CN107653256A - 一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用，烟草多酚氧化酶基因NtPPO1核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的克隆方法，具体步骤包括：A、烟草叶片cDNA合成：B、NtPPO1基因的PCR扩增；C、NtPPO1基因的CRISPR/Cas9载体的构建；D、NtPPO1基因突变测序检测。NtPPO1基因在防止烟草褐变方面具有广阔的应用前景。本发明的多酚氧化酶基因及其编码蛋白为农作物尤其是烟草抗褐变育种提供基因与技术的支持。

Description

一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用。

背景技术

多酚氧化酶（PPO，polyphenol oxidase）是在自然界中广泛存在的一类铜结合酶，一般具有两种活性:加氧酶及脱氢酶活性。多酚氧化酶广泛存在于动植物及真菌中，多酚氧化酶可被分为单酚氧化酶（酪氨酸酶，tyrosinase）、双酚氧化酶（儿茶单酚氧化酶，catechol oxides）和漆酶（laccase）。

植物中的PPO基因多以基因家族形式存在。在茄科经济作物中，茄子中找到个6个PPO基因；番茄中发现7个PPO基因；马铃薯中有2个PPO基因。红三叶草中找到至少6个PPO基因。Cai等发现高粱中存在8个不同的PPO基因。但葡萄藤中只发现一个PPO基因。

PPO活性具有植物组织差异性。PPO广泛存在于植物的多种器官中，如叶片、根、块茎及花中，幼嫩部位含量较高而在成熟部位含量较低(谢春艳和宾金华, 1999)。马铃薯中PPO在块茎、根及花中含量较高，而在叶片中含量较低；PPO的活性随着块茎的发育不断升高。PPO活性在烟草苗期活性较高；进入旺长期后，叶片中PPO活性继续升高；进入成熟期后，PPO活性逐渐下降；并且PPO活性呈现上部叶>中部叶>下部叶的规律。

PPO活性受到外界环境的调控。嘎拉苹果多酚氧化酶反应的最适pH值为6.0，最适反应温度是45℃。Palma-Orozco从马曼果中分离出两种同工酶（PPO1和PPO2），最适pH为7.0，最适温度是35℃。Rahman从花椰菜中分离出一种PPO，最适pH为8.0，最适温度为55℃。Han-Ju（2012）从油菜花中分离出的PPO最适pH为5.5，在60℃到70℃之间活性较为稳定。

多酚氧化酶在烟叶酶促褐变反应中具有重要的作用。烟草中多酚氧化酶能够将酚加氧催化生成醌；醌能够与其它物质如蛋白质、氨基酸及其它化合物结合生成色素类物质。该过程在烟草中被称为多酚氧化酶介导的酶促棕化反应，该过程中绿原酸、芸香苷等烟草重要的致香前体物质氧化为淡红色至黑褐色物质；因此会显著降低烟叶的外观品质，减少烟叶香气成份，最终会导致烟叶外观与内在品质下降，从而给烟农与烟企带来经济损失。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1；第二目的在于提供所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法；第三目的在于提供所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、NtPPO1基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA作为模板，根据NtPPO1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtPPO1基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

D、NtPPO1基因突变测序检测：根据NtPPO1基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtPPO1的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtPPO1基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1在获得抗烟草褐变转基因植株中的应用。

CRISPR/Cas9技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。

CRISPR/Cas9技术使用一段序列特异性向导RNA分子（sequence-specific guideRNA，sgRNA）引导高度保守的CRISPR相关基因（Crispr-associated gene,Cas gene, Cas9）编码的核酸内切酶,到靶位点处对DNA序列进行特异性的切割，从而完成基因组的编辑。CRISPR/Cas系统的开发为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台。

CRISPR/Cas系统的载体构建较以往的基因编辑系统更为简便快捷，该系统已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造，以及水稻、拟南芥、烟草、线虫、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。

目前对CRISPR/Cas系统的优化改进的研究成果不断涌现，主要集中在利用CRISPR/Cas系统实现多个基因同步编辑/敲除和提高CRISPR/Cas系统的精确性，减少脱靶率，从而降低细胞毒性和潜在风险。

本项发明利用CRISPR/Cas9技术，特异性的在烟草多酚氧化酶NtPPO1基因靠近ATG翻译起始部位设计靶位点，成功的造成了NtPPO1基因的突变。通过实时定量技术(realtimePCR)检测到该基因的表达量降低，并且通过检测NtPPO1基因纯合突变的PPO酶活性有降低。

附图说明

图1为NtPPO1-64植株测序比较图；

图2为NtPPO1-64-1植株自交纯合突变测序比较图；

图3为NtPPO1-64-1突变体NtPPO1基因表达量降低示意图；

图4为NtPPO1-64-1突变体PPO酶活性降低示意图；

图5为NtPPO1-70植株测序比较图；

图6为NtPPO1-70-1植株自交纯合突变测序比较图；

图7为NtPPO1-70-1突变体NtPPO1基因表达量降低示意图；

图8为NtPPO1-70-1突变体PPO酶活性降低示意图；

图9为NtPPO1-72植株测序比较图；

图10为NtPPO1-72-1植株自交纯合突变测序比较图；

图11 为NtPPO1-72-1突变体NtPPO1基因表达量降低；

图12为NtPPO1-72-1突变体PPO酶活性降低；

图13为NtPPO1基因PCR扩增产物琼脂凝胶电泳图；

图14为pORE-CRISPR/Cas9表达载体示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、NtPPO1基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA作为模板，根据NtPPO1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtPPO1基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

D、NtPPO1基因突变测序检测：根据NtPPO1基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtPPO1的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtPPO1基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。

B步骤中所述的引物为：

正向引物：5’-ATGGCTTCTTCATTTGTTCTTCAAGC-3’

反向引物：5’-TTAACAAGGGACCAACTGGATCTCAAC-3’。

B步骤中PCR反应体系为：PCR扩增体系为50μl，其中包含10.0μl 的5 X buffer（10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，pH 8.3 @ 25℃。），4μl 的 2.5 mM dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China），2μl 浓度10μM 的上下游引物，0.5μl的2000U/ml高保真DNA聚合酶（NEB），20-50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐50μl；反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。

C步骤中sgRNA序列为： 5’-CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-3’。

D步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’-TTCACGCACTAATTCGTCTCATTGGA-3’

反向引物：5’-TCTGTCGGCAACGCCTTCA-3’。

本发明所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的应用为所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1在获得抗烟草褐变转基因植株中的应用。

本发明所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，具体操作如下：

NtPPO1基因cds序列的验证

烟草叶片cDNA的合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；以烟草叶片cDNA为模板，根据NtPPO1基因序列设计引物，进行PCR扩增。

扩增cDNA的引物：

正向引物：5’-ATGGCTTCTTCATTTGTTCTTCAAGC-3’

反向引物：5’-TTAACAAGGGACCAACTGGATCTCAAC-3’

通过高保真酶扩增后，PCR产物做克隆之后送测序，5个克隆中4个克隆的cds序列为NtPPO1的基因序列，1个克隆出现了NtPPO1可变剪切的基因序列。分析后发现可变剪切形式为外显子跳过，跳过的序列为：

5'-GTACTTATACTTCCATGAGAGAATCTTGGCTTCCCTAATTGGTGACCCTACATTTGCTTTGCCATATTGGAATTGGGACCATCCTAAAGGCATGCATTTGCCTGACATGTTTGATGTCGAAG-3’

此基因可变剪切造成的结果是蛋白翻译提前终止。

NtPPO1基因CRISPR/Cas9定点敲除载体构建

NtPPO1基因sgRNA靶位点序列的设计

选择NtPPO基因距离起始翻译密码子ATG后最相近核苷酸序列CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-TGG作为靶序列。

CRISPR/Cas9载体敲除位点sgRNA序列：5’-CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-3’

采用pORE-CRISPR/Cas9 植物表达载体，需要在5’端不是以G开头的核苷酸靶位点序列前加上G，sgRNA变成5’-G CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-3’。将sgRNA靶序列连接在pORE-CRISPR/Cas9 植物表达载体上，需要在sgRNA靶序列添加Bsa I的酶切接头。在sgRNA序列正向5’端加上GATT接头，反向互补序列的5’端加上AAAC接头，合成后的sgRNA双链的引物序列如下：

正向引物：5’-GATTGCATTTGTTCTTCAAGCTCCA -3’

反向引物：5’-AAACTGGAGCTTGAAGAACAAATGC-3’

NtPPO1基因CRISPR/Cas9载体的构建

靶位点DNA引物单链需要在DNA寡核苷酸退火缓冲液帮助下进行退火反应以形成引物DNA双链。

退火反应体系：

PCR仪进行退火反应：

注：如果所用的PCR仪不具备下降0.1ºC的功能，也可以设置为每90秒下降1ºC。

利用Bsa I酶切CRISPR/Cas9载体，酶切好的载体与已退火好的靶位点DNA引物双链利用T4连接酶进行连接，连接体系与条件参考T4连接酶(NEB)的产品说明书。将连接好的产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用含卡那霉素的抗性培养基筛选阳性克隆。选用pORE-CRISPR/Cas9载体上距离Bsa I酶切位点上游的一段序列作为上游引物：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'，与sgRNA基因靶位点引物DNA的反向引物配合PCR检测阳性菌落。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序验证。

pORE-CRISPR/Cas9表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化

挑取测序正确的菌落，进行小摇(5 mL)扩繁培养。提取质粒后转化农杆菌LBA4404。菌株在含卡那霉素抗性的LB培养基平板上进行筛选培养，按照4.2中的方法筛选阳性农杆菌斑进行测序。挑取测序正确的农杆菌斑进行大摇(500 mL)扩繁培养，离心收集菌体，用MS液体培养液重悬菌体，测量菌液的OD值达到0.5后，浸染烟草叶盘8至10 min。侵染后的叶盘在25℃、黑暗条件共培养2天，被侵染的烟草叶盘转移至含有NAA、6-BA和卡那霉素(50 mg/L)以及头孢噻肟钠(500 mg/L)的MS固体培养基中进行筛选，最终获得含抗性基因的阳性烟草小苗。

NtPPO1基因定点突变的检测

提取转基因烟草小苗的基因组DNA。根据抗卡那霉素基因Kana和Cas9基因在表达载体上的序列设计引物，对阳性的烟草小苗DNA进行PCR电泳检测。Kana基因的上游引物为5'-CAGGTTCTCCGGCCGCTTGG-3'，下游引物为5'-GGAGATCCTGCCCCGGCACT-3'；Cas9基因上游引物为5'-TGTCGGGACAGGGCGACAGT-3'，下游引物为5'-CGCCGCGTTCAGCCTTTGTG-3'。挑取经PCR检测阳性的烟草小苗，PCR检测阳性的小苗NtPPO1基因在靶位点处发生突变状况。设计扩增包含靶位点部位的包含靶位点的片段770bp的片段。

检测引物：

正向引物：5’-TTCACGCACTAATTCGTCTCATTGGA-3’

反向引物：5’-TCTGTCGGCAACGCCTTCA-3’

将扩增的DNA片段进行测序，并对测序结果的测序图进行分析。如果测序图在靶位点处开始出现双峰，则将此株烟草小苗T0留下生长收种，否则丢弃。随机播种萌发T0代的子代T1小苗100株，并提取DNA，利用上述检测NtPPO1基因突变情况引物对T1代DNA进行扩增并测序。测序结果与野生型NtPPO1基因序列进行比对。如测序图在NtPPO1基因序列敲除靶位点后出现单峰的序列图，并有差异，分析并统计T1代在NtPPO1基因序列上的突变情况。

NtPPO1基因突变体基因表达量的检测

利用Real time-PCR分析NtPPO1基因的表达量，内参基因为26s，分析NtPPO1基因不同突变体的基因表达情况。

NtPPO1_qRT引物

NtPPO1_qRT_F：5’-AGCACTGCCTTTATTGATGATGG-3’

NtPPO1_qRT_R：5’-ACTTAGCTATGTATTCGTCATCTACAGTT-3’

26s内参基因引物

26s_F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’

26s_R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’

NtPPO1基因突变体多酚氧化酶活性的测定：

采用邻苯二酚法测定多酚氧化酶（PPO）活性。

取0.5g 处理后鲜烟叶，加入 0.05 mol/L、PH 6.5 、1%PVP的磷酸缓冲液10 ml，4℃下 15000r/min 离心 10min，取全部上清液加入 25ml 容量瓶中，其沉淀用15ml磷酸缓冲液冲洗 1 次，2000r/min 离心 10min 后，上清液加入到先前的样品液中，用磷酸缓冲液定容至25ml，4℃保存备用。

样品：取 1.9ml 磷酸缓冲液（内含0.05mol/L邻苯二酚），再加0.1ml 4℃下的样品液，利用eppendorf D30仪器，在 410nm 波长下测定吸光值，每 10s 读一次 OD 值，一共读9 次。

结果计算：以每 10s 内 A410变化 0.01 为 1 个多酚氧化酶活性单位，计算多酚氧化酶比酶活性

PPO 比酶活性（0.01∆ Ag-1•min-1）=

∆ A 为反应时间内吸光率（A）的变化；W 为蛋白质量。

t 为反应时间（本实验以控制时间1.5min 钟计）

D 为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数（本实验为 250 倍）

实施例1

利用以上的方法，通过测序得到了一株转基因NtPPO1基因NtPPO1-64。测序后的结果和参比序列比较如下图1.所示。箭头标记处显示在NtPPO1基因在sgRNA靶位点后，测序图出现双峰，显示NtPPO1基因序列在此次出现了序列的改变。

转基因植株NtPPO1-64通过自交后收种，通过测序发现自交的后代NtPPO1-64-1的植株的NtPPO1基因出现了如图2.所示的突变。在目标sgRNA序列后，NtPPO1基因缺失了-2bp（缺失了2个GG碱基），造成了基因读码框的改变。NtPPO1基因从敲除位点后，翻译的蛋白序列发生了改变，最终在原来第112个起始编码氨基酸Lys蛋白的密码子提前出现了TAA终止密码子，造成了翻译的提前终止。

测定NtPPO1基因纯合突变植株NtPPO1-64-1的基因表达量如下图3.所示，可以看出相对于野生型对照，NtPPO1-64-1突变体NtPPO1基因表达量下降了75%。

测定NtPPO1-64-1突变体的多酚氧化酶(PPO)活性如下图4.所示，可以看出相对于野生型对照，NtPPO1-64-1突变体的PPO酶活性有所降低。

实施例2

利用以上的方法，通过测序得到了一株转基因NtPPO1基因NtPPO1-70。测序后的结果和参比序列比较如下图5.所示。箭头标记处显示在NtPPO1基因在sgRNA靶位点后，测序图出现双峰，显示NtPPO1基因序列在此次出现了序列的改变。

转基因植株NtPPO1-70通过自交后收种，通过测序发现自交的后代NtPPO1-70-1的植株的NtPPO1基因出现了如图6.所示的突变。在目标sgRNA序列后，NtPPO1基因缺失了-1bp（缺失了1个G碱基），造成了基因读码框的改变。NtPPO1基因从敲除位点后，翻译的蛋白序列发生了改变，最终在原来第193个起始编码氨基酸Leu的密码子移码出现了TAA终止密码子，造成了翻译的提前终止。

测定NtPPO1基因纯合突变植株NtPPO1-70-1的基因表达量如下图7.所示，可以看出相对于野生型对照，NtPPO1-70-1突变体NtPPO1基因表达量下降了76%。

测定NtPPO1-70-1突变体的多酚氧化酶(PPO)活性如下图8.所示，可以看出相对于野生型对照，NtPPO1-70-1突变体的PPO酶活性有所降低。

实施例3

利用以上的方法，通过测序得到了一株转基因NtPPO1基因NtPPO1-72。测序后的结果和参比序列比较如下图9.所示。箭头标记处显示在NtPPO1基因在sgRNA靶位点后，测序图出现双峰，显示NtPPO1基因序列在此次出现了序列的改变。

转基因植株NtPPO1-72通过自交后收种，通过测序发现自交的后代NtPPO1-72-1的植株的NtPPO1基因出现了如图10.所示的突变。在目标sgRNA序列后，NtPPO1基因插入了+1bp（插入了1个A碱基），造成了基因读码框的改变。NtPPO1基因从敲除位点后，翻译的蛋白序列发生了改变，最终在原来第112个起始编码氨基酸Lys的密码子移码出现了TAA终止密码子，造成了翻译的提前终止。

测定NtPPO1基因纯合突变植株NtPPO1-72-1的基因表达量如下图11所示，可以看出相对于野生型对照，NtPPO1-72-1突变体NtPPO1基因表达量下降了84%以上。

测定NtPPO1-72-1突变体的多酚氧化酶(PPO)活性如下图12所示，可以看出相对于野生型对照，NtPPO1-72-1突变体的PPO酶活性有所降低。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用

<130> 2017

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1746

<212> DNA

<213> NtPPO1的基因序列

<400> 1

atggcttctt catttgttct tcaagctcca tgggctatca caaccaactt atcttgtttt 60

ccttccttta caaaaccctc acatgttttc ccacacaaaa aaccaaacaa taagttcaaa 120

gtatcatgca accaaaacaa tgaggcaaat aattctcaag aaaaagttga aaggagaaat 180

cttcttcttg gtttaggagg aatttatggt gctgcccatc ttttaccata tgatgcttta 240

gcaagtccca tcccatcccc tactattaca caatgtagca ctgcctttat tgatgatggc 300

gtgcctaaaa tacctgtgtg ctacacttgt tgtcctccta tcccggataa gaaagacgtt 360

ccttgctatg accttcctct tgtatccgga tttcgcgttc gtcctgcagc tcaaactgta 420

gatgacgaat acatagctaa gtataacgaa gcttattcgc gtatgaaggc gttgccgaca 480

gacgatcctc gtagtttcat gcaacaagcc aatatccatt gtgcttattg caatggtgct 540

tataaagttg gaggcaaaga gttacaagtt cacttctcgt ggcttttctt cccttttcat 600

agatggtact tatacttcca tgagagaatc ttggcttccc taattggtga ccctacattt 660

gctttgccat attggaattg ggaccatcct aaaggcatgc atttgcctga catgtttgat 720

gtcgaaggta caagtatata taacgaaagg cgaaaccaaa agcataggaa tgggtttatt 780

atggatcttg gttatgctgg agaagatgtg gtagcaaatg atctacaaaa aatggttaat 840

aatctcgcta taatgtatcg tcaaatgatc actaatgccc cttgcccttt gctcttcttt 900

ggcaaacctt atagacttgg aagtaaacct agtccaggga tgggtactat agaaaatgtg 960

ccacataatt ctatacatag atgggttggt gatccaagac aaccaaatca agaagacatg 1020

ggaaattttt attcgtcagg caaagatcct gcattttttt cacttcacgc caatgttgat 1080

cgaatgtgga caatatggaa aacactggga cgaaaacgta aggatattag tgacccagat 1140

tatttggaca ctgagttctt tttctacgat gaaaaggcaa agccttttcg tgttagggtt 1200

caagattgct tggatgaaaa gaaattggga tatacatttc aaccaatgga tacaccttgg 1260

aagaatttca agccactact aagaaagaac acaaaaaatg tcaagattga tccaaattca 1320

gttccaccag ctagtcaagt attccctata aagaaattgg acaagattgt aacattttca 1380

gtggctagac ctaaaaaatt aagaactaaa aaagagaagg aagatgaaga ggaactattg 1440

actttcaaga atgtggaatt ggatgtgaga aagtttgtaa ggtttgatgt tttcctcaat 1500

gaggataatg atgtgattgc aaatgaggtg gacaggacag aatttgttgg gagttttgca 1560

aatttaccac atattcatga tgatcccaaa aaagaaaaat ttcctgaatt tagcctggct 1620

attaatgaat tattggagga tttaaaactt gaaggtgatg atcttgttgt ggtgactctg 1680

gttcctaaaa ttggagggga taatgtttcc attgaagctg ttgagatcca gttggtccct 1740

tgttaa 1746

<210> 2

<211> 581

<212> PRT

<213> NtPPO1的基因翻译蛋白序列

<400> 2

Met Ala Ser Ser Phe Val Leu Gln Ala Pro Trp Ala Ile Thr Thr Asn

1 5 10 15

Leu Ser Cys Phe Pro Ser Phe Thr Lys Pro Ser His Val Phe Pro His

20 25 30

Lys Lys Pro Asn Asn Lys Phe Lys Val Ser Cys Asn Gln Asn Asn Glu

35 40 45

Ala Asn Asn Ser Gln Glu Lys Val Glu Arg Arg Asn Leu Leu Leu Gly

50 55 60

Leu Gly Gly Ile Tyr Gly Ala Ala His Leu Leu Pro Tyr Asp Ala Leu

65 70 75 80

Ala Ser Pro Ile Pro Ser Pro Thr Ile Thr Gln Cys Ser Thr Ala Phe

85 90 95

Ile Asp Asp Gly Val Pro Lys Ile Pro Val Cys Tyr Thr Cys Cys Pro

100 105 110

Pro Ile Pro Asp Lys Lys Asp Val Pro Cys Tyr Asp Leu Pro Leu Val

115 120 125

Ser Gly Phe Arg Val Arg Pro Ala Ala Gln Thr Val Asp Asp Glu Tyr

130 135 140

Ile Ala Lys Tyr Asn Glu Ala Tyr Ser Arg Met Lys Ala Leu Pro Thr

145 150 155 160

Asp Asp Pro Arg Ser Phe Met Gln Gln Ala Asn Ile His Cys Ala Tyr

165 170 175

Cys Asn Gly Ala Tyr Lys Val Gly Gly Lys Glu Leu Gln Val His Phe

180 185 190

Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg Trp Tyr Leu Tyr Phe His Glu

195 200 205

Arg Ile Leu Ala Ser Leu Ile Gly Asp Pro Thr Phe Ala Leu Pro Tyr

210 215 220

Trp Asn Trp Asp His Pro Lys Gly Met His Leu Pro Asp Met Phe Asp

225 230 235 240

Val Glu Gly Thr Ser Ile Tyr Asn Glu Arg Arg Asn Gln Lys His Arg

245 250 255

Asn Gly Phe Ile Met Asp Leu Gly Tyr Ala Gly Glu Asp Val Val Ala

260 265 270

Asn Asp Leu Gln Lys Met Val Asn Asn Leu Ala Ile Met Tyr Arg Gln

275 280 285

Met Ile Thr Asn Ala Pro Cys Pro Leu Leu Phe Phe Gly Lys Pro Tyr

290 295 300

Arg Leu Gly Ser Lys Pro Ser Pro Gly Met Gly Thr Ile Glu Asn Val

305 310 315 320

Pro His Asn Ser Ile His Arg Trp Val Gly Asp Pro Arg Gln Pro Asn

325 330 335

Gln Glu Asp Met Gly Asn Phe Tyr Ser Ser Gly Lys Asp Pro Ala Phe

340 345 350

Phe Ser Leu His Ala Asn Val Asp Arg Met Trp Thr Ile Trp Lys Thr

355 360 365

Leu Gly Arg Lys Arg Lys Asp Ile Ser Asp Pro Asp Tyr Leu Asp Thr

370 375 380

Glu Phe Phe Phe Tyr Asp Glu Lys Ala Lys Pro Phe Arg Val Arg Val

385 390 395 400

Gln Asp Cys Leu Asp Glu Lys Lys Leu Gly Tyr Thr Phe Gln Pro Met

405 410 415

Asp Thr Pro Trp Lys Asn Phe Lys Pro Leu Leu Arg Lys Asn Thr Lys

420 425 430

Asn Val Lys Ile Asp Pro Asn Ser Val Pro Pro Ala Ser Gln Val Phe

435 440 445

Pro Ile Lys Lys Leu Asp Lys Ile Val Thr Phe Ser Val Ala Arg Pro

450 455 460

Lys Lys Leu Arg Thr Lys Lys Glu Lys Glu Asp Glu Glu Glu Leu Leu

465 470 475 480

Thr Phe Lys Asn Val Glu Leu Asp Val Arg Lys Phe Val Arg Phe Asp

485 490 495

Val Phe Leu Asn Glu Asp Asn Asp Val Ile Ala Asn Glu Val Asp Arg

500 505 510

Thr Glu Phe Val Gly Ser Phe Ala Asn Leu Pro His Ile His Asp Asp

515 520 525

Pro Lys Lys Glu Lys Phe Pro Glu Phe Ser Leu Ala Ile Asn Glu Leu

530 535 540

Leu Glu Asp Leu Lys Leu Glu Gly Asp Asp Leu Val Val Val Thr Leu

545 550 555 560

Val Pro Lys Ile Gly Gly Asp Asn Val Ser Ile Glu Ala Val Glu Ile

565 570 575

Gln Leu Val Pro Cys

580

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> NtPPO1正向引物

<400> 3

atggcttctt catttgttct tcaagc 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> NtPPO1反向引物

<400> 4

ttaacaaggg accaactgga tctcaac 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 5

catttgttct tcaagctcca 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 特异性引物正向引物

<400> 6

ttcacgcact aattcgtctc attgga 26

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 特异性引物反向引物

<400> 7

tctgtcggca acgccttca 19

<210> 8

<211> 122

<212> DNA

<213> 外显子跳过的序列

<400> 8

gtacttatac ttccatgaga gaatcttggc ttccctaatt ggtgacccta catttgcttt 60

gccatattgg aattgggacc atcctaaagg catgcatttg cctgacatgt ttgatgtcga 120

ag 122

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> sgRNA双链的引物序列正向引物

<400> 9

gattgcattt gttcttcaag ctcca 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> sgRNA双链的引物序列反向引物

<400> 10

aaactggagc ttgaagaaca aatgc 25

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Kana基因的上游引物

<400> 11

caggttctcc ggccgcttgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Kana基因的下游引物

<400> 12

ggagatcctg ccccggcact 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Cas9基因上游引物

<400> 13

tgtcgggaca gggcgacagt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Cas9基因下游引物

<400> 14

cgccgcgttc agcctttgtg 20

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 检测引物正向引物

<400> 15

ttcacgcact aattcgtctc attgga 26

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 检测引物反向引物

<400> 16

tctgtcggca acgccttca 19

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> NtPPO1_qRT_F

<400> 17

agcactgcct ttattgatga tgg 23

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> NtPPO1_qRT_R

<400> 18

acttagctat gtattcgtca tctacagtt 29

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_F

<400> 19

gaagaaggtc ccaagggttc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_R

<400> 20

tctcccttta acaccaacgg 20

Claims (8)

1.一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1，其特征在于所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1，其特征在于所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求1或2所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、NtPPO1基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA作为模板，根据NtPPO1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtPPO1基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

D、NtPPO1基因突变测序检测：根据NtPPO1基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtPPO1的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtPPO1基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。

4.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于B步骤中所述的引物为：

正向引物：5’-ATGGCTTCTTCATTTGTTCTTCAAGC-3’

反向引物：5’-TTAACAAGGGACCAACTGGATCTCAAC-3’。

5.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于B步骤中PCR反应体系为： PCR扩增体系为50μl，其中包含10.0μl 的5 X buffer （10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1.5 mM MgCl₂，pH 8.3 @ 25℃），4μl 的 2.5 mM dNTPs（TakaraBiotechnology Co. Ltd., Dalian, China），2μl 浓度10μM 的上下游引物，0.5μl的2000U/ml高保真DNA聚合酶（NEB），20-50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐50μl；反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。

6.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于C步骤中sgRNA序列为： 5’-CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-3’。

7.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于D步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’-TTCACGCACTAATTCGTCTCATTGGA-3’

反向引物：5’-TCTGTCGGCAACGCCTTCA-3’。

8.一种权利要求1或2所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的应用，其特征在于所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1在获得抗烟草褐变转基因植株中的应用。