切核酸酶的识别位点。这种方法需要大量使用一种经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸作为DNA合成的底物。经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的一个例子是(α-S)脱氧核糖核苷酸三磷酸,其中磷酸基团α位的氧原子被硫原子(S)取代。如果反应是日常进行的比如基因检测,则与使用经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸相关的运行成本问题就会变得很严重。另外在该方法中,由于扩增的DNA片段中上述经修饰的核苷酸(比如(α-S)脱氧核糖核苷酸)的掺入,例如当将该扩增的DNA片断用于限制性酶片段长度多态性(RFLP)分析时,该扩增的DNA片段就不能被限制酶切割。
美国专利5,824,517所描述的改进的SDA法是这样一种DNA扩增方法:它使用一种由RNA和DNA构成的、作为必需元件具有至少在3’末端配置有DNA的结构的嵌合引物。WO99/09211中描述的改进的SDA法需要使用限制酶以生成3’-突出末端。在WO95/25180中介绍的改进的SDA法需要至少两对引物。在WO95/49081中描述的改进的SDA法需要使用至少两对引物以及至少一种经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。另一方面,美国专利5,916,777所述的合成寡核苷酸的方法包括使用3’末端具有核糖核苷酸的引物来合成DNA,使用该引物完成反应,利用内切核酸酶在引物延伸链上的引物和延伸链之间插入切口以使它们相互分离,消化模板并回收引物,以便再次使用。该方法中,为重复使用引物,需要从反应系统中分离引物然后再使其与模板退火。另外,WO00/28082号中所述的环介导的等温扩增(LAMP)法需要四种引物用于扩增反应,而且该方法扩增的产物是不同大小的DNAs,其中有重复的目标扩增区。
另外,已知WO00/56877或WO02/16639中描述的等温和嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN)法,即使用嵌合寡核苷酸引物的等温核酸扩增方法。然而,传统的等温核酸扩增法还是有很多问题。因此期望得到一种低运行成本、可以得到能够进行进一步基因处理的DNA片段的核酸扩增方法。
发明的目的
本发明的主要目的在于提供一种样品中目标核酸扩增方法,它能以高灵敏度特异扩增,同时也提供用于上述方法的组合物和试剂盒。
发明概述
深入研究的结果,本发明人发现:在WO00/56877或WO02/16639中介绍的ICAN方法中,通过将一个嵌合寡核苷酸引物和一个上游阻断寡核苷酸组合使用,目标核酸的扩增效率得到提高,检测灵敏度得到改善,其中上游阻断寡核苷酸在模板核酸与该引物退火的位置的3’侧退火,由此本发明得以完成。
本发明的第一方面涉及到扩增核酸的方法,该方法包括:
(a)通过将作为模板的核酸,脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换反应活性的DNA聚合酶、至少一种嵌合寡核苷酸引物、至少一种上游阻断寡核苷酸以及RNase H混合,制备反应混合液,
其中所述嵌合寡核苷酸引物是与模板核酸的核苷酸序列实质互补的嵌合寡核苷酸引物,它含有一种核糖核苷酸,同时含有选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种,所述核糖核苷酸位于该引物的3’末端或3’末端侧。
其中所述上游阻断寡核苷酸与模板核酸上与该嵌合寡核苷酸引物实质互补的区的3’侧的核苷酸序列实质互补,而且所述上游阻断寡核苷酸的3’末端的核苷酸经过修饰,以使DNA聚合酶作用下的互补链延伸反应不发生。以及
(b)将上述反应混合液保温以使其有足够的时间生成反应产物。
按照上述的第一方面,反应混合液还可以包含具有与模板核酸的核苷酸序列实质同源的序列的第二嵌合寡核苷酸引物。反应混合液还可以包含一种上游阻断寡核苷酸,它具有与模板核酸的5’侧的区的核苷酸序列实质同源的序列,其中的模板核酸具有与第二嵌合寡核苷酸引物实质同源的序列,而且上述的上游阻断寡核苷酸的3’末端的核苷酸经过修饰,以使DNA聚合酶作用下的互补链延伸反应不发生。
本发明的第二方面涉及用于第一方面中的核酸扩增方法的组合物,它包括至少一种嵌合寡核苷酸引物以及至少一种上游阻断寡核苷酸。
本发明的第三方面涉及用于第一方面中的核酸扩增方法的试剂盒,它包含至少一种嵌合寡核苷酸引物以及和至少一种上游阻断寡核苷酸。
本发明的第四方面涉及一种检测目标核酸的方法,该方法包括:
(a)通过第一方面的核酸扩增的方法来扩增目标核酸;以及
(b)检测上一步扩增所得的目标核酸。
附图简述
图1表示按本发明的方法扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。
本发明的具体内容
这里所用到的脱氧核糖核苷酸(也作dN)指的是糖基部分为由D-2-脱氧核糖组成的的核酸。上述脱氧核糖核苷酸包括例如以腺嘌呤、胞嘧碇、鸟嘌呤或胸腺嘧啶为碱基部分的脱氧核糖核苷酸。另外,上述脱氧核糖核苷酸也包括具有经修饰的碱基例如7-脱氮鸟嘌呤的脱氧核糖核苷酸以及脱氧核糖核苷酸类似物例如脱氧肌苷核苷酸。
这里用到的核糖核苷酸(也作N)指的是糖基部分由D-核糖组成的核酸。上述核糖核苷酸包括以腺嘌呤、胞嘧碇、鸟嘌呤或尿嘧啶为碱基部分的核糖核苷酸。上述核糖核苷酸也包括经修饰的核糖核苷酸例如α位磷酸基中的氧原子被硫原子取代的经修饰的核糖核苷酸(也作(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)或其它衍生物。
本发明用到的嵌合寡核苷酸引物包括任何一种在引物的3’末端或3’-末端侧配置有核糖核苷酸、能在本发明的方法中用于核酸链延伸、能被内切核酸酶切割、可进行链置换反应的嵌合寡核苷酸引物。
这里用到的3’-末端侧指的是从核酸例如引物的中央到3’末端的部分。同样的,5’-末端侧指的是从核酸的中央到5’末端的部分。
这里用到的上游位置指的是从本发明的方法中用到的嵌合寡核苷酸引物5’侧到5’端之间的任意位置。也就是说,它是从3’侧到与嵌合寡核苷酸引物退火的模板核酸链上的引物部分的任意位置。
这里用到的内切核酸酶可以是任何一种作用于从与模板核酸退火的嵌合寡核苷酸引物进行DNA延伸而生成的双链DNA、且特异性切割该引物包含核糖核苷酸的部分的内切核酸酶。
此处用到的DNA聚合酶指的是利用DNA链作为模板合成新DNA链的酶。上述DNA聚合酶包括天然型DNA聚合酶及具有上述活性的变异酶。例如这样的酶包括具有链置换活性的DNA聚合酶,不具5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和具有反转录活性或内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
此处用到的”链置换活性”指的是一种可以链置换的活性,也即,在基于模板核酸序列的DNA复制的过程中,置换DNA链以释放已与模板链退火的互补链。另外,由于链置换导致的从模板核酸上解离的DNA链在这里叫“置换链”。
下面具体介绍本发明。
(1)本发明中用到的嵌合寡核苷酸引物
本发明方法中用到的引物是一种嵌合寡核苷酸引物,它含有一个核糖核苷酸同时含有选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种。这些引物也包括含未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸的寡核糖核苷酸引物
本发明的方法中所用到的嵌合寡核苷酸引物是具有与模板核酸的核苷酸序列的一部分实质互补的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。它有助于在使用条件下延伸DNA链。另外,核糖核苷酸配置于嵌合寡核苷酸引物的3’末端或3’-末端侧。通常该引物的设计要使其与要扩增的区的上游部分互补,也即与模板核酸中与要扩增区对应的3’侧核苷酸序列部分互补。此处的“实质互补的核苷酸序列”指的是能在使用条件下与模板DNA退火的核苷酸序列。
本发明的方法中所用到的嵌合寡核苷酸引物可以含有一个或多个经修饰的核糖核苷酸。其中所述核糖核苷酸可以是未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸,它可配置于嵌合寡核苷酸引物的3’末端或3’-末端侧,而且能被内切核酸酶识别或切割。该核糖核苷酸包括上述未经修饰的核糖核苷酸和经修饰的核糖核苷酸。未经修饰的核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸或其组合都可用于本发明的嵌合寡核苷酸引物,只要它不损害该引物的功能。经修饰的核糖核苷酸的例子包括磷酸基上结合的氧原子被硫原子取代的(α-S)核糖核苷酸以及核糖2-位的羟基被甲氧基取代的核糖核苷酸,但不限于这些。含有这样的经修饰的核糖核苷酸的寡核苷酸引物可通过使用例如美国专利5,003,097号所述硫化反应试剂(Glen Research)制备的(α-S)核糖核苷酸三磷酸来制备,或使用2-OMe-RNA-CE亚磷酰胺试剂(Glen Research)来制备。
能用于本发明扩增方法的嵌合寡核苷酸引物可以设计成含有一个抗内切核酸酶切割的、经修饰的核糖核苷酸。这样的引物可用来在扩增反应步骤中控制内切核酸酶的切割位点。
在本发明的方法中使用一种或两种嵌合寡核苷酸引物,这取决于所期望的扩增后DNA片段的组成形式(单链或双链)。具体来说,当希望得到单链DNA时,使用一种嵌合寡核苷酸引物,当希望得到双链DNA时使用两种引物。
本发明对使用的嵌合寡核苷酸引物的长度没有特别的限制,只要在3’末端或3’-末端侧有一个核糖核苷酸,而且能用于ICAN法即可。
上述嵌合寡核苷酸引物可以使用的长度为例如约6个核苷酸-约100个核苷酸,优选约10个核苷酸-约50个核苷酸,更优选约12个核苷酸-约40个核苷酸。优选嵌合寡核苷酸的核苷酸序列与模板核酸实质互补,从而使它在反应条件下能与模板核酸退火。该引物的3’末端或3’-末端侧含有一段内切核酸酶可识别的序列,内切核酸酶会在下文所述的步骤中用到。
比如,具有如下通式所代表的结构的寡核苷酸可以在本发明的DNA合成方法中用作引物,当然这并不是意味着对本发明的限制。
通式:5’-dNa-Nb-dNc-3’
(dN:脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物;N:未经修饰的核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸,其中,有一些dNa中的dNs可被Ns取代,而且3’末端的核苷酸可被修饰以使不发生在DNA聚合酶作用下从该3’末端开始的延伸)。
在上述通式中,a为例如5或更大的整数,优选6以上,更优选8以上;b为1以上的整数例如1-15,优选1-10,更优选1-7,特别优选1-5;而c可以为0或为1以上的整数,优选0-5,更优选0-3,当然这些并不是对本发明的限制。
本发明用到的嵌合寡核苷酸引物的例子包括a=8;同时b=1而c=0,b=2而c=0,b=3-5而c=0,或者b=2-3而c=0-3。a,b,c的值是可以调整的,以使嵌合寡核苷酸引物能用于本发明的方法中。但这不是对本发明的限制。
本发明所用到的嵌合寡核苷酸引物有下述结构,其中内切核酸酶识别或切割DNA聚合酶作用下从该引物处延伸的DNA链(引物延伸链),其作用位点含有核糖核苷酸,这个核糖核苷酸位于嵌合寡核苷酸引物的3’末端或3’-末端侧。比如,当一个RNase H作用于由与模板核酸退火的、上述通式所示的嵌合寡核苷酸引物进行DNA延伸而形成的双链DNA时,上述嵌合寡核苷酸引物就在该核糖核苷酸位置被切割,从而生成了在上述寡核苷酸引物和通过延伸合成的DNA链之间有一切口的双链DNA,当然这不是对本发明的限制。然后,DNA聚合酶作用下的链置换反应从该切口位点开始进行。因此,任何能从引物3’末端延伸核酸链、能被内切核酸酶切割、而且DNA聚合酶能作用于链置换反应的嵌合寡核苷酸引物都能用于本发明的方法中。另外本发明的嵌合寡核苷酸引物包括其3’末端被修饰以使DNA聚合酶作用下的链延伸反应不能进行,DNA链的延伸是从被内切核酸酶切割后形成的3’末端开始的嵌合寡核苷酸引物。
另外,上述嵌合寡核苷酸引物的5’-末端侧可以包含RNA聚合酶的启动子序列。这些RNA聚合酶的例子有T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
另外,本发明的方法中用到的嵌合寡核苷酸引物可以含有核酸类似物或其它物质。也即,只要用于由DNA聚合酶引起的从3’末端开始的聚合酶延伸反应的引物的功能不被损害,本发明的嵌合寡核苷酸引物可以含有一个或多个核苷酸类似物。多种形式的核苷酸类似物可以组合使用。这些核苷酸类似物的例子包括脱氧肌苷核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、具修饰碱基的核苷酸类似物如7-脱氮鸟嘌呤、含有核糖衍生物的核苷酸类似物等,但不限于这些。另外用于本发明的嵌合寡核苷酸可包括脱氧核苷酸,核糖核苷酸或经各种修饰如添加标记化合物的核苷酸类似物,只要它们能保持上文所述的功能即可。
向引物中掺入核苷酸类似物可有效地抑制引物自身形成高级结构及稳定地与模板退火。核糖核苷酸也可以掺入引物中以达到相同的目的。经修饰的核糖核苷酸如(α-S)核糖核苷酸可以被优先用来防止非特异性内切核酸酶(RNase)对引物的消化作用,当然这不是对本发明的限制。
使用如Applied Biosystems Inc.(ABI)公司提供的394型DNA合成仪,按照亚磷酰胺法,可以合成具有所述核酸序列的嵌合寡核苷酸引物。可以选择使用包括磷酸三酯法,H-磷酸酯法以及硫代磷酸酯法的任意方法来合成嵌合寡核苷酸引物。
(2)本发明中使用的上游阻断寡核苷酸
选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种可以优选用于本发明方法中用到的上游阻断寡核苷酸。
上游阻断寡核苷酸具有一段与模板核酸的核苷酸序列的一部分实质互补的核苷酸序列,而且能够与模板核酸与上述(1)的嵌合寡核苷酸引物退火的位置的3’侧的区退火,它可被优选用于本发明的方法中。上述寡核苷酸通常设计成使之与被扩增区上游部分也即与模板核酸链要被扩增区相对应的核苷酸的3’侧的部分互补。此处用到的“实质互补的核苷酸序列”意指能在使用的反应条件下与模板DNA在退火的核苷酸序列。
苷酸序列。
如上述,本发明中的上游阻断寡核苷酸其3’末端被修饰,以使其不能用于DNA聚合酶作用下的DNA延伸反应。在修饰的方法方面没有特别的限制,只要能够达到上述的目标即可。其例子包括在3’末端添加双脱氧核苷酸,在核糖3-位羟基被修饰的核苷酸,或者是经修饰的、具有空间位阻可以干预DNA聚合酶的链延伸反应的核苷酸。烷基化或其它已知的修饰方法都可以应用于对所述上游阻断寡核苷酸中的核糖的3-位羟基的修饰。比如,可以通过氨基烷基化来阻止DNA延伸反应。
在本发明的方法中使用一种或两种上游阻断寡核苷酸,这依赖于期望的扩增后DNA片段的形式(单链DNA或双链DNA)。具体来说,当要得到单链DNA时,使用一种嵌合寡核苷酸引物和一种上游阻断寡核苷酸,当要得到双链DNA时,使用两种嵌合寡核苷酸引物和两种上游阻断寡核苷酸。
本发明的方法中用到的上游阻断寡核苷酸与模板核酸退火的位置没有特别的限制,只要此部分的选择能够带来最大的扩增效率即可,最大扩增效率会随如下因素变化:目标核酸的核苷酸序列、扩增区的长度以及组合的嵌合寡核苷酸引物与目标核酸退火的位置。例如,选择一个位置以使模板3’末端位于离嵌合寡核苷酸引物的5’末端有一个核苷酸或多个核苷酸距离的位置。
优选用于本发明方法的上游阻断寡核苷酸的链长度为任意长度,只要能收到增加检测相关扩增片段的灵敏度等即可。
上游阻断寡核苷酸的长度为例如约6个核苷酸-约100个核苷酸,优选约10个核苷酸-50个核苷酸,更优选约12个核苷酸-约40个核苷酸,但这并不是对本发明的限制。优选上游阻断寡核苷酸的核苷酸序列与模板核酸实质互补,从而使它与模板核酸在反应条件下退火。
本发明方法中所用到的上游阻断寡核苷酸可以含有核苷酸类似物或其它物质。本发明的上游阻断寡核苷酸可以含有一个或多个核苷酸类似物。多种类型的核苷酸类似物可以组合使用。可以用于本发明的核苷酸类似物可例举脱氧肌苷核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、具修饰的碱基的核苷酸类似物如7-脱氮鸟嘌呤、具有核糖衍生物的核苷酸类似物等,但这并非对本发明的限制。用于本发明的上游阻断寡核苷酸可以含有脱氧核苷酸、核糖核苷酸或经各种修饰的核苷酸类似物(例如标记化合物的添加)。
向该上游阻断寡核苷酸中掺入核苷酸类似物可有效的抑制该寡核苷酸自身形成高级结构及稳定其与模板的退火。
使用例如Applied Biosystems Inc.(ABI)公司提供的394型DNA合成仪,按照亚磷酰胺法可以合成含有期望核苷酸序列的上游阻断寡核苷酸。可以选择使用包括磷酸三酯法、H-磷酸酯法以及硫代磷酸酯法的任意方法来合成上游阻断寡核苷酸。
(3)本发明使用的内切核酸酶
任何能作用于由与模板核酸退火的上述(1)所述的嵌合寡核苷酸引物进行DNA延伸从而形成的双链DNA、并且切割延伸链而影响链置换反应的内切核酸酶都可用于本发明。也就是说,上述内切核酸酶是一种能在上述双链DNA的嵌合寡核苷酸引物部分形成一个切口的酶。可用于本发明的内切核酸酶的例子包括核糖核苷酸酶,但并不限于它。其中作用于由DNA和RNA形成的双链核酸的RNA部分的内切核糖核苷酸酶H(RNase H)可优选使用。任何具有上述活性的核糖核苷酸酶都可以优选用于本发明,它们包括嗜温和耐热型核糖核苷酸酶。例如本发明的方法中在约50℃-约70℃反应时可使用来自大肠杆菌的RNaseH。本发明的方法中优选使用的耐热型核糖核酸酶优选使用耐热型核糖核苷酸美的例子有市售的核糖核酸酶HybridaseTM Thermostable RNaseH(Epicenter Technologies)以及来自芽孢杆菌属(Bacillus)的嗜热细菌、栖热菌属(Thermus)的细菌、热球菌属(Pyrococcus)的细菌、栖热袍菌属(Thermotoga)的细菌、古生球菌属(Archaeoglobus)的细菌等的RNase H。另外可以优选使用天然产生的核糖核酸酶和变体。这里的RNase H酶活单位值按照参考例中所介绍的酶活单位测量方法来表示。
RNase H酶只要它能应用于本发明的方法中,并不限制为具体的某一种。比如RNase H酶可以来自不同病毒、噬菌体、原核生物或真核生物。它可以是细胞RNase H也可以是病毒RNase H。上述细胞RNaseH的代表是大肠杆菌(Escherichia coli)RNase HI,病毒RNase H的代表是HIV-1 RNase H。I型、II型、III型RNase H可以用在本发明的方法中。例如优选来自大肠杆菌的RNase HI、或来自热球菌属的细菌或古生球菌属的细菌的RNase HII,但并不限定于此。
在本发明方法中使用的内切核酸酶如RNase H进行切割反应的效率取决于上述引物3’末端附近的核苷酸序列,而且会影响所需DNA的扩增效率。因此,当然就要为所使用的RNase设计最理想的引物。
此处所用到的“引入一个切口”或“形成切口”意思是从内部切割双链核酸的一条链或两条链。比如,RNase H作用于一条由DNA和包含核糖核苷酸的DNA组成的杂交双链核酸,在两条链中,选择性地切割包含核糖核苷酸的链的核糖核苷酸的部分,从而向该杂交双链核酸中引入一个切口。
(4)本发明中所用到的DNA聚合酶
具有DNA的链置换活性的DNA聚合酶可以用于本发明。特别优选使用实质不具5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
任何具有上述链置换活性的DNA聚合酶可以应用于本发明。其例子包括来源于芽孢杆菌属的嗜热细菌如热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)(以下称为B.ca)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Baccilusstearotherophilus)(以下称为B.st)的5’→3’外切核酸酶活性缺失的DNA聚合酶的变体,以及来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I的大片段(克列诺片段)。优选喜温或耐热DNA聚合酶用于本发明。
B.ca为嗜热细菌,最适生长温度为70℃左右。已知从该细菌中得到的Bca DNA聚合酶具有依赖DNA的DNA聚合酶活性、依赖RNA的DNA聚合酶活性(反转录活性)、5’→3’外切核酸酶活性和3’→5’外切核酸酶活性。这种酶可以是从其原始来源中提纯的酶或通过基因工程技术制备的重组蛋白。这种酶可以进行修饰,比如通过基因工程技术或其它手段进行置换、缺失、添加或插入。这样的酶的例子包括BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo),它是缺损5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。
已知在某些特别的件下有些DNA聚合酶有内切核酸酶活性,比如RNase H酶活性。这样的DNA聚合酶可用于本发明的方法中。在某种情况下,该DNA聚合酶可以在允许RNase H活性表达的条件下比如在Mn2+存在的条件下使用。在这种情况下,本发明的方法不需加入RNase H就可以进行。因此,Bca DNA聚合酶在含有Mn2+的缓冲液中能表现出RNase酶活性。上述的情况并不限定为使用Bca DNA聚合酶。已知具有RNase H酶活性的DNA聚合酶,比如来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的Tth DNA聚合酶可用于本发明。
(5)本发明的扩增目标核酸的方法
通过组合使用至少一种如(1)所述的嵌合寡核苷酸引物、至少一种如(2)所述的上游阻断寡核苷酸、如(3)所述的内切核酸酶和如(4)所述的DNA聚合酶来实施本发明的方法。如上所述,在允许RNase H酶活性表达的条件下可以使用具有RNase H酶活性的DNA聚合酶。
优选用于PCR的dNTPs等(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物)用作三磷酸核苷酸,它们作为本方法中延伸反应的底物。另外,dUTP可用作底物。上述的dNTPs可以包括dNTP(脱氧核苷酸三磷酸)类似物,比如7-脱氮-dGTP、dITP的三磷酸等,只要它能作为DNA聚合酶的底物使用。可以使用dNTP或dNTP类似物的衍生物。还可包含具官能团的衍生物如具有氨基的dUTP。本方法中使用嵌合寡核苷酸引物,可以使用DNA合成仪按照通常的合成方法制备引物。
本发明方法中使用的嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸的量可以根据目标核酸的核苷酸序列、待扩增片段的长度以及所使用的反应系统的组成来调节。比如可以用扩增产物的数量作为指标来调节。换句话说就是,本发明方法中使用的上述嵌合寡核苷酸引物以及上述上游阻断寡核苷酸的数量没有特别的限制,只要能得到目标扩增产物即可。
按照本发明,使用的嵌合寡核苷酸引物以及上游阻断寡核苷酸的摩尔比没有具体的限制,只要能得到相关的扩增产物即可。
在本发明方法的一个实施例中,嵌合寡核苷酸引物与上游阻断寡核苷酸的摩尔比为例如1∶0.1-1∶10,优选1∶0.2-1∶5,更优选1∶0.25-1∶4。
在本发明的方法中,假如在反应过程中所使用的酶的活性降低,则可以在反应过程中进一步加入酶。加入的酶可以是与在开始反应时包含在反应混合液中的酶相同的酶,或是表现相同活性的不同种的酶。因此,加入的酶的种类或性质并不限制为具体某一种,只要反应过程中加入的酶可以提供诸如提高检测灵敏度或提高扩增产物数量的效果。
本发明方法所用的模板核酸(DNA或RNA)可以从任何可包含核酸的样品中制备或分离。该样品也可以直接在本发明的核酸扩增反应中使用。含有这些核酸的样品的例子包括来自全血、血清、血沉棕黄层、尿液、粪便、脑脊液、精液、唾液、组织(如癌组织或淋巴结)和细胞培养物(如哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物)等生物体的样品,类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母、植物和动物等含有核酸的样品,可能被微生物如病毒或细菌污染或感染的样品(如食物或生物制剂),以及包含生物体的样品如土壤和废水,但并不受此限定。样品也可以是按照已知方法从上述样品中制备的包含核酸的样品制剂。可用于本发明的样品制剂的例子包括细胞破碎物或其分离而得的样品、样品中的核酸或富集有特别核酸分子如mRNAs的样品。另外,优选使用通过已知方法经样品扩增得到的核酸如RNA或DNA。
含有核酸的制剂可以通过使用例如洗涤剂溶解、超声处理、使用玻璃珠或弗式细胞压碎器的振荡/搅拌从上述材料中制备,但并不限定于此。在某些情况下,将制备样品的核酸进行进一步的纯化是有利的(比如在内源性核酸酶存在的情况下)。在上述情况下,核酸的纯化可以使用已知的方法如苯酚提取、层析法、离子交换法、凝胶电泳或密度梯度离心法。
当希望扩增具有来自RNA的序列的核酸时,本发明方法可以使用以该RNA为模板的反转录反应合成的cDNA作为模板来进行。只要能制备用以进行反转录反应的引物,任何一个RNA都可以用于本发明的方法,包括样品中的总RNA、mRNA、tRNA和rRNA等RNA分子以及其它特殊的RNA分子类型。
任何在反应条件下与模板RNA退火的引物都可用于反转录反应。上述引物可以是具有与某个特定的模板RNA互补的核苷酸序列的引物(特异性引物)、寡-dT(脱氧胸腺嘧啶)引物和有随机序列的引物(随机引物)。考虑到特异性退火,用于反转录反应的引物的长度优选为6个核苷酸或更多,更优选9个核苷酸或更多。考虑到寡核苷酸的合成,长度优选为100个核苷酸或更少,更优选30或更少。嵌合寡核苷酸引物可以用作反转录反应的引物。在本发明中,使用经反转录得到的cDNA作为模板来进行本发明方法的核酸扩增时,该嵌合寡核苷酸引物可以优选用作链置换反应的引物。此引物可以是任何一个具有上述(1)中所述性质、而且能用于RNA反转录反应的引物。
任何具有能以RNA为模板合成cDNA的活性的酶均可用于上述反转录反应。其例子包括各种来源的逆转录酶,如来自禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶(AMV RTase)、来自莫洛尼鼠类白血病病毒的逆转录酶(MML V RTase)以及劳斯相关病毒2的逆转录酶(RAV-2 RTase)。另外,同时具有反转录活性的DNA聚合酶也可以使用。在高温下有反转录活性的酶例如来自栖热菌属(Thermus)细菌的DNA聚合酶(比如Tth DNA聚合酶)和来自芽孢杆菌属嗜热细菌的DNA聚合酶优选用于本发明。比如,优选来自B.st的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)和Bca DNA聚合酶等来自芽孢杆菌属嗜热细菌的DNA聚合酶,当然这并不是对本发明的限制。比如,Bca DNA聚合酶的反转录反应中不需要锰离子参与,另外它能合成cDNA,同时抑制模板RNA在高温条件下形成二级结构。上述具有反转录活性的酶的天然体和变体都可以使用,只要它们有上述活性即可。
从另一个方面来看,在本发明的方法中,在预先复制包含要扩增的核苷酸序列的DNA或RNA后,复制产物也可以用作模板核酸。复制方法的例子包括如下方法,在此方法中,含有需扩增核苷酸序列的核酸片段插入到载体中,用此载体转化一个适当的宿主,得到的转化株进行培养,从其中提取被插入含有上述需扩增核苷酸序列的核酸片段的载体并使用,但并不限于此。任何能在宿主中稳定复制的载体都可以使用。比如可优选使用pUC系列、pBluescript系列、pGEM系列、粘粒载体和噬菌体载体。任何能保持所使用的载体的宿主都可以使用。比如宿主的代表为大肠杆菌,它很容易培养。
从上述复制方法的另一方面来看,使用RNA聚合酶而包含模板核苷酸序列的核酸片段转录含有需扩增核苷酸序列的RNA后,此RNA可以直接的或经反转录反应转化为cDNA后而用作本发明方法的模板。含有上述需扩增核苷酸序列的核酸片段不限为具体某一种,只要它有RNA聚合酶的启动子序列即可。它可以插入到具有RNA聚合酶启动子序列的载体,在末端含有RNA聚合酶启动子序列与适配子的弹夹相连,或者可以使用具有RNA聚合酶的启动子序列的引物和适当模板进行酶促合成。因此,利用如上所述配置的RNA聚合酶的启动子序列,可以以RNA的形式将上述含有需扩增序列的核酸片段进行复制或扩增。任何具有RNA聚合酶启动子序列的载体都可使用。比如可优选使用pUC系列、pBluescript系列、pGEM系列、粘粒载体和噬菌体载体。选择上述载体以环状直接或在直链化后使用。任何RNA聚合酶都可用于上述的复制或扩增方法。比如优选使用SP6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶等。
优选按照上述方法分离的如基因组DNA或PCR片段的双链DNA,以及如由总RNA或mRNA通过反转录反应制备的cDNA等单链DNA用作本发明的模板DNA。优选双链DNA在变性成单链DNAs后或不经变性使用。
也就是说,本发明的方法可以有也可以没有上述变性步骤。
在本发明的一个实施例中,假如具有来自RNA的序列的核酸要扩增,扩增反应可以通过向本发明的含有RNase H的扩增反应液中加入RNA-cDNA双链核酸来启动,其中RNA-DNA双链核酸是以RNA为模板通过反转录反应得到的,由此消化RNA链,并使核酸转化为单链cDNA。另外,使用RNA为模板的反转录反应和以由反转录反应所得的cDNA为模板的DNA扩增反应,都可以用本发明的DNA合成方法中所用的一种DNA聚合酶来进行。这种DNA聚合酶有反转录活性和链置换活性。
在上述双链DNA变性解离成单链DNAs或在以RNA为模板时,在通过反转录反应制备cDNA(单链DNA)后,核酸扩增反应就在等温条件下连续地进行。
“连续地”的意思是反应进行中反应温度或反应液的组成不发生变化。此处“等温”的意思是实质稳定的温度条件,其中酶和核酸链每一步都在此条件下起作用。
本发明的核酸扩增反应可在常温(比如37℃)下使用嗜中温DNA聚合酶比如克列诺片段来进行。也可以在高温(比如50℃或更高)下使用耐热酶(内切核酸酶和DNA聚合酶)来进行。这种情况下,由于引物的非特异性退火得到抑制,因此DNA特异性扩增得到提高。另外,由于DNA模板形成二级结构的问题已经解决,DNA聚合酶的延伸能力得到提高。在本方法中,反转录反应和核酸扩增反应可以连续地进行。在这种情况下,通过在上述反应中联合使用逆转录酶,或者通过使用具有反转录活性的DNA聚合酶,含有来自RNA的序列的DNA就能被扩增。
本发明的任何情况下,优选与模板DNA互补的嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸与该DNA退火,当然这并不是对本发明的限制。然后,与模板DNA互补的DNA(引物延伸链)在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下,从嵌合寡核苷酸引物的3’末端沿模板DNA的剩余序列延伸。然后,嵌合寡核苷酸引物的延伸链因上游阻断寡核苷酸与模板核酸的退火而受到阻断,所述上游阻断寡核苷酸是与模板核酸与该嵌合寡核苷酸引物实质互补区的3’侧的核苷酸序列实质互补的。结果,在本发明方法的反应的前阶段,与非线性扩增的嵌合寡核苷酸引物退火的模板被扩增。该前阶段扩增反应稳定地提高了本发明方法的扩增效率。因而目标核酸的检测灵敏度得到提高。
本发明的一个实施例中,内切核酸酶作为产生切口的酶,向双链DNA中引入一个切口,或改变由嵌合寡核苷酸引物和模板DNA组成的双链DNA的结构,虽然本发明并不局限于其中某一种理论。具有链置换活性的DNA聚合酶从双链DNA切口处的3’末端重新开始延伸DNA链,以生成一条新的引物延伸链,同时从切口的3’末端解离下游DNA。因此新的引物延伸链替换了前面合成的引物延伸链。
本发明的核酸扩增方法可以使用一对引物和一对阻断寡核苷酸,比如,与模板核酸互补的嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸各一个,以及与置换链互补的嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸各另外一个。在这种情况下,可以认为嵌合寡核苷酸引物与双链DNA退火,以分别合成相应的互补链,而上游阻断寡核苷酸与分别相应的互补链退火,因此阻止各相应的互补链在上游阻断寡核苷酸退火位置退火。另外,可以认为模板转换反应与延伸反应平行进行。已知在利用这一方案时,一种引物的反应产物可以作为另一种引物的模板。因此,随着模板量的增加,反应产物的量也以非线性方式增加。
当本发明的核酸扩增法是使用双链DNA作为模板时,通过使用与分别相应的两条链退火的嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸,两条链都可以在扩增反应中作为模板。假如反应用双链DNA作为模板来启动,将一种嵌合寡核苷酸引物、一种上游阻断寡核苷酸、四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)、一种DNA聚合酶和一种内切核酸酶加入到反应液中。假如用热处理来使双链DNA变性且不用耐热酶,则优选在变性反应之后再加入酶。
在本发明的核酸扩增方法是使用双链DNA作为模板、两种嵌合寡核苷酸引物和两种上游阻断寡核苷酸的情况下,在从各引物开始的延伸反应过程中,模板会在模板-延伸链中间产物之间发生转换,从而生成由合成的引物延伸链之间退火组成的双链核酸,虽然这取决于反应条件等。该双链核酸在两端都有嵌合寡核苷酸引物。因而,包含链置换的互补链延伸反应再次从两端开始。反应的结果,生成在一端具有引物序列的扩增产物。另外,假如在反应过程中发生了模板转换,则又生成一条与上述同样的双链核酸。
本发明提供了一种扩增核酸的方法,它包括使用具有链置换活性的DNA聚合酶去进行模板转换反应。在该模板转换反应中,在模板双链核酸、各两种与分别相应的链的核苷酸序列实质互补的嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸、以及具有链置换活性的DNA聚合酶存在下,合成两条与该模板互补的引物延伸链。模板由一条引物延伸链的模板转换为另一条由引物延伸的链,这会在引物延伸链的合成过程中发生。
这里的模板转换反应指的是下述反应:当互补链从双链核酸的两侧通过链置换反应被合成时,一个DNA聚合酶转换其模板并在通过另一种DNA聚合酶使用另一条新合成的互补链作为模板后合成一条互补链。换句话说,模板转换反应也即指:模板双链核酸用引物和具有链置换活性的DNA聚合酶处理,以生成与该模板互补的延伸链,其中在延伸链合成的过程中,合成上述引物延伸链的DNA聚合酶积极地将模板由原始模板转换为其它的引物延伸链。
能够在链置换反应过程中影响模板转换反应的DNA聚合酶可以优选用于本发明中。比如特别优选5’→3’外切核酸酶活性缺失的Bca DNA聚合酶变异酶。这种酶作为BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)已有市场销售。也可以按照日本专利2978001中所述的方法由含有上述酶的基因的大肠杆菌HB101/pUI205(FERM BP-3720)制备。
在本发明的扩增方法中,嵌合寡核苷酸引物延伸链可在其核糖核苷酸位点被切割,使得切割产生的5’侧的片段(引物部分)不含核糖核苷酸。从上述产生的引物部分开始延伸的引物延伸链也不再被内切核酸酶切割。结果是产生了末端含有引物序列的扩增产物。
如上述,在本发明的核酸扩增方法中,产生了没有引物序列的扩增产物和在一端或两端有(多条)引物序列的扩增产物。这些产物也包括在这些扩增产物中。
在本发明的核酸扩增法使用嵌合寡核苷酸引物过程中,会生成一种聚合物,其中要被扩增的区相互连结在一起。这个聚合物具有待扩增的多个区同向排列的结构。通过扩增产物的电泳分析,这种聚合物作为一个梯状条带被观察到。这种聚合物的产生可认为受到扩增的区、该区的大小、侧翼区、使用的嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列、反应条件等因素的影响。
上述聚合物含有多个待扩增的区。比如,这种聚合物在检测含有待扩增区的核酸方面是有用的,因为通过使用合适的探针,聚合物与大量的探针杂交而产生强烈的信号。被扩增的区或其部分可以通过联合使用限制酶等酶消化,作为单体从上述聚合物中得到。
本发明中用到的DNA聚合酶合成一条延伸链,该链从引物部分3’末端开始向下游直到置换之前已延伸的DNA链。DNA聚合酶不应该表现出5’→3’外切核酸酶活性,这一点很重要,否则的话它会将被置换链消化掉。比如克列诺片段,它是从大肠杆菌中得到的外切核酸酶活性缺损的DNA聚合酶I的变异株,从Bst DNA聚合酶中得到的与上述相似的片段(New England Biolabs)以及从B.ca中得到的BcaBESTDNA聚合酶(Takara Shuzo)可被用作这样的DNA聚合酶。也可以使用Sequenase 1.0和Sequenase 2.0(United States Biochemical),以及Gene,97:13-19(1991)中介绍的T5 DNA聚合酶和29 DNA聚合酶。如果其活性可能引添加适当的阻碍剂而受到阻碍,则通常具有5’-3’外且核酸酶活性的聚合酶可以用于本发明的DNA合成方法中。
本发明的核酸扩增方法可以在变温或等温条件下进行。变温意指反应温度在不干扰各个步骤的反应的范围内对应于每个相应的步骤进行变化。具体来说,变温指的是改变温度,以使之分别适合于比如引物退火、互补链合成反应、互补链形成切口及置换反应。
另一方面,等温意指每步反应温度是不变的,每一步反应在实质恒定的温度下进行。在上述两种情况下选择合适的温度以优化反应的条件是理所当然的。
本发明的核酸扩增方法的一个特征就是:在核酸合成过程中不需要时高时低地调节温度。因此,本发明提供了一种等温合成核酸的方法。许多传统的核酸扩增方法需要上下调节温度以从合成链上解离目标。要达到上述目的,这些方法需要特别的反应设备比如热循环控制仪。然而本发明的方法只需要使用一个可以保持恒温的设备就可以进行。如上所述,本发明的方法可以在某个单一的温度下进行。优选通过选择反应温度和严格水平以降低引物非特异性退火,并使引物与模板核酸特异性退火。本发明的方法可以使用上述的耐热酶在高温条件下进行,当然这并不是限制本发明。另外,优选本发明的方法是在合适的温度下进行,以最大限度保持所用酶的活性,从而维持反应效率在高的水平。因此,优选反应温度在约20℃-约80℃,更优选约30℃-约75℃,特别优选约50℃-约70℃,当然它会随具体所使用的酶而变化。特别是反应在高温条件下进行的情况下,相比于在常温条件下,优选使用较长的引物。比如,当反应温度为55℃-60℃或65℃时,本发明方法所使用的引物或阻断寡核苷酸的长度可以没有限制,比如长度为约6个-约100个核苷酸,优选约10个-约50个,更优选长度为约12个-约40个。因反应温度升高而带来影响的实例就是可解决模板DNA链形成二级结构这一难题。即使使用的模板核酸含有大量的GC碱基,反应温度升高使上述核酸的扩增变为可能。而且,在扩增长链区时也有相似的效果。这种效果在长度为约60bp-约20kbp,优选在约60bp-约4.3kbp,更优选在约60bp-约1500bp时可以观察到。
在本发明的方法中,使用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(比如BcaBEST DNA聚合酶)时,只使用一种酶就可以由RNA进行核酸扩增,上述扩增反应包含从RNA制备cDNA的步聚(反转录反应)。通过独立进行从RNA制备cDNA这一步骤而获得的产物如cDNA也可用作本发明方法的模板DNA。
在每一种情况下,本发明方法的反应重复进行直到它被适当的方法,比如使酶失活或降低反应温度而中止,或者反应直到某种底物用完。
本发明的核酸扩增方法可以用于各种利用核酸扩增的实验程序,包括核酸的检测、标记和测序。
本发明的核酸扩增方法也可以应用于原位核酸扩增方法、扩增位于固相底物如DNA芯片上的核酸的方法或者同步扩增多个区的多重核酸扩增方法。
本发明的上游阻断寡核苷酸可以应用于所谓的不对称核酸扩增方法中,该扩增反应中使用的一种引物相对于另一种引物是过量的。
根据本发明的核酸扩增方法,可以制备实质不含有其互补链的单链DNA。比如,可以在短时间内容易地制备具有固相化核酸如DNA芯片的材料的单链DNA、用于检测目标核酸的单链DNA探针或者用于长链PCR法的大引物。使用本发明方法可以选择性地仅扩增有义序列或反义序列。因此,本发明作为一种制备具有有义序列或反义序列的核酸的方法也是有用的。
通过在N-二(羟乙基)甘氨酸,N-三(羟乙基)甘氨酸、HEPES、磷酸盐或tris缓冲液中进行本发明的方法,可从即使痕量的模板核酸中扩增目标核酸区。
而且,本发明的核酸扩增方法不需要可随时调节温度的反应设备。因而,扩增反应可以在大量反应液中进行。由此,核酸(比如用作医学用途)可以工业化大量生产。
本发明的核酸扩增方法可以生成与模板核酸的核苷酸序列高保真度的扩增产物。通过分析所得扩增产物的核苷酸序列确定本发明方法中DNA合成的出错频率时,发现本发明方法所得产物的出错频率与LA-PCR方法的相当,而已知LA-PCR是可以高保真度扩增核酸的方法。也就是说,本发明的方法具有跟LA-PCR方法相当的保真度。
(6)本发明的试剂盒
本发明提供一种用于上述本发明的核酸扩增方法的试剂盒。在一个实施例中,该试剂盒是在包装形态中包含关于链置换反应中的DNA聚合酶、内切核酸酶、嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸的使用说明书。另外,包含具有链置换活性的DNA聚合酶、内切核酸酶和链置换反应缓冲液的试剂盒优选用于本发明方法中。也可以选择市售的具有链置换活性的DNA聚合酶和/或内切核酸酶并按照使用说明书使用。另外,当RNA作为模板使用时,该试剂盒可以包含用于反转录反应的试剂。DNA聚合酶可以从上述(4)中介绍的DNA聚合酶中选择。内切核酸酶可以从上述(3)中介绍的内切核酸酶中选择。
“使用说明”为印刷的文字,它介绍试剂盒的使用方法,比如制备链置换反应试剂溶液的方法、推荐的反应条件等。使用说明包括一个以小册子或单页形式的使用手册、贴于试剂盒上的标签以及试剂盒包装盒上的说明。使用说明也包括通过电子媒介如因特网提供或披露的信息。
本发明的试剂盒还可包含含有N-二(羟乙基)甘氨酸、N-三(羟乙基)甘氨酸、HEPES、磷酸盐或tris作为缓冲成分的反应缓冲液和退火溶液。另外,它可以包含具有链置换活性的DNA聚合酶及RNase H。该试剂盒还可以包含经修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核苷酸三磷酸类似物。
在本方法中,除上述的说明书和扩增反应试剂之外,用于检测目标核酸的试剂盒还可以含有用于扩增目标核酸的适当的嵌合寡核苷酸引物和适当的上游阻断寡核苷酸、用于检测扩增的目标核酸的试剂比如探针等试剂。
另外,本发明的试剂盒也包括含有用于本发明的嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸和/或上述本发明的探针的试剂盒。
(7)本发明的组合物
本发明提供一种用于上述本发明的核酸扩增方法或上述本发明的核酸检测方法的组合物。比如,该组合物可含有上述(1)介绍的嵌合寡核苷酸引物、上述(2)介绍的上游阻断寡核苷酸、上述(3)所介绍的内切核酸酶以及上述(4)介绍的DNA聚合酶。该组合还可以含有缓冲成分、镁盐、dNTPs等作为进行扩增反应的成分。它还可进一步包含经修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核苷酸三磷酸类似物。另外也可以使用缓冲成分和其它添加剂。
在一种特别优化的情况下,该组合物可以包含适量的如上述的用于本发明核酸扩增方法的各种成分。向上述组合物中只加入适当的模板、嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸即可以进行扩增反应。假如事先已知要扩增的对象,该组合物优选包含适合于扩增的嵌合寡核苷酸引物。
(8)本发明的检测目标核酸的方法
通过使用本发明的核酸扩增方法可以检测样品中的目标核酸。该检测方法包括:
(a)通过上述本发明核酸扩增方法扩增目标核酸;以及
(b)检测上面步骤中要扩增的目标核酸。
在上述的(a)步骤中,假如RNA用作模板,则反转录反应和核酸扩增反应可以一步进行。比如优选AMV RTase、MMLV RTase或RAV-2RTase以及Bca DNA聚合酶的组合作为逆转录酶和链置换型DNA聚合酶的组合,当然这并不限制本发明。
本方法可用于检测或定量样品中的特定基因。也就是说,可以从所有可能含有核酸如DNA或RNA的样品中检测或定量特定基因。可被检测或定量的特定基因样品的例子包括全血、血清、血沉棕黄层、尿液、粪便、脑脊液、精液、唾液、组织(如癌组织或淋巴结)和细胞培养物(如哺乳动物细胞培养物或细菌培养物)等来自生物体的样品,类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母、植物和动物等含有核酸的样品,可能被微生物如病毒或细菌污染或感染的样品(如食品或生物制剂),以及可包含生物体的样品如土壤或废水,当然并不局限于这些。比如,基于源于微生物的目标基因的存在水平或含量,可以检测或定量样品中的类病毒、病毒、真菌、细菌或其它的微生物。特别地,用于检测致病微生物的方法在卫生和环境领域是有用的。而且,本发明的方法可以用于鉴别生物体的基因型或确定基因的表达水平。特别地,检测或确定疾病相关基因的表达状态比如细胞癌变相关基因的检测或确定在医学领域是有用的。在上述检测中,RNA和DNA都可以优选作为模板核酸。
另外,本发明的检测目标核酸的方法可用作目标核酸的遗传多态性分型的方法。
比如,使用的嵌合寡核苷酸引物设计成使该引物的3’-末端部分位于待鉴别的核苷酸序列的特征碱基附近,当然这并不是对本发明的限制。比如,它被设计成使上述碱基与该引物的3’-末端碱基形成氢键。使用上述嵌合寡核苷酸引物进行扩增反应时,假如该引物的3’-末端部分的核苷酸序列与模板核苷酸序列之间存在错配,目标核酸的扩增就不会发生,也没有扩增产物产生。使用这种方法可以得到基因中特征碱基有关的信息,如点突变或单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)。
同样地,本发明的方法也可以用作遗传多态性如缺失突变或插入突变的分型。
本发明的上游阻断寡核苷酸可以用于如PCT/JP02/01222介绍的遗传多态性的分型。
在一个实施例中,在目标核酸的遗传多态性分型的方法中,本发明的上游阻断寡核苷酸可以和一种核苷酸组合使用。这种方法包括:
(1)将含有目标核酸的样品与一种核苷酸混合,其中该核苷酸
(A)其3’末端被修饰以使DNA聚合酶不从该末端延伸;
(B)有一条可以与包含目标核酸特征碱基的区退火的碱基序列;以及
(C)包含这样一条序列,其中在该核苷酸和目标核酸的混合物中,如果特征碱基与该核苷酸中特征碱基所对应的碱基存在错误配对,该核苷酸就不会被核酸酶切割,相反,假如特征碱基和该核苷酸中特征碱基所对应的碱基不存在错配,该核苷酸就被核酸酶切割而产生新的3’末端;
(2)将上述混合物用核酸酶和DNA聚合酶处理;以及
(3)用核酸酶检测该核苷酸是否被切割。
在另外一个实施例中,在目标核酸遗传多态性的分型方法中,可以组合使用本发明的上游阻断寡核苷酸,这种方法包括:
(1)将含有目标核酸的样品和一种核苷酸混合,其中该核苷酸
(A)其3’末端被修饰以使DNA聚合酶不从该末端延伸;
(B)有一条可以与包含目标核酸特征碱基的区退火的碱基序列;以及
(C)包含这样一条序列,其中在该核苷酸和目标核酸的混合物中,如果特征碱基和该核苷酸中特征碱基所对应的碱基不存在错配,该核苷酸就不会被核酸酶切割,然而,假如该特征碱基和该核苷酸中特征碱基所对应的碱基存在错配,该核苷酸就被核酸酶切割而产生新的3’末端;
(2)将上述混合物用核酸酶和DNA聚合酶处理;以及
(3)用核酸酶检测该核苷酸是否被切割。
这里的“遗传多态性”指的是存在于同一个生物体群体中不同个体间的基因的核苷酸序列的差异。核苷酸序列间的差异构成“遗传多态性”,其差异不局限于特定的形式,但包括各种形式,比如“碱基置换”、“缺失突变”和“插入突变”。这种遗传信息中的差异也叫做变异。
“碱基置换”指的是在核酸中的特定位点,核苷酸被另外核苷酸置换。“碱基置换”包括“单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)”。
“缺失突变”指的是在核酸的特定位点,核苷酸序列部分或全部缺失。
“插入突变”指的是在核酸的特定位点插入一段任意长度的核苷酸序列。
在上述实施例中,本发明的上游阻断寡核苷酸与目标核酸上的上述核苷酸上游部分退火。结果是,目标核酸中遗传多态性分型的检测灵敏度得到提高,就如本发明核酸扩增方法一样。
本发明的目标核酸检测方法可以通过直接从包含核酸的样品中扩增该目标核酸来进行。在这种情况下,要扩增的目标核酸的链长度没有特别的限制。比如200bp或更短的区,150bp或更短的区对检测目标核酸的灵敏度更有效。因而优选。通过将本发明的嵌合寡核苷酸引物设计成上述的要扩增的长度,就可以以高灵敏度来检测样品中的目标核酸。
另外,在本发明的检测方法中,通过使用含有N-二(羟乙基)甘氨酸、N-三(羟乙基)甘氨酸、HEPES、磷酸盐或tris为缓冲成分的缓冲液,以及含有亚精胺或丙邻二胺的退火溶液,可以以更高的灵敏度检测目标核酸,即便是痕量的核酸样品。在这种情况下,使用的内切核酸酶和DNA聚合酶没有特定的限制。比如优选Afu RNase H和BcaBESTDNA聚合酶的组合。所述内切核酸酶和DNA聚合酶的最适单位被认为是随酶的种类的不同而变化的。在这种情况下,缓冲液的组合物和加入的酶量可以以检测灵敏度或扩增产物量的升高作为指标来调节。
在本发明的检测方法中,在目标核酸的扩增过程中,dUTP可以作为底物掺入。因此,假如dUTP作为底物使用,就可以通过使用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解扩增产物而防止因扩增产物的遗留污染而导致的假阳性结果。
已知可用于步骤(b)的检测核酸的方法的例子包括电泳检测具有特定长度的反应产物,以及使用与探针的杂交进行检测。另外,优选联合使用磁珠检测方法。通过电泳的检测中,通常使用荧光物质例如溴化乙啶。探针杂交可以与电泳检测联合使用。探针可以用放射性同位素标记或非放射性物质如生物素或荧光物质标记。另外,在步骤(a)中使用标记核苷核可以使掺入标记核苷酸的扩增产物的检测变得容易,或者可以使用该标记物增强检测信号。荧光偏振法、荧光能量转移等方法也可用于进行检测。通过构建一个合适的检测系统,可以自动检测或定量目标核酸。另外,优选通过杂交色谱法进行肉眼检测。
用两种或多种荧光物质标记的核糖核苷酸(RNA)探针、由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成的嵌合寡核糖核苷酸探针均可用于本发明的核酸检测方法中,其中配置荧光物质的距离为使荧光处于猝灭状态。该探针不发出荧光。当它和与探针互补的、由目标核酸扩增的DNA退火时,该探针被RNase H消化。探针上荧光物质间的距离增加,从而引发荧光。因此荧光的发射表明目标核酸的存在。假如RNase H用于本发明的目标核酸扩增方法中,只要向反应混合液中加入上述探针,就可以检测目标核酸。比如荧光物质6-羧基荧光素(6-FAM)和N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)的组合可以优选用于该探针的标记。
本发明还提供一种用于上述目标核酸检测方法的探针。本发明的探针不限于某特定一种,只要它在正常的杂交条件下,能与上述本发明核酸扩增方法扩增所得的目标核酸杂交即可。从扩增产物的特异性检测来看,优选在本领域技术人员公知的严格条件下进行探针杂交。这种严格的杂交条件如T.Maniatis等编辑,Molecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd ed.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory所述。具体来说,该严格条件的典型实例如下:在比使用的探针的Tm值低约25℃,在含0.5%SDS、5×Denhardt’s(0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%Ficoll 400)以及100μg/ml鲑鱼精DNA的6×SSC(1×SSC:0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠,pH7.0)中保温4小时-过夜。为使目标核酸的检测更容易,可以使用具上述标记的探针。
本发明的方法不需要如热循环控制仪之类的设备。按照本发明的方法,通过组合使用嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸,可以提高目标核酸检测的灵敏度。用于PCR的dNTPs等试剂可在本发明的方法中应用。因此,本发明的方法可优选用于例如日常进行的遗传测试领域。本发明的方法在短时间内提供了比PCR方法更多的扩增产物。因此,本发明的方法可作为一种方便、快速和灵敏的基因检测方法来使用。
在基因组水平的遗传分析中,尝试使反应系统小型化并提高集成度以分析大量的核苷酸序列。应用最新的超精细处理技术,已经为上述目的开发出了一个系统,在此系统中,基因组分析的基本过程(比如从细胞中提取DNA、DNA扩增反应、电泳、杂交、目标DNA的检测等)全部被集成在几个平方厘米到指尖大小的微芯片上。这个系统被称为微芯片或纳米芯片。
目前正考虑将PCR作为基因扩增反应应用于此系统。然而,既然PCR需要随时的反复地进行温度升降的控制,此系统将会变得复杂起来。而本发明可以在等温条件下扩增核酸,使用本发明的方法,该系统可以被简化,此法很适宜应用于上述的集成系统中。应用本发明的技术,可以构建一个高度集成的系统。
实施例
下面的例子进一步具体说明本发明,但不能将其理解为对其应用范围的限制。
参考例1:从闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)中克隆RNase HII基因
(1)从闪烁古生球菌中制备基因组DNA
由8ml培养物中收集闪烁古生球菌细胞(购自Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;DSM4139)悬浮于100μL25%蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中加入20uL 0.5M EDTA和100μL 10mg/ml溶菌酶氯化物(Nacalai Tesque)水溶液。上述混合液在20℃反应1小时。反应之后,向该反应液中加入800μL含有150mM NaCl、1mM EDTA、20mM tris-HCl(pH8.0)、10μL 20mg/ml蛋白酶K(TakaraShuzo)以及50μL 10%月桂基硫酸钠水溶液的混合液。该混合液在37℃保温1小时。反应后,混合物用苯酚-氯仿萃取,乙醇沉淀,风干,然后溶于50μL TE中,得到基因组DNA溶液。
(2)RNase HII基因的克隆
该闪烁古生球菌的全部基因组序列已经发表[Nature,390:364-370(1997)]。已知存在一个编码RNase HII(AF0621)同源物的基因(SEQ IDNO:1,http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。
在AF0621基因(SEQ ID NO:1)的序列的基础上合成引物AfuNde(SEQ ID NO:2)和AfuBam(SEQ ID NO:3)。
用30ng在(1)中制备的闪烁古生球菌基因组DNA为模板,各20pmol AfuNde和AfuBam作为引物,总体积为100μL,进行PCR。Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)按照所附说明书用作PCR的DNA聚合酶。PCR如下进行:94℃30秒、55℃30秒,72℃1分钟,循环40次。用NdeI和BamHI(均购自于Takara Shuzo)消化约0.6kb的扩增DNA片段。然后将所得的DNA片段掺入到质粒载体pTV119Nd(pTV119N质粒的NcoI位点转化为NdeI位点)的NdeI和BamHI位点之间,构建质粒pAFU204。
(3)确定包含RNase HII基因的DNA片段的核苷酸序列
插入(2)中得到的pAFU204中的DNA片段的核苷酸序列按照双脱氧法来确定。
对确定的核苷酸序列分析,发现可能是编码RNase HII的一个可读框。该可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。由该核苷酸序列得到的RNase HII氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
利用质粒pAFU204转化的大肠杆菌JM109已设计好并表示为大肠杆菌JM109/pAFU204,于2001年2月22日以保藏号FERM P-18221保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心,日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566);同时以保藏号FERM BP-7691保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(申请转为国际保藏的日期:2001年8月2日)。
(4)纯化RNase HII标品的制备
用上述(2)中得到的pAFU204转化大肠杆菌JM109。将得到的含有pAFU204的大肠杆菌JM109接种到2L含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,在37℃振荡培养16小时。培养后,将离心收集的细胞悬浮于37.1ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、2mM苯甲基磺酰氟]进行超声破碎。超声破碎的悬浮液在12000rpm下离心10分钟,得到的上清液在70℃加热15分钟。然后在12000rpm下再离心10分钟,取上清液。得到40.3ml加热的上清液。
加热的上清液用RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)处理,该柱已用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡,使用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行层析。结果RNase HII流过RESOURSE Q柱。
流出的RNase HII级分用经缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)处理,使用FPLC系统(AmershamPharmacia Biotech)进行层析。结果RNase HII流过RESOURSE S柱。
40.0ml RNase HII流出级分相对于2L含有50mM NaCl的缓冲液B(50mM tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA)透析2小时。再重复透析两次。40.2m1经透析的酶液用经含有50mM NaCl的缓冲液B平衡的HiTrap-heparin柱(Amersham Pharmacia Biotech)处理,使用FPLC系统进行50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果,在240mM NaCl附近洗脱得到包含RNase HII的级分。
得到的7.8ml RNase HII级分使用Centricon-10(Amicon)进行超滤浓缩。从约600μL上述浓缩液分别分离得到的四份,分别用经含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡的Superose6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)处理,用相同的缓冲液洗脱。结果,RNase HII在分子量为30.0千道尔顿的位置被洗脱出来。该分子量与单体形式的RNase HII的分子量相当。
上述洗脱的RNase HII用作Afu RNase HII标品。
上述得到的Afu RNase HII标品的酶活性如下测定。
将100μL反应混合液[20mM HEPES-氢氧化钾(pH7.8)、0.01%牛血清白蛋白(Takara Shuzo)、1%二甲基亚砜、4mM乙酸镁、20μg/mlpoly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)、30μg/ml poly(rA)(AmershamPharmacia Biotech)]在40℃保温后,加入到1μL上述Afu RNase HII标品中。混合液在40℃反应10分钟。然后加入10μL 0.5M EDTA(pH8.0)中止反应。测量260nm处的吸光度。结果观测到Afu RNase HII标品的RNase H活性。
耐热RNase H的酶活单位如下计算。
1mg poly(rA)或poly(dT)(均购自于Amersham Pharmacia Biotech)分别溶解于1ml含有1mM EDTA的40mM tris-HCl(pH7.7)中,得到poly(rA)和poly(dT)溶液。
将上述poly(rA)溶液(终浓度为20μg/ml)和poly(dT)溶液(终浓度为30μg/ml)加入到含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003%BSA和4%甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。该混合液在37℃反应10分钟,然后冷却到4℃,制备poly(rA)-poly(dT)溶液。向100μL poly(rA)-poly(dT)溶液中加入1μL适当稀释的酶液。该混合液在40℃反应10分钟。向其中加入10μL 0.5M EDTA中止反应。测量260nm处的吸光度。作为对照,向上述反应混合液中加入10μL 0.5M EDTA,所得的混合液在40℃反应10分钟,测量其吸光度。不含EDTA的反应液的吸光度减去对照的吸光度得到一个值(吸光度差值)。因而,通过酶促反应从poly(rA)-poly(dT)杂交链上游离出的核苷酸的浓度就可在上述吸光度差值基础上来确定。RNase H的一个单位定义为引起A260相应增加的酶量,其相当于10分钟内1nmol核糖核苷酸的游离量。计算公式如下:单位=[吸光度差值×反应体积(ml)]/0.0152×(110/100)×稀释比例
实施例1
(1)引物和阻断寡核苷酸的设计
测试嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸的组合物,其中的上游阻断寡核苷酸能在模板核酸与该引物退火的位置的3’侧的任意位置退火。首先,使用DNA合成仪,在沙眼衣原体质粒的核苷酸序列(GenBank检索号X06767)的基础上,合成用于检测沙眼衣原体质粒DNA、CT-BF19-3(SEQ ID NO:6)和CT-BR23-2(SEQ ID NO:7)的嵌合引物。另外,合成上游阻断寡核苷酸、CR-FBK(SEQ ID NO:8)和CR-RBK(SEQ ID NO:9),它们都有沙眼衣原体质粒DNA的核苷酸序列,都能在模板核酸与上述嵌合寡核苷酸引物退火的位置的3’侧的任意位置退火。该上游寡核苷酸通过在3’末端氨基化而被阻断,从而使DNA聚合酶作用下的延伸反应不能继续进行。上游阻断寡核苷酸CR-FBK和CR-RBK分别是有义和反义的寡核苷酸。
(2)衣原体阳性对照的制备
通过PCR扩增和纯化SEQ ID NO:10所示的衣原体基因的一部分560bp片段,使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将上述扩增的片段插入到pT7 Blue T载体上,和转化大肠杆菌JM109制备衣原体阳性对照质粒。
(3)ICAN反应
准备终体积为25μL的反应混合液,其中含有1μL水作为阴性对照或含有上述(2)中制备的102-106个拷贝的阳性对照DNA的溶液、在(1)中合成的嵌合寡核苷酸引物各50pmol及上游阻断寡核苷酸各100pmol,同时含有:各0.5mM dNTPs、32mM Hepes-KOH缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、4.0mM乙酸镁、0.01%牛血清白蛋白,1.0%二甲基亚砜、4.375U Afu RNase H和2.64U BcaBEST DNA聚合酶(TakaraShuzo)。反应混合液用热循环控制仪在60℃保温1小时。以未加上游阻断寡核苷酸的组作为对照。反应后,每组反应混合液各取5μL,用3.0%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。结果如图1所示。图1A表示未加上游阻断寡核苷酸的反应体系的结果。泳道1:100-bp DNA ladder marker;泳道2:阴性对照(水);泳道3:102个拷贝的模板;泳道4:103个拷贝的模板;泳道5:104个拷贝的模板;泳道6:105个拷贝的模板;泳道7:106个拷贝的模板。图1B表示加入了上游阻断寡核苷酸的反应体系的结果。泳道1:100-bp DNA ladder marker;泳道2:阴性对照(水);泳道3:102个拷贝的模板;泳道4:103个拷贝的模板;泳道5:104个拷贝的模板;泳道6:105个拷贝的模板;泳道7:106个拷贝的模板。
如图1所示,对于未加上游阻断寡核苷酸的组,在使用105个拷贝的模板情况下观察到扩增反应。相反的,对于加入了上游阻断寡核苷酸的组,在使用103个拷贝的模板的情况下观察到扩增反应。因此,与未加上游阻断寡核苷酸的对照组相比,灵敏度增加了两个数量级。基于这些结果,可以确认,通过使用嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸的组合物,检测的灵敏度得到提高,其中的上游阻断寡核苷酸能在模板核酸上与嵌合寡核苷酸引物退火的位置的3’侧任意的位置退火。
工业适应性
本发明提供了一种目标核酸扩增的方法,其中通过使用嵌合寡核苷酸引物和上游阻断寡核苷酸的DNA合成反应,来对目标核酸的核苷酸序列中的某个适合于特异性扩增的区进行扩增。本发明进一步提供了一种检测目标核酸的方法,它包括检测通过所述的目标核酸扩增的方法得到的目标核酸的扩增片段的步骤。
序列表独立文本
SEQ ID NO:2:PCR引物AfuNde,用于克隆编码来自于闪烁古生球菌的具有RNaseHII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO:3:PCR引物AfuBam,用于克隆编码来自于闪烁古生球菌的具有RNaseHII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO:6:设计的嵌合寡核苷酸引物,特指CT-BF19-3,用于扩增沙眼衣原体质粒DNA的某个部分。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO:7:设计的嵌合寡核苷酸引物,特指CT-BR23-2,用于扩增沙眼衣原体质粒DNA的某个部分。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO:8:设计的寡核苷酸,特指CR-FBK。
SEQ ID NO:9:设计的寡核苷酸,特指CR-RBK。
序列表
<110>宝生物工程株式会社(TAKARA BIO INC.)
<120>核酸扩增的方法
<130>663373
<150>JP 2001-249497
<151>2001-08-20
<160>10
<210>1
<211>626
<212>DNA
<213>闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)
<400>1
atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca    60
ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag    120
ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag    180
gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag    240
attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt    300
gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg    360
agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc    420
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ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca    540
ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag    600
acgcttgacg atttctaaac gaaacc                                         626
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆编码来自闪烁古生球菌的具有RNaseHII活性的多肽的基因的PCR引物
AfuNde
<400>2
aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg                                      30
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆编码来自于闪烁古生球菌的具有RNaseHII活性的多肽的基因的PCR引物
AfuBam
<400>3
tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc                                      30
<210>4
<211>638
<212>DNA
<213>闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)
<400>4
catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt    60
gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa    120
aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg    180
gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac    240
gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat    300
gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg    360
ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca    420
atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat    480
ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct    540
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aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc    638
<210>5
<211>205
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)
<400>5
Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly
  1               5                  10                  15
Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu
                 20                  25                  30
Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg
                 35                  40                  45
Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu
                 50                  55                  60
Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala
                 65                  70                  75
Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile
                 80                  85                  90
Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val
                 95                 100                 105
Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu
                110                 115                 120
Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val
                125                 130                 135
Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile
                140                 145                 150
Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala
                155                 160                 165
Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser
                170                 175                 180
Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser
                185                 190                 195
Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe
                200                 205
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物CT-BF19-3,用于扩增沙眼衣原体质粒DNA的某个部分。“核
苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>6
catacggttt tcctcgatga uu                                              22
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物CT-BR23-2,用于扩增沙眼衣原体质粒DNA的某个部分。“核
苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>7
gatctacgca atggattttc auu                                             23
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸CR-FBK
<400>8
gacaagctta gatccgtttc                                                 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸CR-RBK
<400>9
cgctcaagca atagaaacgg                                                 20
<210>10
<211>560
<212>DNA
<213>沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400>10
atgcgttgtt aggtaaagct ctgatatttg aagactctac tgagtatatt ctgaggcagc    60
ttgctaatta tgagtttaag tgttctcatc ataaaaacat attcatagta tttaaatact    120
taaaagacaa tggattacct ataactgtag actcggcttg ggaagagctt ttgcggcgtc    180
gtatcaaaga tatggacaaa tcgtatctcg ggttaatgtt gcatgatgct ttatcaaatg    240
acaagcttag atccgtttct catacggttt tcctcgatga tttgagcgtg tgtagcgctg    300
aagaaaattt gagtaatttc attttccgct cgtttaatga gtacaatgaa aatccattgc    360
gtagatctcc gtttctattg cttgagcgta taaagggaag gcttgacagt gctatagcaa    420
agactttttc tattcgcagc gctagaggcc ggtctattta tgatatattc tcacagtcag    480
aaattggagt gctggctcgt ataaaaaaaa gacgagcaac gttctctgag aatcaaaatt    540
ctttctttga tgccttccca                                                560

Claims (6)

1.一种扩增核酸的方法,该方法包括:
(a)混合模板核酸、一种脱氧核糖核苷酸三磷酸、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种嵌合寡核苷酸引物、至少一种上游阻断寡核苷酸以及一种RNase H制备反应混合液,
其中所述嵌合寡核苷酸引物与模板核酸的核苷酸序列实质互补,它含有核糖核苷酸,以及还含有选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种,所述核糖核苷酸位于该引物的3’末端或3’-末端侧,以及
其中所述上游阻断寡核苷酸与模板核酸上与所述嵌合寡核苷酸引物实质互补的区的3’侧的核苷酸序列实质互补,而且该上游阻断寡核苷酸3’末端的核苷酸是经过修饰的,从而使在DNA聚合酶作用下互补链延伸反应不发生;以及
(b)将上述反应混合液保温足够的时间以生成反应产物。
2.如权利要求1的扩增核酸的方法,其中反应混合液还含有第二嵌合寡核苷酸引物,它具有与模板核酸的核苷酸序列实质同源的序列。
3.如权利要求2的扩增核酸方法,其中反应混合液还含有下述上游阻断寡核苷酸:它具有与模板核酸上某区的5’侧的核苷酸序列实质同源的序列,而某区具有与第二嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列实质同源的序列,而且上述上游阻断寡核苷酸3’末端的核苷酸被修饰,从而使在DNA聚合酶作用下的互补链延伸反应不发生。
4.一种用于权利要求1所定义的核酸扩增方法的组合物,它包含至少一种嵌合寡核苷酸引物和至少一种上游阻断寡核苷酸。
5.一种用于权利要求1所定义的核酸扩增方法的试剂盒,它包含至少一种嵌合寡核苷酸引物和至少一种上游阻断寡核苷酸。
6.一种检测目标核酸的方法,该方法包括:
(a)用权利要求1所定义的核酸扩增方法扩增目标核酸;以及
(b)检测上面步骤中扩增得到的目标核酸。
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