CN110923251A

CN110923251A - 烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用

Info

Publication number: CN110923251A
Application number: CN201911317951.0A
Authority: CN
Inventors: 张慧; 翟妞; 周会娜; 徐国云; 刘萍萍; 郑庆霞; 陈千思; 金立锋; 武明珠
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110923251B

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草多酚氧化酶NtPPO4基因及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草多酚氧化酶NtPPO4由588个氨基酸残基组成，具有3个典型的保守结构域。该蛋白与植物叶片绿原酸含量相关，降低该基因的表达后，叶片中绿原酸含量显著升高。本发明通过对烟草多酚氧化酶NtPPO4的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草叶片中绿原酸含量明显升高，基于这一特性，可为烟草新品种的培育提供应用基础和参考借鉴。

Description

烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用专利申请。

背景技术

绿原酸（Chlorogenic acid，CGA），又名咖啡单宁，是植物在有氧呼吸过程中经苯丙氨酸途径生成的一种苯丙素类化合物。绿原酸具有重要的药用价值，统计表明，卫生部《药品标准》收录的具有清热解毒和抗菌消炎的170种中成药中均含有绿原酸且为主要成分。另一方面，绿原酸作为一种新型的抗氧化剂，在食品和果品保鲜、防晒护肤等方面也有重要应用。因此，对绿原酸合成代谢途径的深入研究具有十分重要的技术价值和实用意义。

我国的烟草种植面积和产量均居世界首位，而烟叶也是绿原酸含量较高的植物之一（约为3%-5%或更高）。统计表明，每年在烟草的采收和生产过程中会产生约25%的废次烟沫等下脚料不能使用，也因此，如果能够从烟草废料中充分提取绿原酸，不仅可以变废为宝，而且具有巨大的经济利益。而鉴于烟草组织培养技术的日趋成熟，加上烟草易于遗传转化，因此如能通过转基因技术或其他育种技术培育获得高绿原酸含量的烟草品种，可为利用烟草作为生物反应器来提取绿原酸奠定良好的技术基础。

已有研究表明，绿原酸是多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）的一种底物，而PPO是一类广泛分布于植物体中的一种铜结合酶，参与生物氧化，在植物抵御外界病原菌伤害、对植物嫁接生根伤口愈合以及农产品的质量等方面都有重要作用。在烟草中，烟草PPO介导酶促棕色化反应，通过分子氧催化酚类物质氧化成醌，醌再与其他醌、氨基酸、蛋白质及化合物聚合成色素物质。因此，烟草中PPO酶活过高时，不仅影响烟叶外观质量，还会降低烟叶内致香物质的含量，使烟叶品质下降，工业可用性降低。

总之，随着烟草基因工程深入，结合多酚类物质组分对于烟叶品质的重要影响，对于与烟草中多酚类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草中绿原酸含量调控相关基因的研究，本发明目的在于提请一个烟草多酚氧化酶NtPPO4基因及其在烟草绿原酸含量调控方面的应用，从而为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草多酚氧化酶NtPPO4的编码基因NtPPO4，由1767个碱基构成，其中特异性核酸片段为33-319位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码基因NtPPO4在叶片绿原酸含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtPPO4基因表达量，来调控烟叶中绿原酸含量情况。

所述编码基因NtPPO4的PCR扩增制备方法，具体包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtPPO4-F：5’- CAGCAAAACTCTCTTTTC- 3’，

NtPPO4-R：5’- CTGGACCATCCGTTATCG- 3’。

烟草多酚氧化酶NtPPO4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由588个氨基酸残基组成，其中第170-373位氨基酸为保守的Tyrosinase结构域，第380-430位氨基酸为保守的PPO1_DWL结构域，第451-584位氨基酸为保守的PPO1_KFDV结构域。

所述烟草多酚氧化酶NtPPO4在叶片绿原酸含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中绿原酸含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中绿原酸含量明显升高。

利用所述编码基因NtPPO4的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtPPO4基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得绿原酸含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtPPO4基因的表达使其沉默，NtPPO4基因沉默植株中绿原酸含量显著升高，进而获得绿原酸含量升高的植物新品种。

换言之，一种培育高绿原酸含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtPPO4基因的表达使其沉默，NtPPO4基因沉默的新烟草品种植株中绿原酸含量显著上升。

本申请中，发明人通过对与绿原酸降解相关的特定烟草多酚氧化酶NtPPO4研究基础上，发现其与烟草中绿原酸含量高度相关。进一步基因功能验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量发生了明显升高。基于这一结果，可为烟草品质调控、高绿原酸含量的烟草新品种培育奠定一定技术基础和提供一定借鉴参考。

附图说明

图1 为与对照植株相比，NtPPO4基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的绿原酸含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10 g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；

MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。

实施例1

本实施例就烟草NtPPO4基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtPPO4基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtPPO4基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtPPO4-F：5’- CAGCAAAACTCTCTTTTC- 3’，

NtPPO4-R：5’- CTGGACCATCCGTTATCG- 3’；

以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtPPO4基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2- NtPPO4载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/LKan的LB固体培养基上，37℃过夜培养；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- NtPPO4。

需要说明的是，

烟草NtPPO4基因，包括1767个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：

ATGGCTTCTTCTTCTACTCTACCTTTATGCACCAGCAAAACTCTCTTTTCTTCCTTCACCAACTCATCTTTCTTTGCAAAACCCTCCCAGCATTTCCTCCATGGAAAACGTAACCAATGTTTCAAGGTTTCATGCACGGGCGAGCATGACGGAAACCAACTTGACGCCATTAAAGAAGGAGCTGTTGACAGAAGGAATGTCCTTTTGGGTTTAGGAGGGCTGTATGGCGCAGCTAATCTTGCGCCATTAGCCTCTGCTGCTCCCGTACCACCCCCCGATCAAAAATCATGTGGCACGGCCACGATAACGGATGGTCCAGCTGTACCATATAGTTGTTGCCCCCCTAAACCAGATGATATGGACAGCGTTCCATATTACAAGATCCCTCGCATGTCCAAGCTTCGTAAGCGGCCCGCTGCCCAAAACGTGACTGAGGAGTATATAGCCAAGTACCAGTTAGCCACTAGTAAAATGAAGGAATTAGACAAAGACCAATTTGATCCTCTTGGCTTCAAGCAACAAGCTAATATCCATTGTGCTTATTGCAACAATGCTTACACAATGGGTGACCAAAAGTTACAAGTTCACGAATCTTGGCTTTTCTTCCCATTTCATAGATGGTACTTGTACTTCTACGAGAGAATCTTGGGCTCCCTCATCGATGATCCAACTTTTGCTTTGCCATATTGGAACTGGGACCATCCAAGCGGCATGCGTTTGCCTCCTATGTTCGATGTCGAAGGTTCTTCCCTGTACGATGCAAGACGTAATCCACAAGTCCGTAATGGAACCATAATCGATCTTGGTTTTTTCGGTGATGAAGTCAAAACTAATGAAATACAGATGATAACTAACAACTTAATTCTAATGTATCGTCAAATGATAACTAATGCTCCATGCCCGCTGTTGTTCTTCGGAGAGCCTTACAGATTCGGATCTAAACCCAATCCGGGGCAGGGAACCATTGAAAACATCCCTCATACTCCAGTCCACATTTGGACTGGTACTGTGCGGGATACGGATTTGGGTAATGGTGTGAAATCATACGGTGAGGATATGGACCCAGTTTTTTACAGCCACCACGCCAATGTGGACCGCATGTGGAATGAATGGAAAGCACTAGGAGGGAAAAGAAGGGATCTCACAGACAATGATTGGTTAAATTCCGAGTTCTCTTTCTACGATGAAAACCGCGACCCATGGCGTGTGAAAGTCCGAGACTGTTTGGACAGTAAGAAGATGGGGTATGATTACGAACCAACATCCACACCATGGCGTAACTTTAAGCCAGGGAAAAAGAGCACAGAGGGCAAGGTGAATCTAAGTTCAATTAAGCCAGCCAGCAAGGTATTCCCACTCTCAAATCTGGACAGAGCCATTTGCTTTAGTATAGAGAGGCCAGCTACATCAAGGAGTCAGCAGGAGAAAGATGAATTCGAGGAGATCCTAACATTCAAGGGTGTAAAGTATGATGATAGCAAGTATATAAGGTTTGATGTGTTCCTCAATGCAGACAAGACTGTGAATGCAGATGACATTAACAAGAGAGAGTATGCAGGGAGCTATACCAGCTTGCCACATGTTCATGGACCTAATAATGCCACTCATGAGTTTAAACCAAAAGAATTCAAGCTAGCCATCACTGAACTTCTTGAGGACTGTGGTTTGGAAGATGAAGACATTATTGCGGTAACTGTGGTTCCAAAGAAGGGGGGCGAAGTGGTCAGCATCGACAATGTGGAGATTGAACTTAAGGATTGTTTTTAA。

烟草多酚氧化酶NtPPO4，包括588个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：

MASSSTLPLCTSKTLFSSFTNSSFFAKPSQHFLHGKRNQCFKVSCTGEHDGNQLDAIKEGAVDRRNVLLGLGGLYGAANLAPLASAAPVPPPDQKSCGTATITDGPAVPYSCCPPKPDDMDSVPYYKIPRMSKLRKRPAAQNVTEEYIAKYQLATSKMKELDKDQFDPLGFKQQANIHCAYCNNAYTMGDQKLQVHESWLFFPFHRWYLYFYERILGSLIDDPTFALPYWNWDHPSGMRLPPMFDVEGSSLYDARRNPQVRNGTIIDLGFFGDEVKTNEIQMITNNLILMYRQMITNAPCPLLFFGEPYRFGSKPNPGQGTIENIPHTPVHIWTGTVRDTDLGNGVKSYGEDMDPVFYSHHANVDRMWNEWKALGGKRRDLTDNDWLNSEFSFYDENRDPWRVKVRDCLDSKKMGYDYEPTSTPWRNFKPGKKSTEGKVNLSSIKPASKVFPLSNLDRAICFSIERPATSRSQQEKDEFEEILTFKGVKYDDSKYIRFDVFLNADKTVNADDINKREYAGSYTSLPHVHGPNNATHEFKPKEFKLAITELLEDCGLEDEDIIAVTVVPKKGGEVVSIDNVEIELKDCF。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2-NtPPO4载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2、TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2- NtPPO4的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/LRif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan 和50mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD₆₀₀=1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型并无变化，进一步通过qRT-PCR对NtPPO4基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtPPO4的侵染植株中，NtPPO4的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtPPO4浸染植株）和对照组（TRV2浸染植株）中的绿原酸含量进行了检测，检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019））。检测结果如图2所示，可以看出，PPO4基因沉默后，实验组绿原酸含量升高了3.5倍左右。基于此，可为烟草品质调控、或者新品种培育奠定良好技术基础。

序列表

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用

<130> none

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1767

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atggcttctt cttctactct acctttatgc accagcaaaa ctctcttttc ttccttcacc 60

aactcatctt tctttgcaaa accctcccag catttcctcc atggaaaacg taaccaatgt 120

ttcaaggttt catgcacggg cgagcatgac ggaaaccaac ttgacgccat taaagaagga 180

gctgttgaca gaaggaatgt ccttttgggt ttaggagggc tgtatggcgc agctaatctt 240

gcgccattag cctctgctgc tcccgtacca ccccccgatc aaaaatcatg tggcacggcc 300

acgataacgg atggtccagc tgtaccatat agttgttgcc cccctaaacc agatgatatg 360

gacagcgttc catattacaa gatccctcgc atgtccaagc ttcgtaagcg gcccgctgcc 420

caaaacgtga ctgaggagta tatagccaag taccagttag ccactagtaa aatgaaggaa 480

ttagacaaag accaatttga tcctcttggc ttcaagcaac aagctaatat ccattgtgct 540

tattgcaaca atgcttacac aatgggtgac caaaagttac aagttcacga atcttggctt 600

ttcttcccat ttcatagatg gtacttgtac ttctacgaga gaatcttggg ctccctcatc 660

gatgatccaa cttttgcttt gccatattgg aactgggacc atccaagcgg catgcgtttg 720

cctcctatgt tcgatgtcga aggttcttcc ctgtacgatg caagacgtaa tccacaagtc 780

cgtaatggaa ccataatcga tcttggtttt ttcggtgatg aagtcaaaac taatgaaata 840

cagatgataa ctaacaactt aattctaatg tatcgtcaaa tgataactaa tgctccatgc 900

ccgctgttgt tcttcggaga gccttacaga ttcggatcta aacccaatcc ggggcaggga 960

accattgaaa acatccctca tactccagtc cacatttgga ctggtactgt gcgggatacg 1020

gatttgggta atggtgtgaa atcatacggt gaggatatgg acccagtttt ttacagccac 1080

cacgccaatg tggaccgcat gtggaatgaa tggaaagcac taggagggaa aagaagggat 1140

ctcacagaca atgattggtt aaattccgag ttctctttct acgatgaaaa ccgcgaccca 1200

tggcgtgtga aagtccgaga ctgtttggac agtaagaaga tggggtatga ttacgaacca 1260

acatccacac catggcgtaa ctttaagcca gggaaaaaga gcacagaggg caaggtgaat 1320

ctaagttcaa ttaagccagc cagcaaggta ttcccactct caaatctgga cagagccatt 1380

tgctttagta tagagaggcc agctacatca aggagtcagc aggagaaaga tgaattcgag 1440

gagatcctaa cattcaaggg tgtaaagtat gatgatagca agtatataag gtttgatgtg 1500

ttcctcaatg cagacaagac tgtgaatgca gatgacatta acaagagaga gtatgcaggg 1560

agctatacca gcttgccaca tgttcatgga cctaataatg ccactcatga gtttaaacca 1620

aaagaattca agctagccat cactgaactt cttgaggact gtggtttgga agatgaagac 1680

attattgcgg taactgtggt tccaaagaag gggggcgaag tggtcagcat cgacaatgtg 1740

gagattgaac ttaaggattg tttttaa 1767

<210> 2

<211> 588

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Ala Ser Ser Ser Thr Leu Pro Leu Cys Thr Ser Lys Thr Leu Phe

1 5 10 15

Ser Ser Phe Thr Asn Ser Ser Phe Phe Ala Lys Pro Ser Gln His Phe

20 25 30

Leu His Gly Lys Arg Asn Gln Cys Phe Lys Val Ser Cys Thr Gly Glu

35 40 45

His Asp Gly Asn Gln Leu Asp Ala Ile Lys Glu Gly Ala Val Asp Arg

50 55 60

Arg Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Tyr Gly Ala Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Pro Leu Ala Ser Ala Ala Pro Val Pro Pro Pro Asp Gln Lys Ser

85 90 95

Cys Gly Thr Ala Thr Ile Thr Asp Gly Pro Ala Val Pro Tyr Ser Cys

100 105 110

Cys Pro Pro Lys Pro Asp Asp Met Asp Ser Val Pro Tyr Tyr Lys Ile

115 120 125

Pro Arg Met Ser Lys Leu Arg Lys Arg Pro Ala Ala Gln Asn Val Thr

130 135 140

Glu Glu Tyr Ile Ala Lys Tyr Gln Leu Ala Thr Ser Lys Met Lys Glu

145 150 155 160

Leu Asp Lys Asp Gln Phe Asp Pro Leu Gly Phe Lys Gln Gln Ala Asn

165 170 175

Ile His Cys Ala Tyr Cys Asn Asn Ala Tyr Thr Met Gly Asp Gln Lys

180 185 190

Leu Gln Val His Glu Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg Trp Tyr

195 200 205

Leu Tyr Phe Tyr Glu Arg Ile Leu Gly Ser Leu Ile Asp Asp Pro Thr

210 215 220

Phe Ala Leu Pro Tyr Trp Asn Trp Asp His Pro Ser Gly Met Arg Leu

225 230 235 240

Pro Pro Met Phe Asp Val Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Arg

245 250 255

Asn Pro Gln Val Arg Asn Gly Thr Ile Ile Asp Leu Gly Phe Phe Gly

260 265 270

Asp Glu Val Lys Thr Asn Glu Ile Gln Met Ile Thr Asn Asn Leu Ile

275 280 285

Leu Met Tyr Arg Gln Met Ile Thr Asn Ala Pro Cys Pro Leu Leu Phe

290 295 300

Phe Gly Glu Pro Tyr Arg Phe Gly Ser Lys Pro Asn Pro Gly Gln Gly

305 310 315 320

Thr Ile Glu Asn Ile Pro His Thr Pro Val His Ile Trp Thr Gly Thr

325 330 335

Val Arg Asp Thr Asp Leu Gly Asn Gly Val Lys Ser Tyr Gly Glu Asp

340 345 350

Met Asp Pro Val Phe Tyr Ser His His Ala Asn Val Asp Arg Met Trp

355 360 365

Asn Glu Trp Lys Ala Leu Gly Gly Lys Arg Arg Asp Leu Thr Asp Asn

370 375 380

Asp Trp Leu Asn Ser Glu Phe Ser Phe Tyr Asp Glu Asn Arg Asp Pro

385 390 395 400

Trp Arg Val Lys Val Arg Asp Cys Leu Asp Ser Lys Lys Met Gly Tyr

405 410 415

Asp Tyr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Trp Arg Asn Phe Lys Pro Gly Lys

420 425 430

Lys Ser Thr Glu Gly Lys Val Asn Leu Ser Ser Ile Lys Pro Ala Ser

435 440 445

Lys Val Phe Pro Leu Ser Asn Leu Asp Arg Ala Ile Cys Phe Ser Ile

450 455 460

Glu Arg Pro Ala Thr Ser Arg Ser Gln Gln Glu Lys Asp Glu Phe Glu

465 470 475 480

Glu Ile Leu Thr Phe Lys Gly Val Lys Tyr Asp Asp Ser Lys Tyr Ile

485 490 495

Arg Phe Asp Val Phe Leu Asn Ala Asp Lys Thr Val Asn Ala Asp Asp

500 505 510

Ile Asn Lys Arg Glu Tyr Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Leu Pro His Val

515 520 525

His Gly Pro Asn Asn Ala Thr His Glu Phe Lys Pro Lys Glu Phe Lys

530 535 540

Leu Ala Ile Thr Glu Leu Leu Glu Asp Cys Gly Leu Glu Asp Glu Asp

545 550 555 560

Ile Ile Ala Val Thr Val Val Pro Lys Lys Gly Gly Glu Val Val Ser

565 570 575

Ile Asp Asn Val Glu Ile Glu Leu Lys Asp Cys Phe

580 585

Claims

1.烟草多酚氧化酶NtPPO4的编码基因NtPPO4，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为第33-319位碱基。

2.权利要求1所述编码基因NtPPO4在叶片绿原酸含量调控中的应用，其特征在于，利用该基因沉默技术或者基因超表达方法，通过调节烟草NtPPO4基因的表达量，来调控烟叶中绿原酸含量变化情况。

3.权利要求1所述编码基因NtPPO4所编码的烟草多酚氧化酶NtPPO4，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由588个氨基酸残基组成，其中第170-373位氨基酸为保守的Tyrosinase结构域，第380-430位氨基酸为保守的PPO1_DWL结构域，第451-584位氨基酸为保守的PPO1_KFDV结构域。

4.权利要求3所述烟草多酚氧化酶NtPPO4在叶片绿原酸含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与植物叶片绿原酸含量相关，降低该基因表达后，叶片中绿原酸含量明显升高。

5.利用权利要求1所述编码基因NtPPO4的烟草新品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtPPO4基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干扰载体、超表达载体或基因编辑载体，转化烟草，筛选获得绿原酸含量变化的烟草新品种。

6.如权利要求5所述烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默技术，干扰NtPPO4基因的表达使其沉默，NtPPO4基因沉默植株中绿原酸含量显著升高，进而获得绿原酸含量下降的植物新品种。

7.PCR扩增权利要求1所述编码基因NtPPO4的引物序列，其特征在于，引物具体设计为：

NtPPO4-F：5’- CAGCAAAACTCTCTTTTC- 3’，

NtPPO4-R：5’- CTGGACCATCCGTTATCG- 3’。

8.利用权利要求7所述引物的编码基因NtPPO4的PCR扩增方法，其特征在于，以烟草K326的cDNA为模板，以NtPPO4-F、NtPPO4-R为引物，进行PCR扩增。