CN100537756C - 重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法。本发明所提供的重组小鼠白血病病毒逆转录酶，是将MLV-RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基X的蛋白质，其中X为丙氨酸或天门冬酰胺。本发明的重组小鼠白血病病毒逆转录酶具有比Superscript更高酶活性和持续合成能力，将在生物技术领域中发挥重要作用，可以广泛用于cDNA的合成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种重组逆转录酶及其编码基因与表达方法，特别涉及一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法。
背景技术
逆转录酶(Reverse Transcriptase，简称RT)是由逆转录病毒编码的DNA聚合酶，能以RNA或DNA作为模板合成DNA。逆转录酶是分子生物学研究的常用工具酶，可以将RNA逆转录成cDNA，主要用于cDNA文库的构建或与聚合酶链式反应(PCR)合用(RT-PCR)检测生物样品中RNA的含量。目前市场上占主导地位的逆转录酶是小鼠白血病病毒(Murine Leukemia Virus，简称MLV)的逆转录酶(MLV-RT)。
MLV-RT由两个功能域组成，同时含有两种酶活性，即位于N端的DNA聚合酶(Pol)和位于C端的RNase H。两个功能域可分别表达，而不影响任何一种酶的活性。用于cDNA合成的第一代重组MLV-RT只含有DNA聚合酶部分而不含有RNaseH部分，虽然酶的活性与全长的MLV-RT相似，但其持续合成能力较弱，合成的cDNA较短。后来人们发现，RNaseH部分虽然不影响MLV-RT的DNA聚合酶活性，却影响其持续合成能力，原因是RNaseH结构域能结合模板一引物复合体，增加MLV-RT与模板一引物的亲和力。当利用定点突变方法将位于RNaseH活性中心的第524位的天门冬氨酸(Asp)突变为天门冬酰胺(Asn)，成为MLV-RT-D524N，该酶不具有RNaseH活性，但保留了其DNA聚合酶的活性和对模板一底物的高亲和力，因此具有更高的持续合成能力。该突变酶为美国Invitrogen公司专利产品，商品名为Superscript，是目前使用最为广泛的逆转录酶。但是，Superscript也并非完美无缺，其持续合成能力尚不理想，合成的cDNA中绝大部分还是不完整的。
发明公开
本发明的目的是提供一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶。
本发明所提供的重组小鼠自血病病毒逆转录酶，名称为MLV-RT-Q84X，是将MLV-RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基X的蛋白质，其中X为侧链短于谷氨酰胺残基侧链的氨基酸。
为了进一步提高其活性，再将上述重组小鼠白血病病毒逆转录酶的自N端第524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基，所得到的重组小鼠白血病病毒逆转录酶的名称为MLV-RT-Q84X-D524N。
其中，所述X优选为丙氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸或天门冬酰胺，尤其优选为丙氨酸。
上述重组小鼠白血病病毒逆转录酶的编码基因也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶的方法。
一种表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶的方法，是将含有重组小鼠白血病病毒逆转录酶编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳性克隆，表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶；所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶，是将MLV-RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基X的蛋白质，其中X为侧链短于所述谷氨酰胺侧链的氨基酸。
其中，所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶优选为将MLV-RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基X，自N端第524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基的蛋白质，其中X为侧链短于所述谷氨酰胺侧链的氨基酸；尤其优选为将MLV-RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为丙氨酸残基，自N端第524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基的蛋白质。
所述含有重组小鼠白血病病毒逆转录酶编码基因的表达载体可以是具有序列表中序列1的核苷酸序列的质粒pTacRT-Q84A-D524N或具有序列表中序列3的核苷酸序列的质粒pTacRT-Q84N-D524N，所述大肠杆菌为EscherichiacoliBL21，质粒pTacRT-Q84A-D524N和质粒pTacRT-Q84N-D524N所表达的重组小鼠白血病病毒逆转录酶的氨基酸序列分别如序列表中的序列2和序列4所示。其中，序列表中的序列1和序列3均由7488个碱基组成，它们的开放阅读框架均自5′端第1515位碱基-3527位碱基，序列表中序列2和4均由671个氨基酸残基组成。
附图说明
图1为纯化后的MLV-RT-Q84A-D524N SDS-PAGE电泳检测图
图2为MLV-RT-Q84A-D524N与MLV-RT-D524N酶动力学分析图
图3为利用MLV-RT-Q84A-D524N和MLV-RT-D524N合成的cDNA的比较图
图4为纯化后的MLV-RT-Q84N-D524N SDS-PAGE电泳检测图
图5为MLV-RT-Q84N-D524N的酶活测定图
实施发明的最佳方式
实施例1、MLV-RT-Q84A-D524N的制备
1、质粒pTacRT-Q84A-D524N的构建
本步骤中将MLV-RT-D524N中的第84位的谷氨酰胺突变为丙氨酸，使之成为MLV-RT-Q84A-D524N。
MLV-RT-Q84A-D524N的定点突变采用将两段PCR产物AflII-EcoRI和EcoRI-MfeI替换掉pTacRT-D524N(Blain，S.W.&Goff，S.P.(1995)J.Virol.69，4440-4452。)的AflII-MfeI片段(nt1467-2058)。引物Q84A-SP(5’CGGAATTCTGGTACCCTGCCAGTC)包含有一个由于同义突变产生的EcoRI酶切位点(用下划线表示)，它和下游引物(5’TGGGAGTCTGGTCCAGG)PCR扩增得到一个300bp的EcoRI-MfeI片段。引物Q84A-AP(5’CGGAATTCCCGCGTCCAACAGTCTCTGTA)同样包含有一个由于同义突变产生的EcoRI酶切位点以及突变的丙氨酸密码子(黑体表示)，它和上游引物(5’GTGGAATTGTGAGCCGA)经PCR扩增得到一个300bp的AflII-EcoRI片段。将分别用AflII/EcoRI双酶切处理过的AflII-EcoRI片段(nt1467-1770)以及EcoRI/MfeI双切处理过的EcoRI-MfeI(nt1770-2058)片段与经AflII-MfeI双切过的载体pTacRT-D524N6.9kb片段连接，转化大肠杆菌Top10。所得重组质粒pTacRT-Q84A-D524N通过酶切鉴定为阳性克隆，双脱氧法测序表明其具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
2、重组逆转录酶在大肠杆菌中的诱导和表达
将pTacRT-Q84A-D524N转化Escherichia coli BL21，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600≈0.5时，加入IPTG至终浓度0.5mM，37℃继续培养2-3小时，收集菌体，将菌体用预冷的50mM Tris-HCl(pH7.5)洗涤一次后备用。
3、重组逆转录酶的纯化
将收集的菌体悬浮于缓冲液A(20mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)，冻融后，加入溶菌酶至终浓度0.5mg/ml，4℃消化30min，超声(功率：190W)破碎3次，每次20秒，离心，收集上清。经过金属螯合层析柱HiTrap chelatingHPcolumn(购自Pharmacia)分离纯化后，纯度即可达80％以上，根据SDS-PAGE显示分子量大小，确定并收集活性蛋白峰。经过离子交换层析柱MonoS(购自Pharmacia)进一步分离纯化后，电泳检测考马斯亮蓝染色，结果如图1所示，表明该蛋白为一分子量约为76KD的均一条带，未见杂质。图1中，M为分子量标准；1表示样品中含5微克蛋白；2表示样品中含2微克蛋白。
4、酶活性测定及动力学分析
50μl反应体系中包括10ng RT纯酶样品，60mM Tris.Hcl(pH8.0)，75mMNaCl，0.7mM MnCl2，5mM DTT，12μg/ml Poly(rA)模板，6μg/ml oligo(dT)18引物，10μCi/ml(1Ci＝37GBq)32P标记的dTTP以及12μM未标记的dTTP，反应于37℃进行。分别于反应开始后不同时间点取样4μl点于DE81滤纸，终止反应。然后将DE81滤纸用2×SSC洗涤三次，95％乙醇漂洗两次，将滤纸晾干后，放射自显影。定量分析采用液闪计数仪测定。
动力学分析采用公知的双倒数作图法进行，如图2所示。用每个样品中“保留在DE81滤纸的放射强度/同一样品总的放射强度”来表示掺入到产物中的dTTP的量。动力学分析显示，在以dTTP为底物时，MLV-RT-Q84A-D524N和RT-D524N具有相似的Km(分别为11.04μM和12.94μM)，而MLV-RT-Q84A-D524N的最大反应速率Vmax值则是MLV-RT-D524N的3.2倍(分别为0.41μmol.min-1.mg-1和0.13μmol.min-1.mg-1)(如表1)。
表1.MLV-RT-Q84A-D524N与MLV-RT-D524N酶动力学参数比较
| 逆转录酶 | Vmax(μmol.min<sup>-1</sup>.mg<sup>-1</sup>) | Km(μM) |
| RT-D524N | 0.13±0.04 | 12.94±2.08 |
| RT-Q84A-D524N | 0.41±0.04 | 11.05±0.72 |
5.cDNA合成
本步骤比较了MLV-RT-Q84A-D524N与MLV-RT-D524N在合成cDNA能力方面的差异。
cDNA合成采用293T细胞的总RNA为模板，oligo(dT)18为引物合成第一链cDNA，产物中掺有32P作为标记。20μl反应体系中包括1μg293T细胞总RNA，50mM Tris.Hcl(pH8.3)，75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，500μM dTTP，50μg/ml oligo(dT)18，2μCi32PdTTP，1μg RT纯酶样品。42℃反应1小时。碱变性电泳检测实验结果。结果如图3所示，表明MLV-RT-Q84A-D524N合成的cDNA片段不但较RT-D524N合成的长，而且合成的cDNA量也比RT-D524N多。
实施例2、MLV-RT-Q84N-D524N的制备
1、质粒pTacRT-Q84N-D524N的构建
本步骤中将MLV-RT-D524N中的第84位的谷氨酰胺突变为天门冬酰胺，使之成为MLV-RT-Q84N-D524N。
MLV-RT-Q84N-D524N的定点突变采用将两段PCR产物AflII-BamHI和BamHI-MfeI替换掉pTacRT-D524N(Blain，S.W.&Goff，S.P.(1995)J.Virol.69，4440-4452。)的AflII-MfeI片段(nt1467-2058)。引物Q84N-SP(5’CGGGATCCTGGTACCCIGCCAGTC)包含有一个由于同义突变产生的BamHI酶切位点(用下划线表示)，它和下游引物(5’TGGGAGTCTGGTCCAGG)PCR扩增得到一个300bp的BamHI-MfeI片段。引物Q84N-AP(5’CGGGATCCCGTTGTCCAACAGTCTCTGTA)同样包含有一个由于同义突变产生的BamHI酶切位点以及突变的天门冬酰胺密码子(黑体表示)，它和上游引物(5’GTGGAATTGTGAGCCGA)经PCR扩增得到一个300bp的AflII-BamHI片段。将分别用AflII/BamHI双酶切处理过的AflII-BamHI片段(nt1467-1770)以及BamHI/MfeI双切处理过的BamHI-MfeI(nt1770-2058)片段与经AflII-MfeI双切过的载体pTacRT-D524N6.9kb片段连接，转化大肠杆菌Top10。所得重组质粒pTacRT-Q84N-D524N通过酶切鉴定为阳性克隆，双脱氧法测序表明其具有序列表中序列3所示的核苷酸序列。
2、重组逆转录酶在大肠杆菌中的诱导和表达
将pTacRT-Q84N-D524N转化Escherichia coli BL21，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600≈0.5时，加入IPTG至终浓度0.5mM，37℃继续培养2-3小时，收集菌体，将菌体用预冷的50mM Tris-HCl(pH7.5)洗涤一次后备用。
3、重组逆转录酶的纯化
将收集的菌体悬浮于缓冲液A(20mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)，冻融后，加入溶菌酶至终浓度0.5mg/ml，4℃消化30min，超声(功率：190W)破碎3次，每次20秒，离心，收集上清。经过金属螯合层析柱HiTrap chelating HPcolumn(购自Pharmacia)分离纯化后，纯度即可达80％以上，根据SDS-PAGE显示分子量大小，确定并收集活性蛋白峰。经过离子交换层析柱MonoS(购自Pharmacia)进一步分离纯化后，电泳检测考马斯亮蓝染色，结果如图4所示，表明该蛋白为一分子量约为76KD的均一条带，未见杂质。图4中，M为分子量标准；1表示样品中含1微克蛋白；2表示样品中含2微克蛋白；3表示样品中含5微克蛋白。
4、酶活性测定及动力学分析
50μl反应体系中包括10ng RT纯酶样品，60mM Tris.Hcl(pH8.0)，75mMNaCl，0.7mM MnCl2，5mM DTT，12μg/ml Poly(rA)模板，6μg/ml oligo(dT)18引物，10μCi/ml(1Ci＝37GBq)32P标记的dTTP以及12μM未标记的dTTP，反应于37℃进行。分别于反应开始后不同时间点取样4μl点于DE81滤纸，终止反应。然后将DE81滤纸用2×SSC洗涤三次，95％乙醇漂洗两次，将滤纸晾干后，放射自显影。结果如图5所示，图中黑点颜色的深浅代表酶活力的高低。结果显示MLV-RT-Q84N-D524N的酶活力较MLV-RT-D524N高，跟MLV-RT-Q84A-D524N的活力相当。
工业应用
本发明通过分析MLV-RT的晶体结构模型，发现该酶第84位的谷氨酰胺(Q84)位于酶的活性中心附近，参与调控酶的催化能力，其较长的侧链妨碍合成产物的延伸，影响DNA聚合酶的活性和持续合成能力。本发明将MLV-RT基因进行突变，使Q84残基突变成侧链较短的残基，产生了新的突变酶MLV-RT-Q84X，其中X为侧链短于谷氨酰胺侧链的氨基酸，如丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、天门冬酰胺(Asn)、或天门冬氨酸(Asp)等。同时，本发明将Q84X突变引入MLV-RT-D524N中，使之成为MLV-RT-Q84X-D524N。本发明的重组小鼠白血病病毒逆转录酶具有比Superscript更高酶活性和持续合成能力，将在生物技术领域中发挥重要作用，可以广泛用于cDNA的合成。
序列表
<160>4
<210>1
<211>7488
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
<210>2
<211>671
<212>PRT
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<220>
<223>
<400>4
Claims (7)
1、一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶，是将MLV-RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基X、自N端第524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基的蛋白质，其中X为丙氨酸或天门冬酰胺。
2、根据权利要求1所述的重组小鼠白血病病毒逆转录酶，其特征在于：所述X为丙氨酸。
3、编码权利要求1所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶的基因。
4、一种表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶的方法，是将含有重组小鼠白血病病毒逆转录酶编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳性克隆，表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶；所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶，是将MLV-RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基X、自N端第524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基的蛋白质，其中X为丙氨酸或天门冬酰胺。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述X为丙氨酸。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述含有重组小鼠白血病病毒逆转录酶编码基因的表达载体是核苷酸序列如序列表中序列1所示的质粒pTacRT-Q84A-D524N。
7、根据权利要求4、5或6所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21。
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