CN115109761A - 异戊烯基转移酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了异戊烯基转移酶及其应用。本发明揭示了一类新型异戊烯基转移酶。在存在异戊烯基供体的情况下，以异戊烯基转移酶进行处理，可催化黄酮类化合物的多个位置发生异戊烯基化修饰，这类产物具有多种重要生理活性。

Description

异戊烯基转移酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和天然产物药物等领域；更具体地，本发明涉及异戊烯基转移酶及其应用。

背景技术

天然产物的异戊烯基修饰是在异戊烯基转移酶的作用下将不同长度的异戊烯基转移至天然产物上(Palsuledesai CC，et al.Protein prenylation:enzymes,therapeutics,and biotechnology applications.ACS Chem Biol.2015.10(1):51-62)。异戊烯基转移酶将异戊烯基转移至天然产物骨架的不同部位，可以形成各类活性分子，如初级代谢中的泛醌、维生素E和质体醌，以及在植物次生代谢中发挥重要作用的异戊烯类黄酮和真菌代谢物(Julia Winkelblech，et al.Prenyltransferases as key enzymes inprimary and secondary metabolism.Appl Microbiol Biotechnol.2015.99(18):7379-97)。与未异戊烯基修饰的前体相比，在天然产物不同位点进行不同长度的异戊烯基修饰，会使天然产物获得更多意想不到的生物活性，如细胞毒性和抗氧化剂(Sunassee SN，etal.Cytotoxic and antioxidant marine prenylated quinones and hydroquinones.NatProd Rep.2012.29(5):513-35)，以及抗菌剂活性等(Oya A，et al.Prenylatedbenzophenones from Triadenum japonicum.J Nat Prod.2015.78(2):258-64)。

异戊烯基转移酶主要分为膜结合型异戊烯基转移酶和可溶型芳香族异戊烯基转移酶，其中可溶型芳香族异戊烯基转移酶主要来源于真菌和细菌，结构上具有aββa-fold(ABBA)特点，称为PT桶(Kumano T，et al.Chemoenzymatic syntheses of prenylatedaromatic small molecules using Streptomyces prenyltransferases with relaxedsubstrate specificities.Bioorg Med Chem.2008.16(17):8117-26)。主要分为CloQ/NphB家族和DMATS超家族，其中CloQ/NphB家族来源于细菌和真菌，催化活性多数不依赖二价离子，不含有NDXXD保守序列。

DMATS家族异戊烯基转移酶有着宽泛的底物谱，通常认为它们的底物为芳香族化合物，包括萘类，吩嗪，醌类和酚类化合物，很难根据异戊烯基转移酶的序列结构去预测它的底物。DMATS家族已鉴定超过40个异戊烯基转移酶，多数催化吲哚衍生物的异戊烯基修饰(Yazaki K，et al.Prenylation of aromatic compounds，a key diversification ofplant secondary metabolites.Phytochemistry.2009.70:1739-1745)，也有少数异戊烯基报道具有催化黄酮类化合物的功能，目前已表征的有7-DMAT对柚皮素的C6位进行异戊烯基修饰，AnaPT对柚皮素的C3位进行异戊烯基修饰(Zhou K，et al.Complementaryflavonoid prenylations by fungal indole prenyltransferases.J NatProd.2015.78:2229–2235)等。

然而，尽管已有一定的研究，但本领域目前对于催化化合物进行异戊烯基修饰的酶的了解仍然停留在少且初级的水平上，本领域亟待开发更多的此类异戊烯基修饰相关的酶，以及作出更深入的功能性研究。

发明内容

本发明的目的在于提供异戊烯基转移酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：(a)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；(b)与(a)多肽的氨基酸序列有至少80％相同性(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％或99％以上)，且具有(a)所限定的多肽的功能(包括催化黄酮(类)化合物底物或聚酮(类)化合物底物的异戊烯基修饰)的多肽；(c)将(a)多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽的功能的多肽；(d)(a)～(c)任一所述多肽的片段，其包含(a)多肽的催化结构域且具有(a)多肽的功能；或(e)(a)～(d)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列或分泌信号序列后形成的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(1)编码如所述多肽的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的整合包括定向整合或随机整合。

在另一优选例中，所述宿主细胞包括(但不限于)：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括(但不限于)大肠杆菌、枯草杆菌；所述真核细胞包括(但不限于)：酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞；较佳地，所述宿主细胞为原核细胞，更佳地为大肠杆菌细胞。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，包括：(i)培养前面所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述多肽的培养物；(iii)从培养物中分离出所述多肽。

在本发明的另一方面，提供前面所述的多肽的用途，用于催化黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物的异戊烯基修饰；或，用于制备催化黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物的异戊烯基修饰的组合物。

在一个优选例中，所述的黄酮(类)化合物为具有式(I)或式(II)所示的母核结构的化合物：

在另一优选例中，所述的黄酮(类)化合物底物的异戊烯基修饰发生于黄酮(类)化合物底物的包括(但不限于)以下位置：C6位、C7位羟基、C8位、C3’位或C4’位上。

在另一优选例中，所述化合物在具有式(I)或式(II)所示的母核结构的基础上，其A环或B环中，还存在0、1、2或3个羟基。

在另一优选例中，所述的聚酮(类)化合物底物的异戊烯基修饰发生于聚酮(类)化合物底物的包括(但不限于)以下位置：C5位羟基。

在另一优选例中，所述的异戊烯基来自异戊烯基供体；较佳地，所述异戊烯基供体包括(但不限于)选自：二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)，法尼基二磷酸(FPP)，或其组合。

在另一优选例中，所述化合物为大豆苷元，所述多肽催化其C8位和/或C3’位的异戊烯基修饰。

在另一优选例中，所述化合物为染料木素，所述多肽催化其C6位和/或C3’位和/或C4’位的异戊烯基修饰。

在另一优选例中，所述化合物为DHMP，所述多肽催化其C5位羟基的异戊烯基修饰。

在另一优选例中，所述化合物为水飞蓟宾，所述多肽催化其C6位和/或C7位羟基的异戊烯基修饰。

在另一优选例中，所述化合物为黄芩素，所述多肽催化其C7位羟基的异戊烯基修饰。

在另一优选例中，所述的黄酮(类)化合物为两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的化合物。

在另一优选例中，所述的大豆苷元、染料木素和水飞蓟宾为植物小分子代谢产物，更具体为构巢曲霉的次级代谢产物。

在另一优选例中，所述的DHMP为植物小分子代谢产物，更具体为麦角菌的次级代谢产物。

在另一优选例中，所述的黄芩素为植物小分子代谢产物，更具体为米曲霉的次级代谢产物。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，其包含选自下组的成分：前面所述的多肽；或所述的宿主细胞；以及，工业学或微生物学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物可以是前面所述的宿主细胞的裂解物或提取物(包括粗提物)。

在本发明的另一方面，提供一种对黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物进行异戊烯基修饰的方法，包括：应用所述的多肽、所述的宿主细胞或所述的组合物处理黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物，生成发生异戊烯基修饰的产物。

在另一优选例中，所述的方法包括：体外方法或体内方法。

在本发明的另一方面，提供一种利用细胞生产异戊烯基修饰的黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物的方法，包括：(S1)提供一工程细胞，该细胞包括黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物的生产体系(代谢体系)；(S2)在(S1)所述工程细胞中表达所述的多肽；(S3)培养(S2)的工程细胞，生产异戊烯基修饰的黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物。

在本发明的另一方面，提供一种用于对黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物进行异戊烯基修饰的试剂盒，其中包括：所述的多肽；或所述的宿主细胞；较佳地，其中还包括对黄酮(类)化合物或聚酮(类)化合物进行异戊烯基修饰的方法加以说明的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1、两对引物SEQ ID NO:7和8的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道1为翊圣生物公司的1kb DNA ladder Marker，泳道2为Ad03p的PCR产物。

图2、两对引物SEQ ID NO:11和12的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道1为翊圣生物公司的1kb DNA ladder Marker，泳道2为Cp05的PCR产物。

图3、两对引物SEQ ID NO:15和16的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道1为翊圣生物公司的1kb DNA ladder Marker，泳道2为Ao01的PCR产物。

图4、大肠杆菌pGEX-Ad03p催化大豆苷元(dai)反应产物的HPLC检测图。其中，编号为1号的HPLC峰图为pGEX-4T-1-dai/BL21空载质粒作为阴性对照的测定峰图，编号为2号的HPLC峰图为pGEX-Ad03p-dai/BL21的测定峰图。

图5、大肠杆菌pGEX-Ad03p催化染料木素(gen)反应产物的HPLC检测图。其中，编号为3号的HPLC峰图为pGEX-4T-1-gen/BL21空载质粒作为阴性对照的测定峰图，编号为4号的HPLC峰图为pGEX-Ad03p-gen/BL21的测定峰图。

图6、大肠杆菌pGEX-Ad03p催化水飞蓟宾(sil)反应产物的HPLC检测图。其中，编号为7号的HPLC峰图为pGEX-4T-1-sil/BL21空载质粒作为阴性对照的测定峰图，编号为8号的HPLC峰图为pGEX-Ad03p-sil/BL21的测定峰图。

图7、大肠杆菌pET28a-Cp05催化DHMP反应产物的HPLC检测图。其中，编号为5号的HPLC峰图为pET28a-DHMP/BL21空载质粒作为阴性对照的测定峰图，编号为6号的HPLC峰图为pET28a-Cp05-DHMP/BL21的测定峰图。

图8、大肠杆菌pGEX-Ao01催化黄芩素(bai)反应产物的HPLC检测图。其中，编号为9号的HPLC峰图为pGEX-4T-1-bai/BL21空载质粒作为阴性对照的测定峰图，编号为10号的HPLC峰图为pGEX-Ao01-bai/BL21的测定峰图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，筛选获得一类新型异戊烯基转移酶。在存在异戊烯基供体的情况下，以异戊烯基转移酶进行处理，可催化黄酮类化合物或聚酮类化合物发生异戊烯基化修饰，这类产物具有多种重要生理活性。

活性多肽、其编码基因、载体及宿主

本发明人分别在构巢曲霉和麦角菌中挖掘到两个DMATS家族的异戊烯基转移酶，并同时利用多种黄酮/聚酮底物进行功能筛选。本发明人将来自构巢曲霉的异戊烯基转移酶称为Ad03p，其能催化多种黄酮类化合物或聚酮类化合物的异戊烯基修饰，具有较好的底物宽泛性；本发明人将来自麦角菌(Clavieps purpurea)的异戊烯基转移酶称为Cp05，能催化多种黄酮类化合物或聚酮类化合物的异戊烯基修饰，例如催化5,7-二羟基-4-甲基-1(3H)-异苯并呋喃酮(5,7-Dihydroxy-4-methyl-1(3H)-isobenzofuranone，DHMP)的异戊烯基化，生成新化合物5-O-5,7-二羟基-4-甲基-1(3H)-异苯并呋喃酮(5-O-5,7-Dihydroxy-4-methyl-1(3H)-isobenzofuranone)。

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“异戊烯基转移酶”可互换使用，都指具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或其片段或其变异形式或衍生物的蛋白或多肽。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明中，所述“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从真核或原核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明所述的多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能；又比如，仅表达该蛋白的催化结构域，而不表达碳水化合物结合结构域也能获得和完整蛋白同样的催化功能。因此该术语还包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的催化功能域之外。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与编码所述多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗所述多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含所述多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了所述多肽的片段。通常，该片段具有所述多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然所述多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

本发明所述的“多肽的保守性变异体”是指与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6的氨基酸序列相比，有至多30个，较佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本发明的多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。多种合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述多肽的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的蛋白质，但与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的多核苷酸的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用编码本发明的多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含所述DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。作为本发明的优选方式，所述原核宿主细胞包括(但不限于)大肠杆菌、枯草杆菌；较佳地，所述真核宿主细胞包括(但不限于)真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括(但不限于)酵母细胞和灵芝细胞；更佳地，所述的酵母包括但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞为大肠杆菌细胞。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，所述的重组多肽在宿主细胞中表达，在表达后，破碎细胞，获得含有本发明所述多肽的混合物(如粗酶液或其加工产物)，也可在此基础上进行分离纯化，获得相对纯的多肽。

应用

本发明的多肽，可应用于催化具有式(I)或式(II)母核结构的化合物进行异戊烯基化修饰。如本发明的实施例中所论证的，所述的多肽能特异和高效地催化具有式(I)母核结构的化合物的一个或多个位置(如选自黄酮类化合物底物的C6位、C8位、C3’位或C4’位)进行异戊烯基化修饰，所述的多肽能特异和高效地催化具有式(II)母核结构的化合物的一个或多个位置(如选自黄酮类化合物底物的C6位或C7位羟基)进行异戊烯基化修饰，获得的经异戊烯基修饰的化合物，这些化合物可具有多种生理活性。所述的多肽也能特异和高效地催化聚酮类化合物的异戊烯基修饰。

本发明所述的式(I)或式(II)母核结构式中，各环上还可以含有一些取代基，包括但不限于：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。进行常规的取代基添加或替换是本领域技术人员易于实现的。

本发明所述的式(I)或式(II)母核结构中，虚线标示处表示含有化学键或不含有化学键。这是本领域人员常用的表示方法。

术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。

作为本发明的优选方式，所述的具有式(I)或式(II)母核结构的化合物是黄酮类化合物。所述的黄酮类化合物包括(但不限于)：大豆苷元、染料木素、DHMP、柚皮素、山奈酚、水飞蓟宾、木犀草素、黄芩素、圣草酚、二氢杨梅素等。

作为本发明的优选方式，所述的聚酮类化合物包括(但不限于)：马替麦考酚酸(霉酚酸)杂质1(DHMP)。

本发明还提供了应用所述的多肽或其衍生多肽催化黄酮类化合物或聚酮类化合物的方法。在获得了本发明的多肽后，本领域人员可以方便地应用它们来发挥异戊烯基转移酶的作用。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的多肽或其衍生多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

作为一种可选的方式，可利用本发明的多肽进行体外生产，可以通过规模化生产本发明的多肽(可以是其提取物(包括粗提物)或发酵液，也可以是其经分离纯化后的产物)，在存在异戊烯基供体的情况下，将之与黄酮类化合物或聚酮类化合物(作为底物)进行反应，以获得经异戊烯基修饰的产物。

作为本发明的另一优选方式，利用生物合成的方法进行生产。这通常包括：(1)提供一工程细胞，该细胞具有选自下组的至少一方面特征：包含黄酮类化合物或聚酮类化合物代谢途径或生产途径；(2)在(1)所述工程细胞中表达本发明所述的多肽；以及(3)培养(2)的工程细胞，在存在异戊烯基供体的情况下，生产经异戊烯基修饰的产物。在更为优选的方式中，所述方法还包括：从工程细胞的培养物中，分离纯化所述产物的步骤。

在利用生物合成的方法进行生产时，作为本发明的优选方式，还包括在细胞中强化黄酮类化合物或聚酮类化合物代谢途径/生产途径。更优选地，通过在细胞中引入一系列的外源的与黄酮类化合物或聚酮类化合物的生产有关基因来进行强化。也可以通过强化黄酮类化合物或聚酮类化合物生产途径的上游途径的化合物的产生，来提供更多的黄酮类化合物或聚酮类化合物，作为本发明的催化反应的前体。应理解，其它一些强化细胞中黄酮类化合物或聚酮类化合物的产生的方法也可被包含于本发明中。

在本发明的具体实施例中，通过在大肠杆菌中表达该序列，制备含有该序列表达产物的粗酶液，以二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)为异戊烯基供体，通过体外催化检测其对大豆苷元和包括染料木素、水飞蓟宾和柚皮素等在内的多种黄酮类化合物或聚酮类化合物的催化活性。结果发现Ad03p表达产物能催化大豆苷元、染料木素和水飞蓟宾，并在不同位置进行异戊烯基化修饰，形成新骨架化合物。此外，尽管转化率不尽相同，本发明人也已发现，Ad03p表达产物能催化多种黄酮类化合物或聚酮类化合物进行异戊烯基化修饰，如圣草酚、木犀草素、槲皮素、芹菜素、黄芩素、山奈酚、杨梅素、二氢杨梅素、新橙皮苷、柚皮素和黄豆黄素。

本发明人通过在大肠杆菌中表达了Cp05，制备含有其表达产物的粗酶液，以二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)为异戊烯基供体，通过体外催化检测其对5,7-dihydroxy-4-methylphthalide(DHMP)和包括圣草酚、木犀草素和槲皮素等在内的多种黄酮类化合物或聚酮类化合物的催化活性。结果发现Cp05表达产物能催化DHMP化合物，在其5位羟基进行异戊烯基化修饰，形成新骨架化合物。

本发明人还通过在大肠杆菌中表达了Ao01，制备含有其表达产物的粗酶液，以二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)为异戊烯基供体，通过体外催化检测其对5,7-dihydroxy-4-methylphthalide(DHMP)和包括黄芩素、大豆苷元和刺甘草查尔酮等在内的多种黄酮类化合物或聚酮类化合物的催化活性。结果发现Ao01表达产物能催化黄芩素，在其7位羟基进行异戊烯基化修饰。此外，尽管转化率不尽相同，本发明人也已发现，Ao01表达产物能催化多种黄酮类化合物或聚酮类化合物进行异戊烯基化修饰，如黄芩素、柚皮素、刺甘草查尔酮、水飞蓟宾、新橙皮苷、圣草酚、芹菜素、大豆苷元、山奈酚、木犀草素和槲皮素。

本发明也提供了用于生物合成所述经异戊烯基修饰的黄酮类化合物或聚酮类化合物的试剂盒，其中包括：本发明所述的基因工程细胞。较佳地，所述试剂盒中还可包括适于进行所述基因工程细胞的培养的培养基或培养组分。较佳地，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书，以指导本领域技术人员以适当的方法来进行生产。

本发明为将来利用合成生物学技术来大量合成经异戊烯基修饰的黄酮类化合物或聚酮类化合物提供了新的途径。相对于传统的植物提取手段，微生物发酵具有速度快、受外界因素影响较小等优势；部分化合物通过微生物合成的产量远高于植物提取，已经成为天然产物获得的一种重要手段。本发明中提供了新型的异戊烯基转移酶，从而使得使用微生物发酵的方式来定向得合成经异戊烯基修饰的黄酮类化合物或聚酮类化合物成为可能，可极为有效地降低分离纯化这类化合物的成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中所用引物如表1。

表1、引物

实施例1、异戊烯基转移酶Ad03p的克隆及其在大肠杆菌中表达

本发明通过对构巢曲霉转录组数据进行拼接和分析，获得一条异戊烯基转移酶Ad03p。异戊烯基转移酶Ad03p的基因具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，编码的异戊烯基转移酶Ad03p具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1(Ad03p-核苷酸序列)：

atggtcgccacacctgatgatccaagagcgcagaccatcgttgatctcttcaatggacagggcagcgccccggctccctttgacgtgctgacctcagccttgtcttttcccaccagagaccaggagcaatggtggcgcaagaccggcccaatgtttggtcagatgctcgcctcgtctggctataccctcgatcagcagtatcggcacctcaccttctactacaaccaactcgttccccgcctcggccctcacccagcaacattccattccagtctgactgtcagcgggttacccatggagttcagcatcaactaccagcaaaagggtgcgcatccaatggtccgcattggcgcggaacctatcgactccttttcggggacggaacgggacccatttaatcagatcccgccggccgagatggtaaaccacttctccagagcgggagttaaaggattcgatccggagctttatgcgtacttcgagccaaagcattctcttactcgtgagcagcaagccagactaccgaaagaagtacctggtggtgacaagttaaagacgcaatatgctttcgggttcgattttaagggtgatgaggtttcactgaaggggtatagctatcccgggctgaaagccacaatggcaggccaggaagttgcgaagctcgtcggagacggggtcaaggacctgaaaaaccaaggcaaactggactgcaccgaggcctgggcagctgtggaagcctacatgactgagctcaacggctggggctaccacaacctctgggcatgggattacgtctcgcctgcgaaatcgcgtctcaagttttattccttcgtcatggatgtcgtagacaagactaagctcgaggagctctggacattgaatggccgcgccaccagccccgctcatcaagagggtctacgacatctcaaagagctctgggatattatcgacctgaagaacgtcggcaagagagacctcccggccgatgcgcctcagatcccagaggatgcagcgcccatggtttggaactatgaaatgacggcgggcaatcccttgccgttcggcaagggctactttccgctgcaagggctcaacgatgcaggctgtatccagaagctcgtcaagttctttgagttaatggggtggaaggatctcgcggccaagtacccggagactattcagtcgttctatcctggcctcgatctgtccaagacatcacatctactgatgtgggtgtcgtacacttattcggagaagacaggggtttatctgagcatttacaatcatccttgtccagagaaatag

SEQ ID NO:2(Ad03p-氨基酸序列)：

MVATPDDPRAQTIVDLFNGQGSAPAPFDVLTSALSFPTRDQEQWWRKTGPMFGQMLASSGYTLDQQYRHLTFYYNQLVPRLGPHPATFHSSLTVSGLPMEFSINYQQKGAHPMVRIGAEPIDSFSGTERDPFNQIPPAEMVNHFSRAGVKGFDPELYAYFEPKHSLTREQQARLPKEVPGGDKLKTQYAFGFDFKGDEVSLKGYSYPGLKATMAGQEVAKLVGDGVKDLKNQGKLDCTEAWAAVEAYMTELNGWGYHNLWAWDYVSPAKSRLKFYSFVMDVVDKTKLEELWTLNGRATSPAHQEGLRHLKELWDIIDLKNVGKRDLPADAPQIPEDAAPMVWNYEMTAGNPLPFGKGYFPLQGLNDAGCIQKLVKFFELMGWKDLAAKYPETIQSFYPGLDLSKTSHLLMWVSYTYSEKTGVYLSIYNHPCPEK

合成如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的两条引物，以从构巢曲霉中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)高保真的PrimeStar DNA聚合酶。PCR扩增程序为：98℃2min；98℃10s，58℃15s，68℃3min，共35个循环；68℃7min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。

在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的异戊烯基转移酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMD18-T载体，所构建的载体命名为PMDT-Ad03p。经测序获得Ad03p的基因序列。

用含有同源重组序列的引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，以质粒PMDT-Ad03p为模板进行PCR，PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后，利用近岸蛋白质科技有限公司的NovoRec Plus PCR试剂盒与经BamHI和XhoI双酶切的pGEX-4T-1质粒一起转入大肠杆菌BL21中，所获得的重组质粒命名为BL21-pGEX-Ad03p。

将pGEX-4T-1空载质粒转入大肠杆菌BL21中，所获得的重组质粒命名为BL21-pGEX。

固体培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2％琼脂糖。

液体培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠。

诱导培养方法：分别挑取在固体培养基平板上划线的大肠杆菌：BL21-pGEX-Ad03p和BL21-pGEX，于含有5mL液体种子培养基(含有0.1mg/ml的氨苄抗生素)的试管震荡培养过夜(37℃，200rpm，10h)；按1％接种量转移至含有50mL液体培养基(含有0.1mg/ml的氨苄抗生素)的250mL三角瓶中，37℃，200rpm震荡培养至OD600达到0.6开始诱导。加2‰的1M IPTG于16℃，110rpm诱导16h，在4℃下8,000g离心5min收集菌体，加3ml Tris-HCl(pH7.5)重悬菌体，25MPa压榨后4℃，12,000g离心10min，取上清作为粗酶液，用于催化反应。

实施例2、异戊烯基转移酶Ad03p催化大豆苷元反应

用上述制备的粗酶液进行对大豆苷元的体外催化，配制如下反应体系(50μL)：

20mM DMAPP 1μL；

100mM大豆苷元 0.2μL；

粗酶液 48.8μL。

在37℃水浴下反应16h。反应结束后加入2倍体积的乙酸乙酯抽提，取乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于40μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图4。

从图中结果可见，含有异戊烯基转移酶Ad03p的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX-Ad03p催化大豆苷元形成产物dai-1(2号)，而对照组含有空载体pGEX-4T-1的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX催化大豆苷元则没有该产物生成(1号)。

异戊烯基转移酶Ad03p催化大豆苷元的产物dai-1的NMR数据如下：

Dai-1：1H NMR(400MHz，d6-acetone)δppm:8.21(s，1H)，7.92(d，J＝8.6Hz，1H)，7.37(J＝1.8Hz，1H)，7.30(dd，J＝8.2，2.2Hz，1H)，7.03(d，J＝8.8Hz，1H)，6.87(d，J＝8.2Hz，1H)，5.38(t，J＝7.4Hz，1H)，5.29(t，J＝7.4Hz，1H)，3.57(d，J＝7.4Hz，2H)，3.36(d，J＝7.3Hz，2H)，1.83(s，3H)，1.73(s，3H)，1.71(s，3H)，1.66(s，3H).

结果表明，本发明的异戊烯基转移酶Ad03p能催化大豆苷元的C8位和C3’位发生异戊烯基修饰。

实施例3、异戊烯基转移酶Ad03p催化染料木素反应

用制好的粗酶液进行对染料木素的体外催化反应，配制如下反应体系(50μL)：

20mM DMAPP 1μL

100mM染料木素 0.2μL

粗酶液 48.8μL

在37℃水浴下反应16h。反应结束后加入2倍体积的乙酸乙酯抽提，取乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于40μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图5。

图中显示，含有异戊烯基转移酶Ad03p的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX-Ad03p催化染料木素形成新的产物，本发明人将之命名为gen-1和gen-2，而对照组含有空载体pGEX-4T-1的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX催化染料木素则没有该产物生成。

异戊烯基转移酶Ad03p催化染料木素产物gen-1的NMR数据：

gen-1：1H NMR(500MHz，d6-DMSO)δppm:13.23(s，1H)，9.49(s，1H)，8.25(s，1H)，7.21-7.15(m，3H)，6.82(d，J＝8.4Hz，1H)，6.42(s，1H)，5.33-5.27(m，1H)，5.17(t，J＝7.4Hz，1H)，3.24(d，J＝7.3Hz，2H)，3.22(d，J＝7.3Hz，2H)，1.72(s，3H)，1.68(s，6H)，1.62(s，3H)。

结果表明，本发明的异戊烯基转移酶Ad03p能催化染料木素的C6位和C3’位发生异戊烯基修饰。

异戊烯基转移酶Ad03p催化染料木素产物gen-2的NMR数据：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δppm:13.25(s,1H,5-OH),7.84(s,1H,2-H),7.44(d,J＝8.6Hz,2H,2’-H and 6’-H),6.98(d,J＝8.6Hz,2H,3’-H and 5’-H),6.38(s,1H,8-H),5.51(t,J＝6.6Hz,1H,2”-H),5.28(t,J＝7.0Hz,1H,2”’-H),4.54(d,J＝6.6Hz,2H,1”-H),3.47(d,J＝7.0Hz,2H,1”’-H),1.84(s,3H,5”’-H),1.80(s,3H,4”-H),1.78(s,3H,4”’-H),1.75(s,3H,5”-H)。

结果表明，本发明的异戊烯基转移酶Ad03p能催化染料木素的C6位和C4’位发生异戊烯基修饰。

实施例4、异戊烯基转移酶Ad03p催化水飞蓟宾反应

用制好的粗酶液进行对水飞蓟宾的体外催化反应，配制如下反应体系(50μL)：

20mM DMAPP 1μL

100mM水飞蓟宾 0.2μL

粗酶液 48.8μL

在37℃水浴下反应16h。反应结束后加入2倍体积的乙酸乙酯抽提，取乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于40μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图6。

图中显示，含有异戊烯基转移酶Ad03p的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX-Ad03p催化水飞蓟宾形成新的产物，本发明人将之命名为sil-1和sil-2，而对照组含有空载体pGEX-4T-1的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX催化水飞蓟宾则没有该产物生成。

结果表明，本发明的异戊烯基转移酶Ad03p能催化水飞蓟宾的C6位发生异戊烯基修饰生成结构新颖的化合物sil-1。

结果表明，本发明的异戊烯基转移酶Ad03p能催化水飞蓟宾的C7位羟基发生异戊烯基修饰生成sil-2。

实施例5、异戊烯基转移酶Ad03p催化其它黄酮类化合物的反应

运用上述方法，本发明人进一步对异戊烯基转移酶Ad03p催化不同黄酮类化合物的功能进行检测。

结果发现，Ad03p还可以催化黄芩素、柚皮素、山奈酚、木犀草素、圣草酚和二氢杨梅素等发生异戊烯基修饰。

实施例6、异戊烯基转移酶Cp05的克隆及其在大肠杆菌中表达

在前述研究的基础上，发明人进一步挖掘了其它的异戊烯基转移酶。通过对麦角菌转录组数据进行拼接和分析，获得一条异戊烯基转移酶的核苷酸候选序列Cp05。

Cp05基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，编码蛋白质Cp05，具有SEQID NO:4所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3(Cp05-nucleic acid sequence)：

atggctactttgcagcagcattcctccgccgaccgcatagggcaggcaacagagtcaacacacaatgatggtagtggacagcggactggctccgactactggtggctcaccagcggccacgacctcgctcatctgatgcaagaggccaactatccggaccacgtcgcgcgggaattcctctcgtatttccgccagaatatttgttctcagctcggagatgaggttacgcccgcctccaagaagagtggcctgggatgggacggctcgccttttgagtacagtattgagctcaagagcaccgactcttcgcaaacggttcgcttcggcgtcgacttggccaacctgaaagcgcctcctgccgatggtgaagaggtcgatggtgagggcgtcttgtccacgtctggcacgcgcaaagtagtcgggactttggctggcaaagcgctcggctttgacgatacctggtaccactctctgctcaaattctttgaccagtcccagcaaaccaaggagaggcagctcgagctcgcgacccaggttggccatcaaactcccatcgtggttggatttgacattcaaccaaaagcggcaccatcaactcttggaaaggatggcgagatccagaccctgcctgccatggcaaaggcctacttcccaccttgccacactgccgcagccagaggccaaacgcgctggcatacaatctgcgatgccattcaccagctgcccgacattgctaccaagtatcccgtcctgcttgactctctcaaaatgattgatgactacctggccaccaagcccgagagctggaaggagggtgcccgctacctcgccacggactttgtgtctcccgaaaagtcccgcctcaagatctacctgcgctatcctggcaactcgttcgatgagatatgggacttctttaccctgggaggacgcgtcccggctcccgagcacaacaaggccatgttccaggatctcatgactctcaccgggcccagtgatgggacagacaacggcagatcccacacggtaaacccggacttggactacaccaactttcgccgcaagatgacgtgtatctacttttctctctcgaataaaaatcgcaccccggcgcccaagattggaatttacccggcaaactttgcagccaacgatggggttattgctcggggccttgacaaatggctccagaaatatgactggccagtgcccaagcggtccattgaggaacagctgaagagtgtattcacgcatcgcagtttggatgaaaagacgggtctttttaccttcatctgtttgggtagaaaggaggatcccacaaagaatgatttaagcatgcagatttatcttgcgccggagctctacgcgagcccgcgggactggcagggagacaagcttgcggccgcactcgagtga

SEQ ID NO:4(Cp05-amino acid sequence)：

MATLQQHSSADRIGQATESTHNDGSGQRTGSDYWWLTSGHDLAHLMQEANYPDHVAREFLSYFRQNICSQLGDEVTPASKKSGLGWDGSPFEYSIELKSTDSSQTVRFGVDLANLKAPPADGEEVDGEGVLSTSGTRKVVGTLAGKALGFDDTWYHSLLKFFDQSQQTKERQLELATQVGHQTPIVVGFDIQPKAAPSTLGKDGEIQTLPAMAKAYFPPCHTAAARGQTRWHTICDAIHQLPDIATKYPVLLDSLKMIDDYLATKPESWKEGARYLATDFVSPEKSRLKIYLRYPGNSFDEIWDFFTLGGRVPAPEHNKAMFQDLMTLTGPSDGTDNGRSHTVNPDLDYTNFRRKMTCIYFSLSNKNRTPAPKIGIYPANFAANDGVIARGLDKWLQKYDWPVPKRSIEEQLKSVFTHRSLDEKTGLFTFICLGRKEDPTKNDLSMQIYLAPELYASPRDWQGDKLAAALE

合成如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的两条引物，以从麦角菌中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)高保真的PrimeStar DNA聚合酶。PCR扩增程序为：98℃2min；98℃10s，58℃15s，68℃3min，共35个循环；68℃7min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2。

在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel ExtractionKit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的异戊烯基转移酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMD18-T载体，所构建的载体命名为PMDT-Cp05。经测序获得Cp05的基因序列。

Cp05基因具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列，编码一个氨基酸的蛋白质Cp05，具有SEQ ID NO:4的氨基酸残基序列。

用含有同源重组序列的引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，以质粒PMDT-Cp05为模板进行PCR，PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后，利用近岸蛋白质科技有限公司的NovoRec Plus PCR试剂盒与经NcoI和SalI双酶切的pET28a质粒一起转入大肠杆菌BL21中，所获得的重组质粒命名为BL21-pET28a-Cp05。

将pET28a空载质粒转入大肠杆菌BL21中，所获得的重组质粒命名为BL21-pET28a。

固体培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2％琼脂糖。

液体培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠。

诱导培养方法：分别挑取在固体培养基平板上划线的大肠杆菌：BL21-pET28a-Cp05和BL21-pET28a，于含有5mL液体种子培养基(含有0.1mg/ml的卡那抗生素)的试管震荡培养过夜(37℃，200rpm，10h)；按1％接种量转移至含有50mL液体培养基(含有0.1mg/ml的卡那抗生素)的250mL三角瓶中，37℃，200rpm震荡培养至OD600达到0.6开始诱导。加2‰的1M IPTG于16℃，110rpm诱导16h，在4℃下8,000g离心5min收集菌体，加3ml Tris-HCl(pH7.5)重悬菌体，25MPa压榨后4℃，12,000g离心10min，取上清作为粗酶液用于催化反应。

实施例7、异戊烯基转移酶Cp05催化聚酮化合物的异戊烯基化反应

配制如下反应体系(50μL)：

20mM DMAPP 1μL

100mM DHMP 0.2μL

粗酶液 48.8μL

在37℃水浴下反应16h。反应结束后加入2倍体积的乙酸乙酯抽提，取乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于40μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图7。

从图中结果可见，含有异戊烯基转移酶Cp05的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-Cp05催化马替麦考酚酸(霉酚酸)杂质1(DHMP)形成一种新的产物DHMP-1，而对照组含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化DHMP则没有该产物生成。

异戊烯基转移酶Cp05催化DHMP的产物DHMP-1的NMR数据：

DHMP-1:1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm:7.53(s，1H)，6.42(s，1H)，5.46(t，J＝6.6Hz，1H)，5.20(s，2H)，4.57(t，J＝6.6Hz，2H)，2.04(s，3H)，1.80(s，3H)，1.75(s，3H)；

13C NMR(125MHz，CDCl3)δppm:172.94，164.15，156.16，145.92，138.78，119.04，112.61，102.72，99.09，70.11，66.08，25.93，18.46，11.06.

结果表明，本发明的异戊烯基转移酶Cp05能催化DHMP的C5位羟基发生异戊烯基修饰合成5-O-5,7-二羟基-4-甲基-1(3H)-异苯并呋喃酮(isobenzofuranone)。

实施例8、异戊烯基转移酶Ao01的克隆及其在大肠杆菌中表达

本发明通过对米曲霉转录组数据进行拼接和分析，获得一条异戊烯基转移酶Ao01。异戊烯基转移酶Ao01的基因具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，编码的异戊烯基转移酶Ao01具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5(Ao01-核苷酸序列)：

atgtctcaaccataccacaccctaactaaatcactcacgtttcccaatctagaccagtaccaatggtggcagcaagccggcccaactttgtccaaactactctccacagctaattaccctatcgaccagcaatatcaatacctcctcttgctgggcctacacatcatccccatgctaggcccgtacccttcctcccagcgaccaggtctctacaagagccctataggaggaatcggcacgctcgaactcagccaaaacttcaccaaggacaagaacacagtccggatggggttcgagccggtgcactacatggcaacaactggacaagaccagtgtaaccaactcatcatgaacgaggcattaacaacgttcaagcgacttggcgctaccatcgacttatcgctctaccattccctggtctctgggctcacactctccgatacggagctggctattctccgagacaaagacgagctcaagaagcacccgacgaaatcccagcatgtattgggaattgacatgaagggaggagacgtgttggttaaggtttacatttatccgcagcttaaggctattgcgcagcaaatacccgtgtcggagatgatattctctgcattgagcaaggtcgacaatggtaagttgggcgagagcggatgtctttccgtcatgaaggatttcattgcagatgagagtgtgaacccggcaaggacacccgtaacctttttagcctgtgatctcctggagcccagtcaggctcggtttaaggtctacatcgccgagttccaattcgacttagacacgctctccagaaactggacccttggcgggaggttgaacgatccagagaccctgaagggactggaattgctccaggaactctggacggcattcaatcttccacagggtctcagggagccccctaaaccgggtgactcgcccgttcggctgccgttcctgtacaacttcgagatgcagtcggggaggaagttccccaagtcgaaggtttactttcccctggctgatgtgaatgatcgcgacattgcgaatgtgttgactgcgttctttgagaagcatggatgtgctgaattggcgaagtcttatacggagaacctgttgcaatacttccctggtgttgatcttgcggagagcgttgcgttgcacgcgtggttgtccttttcgtactcggagaaaacgggtccatatatgacggtttattatcagtggccggatagcttcaatcagtgtcatttgactgcagccagctcctga

SEQ ID NO:6(Ao01-氨基酸序列)：

MSQPYHTLTKSLTFPNLDQYQWWQQAGPTLSKLLSTANYPIDQQYQYLLLLGLHIIPMLGPYPSSQRPGLYKSPIGGIGTLELSQNFTKDKNTVRMGFEPVHYMATTGQDQCNQLIMNEALTTFKRLGATIDLSLYHSLVSGLTLSDTELAILRDKDELKKHPTKSQHVLGIDMKGGDVLVKVYIYPQLKAIAQQIPVSEMIFSALSKVDNGKLGESGCLSVMKDFIADESVNPARTPVTFLACDLLEPSQARFKVYIAEFQFDLDTLSRNWTLGGRLNDPETLKGLELLQELWTAFNLPQGLREPPKPGDSPVRLPFLYNFEMQSGRKFPKSKVYFPLADVNDRDIANVLTAFFEKHGCAELAKSYTENLLQYFPGVDLAESVALHAWLSFSYSEKTGPYMTVYYQWPDSFNQCHLTAASS

合成如序列表中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的两条引物，以从米曲霉中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)高保真的PrimeStar DNA聚合酶。PCR扩增程序为：98℃2min；98℃10s，58℃15s，68℃3min，共35个循环；68℃7min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3。

在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的异戊烯基转移酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMD18-T载体，所构建的载体命名为PMDT-Ao01。经测序获得Ao01的基因序列。

用含有同源重组序列的引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，以质粒PMDT-Ao01为模板进行PCR，PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后，利用近岸蛋白质科技有限公司的NovoRec Plus PCR试剂盒与经BamHI和XhoI双酶切的pGEX-4T-1质粒一起转入大肠杆菌BL21中，所获得的重组质粒命名为BL21-pGEX-Ao01。

将pGEX-4T-1空载质粒转入大肠杆菌BL21中，所获得的重组质粒命名为BL21-pGEX。

固体培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2％琼脂糖。

液体培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠。

诱导培养方法：分别挑取在固体培养基平板上划线的大肠杆菌：BL21-pGEX-Ao01和BL21-pGEX，于含有5mL液体种子培养基(含有0.1mg/ml的氨苄抗生素)的试管震荡培养过夜(37℃，200rpm，10h)；按1％接种量转移至含有50mL液体培养基(含有0.1mg/ml的氨苄抗生素)的250mL三角瓶中，37℃，200rpm震荡培养至OD600达到0.6开始诱导。加2‰的1M IPTG于16℃，110rpm诱导16h，在4℃下8,000g离心5min收集菌体，加3ml Tris-HCl(pH7.5)重悬菌体，25MPa压榨后4℃，12,000g离心10min，取上清作为粗酶液，用于催化反应。

实施例9、异戊烯基转移酶Ao01催化黄芩素反应

用上述制备的粗酶液进行对黄芩素的体外催化，配制如下反应体系(50μL)：

20mM DMAPP 1μL；

100mM黄芩素 0.2μL；

粗酶液 48.8μL。

在37℃水浴下反应16h。反应结束后加入2倍体积的乙酸乙酯抽提，取乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于40μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如图8。

从图中结果可见，含有异戊烯基转移酶Ao01的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX-Ao01催化黄芩素形成产物bai-1(10号)，而对照组含有空载体pGEX-4T-1的大肠杆菌粗酶液BL21-pGEX催化黄芩素则没有该产物生成(9号)。

结果表明，本发明的异戊烯基转移酶Ao01能催化黄芩素的C7位羟基发生异戊烯基修饰。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 异戊烯基转移酶及其应用

<130> 208092

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 1

atggtcgcca cacctgatga tccaagagcg cagaccatcg ttgatctctt caatggacag 60

ggcagcgccc cggctccctt tgacgtgctg acctcagcct tgtcttttcc caccagagac 120

caggagcaat ggtggcgcaa gaccggccca atgtttggtc agatgctcgc ctcgtctggc 180

tataccctcg atcagcagta tcggcacctc accttctact acaaccaact cgttccccgc 240

ctcggccctc acccagcaac attccattcc agtctgactg tcagcgggtt acccatggag 300

ttcagcatca actaccagca aaagggtgcg catccaatgg tccgcattgg cgcggaacct 360

atcgactcct tttcggggac ggaacgggac ccatttaatc agatcccgcc ggccgagatg 420

gtaaaccact tctccagagc gggagttaaa ggattcgatc cggagcttta tgcgtacttc 480

gagccaaagc attctcttac tcgtgagcag caagccagac taccgaaaga agtacctggt 540

ggtgacaagt taaagacgca atatgctttc gggttcgatt ttaagggtga tgaggtttca 600

ctgaaggggt atagctatcc cgggctgaaa gccacaatgg caggccagga agttgcgaag 660

ctcgtcggag acggggtcaa ggacctgaaa aaccaaggca aactggactg caccgaggcc 720

tgggcagctg tggaagccta catgactgag ctcaacggct ggggctacca caacctctgg 780

gcatgggatt acgtctcgcc tgcgaaatcg cgtctcaagt tttattcctt cgtcatggat 840

gtcgtagaca agactaagct cgaggagctc tggacattga atggccgcgc caccagcccc 900

gctcatcaag agggtctacg acatctcaaa gagctctggg atattatcga cctgaagaac 960

gtcggcaaga gagacctccc ggccgatgcg cctcagatcc cagaggatgc agcgcccatg 1020

gtttggaact atgaaatgac ggcgggcaat cccttgccgt tcggcaaggg ctactttccg 1080

ctgcaagggc tcaacgatgc aggctgtatc cagaagctcg tcaagttctt tgagttaatg 1140

gggtggaagg atctcgcggc caagtacccg gagactattc agtcgttcta tcctggcctc 1200

gatctgtcca agacatcaca tctactgatg tgggtgtcgt acacttattc ggagaagaca 1260

ggggtttatc tgagcattta caatcatcct tgtccagaga aatag 1305

<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 2

Met Val Ala Thr Pro Asp Asp Pro Arg Ala Gln Thr Ile Val Asp Leu

1 5 10 15

Phe Asn Gly Gln Gly Ser Ala Pro Ala Pro Phe Asp Val Leu Thr Ser

20 25 30

Ala Leu Ser Phe Pro Thr Arg Asp Gln Glu Gln Trp Trp Arg Lys Thr

35 40 45

Gly Pro Met Phe Gly Gln Met Leu Ala Ser Ser Gly Tyr Thr Leu Asp

50 55 60

Gln Gln Tyr Arg His Leu Thr Phe Tyr Tyr Asn Gln Leu Val Pro Arg

65 70 75 80

Leu Gly Pro His Pro Ala Thr Phe His Ser Ser Leu Thr Val Ser Gly

85 90 95

Leu Pro Met Glu Phe Ser Ile Asn Tyr Gln Gln Lys Gly Ala His Pro

100 105 110

Met Val Arg Ile Gly Ala Glu Pro Ile Asp Ser Phe Ser Gly Thr Glu

115 120 125

Arg Asp Pro Phe Asn Gln Ile Pro Pro Ala Glu Met Val Asn His Phe

130 135 140

Ser Arg Ala Gly Val Lys Gly Phe Asp Pro Glu Leu Tyr Ala Tyr Phe

145 150 155 160

Glu Pro Lys His Ser Leu Thr Arg Glu Gln Gln Ala Arg Leu Pro Lys

165 170 175

Glu Val Pro Gly Gly Asp Lys Leu Lys Thr Gln Tyr Ala Phe Gly Phe

180 185 190

Asp Phe Lys Gly Asp Glu Val Ser Leu Lys Gly Tyr Ser Tyr Pro Gly

195 200 205

Leu Lys Ala Thr Met Ala Gly Gln Glu Val Ala Lys Leu Val Gly Asp

210 215 220

Gly Val Lys Asp Leu Lys Asn Gln Gly Lys Leu Asp Cys Thr Glu Ala

225 230 235 240

Trp Ala Ala Val Glu Ala Tyr Met Thr Glu Leu Asn Gly Trp Gly Tyr

245 250 255

His Asn Leu Trp Ala Trp Asp Tyr Val Ser Pro Ala Lys Ser Arg Leu

260 265 270

Lys Phe Tyr Ser Phe Val Met Asp Val Val Asp Lys Thr Lys Leu Glu

275 280 285

Glu Leu Trp Thr Leu Asn Gly Arg Ala Thr Ser Pro Ala His Gln Glu

290 295 300

Gly Leu Arg His Leu Lys Glu Leu Trp Asp Ile Ile Asp Leu Lys Asn

305 310 315 320

Val Gly Lys Arg Asp Leu Pro Ala Asp Ala Pro Gln Ile Pro Glu Asp

325 330 335

Ala Ala Pro Met Val Trp Asn Tyr Glu Met Thr Ala Gly Asn Pro Leu

340 345 350

Pro Phe Gly Lys Gly Tyr Phe Pro Leu Gln Gly Leu Asn Asp Ala Gly

355 360 365

Cys Ile Gln Lys Leu Val Lys Phe Phe Glu Leu Met Gly Trp Lys Asp

370 375 380

Leu Ala Ala Lys Tyr Pro Glu Thr Ile Gln Ser Phe Tyr Pro Gly Leu

385 390 395 400

Asp Leu Ser Lys Thr Ser His Leu Leu Met Trp Val Ser Tyr Thr Tyr

405 410 415

Ser Glu Lys Thr Gly Val Tyr Leu Ser Ile Tyr Asn His Pro Cys Pro

420 425 430

Glu Lys

<210> 3

<211> 1416

<212> DNA

<213> 麦角菌(Ciavieps purpurea )

<400> 3

atggctactt tgcagcagca ttcctccgcc gaccgcatag ggcaggcaac agagtcaaca 60

cacaatgatg gtagtggaca gcggactggc tccgactact ggtggctcac cagcggccac 120

gacctcgctc atctgatgca agaggccaac tatccggacc acgtcgcgcg ggaattcctc 180

tcgtatttcc gccagaatat ttgttctcag ctcggagatg aggttacgcc cgcctccaag 240

aagagtggcc tgggatggga cggctcgcct tttgagtaca gtattgagct caagagcacc 300

gactcttcgc aaacggttcg cttcggcgtc gacttggcca acctgaaagc gcctcctgcc 360

gatggtgaag aggtcgatgg tgagggcgtc ttgtccacgt ctggcacgcg caaagtagtc 420

gggactttgg ctggcaaagc gctcggcttt gacgatacct ggtaccactc tctgctcaaa 480

ttctttgacc agtcccagca aaccaaggag aggcagctcg agctcgcgac ccaggttggc 540

catcaaactc ccatcgtggt tggatttgac attcaaccaa aagcggcacc atcaactctt 600

ggaaaggatg gcgagatcca gaccctgcct gccatggcaa aggcctactt cccaccttgc 660

cacactgccg cagccagagg ccaaacgcgc tggcatacaa tctgcgatgc cattcaccag 720

ctgcccgaca ttgctaccaa gtatcccgtc ctgcttgact ctctcaaaat gattgatgac 780

tacctggcca ccaagcccga gagctggaag gagggtgccc gctacctcgc cacggacttt 840

gtgtctcccg aaaagtcccg cctcaagatc tacctgcgct atcctggcaa ctcgttcgat 900

gagatatggg acttctttac cctgggagga cgcgtcccgg ctcccgagca caacaaggcc 960

atgttccagg atctcatgac tctcaccggg cccagtgatg ggacagacaa cggcagatcc 1020

cacacggtaa acccggactt ggactacacc aactttcgcc gcaagatgac gtgtatctac 1080

ttttctctct cgaataaaaa tcgcaccccg gcgcccaaga ttggaattta cccggcaaac 1140

tttgcagcca acgatggggt tattgctcgg ggccttgaca aatggctcca gaaatatgac 1200

tggccagtgc ccaagcggtc cattgaggaa cagctgaaga gtgtattcac gcatcgcagt 1260

ttggatgaaa agacgggtct ttttaccttc atctgtttgg gtagaaagga ggatcccaca 1320

aagaatgatt taagcatgca gatttatctt gcgccggagc tctacgcgag cccgcgggac 1380

tggcagggag acaagcttgc ggccgcactc gagtga 1416

<210> 4

<211> 471

<212> PRT

<213> 麦角菌(Ciavieps purpurea )

<400> 4

Met Ala Thr Leu Gln Gln His Ser Ser Ala Asp Arg Ile Gly Gln Ala

1 5 10 15

Thr Glu Ser Thr His Asn Asp Gly Ser Gly Gln Arg Thr Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Trp Trp Leu Thr Ser Gly His Asp Leu Ala His Leu Met Gln Glu

35 40 45

Ala Asn Tyr Pro Asp His Val Ala Arg Glu Phe Leu Ser Tyr Phe Arg

50 55 60

Gln Asn Ile Cys Ser Gln Leu Gly Asp Glu Val Thr Pro Ala Ser Lys

65 70 75 80

Lys Ser Gly Leu Gly Trp Asp Gly Ser Pro Phe Glu Tyr Ser Ile Glu

85 90 95

Leu Lys Ser Thr Asp Ser Ser Gln Thr Val Arg Phe Gly Val Asp Leu

100 105 110

Ala Asn Leu Lys Ala Pro Pro Ala Asp Gly Glu Glu Val Asp Gly Glu

115 120 125

Gly Val Leu Ser Thr Ser Gly Thr Arg Lys Val Val Gly Thr Leu Ala

130 135 140

Gly Lys Ala Leu Gly Phe Asp Asp Thr Trp Tyr His Ser Leu Leu Lys

145 150 155 160

Phe Phe Asp Gln Ser Gln Gln Thr Lys Glu Arg Gln Leu Glu Leu Ala

165 170 175

Thr Gln Val Gly His Gln Thr Pro Ile Val Val Gly Phe Asp Ile Gln

180 185 190

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Thr Leu Gly Lys Asp Gly Glu Ile Gln Thr

195 200 205

Leu Pro Ala Met Ala Lys Ala Tyr Phe Pro Pro Cys His Thr Ala Ala

210 215 220

Ala Arg Gly Gln Thr Arg Trp His Thr Ile Cys Asp Ala Ile His Gln

225 230 235 240

Leu Pro Asp Ile Ala Thr Lys Tyr Pro Val Leu Leu Asp Ser Leu Lys

245 250 255

Met Ile Asp Asp Tyr Leu Ala Thr Lys Pro Glu Ser Trp Lys Glu Gly

260 265 270

Ala Arg Tyr Leu Ala Thr Asp Phe Val Ser Pro Glu Lys Ser Arg Leu

275 280 285

Lys Ile Tyr Leu Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Phe Asp Glu Ile Trp Asp

290 295 300

Phe Phe Thr Leu Gly Gly Arg Val Pro Ala Pro Glu His Asn Lys Ala

305 310 315 320

Met Phe Gln Asp Leu Met Thr Leu Thr Gly Pro Ser Asp Gly Thr Asp

325 330 335

Asn Gly Arg Ser His Thr Val Asn Pro Asp Leu Asp Tyr Thr Asn Phe

340 345 350

Arg Arg Lys Met Thr Cys Ile Tyr Phe Ser Leu Ser Asn Lys Asn Arg

355 360 365

Thr Pro Ala Pro Lys Ile Gly Ile Tyr Pro Ala Asn Phe Ala Ala Asn

370 375 380

Asp Gly Val Ile Ala Arg Gly Leu Asp Lys Trp Leu Gln Lys Tyr Asp

385 390 395 400

Trp Pro Val Pro Lys Arg Ser Ile Glu Glu Gln Leu Lys Ser Val Phe

405 410 415

Thr His Arg Ser Leu Asp Glu Lys Thr Gly Leu Phe Thr Phe Ile Cys

420 425 430

Leu Gly Arg Lys Glu Asp Pro Thr Lys Asn Asp Leu Ser Met Gln Ile

435 440 445

Tyr Leu Ala Pro Glu Leu Tyr Ala Ser Pro Arg Asp Trp Gln Gly Asp

450 455 460

Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu

465 470

<210> 5

<211> 1269

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 5

atgtctcaac cataccacac cctaactaaa tcactcacgt ttcccaatct agaccagtac 60

caatggtggc agcaagccgg cccaactttg tccaaactac tctccacagc taattaccct 120

atcgaccagc aatatcaata cctcctcttg ctgggcctac acatcatccc catgctaggc 180

ccgtaccctt cctcccagcg accaggtctc tacaagagcc ctataggagg aatcggcacg 240

ctcgaactca gccaaaactt caccaaggac aagaacacag tccggatggg gttcgagccg 300

gtgcactaca tggcaacaac tggacaagac cagtgtaacc aactcatcat gaacgaggca 360

ttaacaacgt tcaagcgact tggcgctacc atcgacttat cgctctacca ttccctggtc 420

tctgggctca cactctccga tacggagctg gctattctcc gagacaaaga cgagctcaag 480

aagcacccga cgaaatccca gcatgtattg ggaattgaca tgaagggagg agacgtgttg 540

gttaaggttt acatttatcc gcagcttaag gctattgcgc agcaaatacc cgtgtcggag 600

atgatattct ctgcattgag caaggtcgac aatggtaagt tgggcgagag cggatgtctt 660

tccgtcatga aggatttcat tgcagatgag agtgtgaacc cggcaaggac acccgtaacc 720

tttttagcct gtgatctcct ggagcccagt caggctcggt ttaaggtcta catcgccgag 780

ttccaattcg acttagacac gctctccaga aactggaccc ttggcgggag gttgaacgat 840

ccagagaccc tgaagggact ggaattgctc caggaactct ggacggcatt caatcttcca 900

cagggtctca gggagccccc taaaccgggt gactcgcccg ttcggctgcc gttcctgtac 960

aacttcgaga tgcagtcggg gaggaagttc cccaagtcga aggtttactt tcccctggct 1020

gatgtgaatg atcgcgacat tgcgaatgtg ttgactgcgt tctttgagaa gcatggatgt 1080

gctgaattgg cgaagtctta tacggagaac ctgttgcaat acttccctgg tgttgatctt 1140

gcggagagcg ttgcgttgca cgcgtggttg tccttttcgt actcggagaa aacgggtcca 1200

tatatgacgg tttattatca gtggccggat agcttcaatc agtgtcattt gactgcagcc 1260

agctcctga 1269

<210> 6

<211> 422

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 6

Met Ser Gln Pro Tyr His Thr Leu Thr Lys Ser Leu Thr Phe Pro Asn

1 5 10 15

Leu Asp Gln Tyr Gln Trp Trp Gln Gln Ala Gly Pro Thr Leu Ser Lys

20 25 30

Leu Leu Ser Thr Ala Asn Tyr Pro Ile Asp Gln Gln Tyr Gln Tyr Leu

35 40 45

Leu Leu Leu Gly Leu His Ile Ile Pro Met Leu Gly Pro Tyr Pro Ser

50 55 60

Ser Gln Arg Pro Gly Leu Tyr Lys Ser Pro Ile Gly Gly Ile Gly Thr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Gln Asn Phe Thr Lys Asp Lys Asn Thr Val Arg Met

85 90 95

Gly Phe Glu Pro Val His Tyr Met Ala Thr Thr Gly Gln Asp Gln Cys

100 105 110

Asn Gln Leu Ile Met Asn Glu Ala Leu Thr Thr Phe Lys Arg Leu Gly

115 120 125

Ala Thr Ile Asp Leu Ser Leu Tyr His Ser Leu Val Ser Gly Leu Thr

130 135 140

Leu Ser Asp Thr Glu Leu Ala Ile Leu Arg Asp Lys Asp Glu Leu Lys

145 150 155 160

Lys His Pro Thr Lys Ser Gln His Val Leu Gly Ile Asp Met Lys Gly

165 170 175

Gly Asp Val Leu Val Lys Val Tyr Ile Tyr Pro Gln Leu Lys Ala Ile

180 185 190

Ala Gln Gln Ile Pro Val Ser Glu Met Ile Phe Ser Ala Leu Ser Lys

195 200 205

Val Asp Asn Gly Lys Leu Gly Glu Ser Gly Cys Leu Ser Val Met Lys

210 215 220

Asp Phe Ile Ala Asp Glu Ser Val Asn Pro Ala Arg Thr Pro Val Thr

225 230 235 240

Phe Leu Ala Cys Asp Leu Leu Glu Pro Ser Gln Ala Arg Phe Lys Val

245 250 255

Tyr Ile Ala Glu Phe Gln Phe Asp Leu Asp Thr Leu Ser Arg Asn Trp

260 265 270

Thr Leu Gly Gly Arg Leu Asn Asp Pro Glu Thr Leu Lys Gly Leu Glu

275 280 285

Leu Leu Gln Glu Leu Trp Thr Ala Phe Asn Leu Pro Gln Gly Leu Arg

290 295 300

Glu Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ser Pro Val Arg Leu Pro Phe Leu Tyr

305 310 315 320

Asn Phe Glu Met Gln Ser Gly Arg Lys Phe Pro Lys Ser Lys Val Tyr

325 330 335

Phe Pro Leu Ala Asp Val Asn Asp Arg Asp Ile Ala Asn Val Leu Thr

340 345 350

Ala Phe Phe Glu Lys His Gly Cys Ala Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Thr

355 360 365

Glu Asn Leu Leu Gln Tyr Phe Pro Gly Val Asp Leu Ala Glu Ser Val

370 375 380

Ala Leu His Ala Trp Leu Ser Phe Ser Tyr Ser Glu Lys Thr Gly Pro

385 390 395 400

Tyr Met Thr Val Tyr Tyr Gln Trp Pro Asp Ser Phe Asn Gln Cys His

405 410 415

Leu Thr Ala Ala Ser Ser

420

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

atggtcgcca cacctgatga t 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ctatttctct ggacaaggat gatt 24

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

atcggatctg gttccgcgtg atggtcgcca cacctgatga 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

gtcacgatgc ggccgctcga ctatttctct ggacaaggat 40

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

atggctactt tgcagcagca ttc 23

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

tcatccctgc cagtcccg 18

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

taagaaggag atataccatg atggctactt tgcagcagca 40

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

tgcggccgca agcttgtcga ctcatccctg ccagtcccg 39

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

atgtctcaac cataccacac cctaa 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

tcaggagctg gctgcagtca aa 22

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

atcggatctg gttccgcgtg atgtctcaac cataccacac 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

gtcacgatgc ggccgctcga tcaggagctg gctgcagtca 40

Claims (15)

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；

(b)与(a)多肽的氨基酸序列有至少80％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；

(c)将(a)多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽的功能的多肽；

(d)(a)～(c)任一所述多肽的片段，其包含(a)多肽的催化结构域且具有(a)多肽的功能；或

(e)(a)～(d)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列或分泌信号序列后形成的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2～3任一所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2～3任一所述的多核苷酸。

6.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，包括：

(i)培养权利要求5所述的宿主细胞；

(ii)收集含有权利要求1所述的多肽的培养物；

(iii)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

7.权利要求1所述的多肽的用途，用于催化黄酮化合物或聚酮化合物的异戊烯基修饰；或，用于制备催化黄酮化合物或聚酮化合物的异戊烯基修饰的组合物。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的黄酮化合物为具有式(I)或式(II)所示的母核结构的化合物：

较佳地，所述的黄酮化合物底物的异戊烯基修饰发生于黄酮化合物底物的包括以下位置：C6位、C7位羟基、C8位、C3’位或C4’位上。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的聚酮化合物底物的异戊烯基修饰发生于聚酮化合物底物的包括以下位置：C5位羟基。

10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的异戊烯基来自异戊烯基供体；较佳地，所述异戊烯基供体包括选自：二甲基丙烯焦磷酸，法尼基二磷酸，或其组合。

11.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述化合物为大豆苷元，所述多肽催化其C8位和/或C3’位的异戊烯基修饰；

所述化合物为染料木素，所述多肽催化其C6位和/或C3’位和/或C4’位的异戊烯基修饰；

所述化合物为DHMP，所述多肽催化其C5位羟基的异戊烯基修饰；

所述化合物为水飞蓟宾，所述多肽催化其C6位和/或C7位羟基的异戊烯基修饰；或

所述化合物为黄芩素，所述多肽催化其C7位羟基的异戊烯基修饰。

12.一种组合物，其包含选自下组的成分：权利要求1所述的多肽；或权利要求5所述的宿主细胞；以及，工业学或微生物学上可接受的载体。

13.一种对黄酮化合物或聚酮化合物进行异戊烯基修饰的方法，包括：应用权利要求1所述的多肽、权利要求5所述的宿主细胞或权利要求10所述的组合物处理黄酮化合物或聚酮化合物，生成发生异戊烯基修饰的产物。

14.一种利用细胞生产异戊烯基修饰的黄酮化合物或聚酮化合物的方法，包括：

(S1)提供一工程细胞，该细胞包括黄酮化合物或聚酮化合物的生产体系；

(S2)在(S1)所述工程细胞中表达权利要求1所述的多肽；

(S3)培养(S2)的工程细胞，生产异戊烯基修饰的黄酮化合物或聚酮化合物。

15.一种用于对黄酮化合物或聚酮化合物进行异戊烯基修饰的试剂盒，其中包括：权利要求1所述的多肽；或权利要求5所述的宿主细胞；较佳地，其中还包括对黄酮化合物或聚酮化合物进行异戊烯基修饰的方法加以说明的使用说明书。

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