CN113174376B

CN113174376B - 多酚氧化酶的应用及合成黄酮的方法

Info

Publication number: CN113174376B
Application number: CN202110448995.8A
Authority: CN
Inventors: 张阳; 魏硕; 付饶
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113174376A

Abstract

本发明公开了多酚氧化酶的应用及合成黄酮的方法，进一步限定了多酚氧化酶在催化如式1结构化合物氧化生成如式Ⅱ或式Ⅲ结构化合物中的应用，所述多酚氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；验证了多酚氧化酶可以将圣草酚转化为木犀草素和5,7‑二羟基色原酮，和紫铆亭转化为3',4',7‑三羟基黄酮和7‑羟基‑4色原酮；这对番茄黄酮生物合成机制的研究具有重要的意义。本发明进一步验证了SlPPO F蛋白具有很高的热稳定性，并利用该基因的大肠杆菌工程菌合成了木犀草素，为开发微生物工程和酶工程提供了新的工具。

Description

多酚氧化酶的应用及合成黄酮的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及多酚氧化酶的应用，还涉及合成黄酮的方法。

背景技术

类黄酮(flavonoids)是一大类植物中广泛存在的化合物，种类多样，功能复杂。类黄酮分为黄酮(flavones)、黄酮醇(flavonols)、二氢黄酮(flavanones)、异黄酮(isoflavones)、查尔酮(chalcones)和花青素(anthocyanins)六个主要亚型。其中黄酮化合物是类黄酮中重要的一个亚家族，其化合物结构特征为C2-C3之间存在双键。它们以结合态(黄酮苷)或自由态(黄酮苷元)的形式广泛存在于水果、蔬菜、豆类和茶叶等许多食源性植物中，可应用于饮料、酒类、糕点、焙烤食品等的生产。同时它也可以作为药品广泛应用于医疗行业，经济应用价值很高。木犀草素(Luteolin)是一个具有代表性的黄酮化合物，目前市场上已有很多以木犀草素为主要有效成分的药物，如脉舒胶囊、小春花口服液等，市场需求巨大。但是长期以来，黄酮化合物的来源主要依赖于传统的植物提取以及化学合成的方法。植物提取效率低，耗费药材资源；化学合成则伴随着溶剂残留以及严重的环境污染问题。因而亟需寻找新的具有潜力的绿色的替代方法。

番茄(Solanum lycopersicum)是世界范围内产量仅次于土豆的第二大经济作物，其独特的风味以及丰富的营养使之成为了人们最喜爱的蔬菜水果。同时番茄也是生物学研究的经典模式植物，它具有丰富的遗传资源和较为完善的组学信息。随着类黄酮合成途径的不断深入研究，番茄类黄酮合成的主要步骤已有较清楚的解析。但是番茄乃至茄科植物中类黄酮合成途径的研究还缺乏了重要的一环，即负责合成黄酮化合物的关键酶——黄酮合酶(flavone synthase，FNS)至今未见相关报道。

鉴别出番茄中具有黄酮合酶活性的相关基因，对于阐明和完善番茄黄酮生物合成机制具有十分重要的意义，同时可以为开发微生物工程和酶工程等环境友好型的可替代的黄酮合成方法奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种多酚氧化酶在催化如式Ⅰ结构化合物氧化生成如式Ⅱ或式Ⅲ结构化合物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种合成黄酮的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、多酚氧化酶在催化如式Ⅰ结构化合物氧化生成如式Ⅱ或式Ⅲ结构化合物中的应用，所述多酚氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示，所述式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的结构式如下：

式Ⅰ、式II或式III中的R为氢或羟基。

优选的，所述多酚氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述如式Ⅰ结构化合物为圣草酚或紫铆亭。

优选的，所述式Ⅱ结构化合物为木犀草素，3',4',7-三羟基黄酮；所述式Ⅲ结构化合物为5,7-二羟基色原酮，7-羟基-4色原酮。

2、一种合成黄酮的方法，具体方法如下：将如式Ⅰ结构化合物为底物在含有多酚氧化酶的条件下反应生成如式Ⅱ或式Ⅲ结构化合物，所述多酚氧化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；所述式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ的结构式如下：

式Ⅰ、式II或式III中的R为氢或羟基。

优选的，所述多酚氧化酶为重组多酚氧化酶或表达多酚氧化酶的工程菌。

优选的，所述重组多酚氧化酶由含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列的重组表达载体转化宿主，经诱导表达后，纯化得到。

优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示序列分别通过Gateway克隆技术中的BP反应连接到载体pDONR207中，获得中间载体，然后将中间载体和表达载体pDEST17利用Gateway克隆技术中的LR反应连接获得重组表达载体；所述宿主为大肠杆菌Trans10。

优选的，所述表达多酚氧化酶的工程菌为含有重组表达载体的大肠杆菌Trans10，所述重组表达载体由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列分别通过Gateway克隆技术中的BP反应连接到载体pDONR207中，获得中间载体，然后将中间载体和表达载体pDEST17利用Gateway克隆技术中的LR反应连接获得重组表达载体。

优选的，所述反应的条件为在0～70℃下反应；或将表达多酚氧化酶的工程菌诱导表达后与底物混合，在20℃、180rpm下诱导36h。

本发明的有益效果在于：本发明提供了番茄中具有黄酮合酶以及裂解酶活性的四个关键基因SlPPO A、B、D和F，验证了它们可以将圣草酚转化为木犀草素和5,7-二羟基色原酮，和紫铆亭转化为3',4',7-三羟基黄酮和7-羟基-4色原酮；这对番茄黄酮生物合成机制的研究具有重要的意义。本发明进一步验证了SlPPO F蛋白具有很高的热稳定性，并利用该基因的大肠杆菌工程菌合成了木犀草素，为开发微生物工程和酶工程提供了新的工具。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为SlPPO A、SlPPO B、SlPPO D和SlPPO F纯化的蛋白SDS-PAGE结果图；

图2为重组蛋白活性显示SlPPO A、SlPPO B、SlPPO D和SlPPO F能够将圣草酚转化为木犀草素和5,7-二羟基色原酮。

图3为SlPPO F蛋白的热稳定性及催化效率结果图。

图4为含SlPPO F基因的工程菌菌株和培养基中木犀草素和5,7-二羟基色原酮检测结果。

图5为SlPPO F重组蛋白与紫铆亭反应结果检测图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、番茄SlPPOs基因的克隆

(1)番茄总RNA的提取

番茄总RNA的提取使用成都百菲特科技有限公司的RNA试剂盒，具体步骤如下：取40-100mg番茄须根转入2mL研磨管，加入直径5mm的钢珠，关闭盖子在液氮中冷冻5min，然后迅速转入研磨仪中进行破碎；之后立即加入溶液A涡旋振荡混匀，短暂离心5-10s后加入300μL溶液B和200μL氯仿，涡旋振荡30s使溶液充分乳化，室温，12000g，离心5min，转移800μL上清液到新的2mL离心管中，加入等体积的溶液C，立即涡旋混匀。之后将上述混合物分两次转入RNA吸附柱中，室温，12000g离心1min，弃掉收集管中废液；加入700μL溶液D，静置30s，室温，12000g离心1min，弃掉收集管中废液；加入500μL漂洗液，室温，12000g离心1min，弃滤液；加入500μL漂洗液重复一次；之后12000g离心2min；将RNA吸附柱放入RNase-free离心管中，在吸附膜中间部位加入50uL RNase-free H₂O，室温放置3-5min；室温，12000g离心2min，即得RNA样品，可以立即使用或者存放于-80℃待用。

(2)番茄SlPPOs基因的克隆

提取番茄总RNA，将所获的番茄总RNA通过反转录酶反转录获得第一链cDNA，设计并合成完整编码框的上游引物和下游引物，具体如下：

Solyc08g074680-SlPPO A：

上游引物F-SlPPO A：5'-atggcaagtttgtgtagtaatagtagta-3'(SEQ ID NO.9)；

下游引物R-SlPPO A：5'-ttaacaatccgcaagcttgatctc-3'(SEQ ID NO.10)；

Solyc08g074683-SlPPO B：

上游引物F-SlPPO B：5'-atggcaagtgtagtgtgcaatagtagt-3'(SEQ ID NO.11)；

下游引物R-SlPPO B：5'-ttaacaatccacaagcttgatctccacatt-3'(SEQ ID NO.12)；

Solyc08g074682-SlPPO D：

上游引物F-SlPPO D：5'-atggcaagtgtagtgtgcaatagtagt-3'(SEQ ID NO.11)；

下游引物R-SlPPO D：5'-ttaacaatcagcaagactgatggtcgcatt-3'(SEQ ID NO.13)；

Solyc08g074630-SlPPO F：

上游引物F-SlPPO F：5'-atgtcttcttctactcctaatactcttcc-3'(SEQ ID NO.14)；

下游引物R-SlPPO F：5'-ttaacaatcctcaagcttgatctcc-3'(SEQ ID NO.15)；

以反转获得的第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.9-15所示上游引物和下游引物为引物对，扩增克隆目标序列的全长基因，反应体系如下表1所示：

表1、扩增反应体系

体系成分	体积
		2×Rapid Taq Master Mix	25μL
10μM SlPPOs-F	1.5μL
		10μM SlPPOs-R	1.5μL
cDNA	2μL
		ddH₂O	补足至50μL

反应程序如表2所示。

表2、反应程序

扩增获得SlPPO A、SlPPO B、SlPPO D和SlPPO F，其核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

实施例2、构建含SlPPOs基因的大肠杆菌重组表达载体及工程菌

将扩增后的SlPPOs基因(DNA序列如SEQ ID NO.1-4所示)通过Gateway克隆技术中的BP反应连接到载体pDONR207中，获得中间载体分别命名为pDONR207-SlPPO A、pDONR207-SlPPO B、pDONR207-SlPPO D、pDONR207-SlPPO F。然后由生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认基因的正确性。

然后将中间载体pDONR207-SlPPO A、pDONR207-SlPPO B、pDONR207-SlPPO D、pDONR207-SlPPO F分别和表达载体pDEST17利用Gateway克隆技术中的LR反应连接并转化大肠杆菌Trans10，筛选阳性克隆，然后提取质粒做PCR检测，得到含有SlPPO A、SlPPOB、SlPPO D、SlPPO F四个基因的重组表达载体，分别命名为pDEST17-SlPPO A、pDEST17-SlPPOB、pDEST17-SlPPO D、pDEST17-SlPPOF载体。

将pDEST17-SlPPO A、pDEST17-SlPPO B、pDEST17-SlPPO D、pDEST17-SlPPO F载体转化大肠杆菌(如BL21(DE3)，为市场有公开出售的生物材料，可以从北京全式金生物公司购得，产品目录号为CD601-02)，筛选阳性克隆，获得含pDEST17-SlPPO A、pDEST17-SlPPOB、pDEST17-SlPPO D、pDEST17-SlPPO F载体的工程菌，分别命名为BL21-pDEST17-SlPPO A、BL21-pDEST17-SlPPO B、BL21-pDEST17-SlPPO D、BL21-pDEST17-SlPPO F(合称BL21-pDEST17-SlPPO A/B/D/F)。

实施例3、SlPPOs重组蛋白显示多酚氧化酶和裂解酶活性

SlPPOs重组蛋白的诱导表达：将筛选的工程菌BL21-pDEST17-SlPPO A/B/D/F分别于5mL含有50mg/L Carb(羧苄青霉素)的LB液体培养基中37℃，200rpm培养过夜，之后将其转移至50mL相同LB液体培养基中振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.9。之后向菌液中加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和CuSO₄使其终浓度为0.5mM；20℃，180rpm诱导48h后，室温，5000g，10min收集菌体，可立即进行提取或者冻存于-80℃冰箱备用。

SlPPOs重组蛋白的提取与纯化：向收集的菌体中加入5mL lysis buffer(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)，超声破碎菌体细胞(工作3s，间隔6s，15min)。菌体破碎后，4℃，20000g离心10min收集上清液，即得粗酶液。之后利用德国Qiagen公司的镍柱进行分离纯化。具体步骤如下：(1)温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose数次，吸取500μL的树脂加入15ml离心管中，4℃，500g，离心5min，轻柔的吸出上清。(2)加入5mL无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，4℃，500g，离心5min，轻柔的吸出上清，重复步骤(2)三次。(3)加入5mL裂解液，温和的颠倒柱子3min，4℃，500g，离心5min，轻柔的吸出上清，旨在平衡柱子，平衡三次。(4)加入等体积的裂解液制成50％的slurry。(5)将获得的SlPPOs粗酶液分别在4℃，重力作用下过柱三次。(6)分别用2mL wash buffer 1(裂解液中含20mM咪唑)和2mL washbuffer 2(裂解液中含40mM咪唑)过柱两次，除去吸附在柱子上的杂蛋白。(7)最后用500μL的elution buffer(裂解液中含250mM咪唑)洗脱3次，同时用干净的1.5mL离心管分开收集洗脱下来的蛋白，之后进行SDS-PAGE分析，如图1所示。结果显示，纯化后的蛋白在60KD附近有特异条带，表明重组蛋白成功分离纯化。

SlPPOs重组蛋白体外酶活反应及LC-HRMS检测：将纯化得到的SlPPOs蛋白利用体外酶活法进行反应：取1μg SlPPO A、SlPPO B、SlPPO D或SlPPO F蛋白，加入2.5mM SDS进行激活，之后将蛋白过分子筛(10kD，Merck Millipore)除去SDS。总体系为100μL，加入1mM圣草酚，PBS(pH 7.0)缓冲液补齐体系，室温或者30℃反应15min。向体系中加入400μL甲醇停止反应，10℃，20000g，离心10min。相同条件再次离心，上清液即为待测样品。之后采用LC-HRMS(Nexera UHPLC LC-30A和AB SCIEX qTOF X500R)进行检测。色谱柱为Hypersil GoldC18柱(100×2.1mm,1.9μm；Thermo Fisher Scientific,USA)，柱温：40℃，流速为0.4mL/min；流动相：A相为0.1％甲酸，B相为乙腈。梯度如下：0-4min20％B；4-7min 20-95％B；7-7.5min 95％B；7.5-7.6min 95％-20％B；7.6-10min 20％B。

体外酶活检测结果显示SlPPO A，SlPPO B，SlPPO D和SlPPO F均有黄酮合酶的活性，可以将圣草酚转化成木犀草素，如图2中a所示。同时，四者均具有裂解酶活性，可以将圣草酚转化为5,7-二羟基色原酮，如图2中b所示，其反应流程如。

实施例4、SlPPO F蛋白的热稳定性及利用大肠杆菌工程菌合成木犀草素

SlPPO F蛋白的热稳定性：将SlPPO F蛋白分别在0℃，4℃，20℃，30℃，40℃，50℃，70℃下，利用上述酶活体系进行反应，之后采用酶标仪在356nm下检测木犀草素的含量，旨在检验SlPPO F蛋白在较宽温度范围内是否会变性，验证其对温度的耐受性，结果如图3所示。结果显示，SlPPO F在0-70℃范围内均有活性，并且在较高温度时(50-70℃)活性并没有降低。

SlPPO F在大肠杆菌工程菌中的应用：将工程菌BL21-pDEST17-SlPPO F(50mL体系)诱导表达12h后，向菌液中加入1mM圣草酚为底物，20℃，180rpm接着诱导36h后，室温，5000g，10min收集菌体和上清液(培养基)。菌体直接用600uL甲醇，室温，超声提取15min。10℃，20000g，离心10min。相同条件再次离心，上清液即为待测样品。取5mL培养基，60℃下使溶剂挥发完全后用500uL甲醇溶解，10℃，20000g，离心10min。相同条件再次离心，上清液即为待测样品，结果如图4所示。结果显示，含SlPPO F基因的大肠杆菌工程菌可以直接将圣草酚转化为木犀草素。

实施例5、SlPPO F可以将紫铆亭转化为3',4',7-三羟基黄酮和7-羟基-4色原酮

SlPPO F重组蛋白体外酶活反应及LC-HRMS检测：按照实施例3中相同的体外酶活反应体系及检测方法，将底物换成紫铆亭，即可检测到3',4',7-三羟基黄酮和7-羟基-4色原酮的产生，如图5所示。

本实施例提供了番茄中具有黄酮合酶活性的四个基因，并验证了SlPPO F的热稳定性以及利用大肠杆菌将圣草酚直接转化生成了木犀草素，为利用微生物工程和酶工程规模化生产木犀草素提供了一种有潜力的方法。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 四川大学

<120> 多酚氧化酶的应用及合成黄酮的方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1782

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 1

atggcaagtt tgtgtagtaa tagtagtagt acatctctca aaactccttt tacttcttcc 60

accacttgtt tatcttccac tcctaaggct tctcaacttt tcctacatgg aaaacgtaac 120

aaaacattca aagtttcatg caaggttacc aatactaacg gtaaccaaga tgaaacgaat 180

tctgttgatc gaagaaatgt tcttcttggc ttaggtggtc tttatggtgt tgctaatgct 240

ataccattag ctgcatccgc tgctcctaca ccacctcctg atctctcatc ttgtaataaa 300

ccaaagatta atgcaactac ggaggtgcca tacttttgtt gcgcgcctaa gcctgatgat 360

atgtccaaag ttccttatta caagttccct tctgtgacta agctccgtat tcgtccccct 420

gctcatgctc ttgatgaggc gtatattgcc aagtacaatc tggcgattag ccgaatgaaa 480

gatcttgata agacacaacc tgataaccct attggtttta agcaacaagc taatatacat 540

tgtgcttatt gtaatggtgg ttattctatt gatggcaaag tgttgcaagt tcataactcg 600

tggcttttct tcccgttcca tagatggtac ttgtacttct acgaaagaat cttgggatca 660

ctcatcgatg atccaacatt cggtttgcca ttttggaatt gggatcatcc aaagggcatg 720

cgtttccctc ccatgtttga tgttccaggg accgcccttt atgacgaaag gcgtggtgat 780

caaatccata atgggaactt tatagatctt ggttcttttg gggatcaagt tgagacaact 840

cagttgcagt tgatgactaa taacttaacc ctgatgtacc gtcagttggt aactaattct 900

ccatgtcctc ttatgttctt tggtggacct tacactcttg ggagtacggt cgaagcagcg 960

ggaactgttg aaaacatccc tcacagccct gttcacattt gggttggtac gagacgaggt 1020

tcagttttac ctgatggtaa aatatcaaat ggtgaggata tgggtaattt ctattcagct 1080

ggtttagacc cgcttttcta ttgccatcac agcaatgtgg acaggatgtg gaacgaatgg 1140

aaggcaactg gaggtaaacg aacagatata caaaacaaag attggttgaa ctcggagttc 1200

tttttctatg atgagaatgg aaatccgttc aaagtgagag tcagagactg tttggatacg 1260

aagaagatgg ggtatgatta ccagccaacg gcgaccccat ggcgtaactt caagccaaaa 1320

acaaaggctt cagctgggaa agtgaatacg ggttcaattc ctcccgaaag ccaggtattc 1380

ccattggcta aactcgacaa agcaatttca ttttccatca acaggcctgc ttcctcgagg 1440

actcaacaag agaaaaatgc acaagaggag gtcctaacat tcaatgcaat aaaatatgat 1500

aacagagatt acataagatt cgatgtgttc ctcaacgtgg ataacaatgt gaacgcgaat 1560

gagcttgaca aggcagagtt tgcggggagt tatactagct tgccacatgt acacagagtt 1620

ggagatccta aacatactgc aactgctact ctccggctgg cgataacaga actgttggag 1680

gacattggtt tggaagatga agatactatc gcggtgactc tggtaccaaa gaaaggtgat 1740

atctccattg gaggtgtgga gatcaagctt gcggattgtt aa 1782

<210> 2

<211> 1791

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 2

atggcaagtg tagtgtgcaa tagtagtagt agtactacta ctacaacgct caaaactcct 60

tttacttctt taggttccac tcctaagccc tctcaacttt tccttcatgg aaaacgtaac 120

aaaacattca aagtttcatg caaggttatc aataataacg gtaaccaaga tgaaacgaat 180

tctgttgatc gaaggaatgt tcttcttggt ttaggaggtc tttatggtgt tgctaatgct 240

ataccattag cggcatcggc tactcctatt ccatcccctg atctcaaaac ttgtggtaga 300

gccaccatat cggatggtcc acttgtaccc tattcttgtt gtccccctcc tatgccgact 360

aactttgaca ccattccata ttacaagttc ccttctatga ctaaactccg tatccgtacc 420

cctgctcatg ctgtagatga ggagtatatc gcgaagtata atttggccat aagtcgaatg 480

agggatcttg acaagacaga accgttaaac cctctagggt ttaagcaaca agctaatata 540

cactgtgctt attgtaacgg tgcttatata attggtggca aagagttaca agttcataac 600

tcgtggcttt tcttcccgtt ccatcgatgg tacttgtact tttacgaaag aatattgggg 660

aaactcattg atgatccaac tttcgcttta ccatactgga attgggatca tccaaagggc 720

atgcgtttac ctcccatgtt cgatcgtgaa ggttcttccc tctacgatga aaggcgtaat 780

caacaagtcc gtaatggaac ggttttggat cttggttcat ttggggataa agttgaaaca 840

actcaactcc agttgatgag caataattta accctaatgt accgtcaaat ggtaactaat 900

gctccatgtc ctctcttgtt cttcggtgcg ccttacgttc ttgggaataa cgttgaagca 960

ccgggaacca ttgaaaccat ccctcatatt cctgtacata tttgggctgg tactgtccgt 1020

ggttcaaaat ttcctaacgg tgatgtgtcc tacggtgagg atatgggtaa tttctactca 1080

gctggtttgg acccggtttt ctattgccat cacggcaatg tggaccggat gtggaacgaa 1140

tggaaggcaa taggaggtaa aagaagagat atatctgaaa aggattggtt gaactccgag 1200

ttctttttct acgacgaaca caaaaatcct taccgtgtga aagtcaggga ctgtttggac 1260

acgaagaaaa tggggtatga ttacgcacca atgccaactc catggcgtaa tttcaaacca 1320

aaatcaaagg cgtccgtagg gaaagtgaat acaagtacac tccccccagc aaacgaggta 1380

ttcccactcg cgaagatgga taagactatt tcatttgcta tcaacaggcc agcttcatcg 1440

cggactcaac aagagaaaaa tgaacaagag gagatgttaa cgttcaataa cataagatat 1500

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aatgagcttg ataaggcaga gttcgcgggg agttatacta gtttgccaca tgttcacaga 1620

gctggcgaga atgatcatat cgcgaaggtt aatttccagc tggcgataac agaactgttg 1680

gaggacattg gtttggaaga tgaagatact atcgcggtga ctctggtacc aaagaaaggc 1740

ggtgaaggta tctccattga gaatgtggag atcaagcttg tggattgtta a 1791

<210> 3

<211> 1776

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 3

atggcaagtt tgtgtagtaa tagtagtact acttctctca aaactccttt cacttcttta 60

ggttccactc caaagccttg tcaacttttc ctacatggaa aacgtaacaa agcattcaaa 120

gtttcatgca aggttaccaa tactaacggt aaccaagatg aaacgaattc tgtagatcga 180

aggaatgttc ttcttggctt aggaggtctt tatggtgttg ctaatgctat accattagct 240

gcatcggctg ctcctacacc acctcctgat ctctcgtctt gtagtatagc aaggattgac 300

gagaatcagg tggtgtcata cagttgttgc gcgcctaagc ctgatgatat ggagaaagtt 360

ccgtattaca agttcccttc tatgactaag ctccgtgttc gtcagcctgc tcatgaggct 420

gatgaggagt acatcgccaa gtacaacttg gcggttagca agatgagaga tcttgataag 480

acacaacctt tgaaccctat tggttttaag caacaagcta atatacattg tgcttattgt 540

aacggtgctt atagaattgg tggcaaagag ttacaagttc ataactcgtg gcttttcttc 600

ccgttccata gatggtactt gtacttctac gagagaatcg tgggaaaact gattgatgat 660

ccaactttcg ctttgcccta ttggaattgg gatcatccaa agggtatgcg ttttcctgcc 720

atgtatgatc gtgaagggac ttttcttttc gatgaaacac gtgaccaaag tcaccgtaat 780

ggaaccgtca ttgatcttgg attttttggc aatgaagtcg aaacaactca gctacagatg 840

atgagtaata acttaactct aatgtaccgt caaatggtga ctaatgctcc atgtcctcgg 900

atgttctttg gcggacctta tgatctcggg actaacgttg aactccccgg aactatagag 960

aacatccctc acggtcctgt gcacatttgg tctggtacag tgagaggttc aactttgccc 1020

aatggagcca tatcaaacgg ggagaatatg ggacatttct attccgctgg tttagacccg 1080

gttttctttt gccatcacag caatgtggat cgaatgtgga gcgaatggaa agcaacagga 1140

gggaaaagaa ccgatatcac acataaagat tggttgaact ccgaattctt cttctacgat 1200

gaaaatgaaa atccttaccg tgtgaaagtc agggactgct tggacacgaa gaagatgggg 1260

tacgattaca agccaatggc aaccccatgg cgtaacttca agcctttaac aaaggcttca 1320

gctgggaaag taaatacaag ttcaattcct ccagtaagcc aggcattccc attggcgaaa 1380

ctcgacaaag cagtttcgtt ttccatcaac aggccgactt catcgcggac tccacaagag 1440

aaaaatgcac aagaggagat gctaacattc aacagcataa gatatgataa cagagggtac 1500

ataaggttcg atgtgttcct gaacgtggac aacaatgtga atgcgaatga gcttgataag 1560

gcagagttcg cggggagtta tactagtttg ccacatgttc atagagctgg tgagactaat 1620

cacatcgcca cggttgattt ccagctggcc ataacagaac tgttggagga tattggtttg 1680

gaagatgaag acacaattgc ggtgactctg gtgccaaaga gaggtggaga aggtatctcc 1740

attgaaaatg cgaccatcag tcttgctgat tgttaa 1776

<210> 4

<211> 1764

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 4

atgtcttctt ctactcctaa tactcttcct ttattatcca ccaacaaatc cctctcttct 60

cccttcacca acaaccactc tactttctta tcaaaaccct ctcaaccttt cctccatgga 120

aggcgctgtc aaagtttcaa ggtttcatgc aacgttggcg agcatgacaa aaaccttgac 180

gctgttgata ggagaaatgt tcttttaggg ttaggaggtt tttatggtgc agctaatctt 240

gcaccattag cctctgctgc tcctatacca ccacctgatc tcaaatcttg tggtgttgcc 300

catatagatg ataaaggtac tgaagtctca tacagttgtt gccctcctgt acctgatgat 360

atcgatagcg ttccgtacta caagttccct cctatgacga aactccgcat ccgcccccct 420

gctcatgcgg cggatgagga gtacgtagcc aagtatcaat tggctacaag tcgaatgagg 480

gaacttgata aagacccttt tgaccctctt gggtttaaac aacaagctaa tattcattgt 540

gcttattgta acggtgctta taaaattggt ggtaaagaat tgcaagttca tttctcgtgg 600

cttttctttc cgttccatag atggtacttg tacttttacg aaaggatatt ggggtcactt 660

attaatgatc caacttttgc tttaccttac tggaattggg atcatccaaa aggtatgcgt 720

atacctccca tgtttgatcg tgagggttca tctctttacg atgagaaacg taaccaaaat 780

catcgcaatg gaactattat tgatcttggt cattttggta aggacgtcga aacacctcag 840

ctacagataa tgactaataa tttaacacta atgtaccgtc aaatggttac taatgctcct 900

tgcccgtctc aattcttcgg tgctgcttac cctctgggtt ctgatccaga accaggcatg 960

ggtactattg agaatattcc tcatacaccg gtccatatct ggaccggtga tagtcctaga 1020

caaggacacg gtgaagacat gggtaatttc tattcagctg gtttagaccc gcttttctac 1080

tgtcaccatg ctaatgtgga caggatgtgg aacgagtgga aattaattgg cgggaaaaga 1140

agggatttat caaataaaga ttggttgaac tctgaattct ttttctacga tgaaaatcgt 1200

aacccttacc gcgtgaaagt ccgtgattgt ttggatagta aaaaaatggg attcgattac 1260

gcgccaatgc ccactccatg gcgtaatttc aaaccaatca gaaggtcatc atcaggaaaa 1320

gtgaatacag cgtcaattgc accagttagc aaggtgttcc cactggccaa gctggaccgt 1380

gcgatttcgt tctcgatcac gcggccagct tcgtcaagga caacacaaga gaaaaatgag 1440

caggaggaga ttctgacatt caataaaatg gcatatgatg atacgaagta tgtaaggttc 1500

gatgtgtttt tgaacgtgga caagactgtg aatgcagaag aacttgataa ggcggagttt 1560

gcggggagtt atactagctt gcctcatgtt catggaaata atgataatca tgttaaggat 1620

gttactttta cgctggcgat aactgaactg ttggaggata ttggattgga agatgaagat 1680

acaattgcgg taactttggt tccaaaagtt ggtggtgaag gtgtatccat tgaaagtgtg 1740

gagatcaagc ttgaggattg ttaa 1764

<210> 5

<211> 593

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 5

Met Ala Ser Leu Cys Ser Asn Ser Ser Ser Thr Ser Leu Lys Thr Pro

1 5 10 15

Phe Thr Ser Ser Thr Thr Cys Leu Ser Ser Thr Pro Lys Ala Ser Gln

20 25 30

Leu Phe Leu His Gly Lys Arg Asn Lys Thr Phe Lys Val Ser Cys Lys

35 40 45

Val Thr Asn Thr Asn Gly Asn Gln Asp Glu Thr Asn Ser Val Asp Arg

50 55 60

Arg Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Tyr Gly Val Ala Asn Ala

65 70 75 80

Ile Pro Leu Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Pro Pro Asp Leu Ser

85 90 95

Ser Cys Asn Lys Pro Lys Ile Asn Ala Thr Thr Glu Val Pro Tyr Phe

100 105 110

Cys Cys Ala Pro Lys Pro Asp Asp Met Ser Lys Val Pro Tyr Tyr Lys

115 120 125

Phe Pro Ser Val Thr Lys Leu Arg Ile Arg Pro Pro Ala His Ala Leu

130 135 140

Asp Glu Ala Tyr Ile Ala Lys Tyr Asn Leu Ala Ile Ser Arg Met Lys

145 150 155 160

Asp Leu Asp Lys Thr Gln Pro Asp Asn Pro Ile Gly Phe Lys Gln Gln

165 170 175

Ala Asn Ile His Cys Ala Tyr Cys Asn Gly Gly Tyr Ser Ile Asp Gly

180 185 190

Lys Val Leu Gln Val His Asn Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg

195 200 205

Trp Tyr Leu Tyr Phe Tyr Glu Arg Ile Leu Gly Ser Leu Ile Asp Asp

210 215 220

Pro Thr Phe Gly Leu Pro Phe Trp Asn Trp Asp His Pro Lys Gly Met

225 230 235 240

Arg Phe Pro Pro Met Phe Asp Val Pro Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Glu

245 250 255

Arg Arg Gly Asp Gln Ile His Asn Gly Asn Phe Ile Asp Leu Gly Ser

260 265 270

Phe Gly Asp Gln Val Glu Thr Thr Gln Leu Gln Leu Met Thr Asn Asn

275 280 285

Leu Thr Leu Met Tyr Arg Gln Leu Val Thr Asn Ser Pro Cys Pro Leu

290 295 300

Met Phe Phe Gly Gly Pro Tyr Thr Leu Gly Ser Thr Val Glu Ala Ala

305 310 315 320

Gly Thr Val Glu Asn Ile Pro His Ser Pro Val His Ile Trp Val Gly

325 330 335

Thr Arg Arg Gly Ser Val Leu Pro Asp Gly Lys Ile Ser Asn Gly Glu

340 345 350

Asp Met Gly Asn Phe Tyr Ser Ala Gly Leu Asp Pro Leu Phe Tyr Cys

355 360 365

His His Ser Asn Val Asp Arg Met Trp Asn Glu Trp Lys Ala Thr Gly

370 375 380

Gly Lys Arg Thr Asp Ile Gln Asn Lys Asp Trp Leu Asn Ser Glu Phe

385 390 395 400

Phe Phe Tyr Asp Glu Asn Gly Asn Pro Phe Lys Val Arg Val Arg Asp

405 410 415

Cys Leu Asp Thr Lys Lys Met Gly Tyr Asp Tyr Gln Pro Thr Ala Thr

420 425 430

Pro Trp Arg Asn Phe Lys Pro Lys Thr Lys Ala Ser Ala Gly Lys Val

435 440 445

Asn Thr Gly Ser Ile Pro Pro Glu Ser Gln Val Phe Pro Leu Ala Lys

450 455 460

Leu Asp Lys Ala Ile Ser Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Ser Ser Arg

465 470 475 480

Thr Gln Gln Glu Lys Asn Ala Gln Glu Glu Val Leu Thr Phe Asn Ala

485 490 495

Ile Lys Tyr Asp Asn Arg Asp Tyr Ile Arg Phe Asp Val Phe Leu Asn

500 505 510

Val Asp Asn Asn Val Asn Ala Asn Glu Leu Asp Lys Ala Glu Phe Ala

515 520 525

Gly Ser Tyr Thr Ser Leu Pro His Val His Arg Val Gly Asp Pro Lys

530 535 540

His Thr Ala Thr Ala Thr Leu Arg Leu Ala Ile Thr Glu Leu Leu Glu

545 550 555 560

Asp Ile Gly Leu Glu Asp Glu Asp Thr Ile Ala Val Thr Leu Val Pro

565 570 575

Lys Lys Gly Asp Ile Ser Ile Gly Gly Val Glu Ile Lys Leu Ala Asp

580 585 590

Cys

<210> 6

<211> 596

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 6

Met Ala Ser Val Val Cys Asn Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr

1 5 10 15

Leu Lys Thr Pro Phe Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Lys Pro Ser Gln

20 25 30

Leu Phe Leu His Gly Lys Arg Asn Lys Thr Phe Lys Val Ser Cys Lys

35 40 45

Val Ile Asn Asn Asn Gly Asn Gln Asp Glu Thr Asn Ser Val Asp Arg

50 55 60

Arg Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Tyr Gly Val Ala Asn Ala

65 70 75 80

Ile Pro Leu Ala Ala Ser Ala Thr Pro Ile Pro Ser Pro Asp Leu Lys

85 90 95

Thr Cys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Asp Gly Pro Leu Val Pro Tyr Ser

100 105 110

Cys Cys Pro Pro Pro Met Pro Thr Asn Phe Asp Thr Ile Pro Tyr Tyr

115 120 125

Lys Phe Pro Ser Met Thr Lys Leu Arg Ile Arg Thr Pro Ala His Ala

130 135 140

Val Asp Glu Glu Tyr Ile Ala Lys Tyr Asn Leu Ala Ile Ser Arg Met

145 150 155 160

Arg Asp Leu Asp Lys Thr Glu Pro Leu Asn Pro Leu Gly Phe Lys Gln

165 170 175

Gln Ala Asn Ile His Cys Ala Tyr Cys Asn Gly Ala Tyr Ile Ile Gly

180 185 190

Gly Lys Glu Leu Gln Val His Asn Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His

195 200 205

Arg Trp Tyr Leu Tyr Phe Tyr Glu Arg Ile Leu Gly Lys Leu Ile Asp

210 215 220

Asp Pro Thr Phe Ala Leu Pro Tyr Trp Asn Trp Asp His Pro Lys Gly

225 230 235 240

Met Arg Leu Pro Pro Met Phe Asp Arg Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Asp

245 250 255

Glu Arg Arg Asn Gln Gln Val Arg Asn Gly Thr Val Leu Asp Leu Gly

260 265 270

Ser Phe Gly Asp Lys Val Glu Thr Thr Gln Leu Gln Leu Met Ser Asn

275 280 285

Asn Leu Thr Leu Met Tyr Arg Gln Met Val Thr Asn Ala Pro Cys Pro

290 295 300

Leu Leu Phe Phe Gly Ala Pro Tyr Val Leu Gly Asn Asn Val Glu Ala

305 310 315 320

Pro Gly Thr Ile Glu Thr Ile Pro His Ile Pro Val His Ile Trp Ala

325 330 335

Gly Thr Val Arg Gly Ser Lys Phe Pro Asn Gly Asp Val Ser Tyr Gly

340 345 350

Glu Asp Met Gly Asn Phe Tyr Ser Ala Gly Leu Asp Pro Val Phe Tyr

355 360 365

Cys His His Gly Asn Val Asp Arg Met Trp Asn Glu Trp Lys Ala Ile

370 375 380

Gly Gly Lys Arg Arg Asp Ile Ser Glu Lys Asp Trp Leu Asn Ser Glu

385 390 395 400

Phe Phe Phe Tyr Asp Glu His Lys Asn Pro Tyr Arg Val Lys Val Arg

405 410 415

Asp Cys Leu Asp Thr Lys Lys Met Gly Tyr Asp Tyr Ala Pro Met Pro

420 425 430

Thr Pro Trp Arg Asn Phe Lys Pro Lys Ser Lys Ala Ser Val Gly Lys

435 440 445

Val Asn Thr Ser Thr Leu Pro Pro Ala Asn Glu Val Phe Pro Leu Ala

450 455 460

Lys Met Asp Lys Thr Ile Ser Phe Ala Ile Asn Arg Pro Ala Ser Ser

465 470 475 480

Arg Thr Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Glu Met Leu Thr Phe Asn

485 490 495

Asn Ile Arg Tyr Asp Asn Arg Gly Tyr Ile Arg Phe Asp Val Phe Leu

500 505 510

Asn Val Asp Asn Asn Val Asn Ala Asn Glu Leu Asp Lys Ala Glu Phe

515 520 525

Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Leu Pro His Val His Arg Ala Gly Glu Asn

530 535 540

Asp His Ile Ala Lys Val Asn Phe Gln Leu Ala Ile Thr Glu Leu Leu

545 550 555 560

Glu Asp Ile Gly Leu Glu Asp Glu Asp Thr Ile Ala Val Thr Leu Val

565 570 575

Pro Lys Lys Gly Gly Glu Gly Ile Ser Ile Glu Asn Val Glu Ile Lys

580 585 590

Leu Val Asp Cys

595

<210> 7

<211> 591

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 7

Met Ala Ser Leu Cys Ser Asn Ser Ser Thr Thr Ser Leu Lys Thr Pro

1 5 10 15

Phe Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Lys Pro Cys Gln Leu Phe Leu His

20 25 30

Gly Lys Arg Asn Lys Ala Phe Lys Val Ser Cys Lys Val Thr Asn Thr

35 40 45

Asn Gly Asn Gln Asp Glu Thr Asn Ser Val Asp Arg Arg Asn Val Leu

50 55 60

Leu Gly Leu Gly Gly Leu Tyr Gly Val Ala Asn Ala Ile Pro Leu Ala

65 70 75 80

Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Pro Pro Asp Leu Ser Ser Cys Ser Ile

85 90 95

Ala Arg Ile Asp Glu Asn Gln Val Val Ser Tyr Ser Cys Cys Ala Pro

100 105 110

Lys Pro Asp Asp Met Glu Lys Val Pro Tyr Tyr Lys Phe Pro Ser Met

115 120 125

Thr Lys Leu Arg Val Arg Gln Pro Ala His Glu Ala Asp Glu Glu Tyr

130 135 140

Ile Ala Lys Tyr Asn Leu Ala Val Ser Lys Met Arg Asp Leu Asp Lys

145 150 155 160

Thr Gln Pro Leu Asn Pro Ile Gly Phe Lys Gln Gln Ala Asn Ile His

165 170 175

Cys Ala Tyr Cys Asn Gly Ala Tyr Arg Ile Gly Gly Lys Glu Leu Gln

180 185 190

Val His Asn Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg Trp Tyr Leu Tyr

195 200 205

Phe Tyr Glu Arg Ile Val Gly Lys Leu Ile Asp Asp Pro Thr Phe Ala

210 215 220

Leu Pro Tyr Trp Asn Trp Asp His Pro Lys Gly Met Arg Phe Pro Ala

225 230 235 240

Met Tyr Asp Arg Glu Gly Thr Phe Leu Phe Asp Glu Thr Arg Asp Gln

245 250 255

Ser His Arg Asn Gly Thr Val Ile Asp Leu Gly Phe Phe Gly Asn Glu

260 265 270

Val Glu Thr Thr Gln Leu Gln Met Met Ser Asn Asn Leu Thr Leu Met

275 280 285

Tyr Arg Gln Met Val Thr Asn Ala Pro Cys Pro Arg Met Phe Phe Gly

290 295 300

Gly Pro Tyr Asp Leu Gly Thr Asn Val Glu Leu Pro Gly Thr Ile Glu

305 310 315 320

Asn Ile Pro His Gly Pro Val His Ile Trp Ser Gly Thr Val Arg Gly

325 330 335

Ser Thr Leu Pro Asn Gly Ala Ile Ser Asn Gly Glu Asn Met Gly His

340 345 350

Phe Tyr Ser Ala Gly Leu Asp Pro Val Phe Phe Cys His His Ser Asn

355 360 365

Val Asp Arg Met Trp Ser Glu Trp Lys Ala Thr Gly Gly Lys Arg Thr

370 375 380

Asp Ile Thr His Lys Asp Trp Leu Asn Ser Glu Phe Phe Phe Tyr Asp

385 390 395 400

Glu Asn Glu Asn Pro Tyr Arg Val Lys Val Arg Asp Cys Leu Asp Thr

405 410 415

Lys Lys Met Gly Tyr Asp Tyr Lys Pro Met Ala Thr Pro Trp Arg Asn

420 425 430

Phe Lys Pro Leu Thr Lys Ala Ser Ala Gly Lys Val Asn Thr Ser Ser

435 440 445

Ile Pro Pro Val Ser Gln Ala Phe Pro Leu Ala Lys Leu Asp Lys Ala

450 455 460

Val Ser Phe Ser Ile Asn Arg Pro Thr Ser Ser Arg Thr Pro Gln Glu

465 470 475 480

Lys Asn Ala Gln Glu Glu Met Leu Thr Phe Asn Ser Ile Arg Tyr Asp

485 490 495

Asn Arg Gly Tyr Ile Arg Phe Asp Val Phe Leu Asn Val Asp Asn Asn

500 505 510

Val Asn Ala Asn Glu Leu Asp Lys Ala Glu Phe Ala Gly Ser Tyr Thr

515 520 525

Ser Leu Pro His Val His Arg Ala Gly Glu Thr Asn His Ile Ala Thr

530 535 540

Val Asp Phe Gln Leu Ala Ile Thr Glu Leu Leu Glu Asp Ile Gly Leu

545 550 555 560

Glu Asp Glu Asp Thr Ile Ala Val Thr Leu Val Pro Lys Arg Gly Gly

565 570 575

Glu Gly Ile Ser Ile Glu Asn Ala Thr Ile Ser Leu Ala Asp Cys

580 585 590

<210> 8

<211> 587

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 8

Met Ser Ser Ser Thr Pro Asn Thr Leu Pro Leu Leu Ser Thr Asn Lys

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ser Pro Phe Thr Asn Asn His Ser Thr Phe Leu Ser Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Pro Phe Leu His Gly Arg Arg Cys Gln Ser Phe Lys Val

35 40 45

Ser Cys Asn Val Gly Glu His Asp Lys Asn Leu Asp Ala Val Asp Arg

50 55 60

Arg Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Phe Tyr Gly Ala Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Pro Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ile Pro Pro Pro Asp Leu Lys Ser

85 90 95

Cys Gly Val Ala His Ile Asp Asp Lys Gly Thr Glu Val Ser Tyr Ser

100 105 110

Cys Cys Pro Pro Val Pro Asp Asp Ile Asp Ser Val Pro Tyr Tyr Lys

115 120 125

Phe Pro Pro Met Thr Lys Leu Arg Ile Arg Pro Pro Ala His Ala Ala

130 135 140

Asp Glu Glu Tyr Val Ala Lys Tyr Gln Leu Ala Thr Ser Arg Met Arg

145 150 155 160

Glu Leu Asp Lys Asp Pro Phe Asp Pro Leu Gly Phe Lys Gln Gln Ala

165 170 175

Asn Ile His Cys Ala Tyr Cys Asn Gly Ala Tyr Lys Ile Gly Gly Lys

180 185 190

Glu Leu Gln Val His Phe Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg Trp

195 200 205

Tyr Leu Tyr Phe Tyr Glu Arg Ile Leu Gly Ser Leu Ile Asn Asp Pro

210 215 220

Thr Phe Ala Leu Pro Tyr Trp Asn Trp Asp His Pro Lys Gly Met Arg

225 230 235 240

Ile Pro Pro Met Phe Asp Arg Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Asp Glu Lys

245 250 255

Arg Asn Gln Asn His Arg Asn Gly Thr Ile Ile Asp Leu Gly His Phe

260 265 270

Gly Lys Asp Val Glu Thr Pro Gln Leu Gln Ile Met Thr Asn Asn Leu

275 280 285

Thr Leu Met Tyr Arg Gln Met Val Thr Asn Ala Pro Cys Pro Ser Gln

290 295 300

Phe Phe Gly Ala Ala Tyr Pro Leu Gly Ser Asp Pro Glu Pro Gly Met

305 310 315 320

Gly Thr Ile Glu Asn Ile Pro His Thr Pro Val His Ile Trp Thr Gly

325 330 335

Asp Ser Pro Arg Gln Gly His Gly Glu Asp Met Gly Asn Phe Tyr Ser

340 345 350

Ala Gly Leu Asp Pro Leu Phe Tyr Cys His His Ala Asn Val Asp Arg

355 360 365

Met Trp Asn Glu Trp Lys Leu Ile Gly Gly Lys Arg Arg Asp Leu Ser

370 375 380

Asn Lys Asp Trp Leu Asn Ser Glu Phe Phe Phe Tyr Asp Glu Asn Arg

385 390 395 400

Asn Pro Tyr Arg Val Lys Val Arg Asp Cys Leu Asp Ser Lys Lys Met

405 410 415

Gly Phe Asp Tyr Ala Pro Met Pro Thr Pro Trp Arg Asn Phe Lys Pro

420 425 430

Ile Arg Arg Ser Ser Ser Gly Lys Val Asn Thr Ala Ser Ile Ala Pro

435 440 445

Val Ser Lys Val Phe Pro Leu Ala Lys Leu Asp Arg Ala Ile Ser Phe

450 455 460

Ser Ile Thr Arg Pro Ala Ser Ser Arg Thr Thr Gln Glu Lys Asn Glu

465 470 475 480

Gln Glu Glu Ile Leu Thr Phe Asn Lys Met Ala Tyr Asp Asp Thr Lys

485 490 495

Tyr Val Arg Phe Asp Val Phe Leu Asn Val Asp Lys Thr Val Asn Ala

500 505 510

Glu Glu Leu Asp Lys Ala Glu Phe Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Leu Pro

515 520 525

His Val His Gly Asn Asn Asp Asn His Val Lys Asp Val Thr Phe Thr

530 535 540

Leu Ala Ile Thr Glu Leu Leu Glu Asp Ile Gly Leu Glu Asp Glu Asp

545 550 555 560

Thr Ile Ala Val Thr Leu Val Pro Lys Val Gly Gly Glu Gly Val Ser

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<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcaagtt tgtgtagtaa tagtagta 28

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaacaatcc gcaagcttga tctc 24

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggcaagtg tagtgtgcaa tagtagt 27

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttaacaatcc acaagcttga tctccacatt 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttaacaatca gcaagactga tggtcgcatt 30

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgtcttctt ctactcctaa tactcttcc 29

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttaacaatcc tcaagcttga tctcc 25

Claims

1.多酚氧化酶在催化如式Ⅰ结构化合物氧化生成如式Ⅱ结构化合物中的应用，所述多酚氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；

所述式Ⅰ、式Ⅱ的结构式如下：

式Ⅰ、式II中的R为氢或羟基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多酚氧化酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

3.一种合成黄酮的方法，其特征在于，具体方法如下：将如式Ⅰ结构化合物为底物在含有多酚氧化酶的条件下反应生成如式Ⅱ结构化合物，所述多酚氧化酶的氨基酸序列如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；

所述式Ⅰ、式Ⅱ的结构式如下：

式Ⅰ、式II中的R为氢或羟基。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述多酚氧化酶为重组多酚氧化酶或来自于表达多酚氧化酶的工程菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组多酚氧化酶由含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列的重组表达载体转化宿主，经诱导表达后，纯化得到。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列分别通过Gateway克隆技术中的BP反应连接到载体pDONR207中，获得中间载体，然后将中间载体和表达载体pDEST17利用Gateway克隆技术中的LR反应连接获得重组表达载体；所述宿主为大肠杆菌Trans10。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述表达多酚氧化酶的工程菌为含有重组表达载体的大肠杆菌Trans10，所述重组表达载体由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示序列分别通过Gateway克隆技术中的BP反应连接到载体pDONR207中，获得中间载体，然后将中间载体和表达载体pDEST17利用Gateway克隆技术中的LR反应连接获得重组表达载体。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反应的条件为在0～70℃下反应；或将表达多酚氧化酶的工程菌诱导表达后与底物混合，在20℃、180rpm下诱导36h。

9.多酚氧化酶在催化如式Ⅰ结构化合物氧化生成如式III结构化合物中的应用，所述多酚氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述式Ⅰ和式III的结构式如下：

式Ⅰ或式III中的R为氢或羟基。

10.一种合成黄酮的方法，其特征在于，具体方法如下：将如式Ⅰ结构化合物为底物在含有多酚氧化酶的条件下反应生成如式III结构化合物，所述多酚氧化酶的氨基酸序列如SEQID NO.8所示；

所述式Ⅰ和式III的结构式如下：

式Ⅰ或式III中的R为氢或羟基。