CN113322288B - 新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用 - Google Patents

新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用。本发明人克隆获得了新型的黄酮羟基化酶PhF2H、PhF3’H，其属于细胞色素P450羟基化酶，具有对于化合物特定位置进行羟基化的功能。进一步地，本发明人通过对于所述酶的改造、结合运用碳苷糖基转移酶、黄酮前体合成途径的组装，在人工重组表达系统中高效地合成了黄酮碳苷类化合物如荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素，及其合成途径中相关的中间体圣草酚、2‑羟基柚皮素等。

Description

新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其 应用
技术领域
本发明涉及合成生物学及医药技术领域，具体地，本发明涉及新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物或其中间体的微生物、其制备方法及其应用。
背景技术
竹自古以来作为一种药食两用的植物在民间广为流传。《中药大辞典》记载“竹叶清热除烦，生津利尿”指明竹叶的食用价值；而《文经逢源》记载：“竹叶兼行肌表，能疗疮杀虫”亦标明其外用药效；竹叶在江南地区作为一种清热败火茶饮而广为流传。竹叶中最主要的黄酮提取物为四种碳苷黄酮化合物：荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素。
碳苷类黄酮化合物是以黄酮C6-C3-C6结构为母核，糖基直接与母核以C-C键相连的化合物。碳苷类黄酮相对于氧苷类黄酮更为稀有，迄今为止从自然界中分离到的碳苷黄酮有几十种，按照黄酮的母体结构可分为碳苷黄酮类、黄酮醇碳苷类、双碳苷黄酮类化合物，而其中以碳苷黄酮类化合物存在最为广泛。根据报道，碳苷黄酮类化合物具有显著的抗氧化作用，可以显著性抑制外源性以及内源性自由基；同时，其具有一定程度抑制细菌病毒的作用；碳苷黄酮类化合物也具有调节血脂的作用，可以显著性地降低血液中总胆固醇的含量，并且具有治疗心脑血管疾病的药物活性；同时碳苷黄酮类化合物具有显著性抗辐射以及神经保护的作用；有调查表明碳苷黄酮类化合物具有相关抗代谢疾病的作用，对于糖尿病、肥胖等疾病均具有一定的治疗效果。
与大多数天然产物一样，几种碳苷黄酮化合物的通过化学有机合成的方法十分困难。现阶主要段获得依从植物中进行有机试剂萃取的方法。在此过程中需要大量的有机溶剂，还存在随后的分离工艺繁琐，工业化造价高等问题。最主要的是该方法还会遇到植物生长缓慢的瓶颈问题。
现阶段随着合成生物学的发展，利用微生物作为底盘细胞，通过外源基因的导入以及微生物反应器发酵手段定向合成目标产物为越来越普遍的一种技术。微生物具有遗传操作简便、生长迅速等优势。相对于传统的植物提取手段，微生物发酵具有速度快、受天气气候影响较小等优势，并且一些中间产物更易获得；部分化合物通过微生物合成的产量远高于植物提取，已经成为天然产物获得的一种重要手段。
目前，尚无于大肠杆菌中高效合成碳苷黄酮化合物的报道，因此本领域亟待进行有效的探索，以期找到此类化合物的高效合成途径。
发明内容
本发明的目的在于提供新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物或其中间体的微生物、其制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种催化黄烷酮(类)化合物的C-2位或C-3’位羟基化的方法，包括：以新型黄酮羟基化酶进行所述催化；其中，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ IDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；或所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化。
在一个优选例中，所述黄烷酮(类)化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构(开环形式)的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；
在另一优选例中，A环或B环中，存在1、2或3个羟基。
在另一优选例中，所述的黄烷酮(类)化合物包括(但不限于)：柚皮素，圣草酚，松属素，橙皮素，樱花素。
在另一优选例中，C-2位羟基化的产物为2-羟基黄烷酮化合物，包括(但不限于)：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚，2-羟基松属素，2-羟基橙皮素，2-羟基樱花素；所述黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物较佳的为开环形式。
在另一优选例中，C-3’位羟基化的产物为3’-羟基黄烷酮化合物，包括(但不限于)：圣草酚，3’-羟基松属素，3’-羟基樱花素。
在本发明的另一方面，提供新型黄酮羟基化酶的用途，用于催化黄烷酮(类)化合物的C-2位或C-3’位羟基化，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；或所述新型黄酮羟基化酶为SEQ IDNO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化。
在一个优选例中，所述黄烷酮(类)化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构(开环形式)的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；
在另一优选例中，所述的黄烷酮(类)化合物包括(但不限于)：柚皮素，圣草酚，松属素，橙皮素，樱花素。
在另一优选例中，C-2位羟基化的产物包括(但不限于)：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚，2-羟基松属素，2-羟基橙皮素，2-羟基樱花素；所述黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物较佳的为开环形式。
在另一优选例中，C-3’位羟基化的产物包括(但不限于)：圣草酚，3’-羟基松属素，3’-羟基樱花素。
在另一优选例中，所述SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体中，N端的跨膜区氨基酸序列被部分(如，截去5、10、15、18、20aa或更多)或全部截去；较佳地截去N端第2～24位氨基酸。
在另一优选例中，所述SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体中，N端的跨膜区氨基酸序列被部分(如，截去5、10、15、18aa或更多)或全部截去；较佳地截去N端第2～24位氨基酸。
在另一优选例中，还包括在N端添加标签；较佳地，所述标签包括(但不限于)：2B1，17α，MBP；更佳地为2B1标签。
在另一优选例中，SEQ ID NO:1或2的保守性变异多肽包括：(1)由SEQ ID NO:1或2所示序列的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化黄烷酮(类)化合物的C-2位或C-3’位羟基化功能的多肽；(2)氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2所示序列的多肽有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)相同性，且具有催化黄烷酮(类)化合物的C-2位或C-3’位羟基化功能的多肽；或(3)在SEQ ID NO:1或2所示序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种合成黄酮碳苷(类)化合物或其中间体的方法，包括：(1)将黄烷酮(类)化合物以新型黄酮羟基化酶进行催化，在其C-2位或C-3’位羟基化；所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化；(2)将(1)的C-2位羟基化产物进行碳苷糖基化，获得碳苷-2-羟基黄烷酮(类)化合物；或，将(1)的C-3’位羟基化产物进一步进行C-2位羟基化，之后继续进行碳苷糖基化，获得黄酮碳苷(类)化合物(碳苷-2,3’-二羟基黄烷酮(类)化合物)或其中间体。
在另一优选例中，以碳苷糖基转移酶进行碳苷糖基化。
在另一优选例中，在(1)之前，还包括：(b)将丙二酰-CoA结构类似物(如包括其经1或多基团的取代形式)与p-香豆酰-CoA结构类似物(如包括其经1或多基团的取代形式)经查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)催化，获得黄烷酮(类)化合物。
在另一优选例中，在(b)之前，还包括：(a)将芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶(TAL)或苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)催化，获得p-香豆酰-CoA结构类似物。
在另一优选例中，所述的黄烷酮(类)化合物包括(但不限于)：柚皮素，圣草酚。
在另一优选例中，所述的丙二酰-CoA结构类似物包括(但不限于)：丙二酰-CoA或甲基丙二酰-CoA。
在另一优选例中，所述的p-香豆-CoA结构类似物包括(但不限于)：p-香豆酰-CoA或p-肉桂酰-CoA。
在另一优选例中，所述的芳香族氨基酸包括(但不限于)：L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。
在另一优选例中，所述的碳苷糖基化以碳苷糖基转移酶进行，较佳地，所述碳苷糖基转移酶包括PhCGT1、OsCGT或ZmCGT。
在本发明的另一方面，提供一种生物合成黄烷酮(类)化合物的方法，包括：将合成黄烷酮(类)化合物的前体基因以及编码新型黄酮羟基化酶的基因共转入宿主细胞中；所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化，获得2-羟基黄烷酮化合物；和/或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ IDNO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化，获得3’-羟基黄烷酮化合物。
在本发明的另一方面，提供一种生物合成黄酮碳苷(类)化合物或其中间体的方法，包括：(i)将合成黄烷酮(类)化合物的前体基因、编码新型黄酮羟基化酶的基因以及编码碳苷糖基转移酶的基因共转入宿主细胞中；所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；和/或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化；(ii)培养(i)的细胞，从而生物合成黄酮碳苷(类)化合物或其中间体。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的细胞，其中包括：合成黄烷酮(类)化合物的前体基因、编码新型黄酮羟基化酶的基因；其中，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ IDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化。
在一个优选例中，所述的遗传工程化的细胞中还包括：编码碳苷糖基转移酶的基因。
在本发明的另一方面，提供制备所述的细胞的方法，包括：将合成黄烷酮(类)化合物的前体基因、编码新型黄酮羟基化酶的基因共转入宿主细胞中；其中，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化；较佳地，还将编码碳苷糖基转移酶的基因共转入宿主细胞中。
在本发明的另一方面，提供一种用于生物合成黄酮碳苷(类)化合物或其中间体的试剂盒，其中包括：新型黄酮羟基化酶；合成黄烷酮(类)化合物的前体基因；其中，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化；较佳地，还包括碳苷糖基转移酶；较佳地还包括宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于生物合成黄酮碳苷(类)化合物或其中间体的试剂盒，其中前面所述的遗传工程化的细胞。
在另一优选例中，所述SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体中，N端的跨膜区氨基酸序列被部分或全部截去；较佳地截去N端第2～24位氨基酸；或所述SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体中，N端的跨膜区氨基酸序列被部分或全部截去；较佳地截去N端第2～24位氨基酸；较佳地，还包括在N端添加标签；更佳地，所述标签包括(但不限于)：2B1，17α，MBP；更佳地为2B1标签。
在另一优选例中，所述的细胞包括：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌或链霉菌，所述真核宿主细胞包括酵母。
在另一优选例中，所述的黄酮碳苷(类)化合物包括：牡荆素，异牡荆素，荭草苷，异荭草。
在另一优选例中，所述的黄酮碳苷(类)化合物的中间体包括：2-羟基柚皮素-C-葡萄糖苷，2-羟基圣草酚-C-葡萄糖苷。
在另一优选例中，所述的合成黄烷酮(类)化合物的前体基因包括芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶或苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酰-CoA连接酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶基因；或
在另一优选例中，所述的细胞中还包括合成糖基供体的基因。
在另一优选例中，所述的细胞中还包括细胞色素P450还原酶(如CPR)表达盒。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、生物合成2-羟基柚皮素的预测的反应途径示意图。
图2、实施例各个表达质粒构建示意图。
图3、(左)工程菌株sSYW80、sSYW81的发酵反应液的HPLC产物分析。(右)工程菌株sSYW80和sSYW81生产2-羟基柚皮素的产量。
图4、生物合成牡荆素、异牡荆素、二羟基柚皮素糖基化产物的预测的反应途径示意图。
图5、(左)工程菌株sCZ4和sCZ89的发酵反应液的HPLC产物分析(右)反应液酸处理前与后的各产物的产量。
图6、生物合成圣草酚的预测的反应途径示意图。
图7、(左)工程菌株sCZ51和sCZ97的发酵反应液的HPLC产物分析。(右)工程菌株sCZ51和sCZ97生产圣草酚的产量。
图8、生物合成荭草苷、异荭草苷、二羟基圣草酚糖基化产物的预测的反应途径示意图。
图9、工程菌株sSYW82、sSYW83的发酵反应液的HPLC产物分析。(右)反应液酸处理前与后的各产物的产量。
具体实施方式
本发明人致力于生物合成黄烷酮类化合物或碳苷黄酮类化合物(黄酮碳苷类化合物)方面的研究，通过挖掘植物基因组信息，克隆获得新型的黄酮羟基化酶PhF2H、PhF3’H，其属于细胞色素P450羟基化酶，其具有对于化合物特定位置进行羟基化的功能。进一步地，本发明人通过对于所述酶的改造、结合运用碳苷糖基转移酶、黄酮前体合成途径的组装，在细胞中高效地合成了黄酮碳苷类化合物如荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素，以及它们的途径中间体2-羟基柚皮素、圣草酚等。
活性多肽、其编码基因、载体及宿主
本发明人通过挖掘基因组以及转录组信息，结合大量的研究和实验工作，揭示了新型的黄酮羟基化酶PhF2H及PhF3’H，本发明人对所述酶进行异源表达发现，PhF2H可以高效地催化黄酮类化合物如柚皮素及其衍生物的C-2位置的羟基化；PhF3’H可以高效地催化黄酮类化合物如柚皮素及其衍生物的C-3’位置的羟基化。较佳地，本发明的黄酮羟基化酶来源于单子叶禾本科植物；更佳地，包括来自于毛竹(Phyllostachys edulis(或称Phyllostachys heterocycla)；Ph)。
所述PhF2H具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述的PhF3’H具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明也包括所述黄酮羟基化酶PhF2H(黄烷酮-2-羟化酶)及PhF3’H(黄烷酮-3’-羟化酶)的保守性变异多肽。本发明中，所述的“保守性变异多肽”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。所述的“保守性变异多肽”可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
所述的“保守性变异多肽”可以包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如50个以内，较20个或10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
作为本发明的优选方式，本发明的黄烷酮-2-羟化酶和黄烷酮-3’-羟化酶是去除了N端的跨膜区的多肽片段。本发明人发现，将N端的跨膜区去除，可以使得截短后蛋白的可溶性表达增加，当被应用于生物合成途径中时，发挥更好的活性。
本发明的黄酮羟基化酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。作为本发明的优选方式，所述的标签包括2B，17α，MBP等；更为优选地，所述标签为2B1。
当出于生产本发明的黄酮羟基化酶或其他酶的目的时，为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在本发明的多肽的氨基端添加上信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
编码本发明的碳苷黄酮羟基化酶以及其它酶的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：(1).用编码所述多肽(含其保守性变异多肽)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码所述多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体可以是原核表达载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的黄酮羟基化酶或其它酶的多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，枯草杆菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母，植物细胞，灵芝细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明也提供了用于生物合成黄酮碳苷类化合物或其中间体的宿主细胞，其中包括：合成黄烷酮化合物的前体基因、本发明的编码黄烷酮-2-羟化酶和/或黄烷酮-3’-羟化酶的基因以及碳苷糖基转移酶的基因。
在本发明的优选方式中，所述的宿主细胞为原核细胞，较佳地为大肠杆菌，酵母，链霉菌；更佳地为大肠杆菌细胞。细胞宿主是一种生产工具，本领域技术人员可以通过一些技术手段对大肠杆菌以外的其他宿主细胞进行改造，从而也实现如本发明的生物合成，由此构成的宿主细胞以及生产方法也应包含在本发明中。
在本发明的优选方式中，所述的宿主细胞中，所述的合成黄烷酮(类)化合物的前体基因包括芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶或苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酰-CoA连接酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶基因。本发明也包括所述查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、酪氨酸解氨酶、苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酰-CoA连接酶、碳苷糖基转移酶等的保守性变异多肽。
在本发明的优选方式中，所述的细胞中还可包括合成糖基供体的基因。所述糖基包括葡萄糖；较佳地，所述糖基供体为携带葡萄糖基团的化合物；例如所述糖基供体包括UDP葡萄糖。
在本发明的优选方式中，所述的细胞中还包括细胞色素P450还原酶表达盒，用于与本发明所述的细胞色素P450羟基化酶组合，提供还原力。本发明也包括所述细胞色素P450还原酶的保守性变异多肽。
应用及生产工艺
本发明的黄酮羟基化酶PhF2H及PhF3’H或它们的保守性变异多肽，可应用于特异和高效地催化黄烷酮类化合物的C-2位或C-3’位羟基化，从而产生一类特定位置发生羟基化的产物，结合碳苷糖基化以可以获得进一步的碳苷-2-羟基黄烷酮类或碳苷-2,3’-二羟基黄烷酮类化合物，通过进一步的脱水反应可形成黄酮碳苷类化合物。
因此，本发明提供了黄酮羟基化酶PhF2H及PhF3’H或它们的保守性变异多肽的用途，用于催化黄烷酮类化合物的C-2位或C-3’位羟基化；其中，所述的黄酮羟基化酶PhF2H为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体；所述黄酮羟基化酶PhF3’H为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体。
如本发明所用，所述的2-羟基黄烷酮类化合物包括2-羟基黄烷酮或其衍生物、结构类似物、异构体。所述碳苷-2-羟基黄烷酮类化合物包括碳苷-2-羟基黄烷酮或其衍生物、结构类似物、异构体。所述黄酮碳苷类化合物包括黄酮碳苷或其衍生物、结构类似物、异构体。
在本发明的优选方式中，所述的黄烷酮类化合物包括：柚皮素，圣草酚，松属素，橙皮素，樱花素。此外，它们的类似物或基团被取代的变体形式也应被包含在内。
在本发明的优选方式中，所述的2-羟基黄烷酮类化合物包括：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚；和/或所述的碳苷-2-羟基黄烷酮类化合物包括：2-羟基柚皮素-6-C(8-C)-葡萄糖苷，2-羟基圣草酚-6-C(8-C)-葡萄糖苷。此外，它们的类似物或基团被取代的变体形式也应被包含在内。
在进行碳苷糖基化时，可以以UDP葡萄糖作为糖基供体，应理解，其它的携带活性糖基基团的化合物也是可以作为供体的，也应被包含在本发明中。
本发明也提供了催化黄烷酮类化合物的C-2位或C-3’位羟基化的方法，包括：以新型黄酮羟基化酶进行所述催化；其中，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮类化合物的C-2位羟基化；或所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮类化合物的C-3’位羟基化。
本发明也提供了合成黄酮碳苷类化合物的方法，包括：(1)将黄烷酮类化合物以新型黄酮羟基化酶进行催化，在其C-2位或C-3’位羟基化；所述新型黄酮羟基化酶为SEQ IDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮类化合物的C-2位羟基化；或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮类化合物的C-3’位羟基化；(2)将(1)的C-2位羟基化产物进行碳苷糖基化，获得碳苷-2-羟基黄烷酮类化合物；或，将(1)的C-3’位羟基化产物进一步进行C-2位羟基化，之后继续进行碳苷糖基化，获得碳苷-2,3’-二羟基黄烷酮(类)化合物。较佳地，在应用新型黄酮羟基化酶进行催化之前，还包括：(b)将丙二酰-CoA结构类似物与p-香豆酰-CoA结构类似物经查尔酮合成酶和查尔酮异构酶催化，获得黄烷酮(类)化合物。较佳地，在(b)之前，还包括：(a)将芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶或苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酰-CoA连接酶催化，获得p-香豆酰-CoA结构类似物。
在本发明的优选方式中，所述的丙二酰-CoA类化合物包括：丙二酰-CoA，甲基丙二酰-CoA；所述的p-香豆酰-CoA类化合物包括：p-香豆酰-CoA，p-肉桂酰-CoA；所述的L-酪氨酸类化合物包括：L-酪氨酸，L-苯丙氨酸。应理解，根据本发明的整体描述，它们的类似物或变异形式也可应用于本发明中。
在本发明的优选方式中，所述的2-羟基黄烷酮类化合物为2-羟基柚皮素，其是从柚皮素通过黄烷酮-2-羟化酶(F2H)催化获得；或所述2-羟基黄烷酮类化合物为2-羟基圣草酚，其是从圣草酚通过黄烷酮-2-羟化酶(F2H)催化获得；较佳地，所述圣草酚是从柚皮素通过黄烷酮-3’-羟化酶(F3’H)催化获得。应理解，根据本发明的整体描述，它们的类似物或变异形式也可应用于本发明中。
本发明也提供了生物合成黄烷酮类化合物的方法，包括将合成黄烷酮类化合物的前体基因以及编码新型黄酮羟基化酶的基因共转入宿主细胞中，获得2-羟基黄烷酮化合物和/或3’-羟基黄烷酮化合物。
本发明也提供了生物合成黄酮碳苷类化合物的方法，包括：将合成黄烷酮化合物的前体基因、编码新型黄酮羟基化酶的基因以及编码碳苷糖基转移酶的基因共转入宿主细胞中；其中，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；和/或，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化；(ii)培养(i)的细胞，从而生物合成黄酮碳苷类化合物。
在本发明的具体实施例中，本发明人发现，本发明所构建的生物合成黄酮碳苷类化合物的体系，产物产量非常高，也即实现了高效的生物合成。
相对于传统的植物提取手段，微生物发酵具有速度快、受外界因素影响较小等优势；部分化合物通过微生物合成的产量远高于植物提取，已经成为天然产物获得的一种重要手段。黄酮碳苷类化合物天然丰度低，并且在植物提取物中与大量结构类似的黄酮氧苷、苯丙素类化合物共存，使得分离纯化繁琐复杂。本发明中使用微生物发酵的方式来高效、定向得合成黄酮碳苷，极为有效地降低了分离纯化这类化合物的成本。
本发明也提供了用于生物合成黄酮碳苷类化合物或其中间体的试剂盒，其中包括：SEQ ID NO:1～2所示的新型黄酮羟基化酶或其保守性变异多肽；碳苷糖基转移酶；合成黄烷酮(类)化合物的前体基因；较佳地还包括宿主细胞。更佳地，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书。
本发明的主要优点在于：
经过大量筛选获得了新型黄酮羟基化酶PhF2H及PhF3’H，其具有对于黄烷酮类化合物的C-2位或C-3’位进行羟基化的功能，且效果优于已知功能的OsF2H、OsF3’H。本发明人还对该两种酶进行了优化，有效提高了其表达效率。
应用所述的新型黄酮羟基化酶(特别是还对其进行了优化改造)以及结合应用其它的酶，通过基因工程的方法对宿主细胞进行改造，获得了高产黄酮碳苷类化合物如荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素的工程菌株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
毛竹采自上海辰山植物园，水稻、高粱、玉米、均取自中国科学院上海分子植物研究中心。
寡核苷酸引物购自生工科技(Sangon Biotech)与金斯瑞中国(GenScriptBiotech Corp)生物科技有限公司。
合成优化序列购自金斯瑞中国(GenScript Biotech Corp)生物科技有限公司。
AxyPrep总RNA小量制备试剂盒，多聚酶链式反应(PCR)胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒均为美国Axygen产品；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)聚合酶试剂盒，聚合酶链式反应(PCR)高保真酶PrimeSTAR Max DNAPolymerase为日本宝生物公司(TAKARA)产品。平端克隆使用pEASY-Blunt Simple CloningKit(北京全式金生物技术有限公司)。
植物基因组DNA提取使用TIANGEN植物基因组提取试剂盒。
限制性内切酶均为NEB产品。
大肠杆菌DH10B、BL21(DE3)菌株和pET21a、pET28a载体用于基因克隆及蛋白表达。
标准品化合物柚皮素、圣草酚、牡荆素、异牡荆素、荭草苷、异荭草苷购自大连美仑生物技术有限公司。
其他试剂为国产分析纯或色谱纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。
PCR使用Arktik Thermal Cycler(Thermo Fisher Scientific)。
高效液相色谱使用Dionex UltiMate 3000液相色谱系统(Thermo FisherScientific)。
高分辨质谱由Thermo Fisher Scientific静电场轨道阱组合质谱Q Exactive测得。
实施例1、新型的细胞色素P450羟基化酶
本发明通过挖掘毛竹的基因组信息，获得两种新型的细胞色素P450羟基化酶，其氨基酸序列如下：
>PhF2H(SEQ ID NO:1；下划线为N端跨膜区)
MAMELVALVLAAMLLLTVIMRRYGGSAGSSKHGRLPPSPMALPFIGHLHLIRPPPHRAFDRIIARHGPLIYLRLGPSTHCVVVGSADVARDFLRFEASIPERPLTAVTRQLAYGSAGFAFAPYGPHWRFMKRLCMSELLGPRTVEQLRPVRDAELAGVLRAVRAAAERGESVDMSRELIRMSNNAIMRMVASALPGDMAEAARDCAKQVAELVGAFNVEDYVAMCRGWDLQGIGRRTREVHARFDALLETMIRAKEEARRDPLPRDKSRTTKDLLDILMDVAEDEAAEVRLTRENIKAFVLDIFTAGSDTTATSVEWMLAELINHPAYLEKLRAEVDAVVGGSRLVGEPDVAQMPYLQAVLKETLRLRPPAVFAQRETIEAVHVCGYTIPPKTSVFFNIFSIGRDPACWEDPLEFRPERFMPGGASAGVDPKGQHQQLMPFGSGRRACPGMGLAMQAVPAFLAALVQCFDWAVPLPQGTPLDMEEAEGLVSARKQPLVLVPTQRLRPLPAGAAAALA*
>PhF3’H(SEQ ID NO:2；下划线为N端跨膜区)
MGDVPLPLLLGSLAVSALVWYVLFRRGGGEGAKRPPGPRGWPVLGNLPQLGAKPHHTMCAMAREYGPLFRLRFGSAEVVVAASAGVAAQFLRGLDANFSNRPPNSGAEHVAYNYQDLVFAPYGARWRALRKLCALHLFSAKALDDLRAVREGEVALLVRELARAAAGGVPAVALGQEANVTATNTLARATVGRRVFAVDGGEGAREFKEMVVELMQLAGVFNVGDFVPALRWLDPQGVVAKMKRLHRRYDDMLNGFIKERKAVVKPDGLSGGDQGKDLLSVLLARMREEQPLDGEDGKITETDIKALLLNLFTAGTDTTSSTVEWALAELIRHPDVLKQAQHELDAVAGRDRLVSESDLPRLTFLAAVIKETFRLHPSTPLSLPRVAAEECTVDGYRVPKGTTLLVNVWAIARDPASWPNPLDFNPARFLPGGTHESVDLKGSDFELIPFGAGRRVCAGLSWGLRMVTLMTATLVHAFDWALVDGMTPDKLNMEEAYGLTLQRAVPLMVQPAPRLLPSAYGM*
本发明人发现，上述两种新型的细胞色素P450羟基化酶，用于在后续实施例2、3中进行基于重组微生物系统的体内功能验证。
实施例2、运用细胞色素P450羟基化酶PhF2H生产2-羟基柚皮素
本实施例中，生物合成2-羟基柚皮素的预测的反应途径如图1。主要包括：L-酪氨酸经芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶(TAL)或苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)催化，获得p-香豆酰-CoA，其与丙二酰-CoA经查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)催化，获得柚皮素，进一步通过黄烷酮-2-羟化酶(F2H)催化，获得2-羟基柚皮素(开环形式)。
1、构建从头合成柚皮素质粒
将人工合成并经密码子优化(大肠杆菌偏好)的前体合成基因序列构建到pET28a载体上，分别获得pET28-RtPAL，pET28-Pc4CL，pET28-PxhCHS和pET28a-MsCHI。其中，PxhCHS：GenBank登录号KF765781；MsCHI：GenBank登录号KF765782；Pc4CL：GenBank登录号KF765780；RtPAL：GenBank登录号AAA33883。PCR引物如表1所示。
以pET28-Pc4CL为模板，4CL-F-NcoI/4CL-R-BamHI为引物对扩增Pc4CL片段，与NcoI/BamHI双酶切的pCDFDuet-1载体连接获得pYH40。
以pET28-PxhCHS为模板，CHS-F-NdeI/CHS-R-XhoI为引物对扩增PxhCHS片段，与NdeI/XhoI双酶切的pYH40连接获得pYH50。
以pET28-MsCHI为模板，T7CHI-F-XhoI/CHI-R-AvrII为引物对扩增McCHI片段，与XhoI/AvrII双酶切的pYH50连接，获得质粒pYH51。
以pET28-RtPAL为模板，T7PAL-F-BamHI/PAL-R-HindIII为引物对扩增RtPAL片段，与BamHI/HindIII双酶切的pYH51连接，获得质粒pYH55用于柚皮素(naringenin)合成的从头合成。
表1、柚皮素合成前体基因的表达盒构建所用引物
引物 序列(5’→3’)
4CL-F-NcoI tataccatgggtgactgcgttgccccg(SEQ ID NO:3)
4CL-R-BamHI cgggatccttacttcggcaggtcgccgctc(SEQ ID NO:4)
T7PAL-F-BamHI cgggatcccttatgcgactcctgcattag(SEQ ID NO:5)
PAL-R-HindIII gcccaagcttttatgccagcatcttc(SEQ ID NO:6)
CHS-F-NdeI agatatacatatggttacggtggaagaatac(SEQ ID NO:7)
CHS-R-XhoI ccgctcgagttaggtagccacactatgcag(SEQ ID NO:8)
T7CHI-F-XhoI ccgctcgagctagaaataattttgtttaac(SEQ ID NO:9)
CHI-R-AvrII gagcctaggttagttaccgattttaaag(SEQ ID NO:10)
2、PhF2H多肽序列优化改造和PhF2H/CPR表达盒构建
通过人工合成密码子优化(大肠杆菌偏好)的黄烷酮-2-羟基化酶编码基因PhF2H以适用于大肠杆菌。对PhF2H的密码子优化后的序列进行相应于其蛋白的N端改造，截去N端跨膜区域(2-24位)并在第一个氨基酸M之前加载标签2B1(序列为MAKKTSSKGKLPPGPS)。将此片段克隆至平端克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。
使用引物对CZ277-F/CZ277-R(见表2)扩增优化改造的PhF2H片段。将该片段通过无缝克隆法插入pDuet-1载体多克隆位点1的NcoI和BamHI之间。AtCPR2(GenBank登录号NM_179141.2)使用引物对InfuNde-AtCPR2-F/InfuXho-AtCPR2-R(见表2)扩增后插入pDuet-1载体多克隆位点2的NdeI和XhoI位点之间，构成质粒pCZ277(图2)。
此外作为阳性对照，将水稻OsF2H(GenBank登录号XP_015642954.1，进行大肠杆菌偏好密码子优化以适用于大肠杆菌)截去N端跨膜区域(2-26位)并在第一个氨基酸M之前加载标签2B1，以同样的方式与AtCPR2共同组装至pDuet-1载体上，获得质粒pCZ203(图2)。使用引物对为CZ203-F/CZ203-R(见表2)。
表2、构建pCZ203，pCZ277所使用的引物
3、构建2-羟基柚皮素生产菌株
将构建成功的pCZ203、pCZ277分别与质粒pYH55共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中以获得工程菌株，分别命名为sSYW80、sSYW81。
使用LB固体培养基(氨苄青霉素100μg/mL、壮观霉素80μg/mL)在37℃培养过夜。挑取单个sSYW80和sSYW81克隆到2mL LB液体培养基(氨苄青霉素100μg/mL、壮观霉素80μg/mL)，转接过夜培养的菌液到新的20mL MOPS液体抗性培养基中37℃，250r/min培养至OD600＝0.5-0.6，水浴降温至16℃左右，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，加入经灭菌的酪氨酸至2g/L，在摇床转速220r/min，温度22℃条件下继续培养120h。待发酵反应结束后，发酵液取样0.5mL并且向反应液中加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取3次，浓缩有机相获得的残留物用100μL甲醇溶解后取20μL进行HPLC分析。
检测到反应液中含2-羟基柚皮素和未转化的柚皮素，如图3(左)所示。产物与2-羟基柚皮素标准品保留时间一致，且与已知功能的OsF2H产物相同，证明PhF2H可以将柚皮素进行2位羟基化。相比于功能已知的OsF2H(对应于菌株sSYW80，柚皮素转化率约为35％，2-羟基柚皮素产量22mg/L)，使用PhF2H的菌株sSYW81转化柚皮素生成2-羟基柚皮素的转化率有非常明显的提高图3(右)，可以达到85％，2-羟基柚皮素产量达到57mg/L。
实施例3、细胞色素P450羟基化酶(F2H)结合碳苷糖基转移酶生产牡荆素、异牡荆素及其中间产物
本实施例中，生物合成牡荆素、异牡荆素、二羟基柚皮素糖基化产物，其反应途径如图4。主要包括：L-酪氨酸经芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶(TAL)或苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)催化，获得p-香豆酰-CoA，其与丙二酰-CoA经查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)催化，获得柚皮素，进一步通过黄烷酮-2-羟化酶(F2H)催化，获得2-羟基柚皮素(开环形式)；2-羟基柚皮素经由糖基转移酶(CGT)获得2-羟基柚皮素-C-葡萄糖苷，进而脱水形成牡荆素或异牡荆素。
1、构建从头合成柚皮素质粒
同实施例2。
2、优化后F2H/CPR表达盒构建
同实施例2。
3、构建工程菌株发酵生产牡荆素、异牡荆素及其中间产物
糖基化模块质粒pCZ86的构建：以毛竹基因组DNA为模板，采用Primestar max DNA聚合酶为PCR酶对目的基因PhCGT1进行扩增(引物F序列：tgccgcgcggcagccatatgatgggccacctggtgc(SEQ ID NO:17)；引物R序列：tggtgctcgagtgcggccgcctagtccaacactgcaagatccc(SEQ ID NO:18))。对于扩增出的目的条带通过琼脂糖胶电泳纯化回收。对pET28a载体采用NdeⅠ/NotⅠ两种限制性核酸内切酶进行双酶切，通过无缝克隆的方法将PCR的目标基因PhCGT1克隆到pET28a的NdeⅠ/NotⅠ位点，获得pCZ86。
将构建成功的pCZ203、pCZ277与质粒pYH55以及pCZ86共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中以获得工程菌株，分别命名为sCZ4和sCZ89。
使用LB固体培养基(氨苄青霉素100μg/mL、卡那霉素50μg/mL、壮观霉素80μg/mL)37℃培养过夜。挑取单个克隆到2mL LB液体培养基(氨苄青霉素100μg/mL、卡那霉素50μg/mL、壮观霉素80μg/mL)，转接过夜培养的菌液到新的20mL MOPS液体抗性培养基中37℃，250r/min培养至OD600＝0.5-0.6，水浴降温至16℃左右，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，加入经灭菌的酪氨酸至2g/L，在摇床转速220r/min，温度22℃条件下继续培养120h。待发酵反应结束后，发酵液取样0.5mL并且向反应液中加入0.5mL正丁醇进行萃取3次，浓缩有机相获得的残留物用100μL甲醇溶解后取20μL进行HPLC分析。
检测到反应液中含牡荆素、异牡荆素以及二羟基柚皮素-C-葡萄糖苷，如图5(左)所示。2-羟基柚皮素-C-葡萄糖苷作为中间体对酸不稳定，通过将发酵产物酸处理(HCl 1M，2h)后，2-羟基柚皮素-C-葡萄糖苷可脱水形成牡荆素和异牡荆素的混合物。酸化处理后产量如图5(右)所示。本发明人发现，PhF2H活性优良，对应菌株sCZ89产生牡荆素、异牡荆素总共的量约120mg/L发酵液，显著优于水稻的OsF2H(对应于菌株sCZ4，产量约25mg/L)。
实施例4、运用细胞色素P450羟基化酶F3’H生产圣草酚
本实施例中，生物合成圣草酚的预测的反应途径如图6。主要包括：L-酪氨酸经芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶(TAL)或苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)催化，获得p-香豆酰-CoA，其与丙二酰-CoA经查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)催化，获得柚皮素，进一步通过黄烷酮-3’-羟化酶(F3’H)催化，获得圣草酚。
1、构建从头合成柚皮素质粒
同实施例2。
2、PhF3’H优化改造和PhF3’H/CPR表达盒构建
通过人工合成密码子优化(大肠杆菌偏好)的黄烷酮-3’-羟基化酶编码基因PhF3’H以适用于大肠杆菌。对PhF3’H的密码子优化的序列进行相应于其蛋白的N端改造，截去N端跨膜区域(2-24位)并在第一个氨基酸M之前加载标签2B1(序列为MAKKTSSKGKLPPGPS(SEQID NO:19))。将此片段克隆至平端克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。
以CZ285-F/CZ285-R为引物对(见表3)，通过PCR扩增优化改造的PhF3’H片段。将扩增得到的片段通过无缝克隆法插入pDuet-1载体多克隆位点1的NcoI和BamHI之间。AtCPR2使用引物对InfuNde-AtCPR2-F/InfuXho-AtCPR2-R(见表2)扩增后插入pDuet-1载体多克隆位点2的NdeI和XhoI位点之间，构成质粒pCZ285(图2)。
作为阳性对照，将水稻OsF3’H(GenBank登录号XP_015613041.1，进行密码子优化以适用于大肠杆菌)截去N端跨膜区域(2-26位)并在第一个氨基酸M之前加载标签2B1，以同样的方式与AtCPR2共同组装至pDuet-1载体上，获得质粒pCZ257(图2)。使用引物对为CZ257-F/CZ257-R(见表3)。
表3、构建pCZ285和pCZ257所使用的引物
3、构建圣草酚生产菌株
将构建成功的pCZ257、pCZ285分别与质粒pYH55共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中以获得工程菌株，分别命名为sCZ51和sCZ97。
使用LB固体培养基(氨苄青霉素100μg/mL、壮观霉素80μg/mL)在37℃培养过夜。挑取单个sCZ51和sCZ97克隆到2mL LB液体培养基(氨苄青霉素100μg/mL、壮观霉素80μg/mL)，转接过夜培养的菌液到新的20mL MOPS液体抗性培养基中37℃，250r/min培养至OD600＝0.5-0.6，水浴降温至16℃左右，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，加入经灭菌的酪氨酸至2g/L，在摇床转速220r/min，温度22℃条件下继续培养120h。待发酵反应结束后，发酵液取样0.5mL并且向反应液中加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取3次，浓缩有机相获得的残留物用100μL甲醇溶解后取20μL进行HPLC分析。
根据图7(左)所示，检测到反应液中含圣草酚和未转化的柚皮素。产物与圣草酚标准品保留时间一致，且与OsF3’H的产物一致，证明PhF3’H可以将柚皮素进行3’位羟基化。经过本发明人改造之后的F3’H活性优良，如图7(右)所示，sCZ97催化柚皮素产生圣草酚(转化率49％，产量为41mg/L发酵液)，高于水稻OsF3’H(对应于菌株sCZ51，转化率41％，32mg/L发酵液)。
实施例5、细胞色素P450羟基化酶(F3’H)结合碳苷糖基转移酶生产荭草苷、异荭草苷及其中间产物
本实施例中，生物合成荭草苷、异荭草苷、二羟基圣草酚糖基化产物，其预测的反应途径如图8。主要包括：L-酪氨酸经芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶(TAL)或苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)催化，获得p-香豆酰-CoA，其与丙二酰-CoA经查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)催化，获得柚皮素，通过黄烷酮-3’-羟化酶(F3’H)催化，获得圣草酚；通过F2H催化，获得2-羟基圣草酚(开环形式)；2-羟基圣草酚经由糖基转移酶(CGT)获得2-羟基圣草酚-C-葡萄糖苷，进而脱水形成荭草苷或异荭草苷。
1、构建从头合成柚皮素质粒
同实施例2。
2、优化后F2H/F3’H/CPR二元P450表达盒构建
对质粒pCZ277进行BamHI/NotI双酶切，以SYW100-F/SYW100-R为引物，pCZ285为模板，通过PCR扩增获得PhF3’H-CPR片段，通过一步克隆方法连接到pCZ277的BamHI和NotI位点，获得质粒pSYW100(含PhF2H/PhF3’H双元P450表达盒)。
作为阳性对照，对质粒pCZ203同样进行BamHI/NotI双酶切，以SYW101-F/SYW101-R为引物，pCZ257为模板，通过PCR扩增获得OsF3’H-CPR片段，通过一步克隆方法连接到pCZ203的BamHI和NotI位点，获得质粒pSYW101(含OsF2H/OsF3’H双元P450表达盒)。
表4、构建pSYW100和pSYW101所使用的引物
3、构建工程菌株发酵生产荭草苷、异荭草苷及其中间产物
糖基化模块质粒pCZ86的构建同实施例3。
将质粒pSYW100和pSYW101分别与质粒pYH55以及质粒pCZ86共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中以获得工程菌株sSYW82、sSYW83。
使用LB固体培养基(壮观霉素80μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL)37℃培养过夜。挑取单个克隆到2mL LB液体培养基(壮观霉素80μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL)，转接过夜培养的菌液到新的20mL MOPS液体抗性培养基中37℃，250r/min培养至OD600＝0.5-0.6，水浴降温至16℃左右，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，加入经灭菌的酪氨酸至2g/L，在摇床转速220r/min，温度22℃条件下继续培养120h。待发酵反应结束后，发酵液取样0.5mL并且向反应液中加入0.5mL正丁醇进行萃取3次，浓缩有机相获得的残留物用100μL甲醇溶解后取20μL进行HPLC分析。检测到发酵液中各种产物的量如图9右图所示。
如图9(左)所示，检测到反应液中含多种产物，包括荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素、二羟基柚皮素-C-葡萄糖苷以及二羟基圣草酚-C-葡萄糖苷。各产物的产量如图9(右)所示。2-羟基柚皮素-C-葡萄糖苷和2-羟基圣草酚-C-葡萄糖苷作为中间体对酸不稳定，通过将发酵产物酸处理(HCl 1M，2h)后，2-羟基柚皮素-C-葡萄糖苷可脱水形成牡荆素和异牡荆素的混合物，2-羟基圣草酚-C-葡萄糖苷可脱水形成荭草苷和异荭草苷的混合物。酸化处理后产量如图9(右)所示，经过本发明人改造之后的PhF2H，PhF3’H的组合活性优良，对应菌株sSYW82产生荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素总共的量可超过60mg/L发酵液，显著优于水稻的OsF2H(对应于菌株sSYW83，总产量约30mg/L)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用
<130> 200308
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 517
<212> PRT
<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)
<400> 1
Met Ala Met Glu Leu Val Ala Leu Val Leu Ala Ala Met Leu Leu Leu
1 5 10 15
Thr Val Ile Met Arg Arg Tyr Gly Gly Ser Ala Gly Ser Ser Lys His
20 25 30
Gly Arg Leu Pro Pro Ser Pro Met Ala Leu Pro Phe Ile Gly His Leu
35 40 45
His Leu Ile Arg Pro Pro Pro His Arg Ala Phe Asp Arg Ile Ile Ala
50 55 60
Arg His Gly Pro Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Gly Pro Ser Thr His Cys
65 70 75 80
Val Val Val Gly Ser Ala Asp Val Ala Arg Asp Phe Leu Arg Phe Glu
85 90 95
Ala Ser Ile Pro Glu Arg Pro Leu Thr Ala Val Thr Arg Gln Leu Ala
100 105 110
Tyr Gly Ser Ala Gly Phe Ala Phe Ala Pro Tyr Gly Pro His Trp Arg
115 120 125
Phe Met Lys Arg Leu Cys Met Ser Glu Leu Leu Gly Pro Arg Thr Val
130 135 140
Glu Gln Leu Arg Pro Val Arg Asp Ala Glu Leu Ala Gly Val Leu Arg
145 150 155 160
Ala Val Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Glu Ser Val Asp Met Ser Arg
165 170 175
Glu Leu Ile Arg Met Ser Asn Asn Ala Ile Met Arg Met Val Ala Ser
180 185 190
Ala Leu Pro Gly Asp Met Ala Glu Ala Ala Arg Asp Cys Ala Lys Gln
195 200 205
Val Ala Glu Leu Val Gly Ala Phe Asn Val Glu Asp Tyr Val Ala Met
210 215 220
Cys Arg Gly Trp Asp Leu Gln Gly Ile Gly Arg Arg Thr Arg Glu Val
225 230 235 240
His Ala Arg Phe Asp Ala Leu Leu Glu Thr Met Ile Arg Ala Lys Glu
245 250 255
Glu Ala Arg Arg Asp Pro Leu Pro Arg Asp Lys Ser Arg Thr Thr Lys
260 265 270
Asp Leu Leu Asp Ile Leu Met Asp Val Ala Glu Asp Glu Ala Ala Glu
275 280 285
Val Arg Leu Thr Arg Glu Asn Ile Lys Ala Phe Val Leu Asp Ile Phe
290 295 300
Thr Ala Gly Ser Asp Thr Thr Ala Thr Ser Val Glu Trp Met Leu Ala
305 310 315 320
Glu Leu Ile Asn His Pro Ala Tyr Leu Glu Lys Leu Arg Ala Glu Val
325 330 335
Asp Ala Val Val Gly Gly Ser Arg Leu Val Gly Glu Pro Asp Val Ala
340 345 350
Gln Met Pro Tyr Leu Gln Ala Val Leu Lys Glu Thr Leu Arg Leu Arg
355 360 365
Pro Pro Ala Val Phe Ala Gln Arg Glu Thr Ile Glu Ala Val His Val
370 375 380
Cys Gly Tyr Thr Ile Pro Pro Lys Thr Ser Val Phe Phe Asn Ile Phe
385 390 395 400
Ser Ile Gly Arg Asp Pro Ala Cys Trp Glu Asp Pro Leu Glu Phe Arg
405 410 415
Pro Glu Arg Phe Met Pro Gly Gly Ala Ser Ala Gly Val Asp Pro Lys
420 425 430
Gly Gln His Gln Gln Leu Met Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ala Cys
435 440 445
Pro Gly Met Gly Leu Ala Met Gln Ala Val Pro Ala Phe Leu Ala Ala
450 455 460
Leu Val Gln Cys Phe Asp Trp Ala Val Pro Leu Pro Gln Gly Thr Pro
465 470 475 480
Leu Asp Met Glu Glu Ala Glu Gly Leu Val Ser Ala Arg Lys Gln Pro
485 490 495
Leu Val Leu Val Pro Thr Gln Arg Leu Arg Pro Leu Pro Ala Gly Ala
500 505 510
Ala Ala Ala Leu Ala
515
<210> 2
<211> 522
<212> PRT
<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)
<400> 2
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Ala Leu Val Trp Tyr Val Leu Phe Arg Arg Gly Gly Gly Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Arg Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Leu Gly Asn Leu Pro
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Gln Leu Gly Ala Lys Pro His His Thr Met Cys Ala Met Ala Arg Glu
50 55 60
Tyr Gly Pro Leu Phe Arg Leu Arg Phe Gly Ser Ala Glu Val Val Val
65 70 75 80
Ala Ala Ser Ala Gly Val Ala Ala Gln Phe Leu Arg Gly Leu Asp Ala
85 90 95
Asn Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Glu His Val Ala Tyr
100 105 110
Asn Tyr Gln Asp Leu Val Phe Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Trp Arg Ala
115 120 125
Leu Arg Lys Leu Cys Ala Leu His Leu Phe Ser Ala Lys Ala Leu Asp
130 135 140
Asp Leu Arg Ala Val Arg Glu Gly Glu Val Ala Leu Leu Val Arg Glu
145 150 155 160
Leu Ala Arg Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Ala Val Ala Leu Gly Gln
165 170 175
Glu Ala Asn Val Thr Ala Thr Asn Thr Leu Ala Arg Ala Thr Val Gly
180 185 190
Arg Arg Val Phe Ala Val Asp Gly Gly Glu Gly Ala Arg Glu Phe Lys
195 200 205
Glu Met Val Val Glu Leu Met Gln Leu Ala Gly Val Phe Asn Val Gly
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Asp Phe Val Pro Ala Leu Arg Trp Leu Asp Pro Gln Gly Val Val Ala
225 230 235 240
Lys Met Lys Arg Leu His Arg Arg Tyr Asp Asp Met Leu Asn Gly Phe
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Asp Gln Gly Lys Asp Leu Leu Ser Val Leu Leu Ala Arg Met Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Pro Leu Asp Gly Glu Asp Gly Lys Ile Thr Glu Thr Asp Ile
290 295 300
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Leu Lys Gln Ala Gln His Glu Leu Asp Ala Val Ala Gly Arg Asp Arg
340 345 350
Leu Val Ser Glu Ser Asp Leu Pro Arg Leu Thr Phe Leu Ala Ala Val
355 360 365
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Gly Thr His Glu Ser Val Asp Leu Lys Gly Ser Asp Phe Glu Leu Ile
435 440 445
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450 455 460
Arg Met Val Thr Leu Met Thr Ala Thr Leu Val His Ala Phe Asp Trp
465 470 475 480
Ala Leu Val Asp Gly Met Thr Pro Asp Lys Leu Asn Met Glu Glu Ala
485 490 495
Tyr Gly Leu Thr Leu Gln Arg Ala Val Pro Leu Met Val Gln Pro Ala
500 505 510
Pro Arg Leu Leu Pro Ser Ala Tyr Gly Met
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<210> 3
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tataccatgg gtgactgcgt tgccccg 27
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<212> DNA
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<400> 4
cgggatcctt acttcggcag gtcgccgctc 30
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
cgggatccct tatgcgactc ctgcattag 29
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
gcccaagctt ttatgccagc atcttc 26
<210> 7
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
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<213> 引物(Primer)
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<212> DNA
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gagcctaggt tagttaccga ttttaaag 28
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<213> 引物(Primer)
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ctcccaccag gacctagcat gcgtagcgcg ggtagccg 38
<210> 12
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<212> DNA
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tcgaattcgg atccactagt ttagctataa aagctcggca gcg 43
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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agctcccacc aggacctagc atgggcagcg cggg 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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ataagaagga gatatacata tgtcctcttc ttcttcttcg tcaacc 46
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<213> 引物(Primer)
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<211> 36
<212> DNA
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<400> 17
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<212> DNA
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<400> 22
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<212> DNA
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<400> 23
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<212> DNA
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<400> 24
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<400> 26
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catg 64
<210> 27
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 27
cttaagcatt atgcggcctt aaacgccata cgcgctcg 38

Claims (20)

1. 一种催化黄烷酮化合物的C-2位或C-3’位羟基化的方法，其特征在于，包括：以黄酮羟基化酶进行所述催化；其中，
所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 1所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；或
所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 2所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化；
所述黄烷酮化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；
(I)/>(II) />(III)；
A环或B环中，存在1、2或3个羟基；其中，所述的黄烷酮化合物为柚皮素或圣草酚；
C-2位羟基化的产物为2-羟基黄烷酮化合物：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚；所述黄烷酮化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物为开环形式；
C-3’位羟基化的产物为3’-羟基黄烷酮化合物：圣草酚。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮羟基化酶还包括在N端添加标签。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签为2B1，17α或MBP。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签为2B1标签。
5. 黄酮羟基化酶的用途，用于催化黄烷酮化合物的C-2位或C-3’位羟基化，所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 1所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；或
所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 2所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化；
所述黄烷酮化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；
(I)/>(II) />(III)；
A环或B环中，存在1、2或3个羟基；其中，所述的黄烷酮化合物为柚皮素，圣草酚；
C-2位羟基化的产物为2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚；所述黄烷酮化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物为开环形式；
C-3’位羟基化的产物为圣草酚。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，还包括在N端添加标签。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述标签为2B1，17α或MBP。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述标签为2B1标签。
9.一种合成黄酮碳苷化合物或其中间体的方法，其特征在于，包括：
(1) 将黄烷酮化合物以黄酮羟基化酶进行催化，在其C-2位或C-3’位羟基化；所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 1所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；或，所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 2所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化；
(2) 将(1)的C-2位羟基化产物进行碳苷糖基化，获得碳苷-2-羟基黄烷酮化合物；或，将(1)的C-3’位羟基化产物进一步进行C-2位羟基化，之后继续进行碳苷糖基化，获得黄酮碳苷化合物或其中间体；
其中，所述的黄酮碳苷化合物为牡荆素，异牡荆素，荭草苷或异荭草苷；所述的黄酮碳苷化合物的中间体为2-羟基柚皮素-C-葡萄糖苷或2-羟基圣草酚-C-葡萄糖苷；
其中，所述的黄烷酮化合物为柚皮素或圣草酚。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在(1)之前，还包括：(b)将丙二酰-CoA结构类似物与p-香豆酰-CoA结构类似物经查尔酮合成酶和查尔酮异构酶催化，获得黄烷酮化合物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在(b)之前，还包括：(a)将芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶或苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酰-CoA连接酶催化，获得p-香豆酰-CoA结构类似物。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的丙二酰-CoA结构类似物包括：丙二酰-CoA或甲基丙二酰-CoA；
所述的p-香豆-CoA结构类似物包括：p-香豆酰-CoA或p-肉桂酰-CoA；
所述的芳香族氨基酸包括：l-酪氨酸或l-苯丙氨酸；或
所述的碳苷糖基化以碳苷糖基转移酶进行。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述碳苷糖基转移酶为PhCGT1、OsCGT或ZmCGT。
14. 一种生物合成黄烷酮化合物的方法，其特征在于，包括：将合成黄烷酮化合物的前体基因以及编码黄酮羟基化酶的基因共转入宿主细胞中；所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:1所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化，获得2-羟基黄烷酮化合物；和/或，所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 2所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化，获得3’-羟基黄烷酮化合物；
所述黄烷酮化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；
(I)/>(II)/>(III)；
A环或B环中，存在1、2或3个羟基；其中，所述的黄烷酮化合物为柚皮素或圣草酚；
C-2位羟基化的产物为2-羟基黄烷酮化合物：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚；所述黄烷酮化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物为开环形式；
C-3’位羟基化的产物为3’-羟基黄烷酮化合物：圣草酚。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核宿主细胞包括大肠杆菌或链霉菌，所述真核宿主细胞包括酵母。
16.一种生物合成黄酮碳苷化合物或其中间体的方法，其特征在于，包括：
(i) 将合成黄烷酮化合物的前体基因、编码黄酮羟基化酶的基因以及编码碳苷糖基转移酶的基因共转入宿主细胞中；所述黄酮羟基化酶为SEQ ID NO: 1所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-2位羟基化；和/或，所述黄酮羟基化酶为SEQ IDNO: 2所示且截去N端第2～24位氨基酸的多肽，其催化黄烷酮化合物的C-3’位羟基化；
所述黄烷酮化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；
(I)/>(II)/>(III)；
A环或B环中，存在1、2或3个羟基；其中，所述的黄烷酮化合物为柚皮素或圣草酚；
C-2位羟基化的产物为2-羟基黄烷酮化合物：2-羟基柚皮素，2-羟基圣草酚；所述黄烷酮化合物的C-2位羟基化后，所形成的2-羟基黄烷酮化合物为开环形式；
C-3’位羟基化的产物为3’-羟基黄烷酮化合物：圣草酚；
(ii) 培养(i)的细胞，以酪氨酸或苯丙氨酸为底物，产生中间体且酸化处理，进而合成牡荆素与异牡荆素或荭草苷与异荭草苷。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核宿主细胞包括大肠杆菌或链霉菌，所述真核宿主细胞包括酵母。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的合成黄烷酮化合物的前体基因包括芳香族氨基酸经酪氨酸解氨酶或苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酰-CoA连接酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶基因。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的细胞中还包括合成糖基供体的基因。
20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的细胞中还包括细胞色素P450还原酶表达盒。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112391360B (zh) * 2020-11-04 2022-09-06 江南大学 黄酮3β-羟化酶还原酶突变体及其应用
CN112961870B (zh) * 2021-02-26 2022-08-16 云南农业大学 一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因及应用
CN112813084B (zh) * 2021-02-26 2022-07-19 云南农业大学 一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用
CN116515876A (zh) * 2022-01-20 2023-08-01 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 异源合成黄酮类化合物的调控方法与应用
CN116042547B (zh) * 2022-06-08 2023-08-04 广东省卓肽医药有限公司 一种黄酮3′-羟基化酶及其应用
CN115161295B (zh) * 2022-06-20 2023-11-24 北京中医药大学 一种能将黄酮氧苷转化为黄酮碳苷的酶组合物及其应用
CN117917216A (zh) * 2022-10-21 2024-04-23 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 氯黄菌素及其衍生物的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589694A (zh) * 2012-10-31 2014-02-19 上海交通大学 郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白及其编码基因
CN106754989A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 广东药科大学 布渣叶黄烷酮‑2‑羟基化酶及其编码基因与应用
CN110616205A (zh) * 2019-09-27 2019-12-27 佛山市汇腾生物技术有限公司 一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589694A (zh) * 2012-10-31 2014-02-19 上海交通大学 郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白及其编码基因
CN106754989A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 广东药科大学 布渣叶黄烷酮‑2‑羟基化酶及其编码基因与应用
CN110616205A (zh) * 2019-09-27 2019-12-27 佛山市汇腾生物技术有限公司 一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
flavanone 2-hydroxylase [Phyllostachys edulis] GenBank: QES86351.1;Sun Yuwei等;《NCBI BLAST》;20190929;第1页 *
flavonoid 3"-monooxygenase [Phyllostachys edulis] GenBank: QEP54410.1;Sun Yuwei等;《NCBI BLAST》;20190918;第1页 *

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