CN110819600B - 甲基转移酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甲基转移酶及其应用。本发明揭示了最新分离和鉴定获得的一组甲基转移酶。在提供甲基供体的情况下，本发明的酶能将甲基转移到黄酮类或异黄酮类化合物上，使之增加一个甲基。具体地，本发明的甲基转移酶能特异和高效地催化黄酮类化合物底物的C‑3位、C‑7位、C‑3’位、C‑4’位的羟基甲基化，或异黄酮类化合物底物的C‑7位、C‑4’位的羟基甲基化。所述的甲基转移酶可应用于黄酮类或异黄酮类化合物的合成、改造与生物转化等领域。

Description

甲基转移酶及其应用
技术领域
本发明生物生物技术和天然产物药物等领域；具体地，本发明涉及一组甲基转移酶及其应用。
背景技术
在植物天然产物大家族中，黄酮类化合物一直都是人们比较关注的一类。在中草药中黄酮类作为有效成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化损伤、抗致病菌感染、保护心血管系统等多种功效。目前已鉴定的黄酮类天然产物已超过10000种，主要存在于各种蔬菜、水果、植物茎和种子中。
在黄酮类化合物的后修饰中，羟基化是最基本的类型，通常发生在骨架3,5,6,7,3’,4’,5’位的碳原子上。不同的羟基化数量与位点是造成黄酮类化合物种类多样性的重要原因。黄酮经羟基化后便可以进行更进一步的甲基化或糖基化修饰。羟基基团的甲基化在黄酮的应用中至关重要。黄酮经甲基化后可显著增强其代谢稳定性，提高其细胞膜穿透能力，促进吸收，提高其口服利用率，并且还能增添一些原本不具有的特性。植物天然化合物的甲基化修饰是由S腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖型的甲基转移酶完成的。
甲基转移酶具有丰富的结构与功能多样性，这预示着它能应用到各种各种医药、农药或高附加值化合物的甲基化生产中。在植物体内，负责催化黄酮类化合物甲基化的是天然产物O-甲基转移酶。通常，天然产物的O-甲基转移酶依据其结构、分子量大小和阳离子依赖性等生化特性可划分为咖啡酰辅酶A-氧-甲基转移酶和咖啡酸-氧-甲基转移酶两类。咖啡酰辅酶A-氧-甲基转移酶类蛋白分子量为26～30kDa，其活性依赖于二价阳离子的存在，在木质素单体的合成中发挥重要作用。咖啡酸-氧-甲基转移酶类蛋白分子量为36-43kDa，对二价阳离子不存在依赖性，其识别的底物范围也更加广泛，黄酮类化合物的氧-甲基转移酶均属于此类。
目前，依据黄酮类化合物氧-甲基转移酶的序列特征，对其中的部分进行了克隆、异源表达和功能验证。例如Man-Ho Cho等在番茄中克隆得到的SIOMT3可以对黄酮醇类化合物的3’和5’羟基进行位点特异性的甲基化；Randeep Rakwal等在水稻中鉴定到了催化二氢黄酮醇7位羟基的氧-甲基转移酶。新的氧-甲基转移酶的克隆与鉴定完善了现有黄酮氧-甲基转移酶的活性位点，对进一步了解此类酶的催化机理也会有很大帮助。在生产应用方面，利用位点特异性的酶对底物进行催化既安全环保又可以减少副产物的生成，减少能量浪费。
大豆、马铃薯、淫羊藿中含有种类丰富的黄酮类化合物，例如芹菜素、木犀草素、山奈酚和槲皮素等种类繁多的黄酮类化合物及其甲基化衍生物，这预示着这些植物基因组中应该会存在大量不同位点、不同底物的黄酮氧-甲基转移酶。近年来，随着众多植物基因组与转录组测序的完成，人们已经在多种植物转录组中注释、克隆、鉴定得到了数个新的黄酮氧-甲基转移酶。
然而，仍然有一些潜在的黄酮氧-甲基转移酶未经过克隆与鉴定，本领域有必要去进行进一步研究，以找到更具应用价值的酶。
发明内容
本发明的目的在于提供甲基转移酶及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种利用甲基转移酶进行甲基转移的方法，包括：在甲基转移酶存在下，将甲基转移到黄酮类化合物的选自下组的位点上：C-3位、C-7位、C-3’位、C-4’位，或将甲基转移到异黄酮类化合物的选自下组的位点上：C-7位、C-4’位，从而形成甲基化的黄酮或异黄酮类化合物；其中，所述的甲基转移酶选自：具有SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示氨基酸序列的甲基转移酶。
在本发明的另一方面，提供甲基转移酶的用途，用于将甲基转移到黄酮类化合物的选自下组的位点上：C-3位、C-7位、C-3’位、C-4’位，或将甲基转移到异黄酮类化合物的选自下组的位点上：C-7位、C-4’位，从而形成甲基化的黄酮或异黄酮类化合物；其中，所述的甲基转移酶选自：具有SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示氨基酸序列的甲基转移酶。
在一个优选例中，所述的甲基来自甲基供体；所述的甲基供体包括：S腺苷-L-甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的甲基转移酶选自：具有SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示氨基酸序列的甲基转移酶。
在另一优选例中，所述的甲基转移酶具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，将甲基转移到黄酮类化合物的C-4’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物C-4’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-4’位，或异黄酮类化合物的C-4’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-4’位，或异黄酮类化合物的C-7位或C-4’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-3位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-3位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-4’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-4’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-3’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-7位，或异黄酮类化合物的C-7位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-7位，或异黄酮类化合物的C-7位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-7位，或异黄酮类化合物的C-7位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-3位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到黄酮类化合物的C-3’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到异黄酮类化合物的C-7位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到异黄酮类化合物的C-4’位；
所述的甲基转移酶是具有SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，将甲基转移到异黄酮类化合物的C-7位。
在另一优选例中，所述的甲基转移酶催化以式(I)、(III)、(V)、(VII)、(IX)、(XI)、(XIII)、(XV)、(XVII)为母核的化合物，分别形成以(II)、(IV)、(VI)、(VIII)、(X)、(XII)、(XIV)、(XVI)、(XVIII)为母核的化合物；或
其被用于制备催化制剂，该催化制剂催化以式(I)、(III)、(V)、(VII)、(IX)、(XI)、(XIII)、(XV)、(XVII)为母核的化合物，分别形成以(II)、(IV)、(VI)、(VIII)、(X)、(XII)、(XIV)、(XVI)、(XVIII)为母核的化合物：
(A)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：12、16、90或其保守性变异多肽；R1为H或甲氧基，R2为CH3，R3为H、甲基或糖基；
(B)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：16、46、48、50、86、102或其保守性变异多肽；R1为H或甲氧基，R2为CH3，R3为H、甲基或糖基；
(C)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：46、48、50或其保守性变异多肽；R1为H、OH、OCH3或氧糖基，R2为CH3，R3为H、甲基或糖基，R4为H、OH、OCH3或氧糖基，R5为H、甲基或糖基；
(D)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：12、30或其保守性变异多肽；R1为H、OH、OCH3或氧糖基，R2为CH3，R3为H、OH、OCH3或氧糖基，R4为H、甲基或糖基，R5为H、甲基或糖基；
(E)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：42、62或其保守性变异多肽；R1为CH3，R2为H或OH或OCH3或氧糖基，R3为H、OH、OCH3或氧糖基，R4为H、甲基或糖基，R5为H、甲基或糖基；
(F)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：46、48、50、58或其保守性变异多肽；R1为CH3，R2为H、OH、OCH3或氧糖基，R3为H、OH、OCH3或氧糖基，R4为H、OH、OCH3或氧糖基，R5为H、OH、OCH3或氧糖基，R6为H、甲基或糖基；
(G)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：8、6、12、16、34或其保守性变异多肽；R1为CH3，R2、R4、R5为H、OH、OCH3或氧糖基，R3、R6为H、甲基或糖基；
(H)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：42、62或其保守性变异多肽；R1为CH3，R2、R4、R5为H、OH、OCH3或氧糖基，R3、R6为H、甲基或糖基；
(I)
其中，所述的多肽选自SEQ ID NO：8、6、34或其保守性变异多肽；R1为CH3，R2为H、CH3或糖基，R3为H、CH3或糖基，R4为H、CH3或糖基。
在本发明的另一方面，提供分离的多肽，所述的多肽选自下组：(a)具有SEQ IDNO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102中任一条所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102中任一条所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个(如1～20个；较佳地额1～10个，1～5个或1～3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有甲基转移酶活性的衍生多肽；
(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的衍生多肽；(d)氨基酸序列与SEQ IDNO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102中任一条中所示氨基酸序列的同源性≥85％或≥90％(较佳地≥95％)，并具有甲基转移酶活性的衍生多肽。
在一个优选例中，所述的序列(c)为由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的多肽为SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为选自下组的序列：(A)编码签名所述多肽的核苷酸序列；(B)编码如SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示多肽的核苷酸序列；
(C)如SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示的核苷酸序列；(D)与SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示序列的同源性≥85％或≥90％(较佳地≥95％)的核苷酸序列；(E)在SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；或(F)与(A)-(E)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。
在一个优选例中，所述的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102所示。
在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸。
在一个优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的载体，或含有所述的多核苷酸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1为GMOMT系列基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。(A)图中:泳道M为Marker，条带大小从上往下依次为2000bp、1000bp、750bp和500bp，泳道1为GMOMT1样品，泳道2、3分别为GMOMT2-1、GMOMT2-2样品，泳道4为GMOMT3样品，泳道5为GMOMT5样品，泳道6-9分别为GMOMT7-1、GMOMT7-2、GMOMT7-3和GMOMT7-4样品，泳道10为GMOMT8样品，泳道11为GMOMT9样品；(B)图中：泳道M为Marker，条带大小从上往下依次为2000bp、1000bp、750bp和500bp，泳道1为GMOMT10样品，泳道2为GMOMT11样品，泳道4-6分别为GMOMT17-1、GMOMT17-2和GMOMT17-3样品，泳道7为GMOMT19样品，泳道8为GMOMT20样品，泳道9为GMOMT21样品；(C)图中：泳道M为Marker，条带大小从上往下依次为2000bp、1000bp、750bp和500bp，泳道3为GMOMT24样品，泳道4为GMOMT25样品，泳道5、6分别为GMOMT26-1和GMOMT26-2样品，泳道7-10分别为GMOMT27-1、GMOMT27-2、GMOMT27-3和GMOMT27-4样品，泳道11为GMOMT29样品，泳道12为GMOMT30样品，泳道13为GMOMT31样品，泳道14为GMOMT32样品。上述样品条带大小均与目标一致。
图2显示GMOMT系列甲基转移酶催化大豆苷元的产物HPLC检测。第2行样品：GMOMT32粗酶液催化大豆苷元；第3行样品：GMOMT27-4粗酶液催化大豆苷元；第4行样品：GMOMT5粗酶液催化大豆苷元；第5行样品：GMOMT17-3粗酶液催化大豆苷元；第6行样品：GMOMT17-1粗酶液催化大豆苷元；第7行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化大豆苷元，即大豆苷元标准品。图中大豆苷元保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2。
图3显示GMOMT系列甲基转移酶催化大豆苷元的产物HPLC检测。第1行样品：GMOMT3粗酶液催化大豆苷元；第2行样品：GMOMT5粗酶液催化大豆苷元；第3行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化大豆苷元，即大豆苷元标准品。图中大豆苷元保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2。
图4显示GMOMT系列甲基转移酶催化黄豆黄素的产物HPLC检测。第1行样品：第2行样品：GMOMT5粗酶液催化黄豆黄素；第3行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化黄豆黄素，即黄豆黄素标准品。图中黄豆黄素保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2。
图5显示GMOMT系列甲基转移酶催化黄豆黄素的产物HPLC检测。第1行样品：GMOMT3粗酶液催化黄豆黄素；第2行样品：GMOMT29粗酶液催化黄豆黄素；第3行样品：GMOMT5粗酶液催化黄豆黄素；第4行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化黄豆黄素，即黄豆黄素标准品。图中黄豆黄素保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2。
图6显示GMOMT系列甲基转移酶催化柚皮素的产物HPLC检测。第1行样品：樱花亭标准品；第2行样品：GMOMT17-1粗酶液催化柚皮素；第3行样品：GMOMT17-2粗酶液催化柚皮素；第4行样品：GMOMT17-3粗酶液催化柚皮素；第5行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化柚皮素，即柚皮素标准品。图中柚皮素保留时间为峰1，甲基化产物樱花亭保留时间为峰2。
图7显示GMOMT系列甲基转移酶催化柚皮素的产物HPLC检测。第1行样品：GMOMT8粗酶液催化柚皮素；第2行样品：GMOMT3粗酶液催化柚皮素；第3行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化柚皮素，即柚皮素标准品。图中柚皮素保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2。
图8显示GMOMT系列甲基转移酶催化圣草酚的产物HPLC检测。第1行样品：7-甲氧基圣草酚标准品；第2行样品：GMOMT17-1粗酶液催化圣草酚；第3行样品：GMOMT17-2粗酶液催化圣草酚；第4行样品：GMOMT17-3粗酶液催化圣草酚；第5行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化圣草酚，即圣草酚标准品。图中圣草酚保留时间为峰1，甲基化产物7-甲氧基圣草酚保留时间为峰2。
图9显示GMOMT系列甲基转移酶催化圣草酚的产物HPLC检测。第1行样品：橙皮素标准品；第2行样品：GMOMT8粗酶液催化圣草酚；第3行样品：GMOMT3粗酶液催化圣草酚；第4行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化圣草酚，即圣草酚标准品。图中圣草酚保留时间为峰1，甲基化产物橙皮素保留时间为峰2。
图10显示GMOMT系列甲基转移酶催化圣草酚的产物HPLC检测。第1行样品：高圣草酚标准品；第2行样品：GMOMT11粗酶液催化圣草酚；第3行样品：GMOMT21粗酶液催化圣草酚；第4行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化圣草酚，即圣草酚标准品。图中圣草酚保留时间为峰1，甲基化产物高圣草酚保留时间为峰2。
图11显示GMOMT系列甲基转移酶催化木犀草素的产物HPLC检测。第1行样品：羟基芫花素标准品；第2行样品：GMOMT17-1粗酶液催化木犀草素；第3行样品：GMOMT17-2粗酶液催化木犀草素；第4行样品：GMOMT17-3粗酶液催化木犀草素；第5行样品：GMOMT20粗酶液催化木犀草素；第6行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化木犀草素，即木犀草素标准品。图中木犀草素保留时间为峰1，甲基化产物羟基芫花素保留时间为峰2。
图12显示GMOMT系列甲基转移酶催化木犀草素的产物HPLC检测。第1行样品：金圣草黄素标准品；第2行样品：GMOMT11粗酶液催化木犀草素；第3行样品：GMOMT21粗酶液催化木犀草素；第5行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化木犀草素，即木犀草素标准品。图中木犀草素保留时间为峰1，甲基化产物金圣草黄素保留时间为峰2。
图13显示GMOMT系列甲基转移酶催化木犀草素的产物HPLC检测。第1行样品：香叶木素标准品；第2行样品：GMOMT2-1粗酶液催化木犀草素；第3行样品：GMOMT9粗酶液催化木犀草素；第4行样品：GMOMT5粗酶液催化木犀草素；第5行样品：GMOMT2-2粗酶液催化木犀草素；第6行样品：GMOMT3粗酶液催化木犀草素；第7行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化木犀草素，即木犀草素标准品。图中木犀草素保留时间为峰1，甲基化产物香叶木素保留时间为峰2。
图14显示GMOMT系列甲基转移酶催化山奈酚的产物HPLC检测。第1行样品：鼠李柠檬素标准品；第2行样品：GMOMT17-1粗酶液催化山奈酚；第3行样品：GMOMT17-2粗酶液催化山奈酚；第4行样品：GMOMT17-3粗酶液催化山奈酚；第5行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化山奈酚，即山奈酚标准品。图中山奈酚保留时间为峰1，甲基化产物鼠李柠檬素保留时间为峰2。
图15显示GMOMT系列甲基转移酶催化山奈酚的产物HPLC检测。第1行样品：山奈素标准品；第2行样品：GMOMT2-2粗酶液催化山奈酚；第3行样品：GMOMT9粗酶液催化山奈酚；第4行样品：GMOMT2-1粗酶液催化山奈酚；第5行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化山奈酚，即山奈酚标准品。图中山奈酚保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2。
图16显示GMOMT20催化山奈酚的产物HPLC检测。第1行样品：GMOMT20粗酶液催化山奈酚；第2行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化山奈酚，即山奈酚标准品。图中山奈酚保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2，推测为山奈酚-3-甲基化产物。
图17显示GMOMT系列甲基转移酶催化槲皮素的产物HPLC检测。第1行样品：鼠李素标准品；第2行样品：GMOMT17-1粗酶液催化槲皮素；第3行样品：GMOMT17-2粗酶液催化槲皮素；第4行样品：GMOMT17-3粗酶液催化槲皮素；第5行样品：GMOMT2-2粗酶液催化槲皮素；第6行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化槲皮素，即槲皮素标准品。图中槲皮素保留时间为峰1，甲基化产物鼠李素保留时间为峰2。
图18显示GMOMT系列甲基转移酶催化槲皮素的产物HPLC检测。第1行样品：异鼠李素标准品；第2行样品：GMOMT11粗酶液催化槲皮素；第3行样品：GMOMT21粗酶液催化槲皮素；第4行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化槲皮素，即槲皮素标准品。图中槲皮素保留时间为峰1，甲基化产物异鼠李素保留时间为峰2。
图19显示GMOMT系列甲基转移酶催化槲皮素的产物HPLC检测。第1行样品：GMOMT20粗酶液催化槲皮素；第2行样品：GMOMT7-1粗酶液催化槲皮素；第3行样品：GMOMT7-2粗酶液催化槲皮素；第4行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化槲皮素，即槲皮素标准品。图中槲皮素保留时间为峰1，甲基化产物保留时间为峰2，推测为槲皮素-3-甲基化产物。
图20显示GMOMT系列甲基转移酶催化8-异戊烯基山奈酚的产物HPLC检测。第1行样品：淫羊藿素标准品；第2行样品：GMOMT2-1粗酶液催化8-异戊烯基山奈酚；第3行样品：GMOMT2-2粗酶液催化8-异戊烯基山奈酚；第4行样品：GMOMT9粗酶液催化8-异戊烯基山奈酚；第5行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化8-异戊烯基山奈酚，即8-异戊烯基山奈酚标准品。图中8-异戊烯基山奈酚保留时间为峰1，甲基化产物淫羊藿素保留时间为峰2。
图21显示其他已报道的黄酮4’甲基转移酶催化8-异戊烯基山奈酚的产物HPLC检测。第1行样品：淫羊藿素标准品；第2行样品：SOMT2粗酶液催化8-异戊烯基山奈酚；第3行样品：ShMOMT2粗酶液催化8-异戊烯基山奈酚；第4行样品：负对照，空载体重组大肠杆菌裂解液催化8-异戊烯基山奈酚，即8-异戊烯基山奈酚标准品；第5行样品：正对照，GMOMT2-2粗酶液催化8-异戊烯基山奈酚。图中8-异戊烯基山奈酚保留时间为峰1，甲基化产物淫羊藿素保留时间为峰2。
图22显示了图2中甲基化产物峰2的LC/MS检测(A)和1H核磁检测(B)数据。经分析可知，图2中甲基化产物为异芒柄花素。
图23显示了图4中甲基化产物峰2的LC/MS检测(A)和1H核磁检测(B)数据。经分析可知，图4中甲基化产物为7-氧甲基黄豆黄素。
图24显示了图7中甲基化产物峰2的1H核磁检测数据。经分析可知，图7中甲基化产物为异樱花亭。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，分离和鉴定获得一组甲基转移酶。在提供甲基供体的情况下，其能将甲基转移到黄酮类或异黄酮类化合物上(较佳地OH基团上)，使之增加一个甲基(较佳地形成氧-甲基)。具体地，本发明的甲基转移酶能特异和高效地催化黄酮类化合物底物的C-3位、C-7位、C-3’位、C-4’位的羟基甲基化，或异黄酮类化合物底物的C-7位、C-4’位的羟基甲基化。所述的甲基转移酶可应用于黄酮类或异黄酮类化合物的合成、改造领域。
所述的甲基转移酶包括：GMOMT1(SEQ ID NO:2)、GMOMT2-1(SEQ ID NO:6)、GMOMT2-2(SEQ ID NO:8)、GMOMT3(SEQ ID NO:12)、GMOMT5(SEQ ID NO:16)、GMOMT7-1(SEQID NO:20)、GMOMT7-2(SEQ ID NO:22)、GMOMT7-3(SEQ ID NO:24)、GMOMT7-4(SEQ ID NO:26)、GMOMT8(SEQ ID NO:30)、GMOMT9(SEQ ID NO:34)、GMOMT10(SEQ ID NO:38)、GMOMT11(SEQ ID NO:42)、GMOMT17-1(SEQ ID NO:46)、GMOMT17-2(SEQ ID NO:48)、GMOMT17-3(SEQID NO:50)、GMOMT19(SEQ ID NO:54)、GMOMT20(SEQ ID NO:58)、GMOMT21(SEQ ID NO:62)、GMOMT24(SEQ ID NO:66)、GMOMT25(SEQ ID NO:70)、GMOMT26-1(SEQ ID NO:74)、GMOMT26-2(SEQ ID NO:76)、GMOMT27-1(SEQ ID NO:80)、GMOMT27-2(SEQ ID NO:82)、GMOMT27-3(SEQID NO:84)、GMOMT27-4(SEQ ID NO:86)、GMOMT29(SEQ ID NO:90)、GMOMT30(SEQ ID NO:94)、GMOMT31(SEQ ID NO:98)、GMOMT32(SEQ ID NO:102)。
本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述多肽的保守性变异多肽，包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明还包括具有与所示多肽具有相同功能的序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:5、7、11、15、19、21、23、25、29、33、37、41、45、47、49、53、57、61、65、69、73、75、79、81、83、85、89、93、97、101所示的核苷酸序列所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:8、6、12、16、20、22、30、34、42、46、48、50、58、62、86、90、102的蛋白质，但与SEQ ID NO:5、7、11、15、19、21、23、25、29、33、37、41、45、47、49、53、57、61、65、69、73、75、79、81、83、85、89、93、97、101所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。作为本发明的优选方式，所述原核宿主细胞包括(但不限于)大肠杆菌、枯草杆菌；较佳地，所述真核宿主细胞包括(但不限于)真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括(但不限于)酵母细胞和灵芝细胞；更佳地，所述的酵母包括但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。
应用
本发明的甲基转移酶，可应用于黄酮类/异黄酮类化合物甲基化催化及新黄酮类合成。具体地，将甲基转移到黄酮类化合物的选自下组的位点上：C-3位、C-7位、C-3’位、C-4’位，或将甲基转移到异黄酮类化合物的选自下组的位点上：C-7位、C-4’位，从而形成甲基化的黄酮或异黄酮类化合物。
在本发明的优选实施方式中，所述分离的多肽用于催化下述一种或多种反应或被用于制备催化下述一种或多种反应的催化制剂：
(A)
其中，R1为H或甲氧基，R2为CH3，R3为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：12、16、90或其保守性变异多肽；
当R3为H时，R1、R2经取代后的化合物如下表所示：
底物 R1 R2 产物
大豆苷元 -H -CH3 芒柄花素
黄豆黄素 -OCH3 -CH3 4’-O-甲基黄豆黄素
即当R1为H时，所述的式(I)化合物为大豆苷元；R1为-OCH3时，所述的式(I)化合物为黄豆黄素。
(B)
其中，R1为H或甲氧基，R2为CH3，R3为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：16、46、48、50、86、102或其保守性变异多肽；
当R3为H时，R1、R2经取代后的化合物如下表所示：
即当R1为H时，所述的式(III)化合物为大豆苷元；R1为-OCH3时，所述的式(III)化合物为黄豆黄素。
(C)
其中，R1为H或OH或OCH3或氧糖基，R2为CH3，R3为H或甲基或糖基，R4为H或OH或OCH3或氧糖基，R5为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：46、48、50或其保守性变异多肽；
当R3、R4、R5为H时，R1、R2经取代后的化合物如下表所示：
底物 R1 R2 产物
柚皮素 -H -CH3 樱花亭
圣草酚 -OH -CH3 7-O-甲基圣草酚
即当R1为H时，所述的式(V)化合物为柚皮素；R1为-OH时，所述的式(V)化合物为圣草酚。
(D)
其中，R1为H或OH或OCH3或氧糖基，R2为CH3，R3为H或OH或OCH3或氧糖基，R4为H或甲基或糖基，R5为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：12、30或其保守性变异多肽；
当R3、R4、R5为H时，R1、R2经取代后的化合物如下表所示：
底物 R1 R2 产物
柚皮素 -H -CH3 异樱花亭
圣草酚 -OH -CH3 橙皮素
即当R1为H时，所述的式(VII)化合物为柚皮素；R1为-OH时，所述的式(VII)化合物为圣草酚。
(E)
其中，R1为CH3，R2为H或OH或OCH3或氧糖基，R3为H或OH或OCH3或氧糖基，R4为H或甲基或糖基，R5为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：42、62或其保守性变异多肽；
当R2为OH，R3、R4、R5为H时，底物式(IX)化合物为圣草酚；产物式(X)化合物高圣草酚。
(F)
其中，R1为CH3，R2为H或OH或OCH3或氧糖基，R3为H或OH或OCH3或氧糖基，R4为H或OH或OCH3或氧糖基，R5为H或OH或OCH3或氧糖基，R6为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQID NO：46、48、50、58或其保守性变异多肽；
当R3为OH，R4、R6为H时，R1、R2、R5经取代后的化合物如下表所示：
底物 R1 R2 R5 产物
木犀草素 -CH3 -OH -H 羟基芫花素
山奈酚 -CH3 -H -OH 鼠李柠檬素
槲皮素 -CH3 -OH -OH 鼠李素
即当R1为CH3，R2为OH，R5为H时，所述的式(XI)化合物为木犀草素；
R1为CH3，R2为H，R5为OH时，所述的式(XI)化合物为山奈酚；
R1为CH3，R2为OH，R5为OH时，所述的式(XI)化合物为槲皮素。
(G)
其中，R1为CH3，R2、R4、R5为H或OH或OCH3或氧糖基，R3、R6为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：8、6、12、16、34或其保守性变异多肽；
当R3、R6为H，R4为H时，R1、R2、R5经取代后的化合物如下表所示：
底物 R1 R2 R5 产物
木犀草素 -CH3 -OH -H 香叶木素
山奈酚 -CH3 -H -OH 山奈素
槲皮素 -CH3 -OH -OH 柳怪黄素
即当R1为CH3，R2为OH，R5为H时，所述的式(XIII)化合物为木犀草素；
时，所述的式(XIII)化合物为山奈酚；
时，所述的式(XIII)化合物为槲皮素。
(H)
其中，R1为CH3，R2、R4、R5为H或OH或OCH3或氧糖基，R3、R6为H或甲基或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：42、62或其保守性变异多肽；
当R2为OH，R3、R4、R6为H时，R1、R5经取代后的化合物如下表所示：
底物 R1 R5 产物
木犀草素 -CH3 -H 金圣草黄素
槲皮素 -CH3 -OH 异鼠李素
即当R1为CH3，R5为H时，所述的式(XV)化合物为木犀草素；
R1为CH3，R5为OH时，所述的式(XV)化合物为槲皮素。
(I)
其中，R1为CH3，R2为H或CH3或糖基，R3为H或CH3或糖基，R4为H或CH3或糖基；所述的多肽选自SEQ ID NO：8、6、34或其保守性变异多肽；
当R2为H，R3为H，R4为H时，底物式(XVII)化合物为8-异戊烯基山奈酚；产物式(XVIII)化合物淫羊藿素。
在应用时，特别是工业化生产中，本发明的多肽或其保守性变异多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、甲基转移酶及其编码基因的分离
本发明人从大豆中共克隆了31条cDNA全长序列。
提取大豆RNA并进行反转录，获得大豆的cDNA。以该cDNA为模板进行PCR扩增，使用其中引物对1(SEQ ID NO:3、4)；引物对2(SEQ ID NO:9、10)；引物对3(SEQ ID NO:13、14)；引物对4(SEQ ID NO:17、18)；引物对5(SEQ ID NO:27、28)；引物对6(SEQ ID NO:31、32)；引物对7(SEQ ID NO:35、36)；引物对8(SEQ ID NO:39、40)；引物对9(SEQ ID NO:43、44)；引物对10(SEQ ID NO:51、52)；引物对11(SEQ ID NO:55、56)；引物对12(SEQ ID NO:59、60)；引物对13(SEQ ID NO:63、64)；引物对15(SEQ ID NO:71、72)；引物对16(SEQ ID NO:75、76)；引物对17(SEQ ID NO:81、82)；引物对18(SEQ ID NO:91、92)；引物对19(SEQ ID NO:95、96)；引物对20(SEQ ID NO:99、100)；引物对21(SEQ ID NO:103、104)；引物对22(SEQ IDNO:107、108)全部获得扩增产物。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的PrimerStar DNA聚合酶。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的DNA片段。将此DNA片段用宝生物工程有限公司的rTaq DNA聚合酶在末端加A后与市售的克隆载体pMD18-T Vector连接，连接产物转化市售的大肠杆菌Top 10感受态细胞，将转化后的大肠杆菌菌液涂布在添加氨苄青霉素50ug/mL、IPTG 0.5mM、X-Gal 25μg/mL的LB平板上，并进一步通过PCR验证重组克隆。分别选取其中一个克隆提取重组质粒后进行测序。用BESTORF软件寻找开放阅读框(ORF)。通过序列比对，ORF编码了甲基转移酶保守功能域，表明是甲基转移酶基因。
用引物对1(SEQ ID NO:3、4)获得的基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，命名为GMOMT1。自SEQ ID NO:1的5’端第1至1092位核苷酸为GMOMT1的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:1的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:1的5’端的第1090至1092位核苷酸为GMOMT1基因的终止密码子TAA。
用引物对2(SEQ ID NO:9、10)获得的基因具有SEQ ID NO:5和7所示的核苷酸序列，分别命名为GMOMT2-1和GMOMT2-2。自SEQ ID NO:5的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT2-1的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:5的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT2-1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:5的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT2-1基因的终止密码子TGA。序列表中SEQ ID NO:7的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT2-2的开放阅读框(ORF)，自SEQID NO:7的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT2-2基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:7的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT2-2基因的终止密码子TGA。
用引物对3(SEQ ID NO:13、14)获得的基因具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，命名为GMOMT3。自SEQ ID NO:11的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT3的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:11的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT3基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:11的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT1基因的终止密码子TAG。
用引物对4(SEQ ID NO:17、18)获得的基因具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，命名为GMOMT5。自SEQ ID NO:15的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT1的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:15的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:15的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT1基因的终止密码子TAG。
用引物对5(SEQ ID NO:27、28)获得的基因具有SEQ ID NO:19、21、23和25所示的核苷酸序列，分别命名为GMOMT7-1、GMOMT7-2、GMOMT7-3和GMOMT7-4。自SEQ ID NO:19的5’端第1至1083位核苷酸为GMOMT7-1的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:19的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT7-1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:19的5’端的第1081至1083位核苷酸为GMOMT7-1基因的终止密码子TAA。自SEQ ID NO:21的5’端第1至1083位核苷酸为GMOMT7-2的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:21的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT7-2基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:21的5’端的第1081至1083位核苷酸为GMOMT7-2基因的终止密码子TAA。自SEQ ID NO:23的5’端第1至1083位核苷酸为GMOMT7-3的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:23的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT7-3基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:23的5’端的第1081至1083位核苷酸为GMOMT7-3基因的终止密码子TAA。自SEQ ID NO:25的5’端第1至1083位核苷酸为GMOMT7-4的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:25的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT7-4基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:25的5’端的第1081至1083位核苷酸为GMOMT7-4基因的终止密码子TAA。
用引物对6(SEQ ID NO:31、32)获得的基因具有SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，命名为GMOMT8。自SEQ ID NO:29的5’端第1至1098位核苷酸为GMOMT8的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:29的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT8基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:29的5’端的第1096至1098位核苷酸为GMOMT8基因的终止密码子TAA。
用引物对7(SEQ ID NO:35、36)获得的基因具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列，命名为GMOMT9。自SEQ ID NO:33的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT9的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:33的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT9基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:33的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT9基因的终止密码子TGA。
用引物对8(SEQ ID NO:39、40)获得的基因具有SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列，命名为GMOMT10。自SEQ ID NO:37的5’端第1至1110位核苷酸为GMOMT10的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:37的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT10基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:37的5’端的第1108至1110位核苷酸为GMOMT10基因的终止密码子TGA。
用引物对9(SEQ ID NO:43、44)获得的基因具有SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列，命名为GMOMT11。自SEQ ID NO:41的5’端第1至1098位核苷酸为GMOMT11的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:41的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT11基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:41的5’端的第1096至1098位核苷酸为GMOMT11基因的终止密码子TAA。
用引物对10(SEQ ID NO:51、52)获得的基因具有SEQ ID NO:45、47和49所示的核苷酸序列，分别命名为GMOMT17-1、GMOMT17-2、GMOMT17-3。自SEQ ID NO:45的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT17-1的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:45的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT17-1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:45的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT17-1基因的终止密码子TAG。自SEQ ID NO:47的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT17-2的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:47的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT17-2基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:47的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT17-2基因的终止密码子TAG。自SEQ ID NO:49的5’端第1至1065位核苷酸为GMOMT17-3的开放阅读框(ORF)，自SEQID NO:49的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT17-3基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:49的5’端的第1063至1065位核苷酸为GMOMT17-3基因的终止密码子TAG。
用引物对11(SEQ ID NO:55、56)获得的基因具有SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列，命名为GMOMT19。自SEQ ID NO:53的5’端第1至1062位核苷酸为GMOMT19的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:53的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT19基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:53的5’端的第1060至1062位核苷酸为GMOMT19基因的终止密码子TAA。
用引物对12(SEQ ID NO:59、60)获得的基因具有SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，命名为GMOMT20。自SEQ ID NO:57的5’端第1至1101位核苷酸为GMOMT20的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:57的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT20基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:57的5’端的第1099至1101位核苷酸为GMOMT20基因的终止密码子TAA。
用引物对13(SEQ ID NO:63、64)获得的基因具有SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列，命名为GMOMT21。自SEQ ID NO:61的5’端第1至1101位核苷酸为GMOMT21的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:61的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT21基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:61的5’端的第1099至1101位核苷酸为GMOMT21基因的终止密码子TAA。
用引物对15(SEQ ID NO:67、68)获得的基因具有SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列，命名为GMOMT24。自SEQ ID NO:65的5’端第1至1068位核苷酸为GMOMT24的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:65的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT24基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:65的5’端的第1096至1068位核苷酸为GMOMT24基因的终止密码子TAG。
用引物对16(SEQ ID NO:71、72)获得的基因具有SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列，命名为GMOMT25。自SEQ ID NO:69的5’端第1至1098位核苷酸为GMOMT25的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:69的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT25基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:69的5’端的第1096至1098位核苷酸为GMOMT25基因的终止密码子TAA。
用引物对17(SEQ ID NO:77、78)获得的基因具有SEQ ID NO:73和75所示的核苷酸序列，分别命名为GMOMT26-1和GMOMT26-2。自SEQ ID NO:73的5’端第1至1077位核苷酸为GMOMT26-1的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:73的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT26-1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:73的5’端的第1075至1077位核苷酸为GMOMT26-1基因的终止密码子TAG。自SEQ ID NO:75的5’端第1至1077位核苷酸为GMOMT26-2的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:75的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT26-2基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:75的5’端的第1075至1077位核苷酸为GMOMT26-2基因的终止密码子TAG。
用引物对18(SEQ ID NO:87、88)获得的基因具有SEQ ID NO:79、81、83和85所示的核苷酸序列，分别命名为GMOMT27-1、GMOMT27-2、GMOMT27-3和GMOMT27-4。自SEQ ID NO:79的5’端第1至1059位核苷酸为GMOMT27-1的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:79的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT27-1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:79的5’端的第1057至1059位核苷酸为GMOMT27-1基因的终止密码子TAA。自SEQ ID NO:81的5’端第1至1059位核苷酸为GMOMT27-2的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:81的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT27-2基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:81的5’端的第1057至1059位核苷酸为GMOMT27-2基因的终止密码子TAA。自SEQ ID NO:83的5’端第1至1059位核苷酸为GMOMT27-3的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:83的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT27-3基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:83的5’端的第1057至1059位核苷酸为GMOMT27-3基因的终止密码子TAA。自SEQ IDNO:85的5’端第1至1059位核苷酸为GMOMT27-4的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:85的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT27-4基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:85的5’端的第1057至1059位核苷酸为GMOMT27-4基因的终止密码子TAA。
用引物对19(SEQ ID NO:91、92)获得的基因具有SEQ ID NO:89所示的核苷酸序列，命名为GMOMT29。自SEQ ID NO:89的5’端第1至1077位核苷酸为GMOMT29的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:89的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT29基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:89的5’端的第1075至1077位核苷酸为GMOMT29基因的终止密码子TAG。
用引物对20(SEQ ID NO:95、96)获得的基因具有SEQ ID NO:93所示的核苷酸序列，命名为GMOMT30。自SEQ ID NO:93的5’端第1至942位核苷酸为GMOMT30的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:93的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT30基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:93的5’端的第940至942位核苷酸为GMOMT30基因的终止密码子TAA。
用引物对21(SEQ ID NO:99、100)获得的基因具有SEQ ID NO:97所示的核苷酸序列，命名为GMOMT31。自SEQ ID NO:97的5’端第1至966位核苷酸为GMOMT31的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:97的5’端的第1-3位核苷酸为GMOMT31基因的起始密码子ATG，自SEQID NO:97的5’端的第964至966位核苷酸为GMOMT31基因的终止密码子TGA。
用引物对22(SEQ ID NO:103、104)获得的基因具有SEQ ID NO:101所示的核苷酸序列，命名为GMOMT32。自SEQ ID NO:101端第1至1068位核苷酸为GMOMT32的开放阅读框(ORF)，自SEQ ID NO:101端的第1-3位核苷酸为GMOMT32基因的起始密码子ATG，自SEQ IDNO:101端的第1066至1068位核苷酸为GMOMT32基因的终止密码子TAA。
甲基转移酶基因GMOMT1编码一个含有363个氨基酸的蛋白质GMOMT1，具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为41kDa，等电点pI为6.32。
甲基转移酶基因GMOMT2-1编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT2-1，具有SEQID NO:6所示的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.55。
甲基转移酶基因GMOMT2-2编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT2-2，具有SEQID NO:8所示的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.57。
甲基转移酶基因GMOMT3编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT3，具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.90。
甲基转移酶基因GMOMT5编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT5，具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为6.13。
甲基转移酶基因GMOMT7-1编码一个含有360个氨基酸的蛋白质GMOMT7-1，具有SEQID NO:20的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为41kDa，等电点pI为5.54。
甲基转移酶基因GMOMT7-2编码一个含有360个氨基酸的蛋白质GMOMT7-2，具有SEQID NO:22的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为41kDa，等电点pI为5.22。
甲基转移酶基因GMOMT7-3编码一个含有360个氨基酸的蛋白质GMOMT7-3，具有SEQID NO:24的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为41kDa，等电点pI为5.23。
甲基转移酶基因GMOMT7-4编码一个含有360个氨基酸的蛋白质GMOMT7-4，具有SEQID NO:26所示的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为41kDa，等电点pI为5.54。
甲基转移酶基因GMOMT8编码一个含有365个氨基酸的蛋白质GMOMT8，具有SEQ IDNO:30的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为41kDa，等电点pI为6.06。
甲基转移酶基因GMOMT9编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT9，具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.56。
甲基转移酶基因GMOMT10编码一个含有369个氨基酸的蛋白质GMOMT10，具有SEQID NO:38的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为42kDa，等电点pI为6.32。
甲基转移酶基因GMOMT11编码一个含有365个氨基酸的蛋白质GMOMT11，具有SEQID NO:42的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.39。
甲基转移酶基因GMOMT17-1编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT17-1，具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.77。
甲基转移酶基因GMOMT17-2编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT17-2，具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.96。
甲基转移酶基因GMOMT17-3编码一个含有354个氨基酸的蛋白质GMOMT17-3，具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.77。
甲基转移酶基因GMOMT19编码一个含有353个氨基酸的蛋白质GMOMT19，具有SEQID NO:54的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为6.08。
甲基转移酶基因GMOMT20编码一个含有366个氨基酸的蛋白质GMOMT20，具有SEQID NO:58的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.18。
甲基转移酶基因GMOMT21编码一个含有366个氨基酸的蛋白质GMOMT21，具有SEQID NO:62的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.96。
甲基转移酶基因GMOMT24编码一个含有355个氨基酸的蛋白质GMOMT24，具有SEQID NO:66的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为41kDa，等电点pI为5.84。
甲基转移酶基因GMOMT25编码一个含有365个氨基酸的蛋白质GMOMT25，具有SEQID NO:70的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为6.08。
甲基转移酶基因GMOMT26-1编码一个含有358个氨基酸的蛋白质GMOMT26-1，具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为6.39。
甲基转移酶基因GMOMT26-2编码一个含有358个氨基酸的蛋白质GMOMT26-2，具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为6.39。
甲基转移酶基因GMOMT27-1编码一个含有352个氨基酸的蛋白质GMOMT27-1，具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.00。
甲基转移酶基因GMOMT27-2编码一个含有352个氨基酸的蛋白质GMOMT27-2，具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.11。
甲基转移酶基因GMOMT27-3编码一个含有352个氨基酸的蛋白质GMOMT27-3，具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.24。
甲基转移酶基因GMOMT27-4编码一个含有352个氨基酸的蛋白质GMOMT27-4，具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.11。
甲基转移酶基因GMOMT29编码一个含有358个氨基酸的蛋白质GMOMT29，具有SEQID NO:90的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为6.45。
甲基转移酶基因GMOMT30编码一个含有313个氨基酸的蛋白质GMOMT30，具有SEQID NO:94的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为36kDa，等电点pI为5.99。
甲基转移酶基因GMOMT31编码一个含有321个氨基酸的蛋白质GMOMT31，具有SEQID NO:98的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为36kDa，等电点pI为5.03。
甲基转移酶基因GMOMT32编码一个含有355个氨基酸的蛋白质GMOMT32，具有SEQID NO:102的氨基酸序列。用软件预测该蛋白质的理论分子量大小为40kDa，等电点pI为5.47。
将上述获得的31条cDNA全长序列分别插入到pMD18T中，获得重组质粒。
实施例2、甲基转移酶基因GMOMT3的大肠杆菌重组表达载体的构建
以实施例1构建的含有GMOMT3基因的质粒GMOMT3-pMD18T为模板扩增目标基因。
GMOMT3所用正向引物为GMOMT3基因的1-20位核苷酸序列，其5’端再添加pGEX4T-1同源臂序列：GATCTGGTTCCGCGTGGATCC；GMOMT3所用反向引物为GMOMT3基因的末尾20位核苷酸序列，其5’端添加pGEX4T-1同源臂序列：GTCACGATGCGGCCGCTCGAG。
利用上述引物和模板通过PCR方法扩增GMOMT3基因。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的Primer Star DNA聚合酶，参考其说明书设定PCR程序：98℃2min；98℃15s，58℃15s，72℃1.2min，共35个循环；72℃5min；10℃保温。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下，切下与目标DNA大小一致的条带。然后采用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExtraction Kit从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。用Takara公司的QuickCut限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切pGEX4T-1大肠杆菌表达质粒30min，用AXYGEN公司的AxyPrep PCRCleanup Kit对酶切产物进行清洁回收。利用Vazyme公司的CE重组酶将回收片段与酶切质粒进行重组连接(条件参考说明书)。连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，并涂布于添加50μg/mL卡那霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证表达质粒GMOMT3-pGEX4T-1构建成功。
实施例3、甲基转移酶基因GMOMT3在大肠杆菌中的表达
以实施例2构建的大肠杆菌表达载体GMOMT3-pGEX4T-1，转化到市售的E.coliBL21中。接种一个重组子到LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为200μM的IPTG，18℃110rpm诱导表达18h。4℃离心收集菌体，用50mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液裂解细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行SDS-PAGE电泳。与pGEX4T-1空载体的重组子相比，GMOMT3-pGEX4T-1重组子有明显的条带(大约65KD)表征GST-GMOMT3。从Western Blot的结果看，也证明目标蛋白GST-GMOMT3在宿主中实现了可溶表达。
实施例4、大肠杆菌表达产物GMOMT3转甲基反应和产物的鉴定
以表达GMOMT3的重组大肠杆菌裂解上清为粗酶液来催化黄酮类化合物的转甲基反应，表达空载体的重组大肠杆菌裂解上清为对照。200μL反应体系如表1所示。反应在30℃下进行3h，然后加入200μL乙酸乙酯终止反应，并抽提产物。产物真空干燥后，用50ul甲醇溶解。
表1
50mM Tris-HCl，pH8.0 98.8μL
100mM SAM(作为甲基供体) 1μL
100mM底物(乙醇：DMSO＝1:1溶解) 0.2μL
酶液 100ul
GMOMT3反应产物用高效液相色谱(HPLC)进行检测，结果发现其粗酶液可将大豆苷元转化为芒丙花素(图3)、将黄豆黄素转化为4’-氧甲基黄豆黄素(图5)、将柚皮素转化为异樱花亭(图7)、将圣草酚转化为橙皮素(图9)、将木犀草素转化为香叶木素(图13)，GMOMT3为黄酮类和异黄酮类的4’位甲基转移酶(表2)。
表2
注：50％<转化率：+++，10％<转化率<50％：++，转化率<10％：+；部分转化率低于10％的未在实施例中列出。
实施例5、甲基转移酶基因GMOMT2-1和GMOMT2-2在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT2-1和GMOMT2-2基因的质粒GMOMT2-1-pMD18T和GMOMT2-2-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。采用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT2-1和GMOMT2-2的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT2-2和GMOMT2-1可以将黄酮的4’位羟基甲基化。其粗酶液可以催化8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素(图20)，催化木犀草素转化为香叶木素(图13)，催化山奈酚转化为山奈素(图15)、将槲皮素转化为鼠李素(图17)。其中催化8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素，催化木犀草素转化为香叶木素的酶催化反应均未报道，其中GMOMT2-2和GMOMT2-1催化8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素的效率超过90％。本发明人利用目前文献已报道的黄酮4’位甲基转移酶SOMT2(Accession number：C6TAY1.1)和ShMOMT2(Accession number：ADZ76434.1)对8-异戊烯基山奈酚进行催化实验，结果表明SOMT2和ShMOMT2无法催化8-异戊烯基山奈酚(图21)，8位异戊烯基的存在可能干扰了这些4’位甲基转移酶的活性，但是8位异戊烯基的存在会促进GMOMT2-2和GMOMT2-1的4’位甲基转移酶活性。
实施例6、甲基转移酶基因GMOMT5在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT5基因的质粒GMOMT5-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT5的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT5可以将黄酮的4’位羟基甲基化，也可以将异黄酮的7位和4’位羟基甲基化。其粗酶液可将大豆苷元转化为芒丙花素(图3)和异芒丙花素(图2)、将黄豆黄素转化为4’-氧甲基黄豆黄素(图5)和7-氧甲基黄豆黄素(图4)、将木犀草素转化为香叶木素(图13)。其中催化木犀草素转化为香叶木素的酶催化反应未有报道。
实施例7、甲基转移酶基因GMOMT7-1、GMOMT7-2在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT7-1、GMOMT7-2基因的质粒GMOMT7-1-pMD18T、GMOMT7-2-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT7-1、GMOMT7-2的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT7-1和GMOMT7-2可以将黄酮的3位羟基甲基化。其粗酶液可将槲皮素转化为新产物(图19)，推测为3-O-甲基槲皮素。
实施例8、甲基转移酶基因GMOMT8在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT8基因的质粒GMOMT8-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT8的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT8可以将二氢黄酮的4’位羟基甲基化，且专一性好、催化活性高。其粗酶液可将柚皮素转化为异樱花亭(图7)、圣草酚转化为橙皮素(图9)，转化效率达到90％以上，在相同条件下，用已报道的4’位甲基转移酶SOMT2(Accession number：C6TAY1.1)催化异樱花亭和圣草酚，转化效率只有30％。
实施例9、甲基转移酶基因GMOMT9在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT9基因的质粒GMOMT9-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT9的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT9可以将黄酮的4’位羟基甲基化。其粗酶液可以催化8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素(图20)，催化木犀草素转化为香叶木素(图13)，催化山奈酚转化为山奈素(图15)。其中催化8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素、催化木犀草素转化为香叶木素的酶催化反应均未报道。催化8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素的效率超过20％。本发明人利用目前文献已报道的黄酮4’位甲基转移酶SOMT2(Accession number：C6TAY1.1)和ShMOMT2(Accession number：ADZ76434.1)对8-异戊烯基山奈酚进行催化实验，结果表明SOMT2和ShMOMT2无法催化8-异戊烯基山奈酚(图21)，8位异戊烯基的存在可能干扰了这些4’位甲基转移酶的活性，但是8位异戊烯基对GMOMT9的4’位甲基转移酶活性影响较小。
实施例10、甲基转移酶基因GMOMT11在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT11基因的质粒GMOMT11-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT11的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT11可以将黄酮的3’位羟基甲基化，且专一性好、催化活性高。其粗酶液可以将圣草酚转化为高圣草酚(图10)、木犀草素转化为金圣草黄素(图12)、将槲皮素转化为异鼠李素(图18)，其转化效率都在90％左右。而已报道的黄酮类3’位甲基转移酶，如ROMT-9(Accession number：ABB90678)对槲皮素、圣草酚和木犀草素的转化率仅有60％-70％。
实施例11、甲基转移酶基因GMOMT17-1、GMOMT17-2和GMOMT17-3在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT17-1、GMOMT17-2和GMOMT17-3基因的质粒GMOMT17-1-pMD18T、GMOMT17-2-pMD18T和GMOMT17-3-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT17-1、GMOMT17-2和GMOMT17-3的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT17-1、GMOMT17-2和GMOMT17-3可以将黄酮的7位羟基甲基化，也可以将异黄酮的7位羟基甲基化，且专一性好、催化活性高。其粗酶液可以将大豆苷元转化为异芒柄花素(图2)、将柚皮素转化为樱花亭(图6)、将圣草酚转化为7-氧甲基圣草酚(图8)、将木犀草素转化为羟基芫花素(图11)、将山奈酚转化为鼠李柠檬素(图14)、将槲皮素转化为鼠李素(图17)。
实施例12、甲基转移酶基因GMOMT20在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT20基因的质粒GMOMT20-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT20的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT20反应产物用高效液相色谱(HPLC)进行检测，结果发现，GMOMT20的蛋白表达产物可以将木犀草素转化为羟基芫花素(图11)。GMOMT20为黄酮类化合物的7位甲基转移酶。
GMOMT20可以将黄酮的7位羟基甲基化，也可以将黄酮的3位羟基甲基化。其粗酶液可以将木犀草素转化为羟基芫花素(图11)、将槲皮素转化为一种新产物(图19)，推测为3-O-甲基槲皮素。
实施例13、甲基转移酶基因GMOMT21在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT21基因的质粒GMOMT21-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT21的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT21可以将黄酮的3’位羟基甲基化，且专一性好、催化活性高。其粗酶液可以将圣草酚转化为高圣草酚(图10)、木犀草素转化为金圣草黄素(图12)、将槲皮素转化为异鼠李素(图18)，其转化效率都在90％左右。而已报道的黄酮类3’位甲基转移酶，如ROMT-9(Accession number：ABB90678)对槲皮素、圣草酚和木犀草素的转化率仅有60％-70％。
实施例14、甲基转移酶基因GMOMT27-4在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT27-4基因的质粒GMOMT27-4-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT27-4的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT27-4可以将异黄酮的7位羟基甲基化。其粗酶液可以将大豆苷元转化为异芒柄花素(图2)。
实施例15、甲基转移酶基因GMOMT29在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT29基因的质粒GMOMT29-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT29的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT29可以将异黄酮的4’位羟基甲基化。其粗酶液可以将黄豆黄素转化为4’-氧甲基黄豆黄素(图5)。
实施例16、甲基转移酶基因GMOMT32在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT32基因的质粒GMOMT32-pMD18T为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT32的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT32可以将异黄酮的7位羟基甲基化。其粗酶液可以将大豆苷元转化为异芒柄花素(图2)。
实施例17、其他甲基转移酶基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的转甲基反应
以实施例1构建的含有GMOMT1、GMOMT7-3、GMOMT7-4、GMOMT10、GMOMT19、GMOMT24、GMOMT25、GMOMT26-1、GMOMT26-2、GMOMT27-1、GMOMT27-2、GMOMT27-3、GMOMT30、GMOMT31基因的质粒GMOMT1-pMD18T、GMOMT7-3-pMD18T、GMOMT7-4-pMD18T、GMOMT10-pMD18T、GMOMT19-pMD18T、GMOMT24-pMD18T、GMOMT25-pMD18T、GMOMT26-1-pMD18T、GMOMT26-2-pMD18T、GMOMT27-1-pMD18T、GMOMT27-2-pMD18T、GMOMT27-3-pMD18T、GMOMT30-pMD18T、GMOMT31-pMD18T、为模板，用与实施例2同样的方法，构建了它们的大肠杆菌重组表达载体。按照实施例3相同的步骤诱导甲基转移酶的表达，并进行相应的检测。用与实施例4同样的方法，利用表达GMOMT1、GMOMT7-3、GMOMT7-4、GMOMT10、GMOMT19、GMOMT24、GMOMT25、GMOMT26-1、GMOMT26-2、GMOMT27-1、GMOMT27-2、GMOMT27-3、GMOMT30、GMOMT31的重组大肠杆菌细胞裂解液催化黄酮类化合物。
GMOMT1、GMOMT7-3、GMOMT7-4、GMOMT10、GMOMT19、GMOMT24、GMOMT25、GMOMT26-1、GMOMT26-2、GMOMT27-1、GMOMT27-2、GMOMT27-3、GMOMT30、GMOMT31反应产物用高效液相色谱(HPLC)进行检测，结果发现，它们的蛋白表达产物无法转化黄酮类化合物大豆苷元、黄豆黄素、柚皮素、圣草酚、木犀草素、山奈酚、槲皮素和异戊烯基化黄酮。
上述结果表明，尽管GMOMT1、GMOMT7-3、GMOMT7-4、GMOMT10、GMOMT19、GMOMT24、GMOMT25、GMOMT26-1、GMOMT26-2、GMOMT27-1、GMOMT27-2、GMOMT27-3、GMOMT30、GMOMT31也是本发明人初期预测的大豆氧甲基转移酶，但是它们对上述的底物都没有转甲基作用，说明仅依据蛋白序列很难直接预测OMT活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 甲基转移酶及其应用
<130> 183697
<160> 104
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1092
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 1
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gggcaagttg aaatatggag gtacatgaca tgcttcacgg actccgtggc cttgaaatcc 120
gtcatagagc tgcgcatagc cgacataata gaccgttatg ggaaaccact atccttgtca 180
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tatgatggaa tcacccatgt tggaggtgac atgttcgtgt ccattccaga tgctgatgct 780
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aactgcagga aggcaatacc agagaaaaca gggaaagtga tcatcgttga tcacgtgctg 900
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<210> 2
<211> 363
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 2
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Thr Asp Ser Val Ala Leu Lys Ser Val Ile Glu Leu Arg Ile Ala Asp
35 40 45
Ile Ile Asp Arg Tyr Gly Lys Pro Leu Ser Leu Ser Gln Ile Val Glu
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Asn Ile Asp Asp Ala Pro Ser Pro Asp Ala Ser Leu Leu Gln Arg Val
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Gly Met Val Cys Thr Ala Arg Val Val Ser Lys Ala Val Ile Thr Gly
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Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ser Glu Ile Val Arg Ala Tyr Pro His Ile
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Asn Ala Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val Val Ala Thr Ala Pro Lys
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Tyr Asp Gly Ile Thr His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser Ile Pro
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Asp Ala Asp Ala Ile Tyr Met Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Ser Asp
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Asn Glu Leu Phe Thr Asp Val Gly Ile Ala Phe Asp Met Met Leu Leu
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
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<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
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<213> 大豆(Glycine max)
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atggcttcaa ataatggccg aaaagcaagt gagatctttc aaggccaagc tctcatatac 60
agacacatgt ttgccttcat agattctatg tgcctcaaaa cgattattga gcttggaata 120
ccagacataa tccacaagca cggccaaccc attactcttt ctgagttggt gtcaattcta 180
catgttccac cagctagagt aggtcacgtt cagagcctca tgcactacct gtcacaccat 240
agattctttg aaagtgtaag aatccatgaa aaagaagcat atgctctcac tgctgcttca 300
gagctacttg taaaaagcag tgaactttct ttagctccaa tggttaagta catccttgat 360
ccaactctat cagcttcatt ccatcaaatg aaaaagtggg tttatgagga agatctctca 420
gtatttgata tctccttagg gtgtagttta tgggattttc ttaacaaaaa ccctgcatac 480
aacgagtcat tcaatgaggc aatggctaga gattctcaaa tgagtaattt ggcattgaga 540
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gataaagact gcataaagat attagagaat tgtaaagaag ctatttcttc aaataatggc 840
aaaagaggaa aaataatcgt catagatatg gtgatacaag aaaagcaaga tgagcataaa 900
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agaaatgaag aagaatggaa gaaactcttc atggaagcag ggttccaaga ctacaaaata 1020
tctcccttga ccgggtttct gtctcttatt gagatctatc cttag 1065
<210> 12
<211> 354
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 12
Met Ala Ser Asn Asn Gly Arg Lys Ala Ser Glu Ile Phe Gln Gly Gln
1 5 10 15
Ala Leu Ile Tyr Arg His Met Phe Ala Phe Ile Asp Ser Met Cys Leu
20 25 30
Lys Thr Ile Ile Glu Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His Lys His Gly
35 40 45
Gln Pro Ile Thr Leu Ser Glu Leu Val Ser Ile Leu His Val Pro Pro
50 55 60
Ala Arg Val Gly His Val Gln Ser Leu Met His Tyr Leu Ser His His
65 70 75 80
Arg Phe Phe Glu Ser Val Arg Ile His Glu Lys Glu Ala Tyr Ala Leu
85 90 95
Thr Ala Ala Ser Glu Leu Leu Val Lys Ser Ser Glu Leu Ser Leu Ala
100 105 110
Pro Met Val Lys Tyr Ile Leu Asp Pro Thr Leu Ser Ala Ser Phe His
115 120 125
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Asn Glu Ser Phe Asn Glu Ala Met Ala Arg Asp Ser Gln Met Ser Asn
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Leu Ala Leu Arg Asp Cys Lys Leu Val Phe Glu Gly Leu Glu Ser Ile
180 185 190
Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Arg Met Ile Ser Glu
195 200 205
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210 215 220
Glu Asn Leu Ser Glu Ser Asn Asn Leu Thr Tyr Val Gly Gly Asp Met
225 230 235 240
Phe Lys Ser Ile Pro Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp Ile Leu
245 250 255
His Asp Trp Thr Asp Lys Asp Cys Ile Lys Ile Leu Glu Asn Cys Lys
260 265 270
Glu Ala Ile Ser Ser Asn Asn Gly Lys Arg Gly Lys Ile Ile Val Ile
275 280 285
Asp Met Val Ile Gln Glu Lys Gln Asp Glu His Lys Val Thr Glu Leu
290 295 300
Lys Leu Leu Trp Asp Val Ala Met Ala Cys Val Leu Asn Gly Lys Glu
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Arg Asn Glu Glu Glu Trp Lys Lys Leu Phe Met Glu Ala Gly Phe Gln
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Asp Tyr Lys Ile Ser Pro Leu Thr Gly Phe Leu Ser Leu Ile Glu Ile
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Tyr Pro
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 14
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<212> DNA
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acactatttg agatttcctt aggatcacat ttgtgggact ttcttaatag aaaccctgca 480
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tctcctttga caggatattt gtctcttatt gagatctatc cttag 1065
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<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
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Met Ala Ser Ser Ile Asn Gly Arg Asn Ala Ser Glu Ile Phe Gln Gly
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Gln Thr Leu Leu Tyr Lys His Leu Phe Ala His Val Asp Ser Lys Cys
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Leu Lys Cys Ile Val Glu Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His Asn His
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Asn Leu Ala Leu Arg Asp Cys Lys Leu Val Phe Glu Gly Leu Glu Ser
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Ile Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Lys Ile Ile Cys
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Tyr Pro
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 18
ttattgagat ctatccttag 20
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<212> DNA
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<400> 19
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<213> 大豆(Glycine max)
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Met Glu Phe Asp Asn Glu Asp His Tyr Ala Lys Leu Leu Arg Ala Gln
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<211> 1083
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 21
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taa 1083
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<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 22
Met Glu Phe Asp Asn Glu Asp His Tyr Ala Lys Leu Leu Arg Ala Gln
1 5 10 15
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245 250 255
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355 360
<210> 23
<211> 1083
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 23
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<211> 360
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 24
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165 170 175
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180 185 190
Phe Ser Gly Leu Glu Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr
195 200 205
Met Ala Lys Ala Ile Ala Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Cys Ile Val
210 215 220
Phe Asp Leu Pro His Val Val Asp Gly Leu Gln Gly Thr Lys Asp Val
225 230 235 240
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245 250 255
Ile Met Leu Lys Thr Ile Met His Asn Trp Asn Asp Glu Glu Cys Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Lys Arg Cys Lys Glu Ala Ile Ala Asn Lys Asp Lys Gly
275 280 285
Lys Val Ile Ile Ile Asp Val Val Ile Gly Asn Glu Lys Gly Asp Ser
290 295 300
Glu Leu Asp Gln Thr Lys Leu Phe Tyr Asp Ile Glu Met Met Val Leu
305 310 315 320
Val Thr Gly Lys Glu Arg Asn Glu Lys Asp Trp Ala Lys Leu Phe Leu
325 330 335
Ser Ala Gly Phe Asn Ser Tyr Lys Ile Thr Pro Val Leu Gly Phe Lys
340 345 350
Ser Leu Ile Glu Val Tyr Pro Tyr
355 360
<210> 25
<211> 1083
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 25
atggaatttg ataatgaaga ccattatgca aaactacttc gagctcaaac ccacatattt 60
gatcaaactt tcggattcat aaactctatg tcccttaagt gtgcaattga tttgtgcata 120
cctgatgtaa tacacaagta tggccaaccc atgccactct ctcaactcat tgcttcactt 180
ccaattcacc cttctaaggc ttgcttcatt tcccgcttga tgcaaatttt gactcattcc 240
ggtttctact ctcaacacaa taatgccacc gaaaattatg agcaagaaga agtgagttat 300
gtgctaactg atgcatctaa actactcctt aaggaccatc actttagtat gatttccttg 360
ccacaagtca tacttgatcc aattttggtg aatccatggt ttcaattctc tacctggttc 420
acaaatgaag accctacacc gtttcacaca caaaatggga tggcattttg ggattatgct 480
agctctgagc ccaaactcaa ccaccttttt aatgatgcca tgactaatga ctcacggttg 540
atttccagcg tgttgattga gaagtgcaag ggagtgttta gtggattgga gtctttggtt 600
gatgttgggg gtggaactgg gactatggct aaggccattg ccaagtcgtt tcctcaattg 660
aagtgtattg tgtttgatct cccacatgtt gttgatggct tgcaaggaac aaagaacgta 720
gaatatgttc atggggacat gtttgaagca attccttctg ctgattccat tatgttgaag 780
actataatgc ataactggaa cgatgaggaa tgcttgaaaa tcctgaagag atgtaaggag 840
gcaatcgcaa acaaagataa aggaaaggtg attatcatag acgtggtgat aggaaacgag 900
aaaggagaca gtgaattaga tcaaacaaag ctcttctatg atattgagat gatggtgtta 960
gtcactggga aagagagaaa tgagaaagac tgggctaaat tgtttttgtc tgcaggtttc 1020
aatagctaca agataactcc agttctaggt tttaagtctc taatcgaggt ttatccatat 1080
taa 1083
<210> 26
<211> 360
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 26
Met Glu Phe Asp Asn Glu Asp His Tyr Ala Lys Leu Leu Arg Ala Gln
1 5 10 15
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35 40 45
Gln Pro Met Pro Leu Ser Gln Leu Ile Ala Ser Leu Pro Ile His Pro
50 55 60
Ser Lys Ala Cys Phe Ile Ser Arg Leu Met Gln Ile Leu Thr His Ser
65 70 75 80
Gly Phe Tyr Ser Gln His Asn Asn Ala Thr Glu Asn Tyr Glu Gln Glu
85 90 95
Glu Val Ser Tyr Val Leu Thr Asp Ala Ser Lys Leu Leu Leu Lys Asp
100 105 110
His His Phe Ser Met Ile Ser Leu Pro Gln Val Ile Leu Asp Pro Ile
115 120 125
Leu Val Asn Pro Trp Phe Gln Phe Ser Thr Trp Phe Thr Asn Glu Asp
130 135 140
Pro Thr Pro Phe His Thr Gln Asn Gly Met Ala Phe Trp Asp Tyr Ala
145 150 155 160
Ser Ser Glu Pro Lys Leu Asn His Leu Phe Asn Asp Ala Met Thr Asn
165 170 175
Asp Ser Arg Leu Ile Ser Ser Val Leu Ile Glu Lys Cys Lys Gly Val
180 185 190
Phe Ser Gly Leu Glu Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr
195 200 205
Met Ala Lys Ala Ile Ala Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Cys Ile Val
210 215 220
Phe Asp Leu Pro His Val Val Asp Gly Leu Gln Gly Thr Lys Asn Val
225 230 235 240
Glu Tyr Val His Gly Asp Met Phe Glu Ala Ile Pro Ser Ala Asp Ser
245 250 255
Ile Met Leu Lys Thr Ile Met His Asn Trp Asn Asp Glu Glu Cys Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Lys Arg Cys Lys Glu Ala Ile Ala Asn Lys Asp Lys Gly
275 280 285
Lys Val Ile Ile Ile Asp Val Val Ile Gly Asn Glu Lys Gly Asp Ser
290 295 300
Glu Leu Asp Gln Thr Lys Leu Phe Tyr Asp Ile Glu Met Met Val Leu
305 310 315 320
Val Thr Gly Lys Glu Arg Asn Glu Lys Asp Trp Ala Lys Leu Phe Leu
325 330 335
Ser Ala Gly Phe Asn Ser Tyr Lys Ile Thr Pro Val Leu Gly Phe Lys
340 345 350
Ser Leu Ile Glu Val Tyr Pro Tyr
355 360
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 27
atggaatttg ataatgaaga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 28
tcgaggttta tccatattaa 20
<210> 29
<211> 1098
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 29
atgattttct gtggcaacag cactgaagag agtgaactgc atcatgctca aattcatttg 60
tacaaacacg tatacaactt tgtgagttcc atggctctta agtctgctat ggaattaggc 120
atagcagacg taatccatag ccacggaaaa cccatgacta tttccgagtt atcctcagct 180
ctcaaattgc acccttcaaa agtgagtgtc ctccaacgct ttctccgcct tttaacgcac 240
aatgggttct ttgcaaaaac aatattgccg tcaaagaacg gtgtagaagg aggagaagaa 300
atagcgtatg ctcttactcc tccttcgaag cttctaataa gaaacaagtc aatatgtttg 360
gcgcctattg tgaagggagc tcttcattcg agctcccttg acatgtggca ttcctccaag 420
aaatggttca gtgaggataa ggaactgaca ctgtatgaga gtgcaactgg ggagagtttc 480
tgggactttc tcaacaaaac cacagaatct gacacgctgg gtatgtttca agatgccatg 540
gctgcagatt ctaaggtgtt caaacttgca ctcgaggaat gcaagcatgt gttcgaggga 600
ttgggttccc tcgtcgatgt gggtggtgga actggtgttg tcacaagact catcagtgaa 660
accttccctc acttgaaatg cactgtgttt gaccaaccac aggttgtggc taatttaact 720
ggaaacgaaa atttgaactt tgttggtgga gatatgttca agtccatccc ctctgccgat 780
gcagttttac tcaagtgggt tctgcatgat tggaacgatg aactctctgt gaagatattg 840
aagaactgca gagaagctat ttcagggaaa gggaaagaag gaaaggttat aattatagac 900
atagcaattg atgaagtagg tgatgatcgc gaaatgactg aattgaagct agactatgat 960
ttagtgatgt tgactatgtt taatggaaaa gaaagagaaa agaaagagtg ggagaaacta 1020
atttacgagg caggattcag caactacaaa attattccca tatgtggatt caaatctctc 1080
attgaagttt atccttaa 1098
<210> 30
<211> 365
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 30
Met Ile Phe Cys Gly Asn Ser Thr Glu Glu Ser Glu Leu His His Ala
1 5 10 15
Gln Ile His Leu Tyr Lys His Val Tyr Asn Phe Val Ser Ser Met Ala
20 25 30
Leu Lys Ser Ala Met Glu Leu Gly Ile Ala Asp Val Ile His Ser His
35 40 45
Gly Lys Pro Met Thr Ile Ser Glu Leu Ser Ser Ala Leu Lys Leu His
50 55 60
Pro Ser Lys Val Ser Val Leu Gln Arg Phe Leu Arg Leu Leu Thr His
65 70 75 80
Asn Gly Phe Phe Ala Lys Thr Ile Leu Pro Ser Lys Asn Gly Val Glu
85 90 95
Gly Gly Glu Glu Ile Ala Tyr Ala Leu Thr Pro Pro Ser Lys Leu Leu
100 105 110
Ile Arg Asn Lys Ser Ile Cys Leu Ala Pro Ile Val Lys Gly Ala Leu
115 120 125
His Ser Ser Ser Leu Asp Met Trp His Ser Ser Lys Lys Trp Phe Ser
130 135 140
Glu Asp Lys Glu Leu Thr Leu Tyr Glu Ser Ala Thr Gly Glu Ser Phe
145 150 155 160
Trp Asp Phe Leu Asn Lys Thr Thr Glu Ser Asp Thr Leu Gly Met Phe
165 170 175
Gln Asp Ala Met Ala Ala Asp Ser Lys Val Phe Lys Leu Ala Leu Glu
180 185 190
Glu Cys Lys His Val Phe Glu Gly Leu Gly Ser Leu Val Asp Val Gly
195 200 205
Gly Gly Thr Gly Val Val Thr Arg Leu Ile Ser Glu Thr Phe Pro His
210 215 220
Leu Lys Cys Thr Val Phe Asp Gln Pro Gln Val Val Ala Asn Leu Thr
225 230 235 240
Gly Asn Glu Asn Leu Asn Phe Val Gly Gly Asp Met Phe Lys Ser Ile
245 250 255
Pro Ser Ala Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp Val Leu His Asp Trp Asn
260 265 270
Asp Glu Leu Ser Val Lys Ile Leu Lys Asn Cys Arg Glu Ala Ile Ser
275 280 285
Gly Lys Gly Lys Glu Gly Lys Val Ile Ile Ile Asp Ile Ala Ile Asp
290 295 300
Glu Val Gly Asp Asp Arg Glu Met Thr Glu Leu Lys Leu Asp Tyr Asp
305 310 315 320
Leu Val Met Leu Thr Met Phe Asn Gly Lys Glu Arg Glu Lys Lys Glu
325 330 335
Trp Glu Lys Leu Ile Tyr Glu Ala Gly Phe Ser Asn Tyr Lys Ile Ile
340 345 350
Pro Ile Cys Gly Phe Lys Ser Leu Ile Glu Val Tyr Pro
355 360 365
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 31
atgattttct gtggcaacag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 32
tcattgaagt ttatccttaa 20
<210> 33
<211> 1065
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 33
atggcttcaa tgaataacca aaaagaaatt gagctctttg agggccaatc tcttttgtac 60
atgcagctat atggctatct aagacctatg tgtcttaagt gggctgtcca attaggtatt 120
ccagacataa tacacaacca tcccaaaccc attactcttt ctgacttggt ctccactctt 180
cagattccac cagctaaggc tggttttgtg caacggttca tgcgcttctt ggcacacaat 240
gggatatttg agatccatga gagccaagaa gaacatgaat taacatatgc tctaacccct 300
gcatcaaagc ttcttgtcaa tagtagtgat cattgtttat ctccaatggt tctagccttt 360
accgatccac ttcggaacgt taaatatcat cacttggggg aatggattcg tggggaggac 420
ccctcagtat ttgagacagc ccacggaaca agtgcttggg ggcttcttga gaaaaaccct 480
gaatattttg gtctcttcaa tgaggctatg gcaagtgatt cccgaatagt agacttggca 540
ctcaaaaatt gcacttcagt ttttgagggg ctagattcca tggtggatgt aggtggtgga 600
actggaacca ccgcaagaat tatctgtgac gcatttcctg agctgaaatg tgttgtgctt 660
gaccttcctc atgttgtaga aaacttgatg gcaaccaata atttaagttt tgttggtggt 720
gacatgttca aatctatccc tcaagctgat gcagttctac taaagtgggt tttacataat 780
tggactgacg aaaattgcat aaagatcctg aaaaagtgta gagattctat ttcaagcaaa 840
ggcaacagtg ggaaagtgat tatcatagat acagtgataa acgagaagct agatgacccg 900
gatatgactc aaacaaagct tagtttggat ataattatgt tgactatgaa tggaagagag 960
agaacggaaa aagactggaa acaactcttc actgaagcag gattcaatca ctacaaaata 1020
tttcccatct ttggttttag atctttgatt gaggtctatc cttga 1065
<210> 34
<211> 354
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 34
Met Ala Ser Met Asn Asn Gln Lys Glu Ile Glu Leu Phe Glu Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Leu Tyr Met Gln Leu Tyr Gly Tyr Leu Arg Pro Met Cys Leu
20 25 30
Lys Trp Ala Val Gln Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His Asn His Pro
35 40 45
Lys Pro Ile Thr Leu Ser Asp Leu Val Ser Thr Leu Gln Ile Pro Pro
50 55 60
Ala Lys Ala Gly Phe Val Gln Arg Phe Met Arg Phe Leu Ala His Asn
65 70 75 80
Gly Ile Phe Glu Ile His Glu Ser Gln Glu Glu His Glu Leu Thr Tyr
85 90 95
Ala Leu Thr Pro Ala Ser Lys Leu Leu Val Asn Ser Ser Asp His Cys
100 105 110
Leu Ser Pro Met Val Leu Ala Phe Thr Asp Pro Leu Arg Asn Val Lys
115 120 125
Tyr His His Leu Gly Glu Trp Ile Arg Gly Glu Asp Pro Ser Val Phe
130 135 140
Glu Thr Ala His Gly Thr Ser Ala Trp Gly Leu Leu Glu Lys Asn Pro
145 150 155 160
Glu Tyr Phe Gly Leu Phe Asn Glu Ala Met Ala Ser Asp Ser Arg Ile
165 170 175
Val Asp Leu Ala Leu Lys Asn Cys Thr Ser Val Phe Glu Gly Leu Asp
180 185 190
Ser Met Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Arg Ile Ile
195 200 205
Cys Asp Ala Phe Pro Glu Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Leu Pro His
210 215 220
Val Val Glu Asn Leu Met Ala Thr Asn Asn Leu Ser Phe Val Gly Gly
225 230 235 240
Asp Met Phe Lys Ser Ile Pro Gln Ala Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp
245 250 255
Val Leu His Asn Trp Thr Asp Glu Asn Cys Ile Lys Ile Leu Lys Lys
260 265 270
Cys Arg Asp Ser Ile Ser Ser Lys Gly Asn Ser Gly Lys Val Ile Ile
275 280 285
Ile Asp Thr Val Ile Asn Glu Lys Leu Asp Asp Pro Asp Met Thr Gln
290 295 300
Thr Lys Leu Ser Leu Asp Ile Ile Met Leu Thr Met Asn Gly Arg Glu
305 310 315 320
Arg Thr Glu Lys Asp Trp Lys Gln Leu Phe Thr Glu Ala Gly Phe Asn
325 330 335
His Tyr Lys Ile Phe Pro Ile Phe Gly Phe Arg Ser Leu Ile Glu Val
340 345 350
Tyr Pro
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 35
atggcttcaa tgaataacca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 36
tgattgaggt ctatccttga 20
<210> 37
<211> 1110
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 37
atggagactg ttcttttcaa tcactcccca cctttggaat tcaagggttt gagcaaggag 60
gaggaagact cattgctagg gcaagtggaa atatggaggt acatgacatg cttcacggac 120
tccgtggcct tgaaagctgt catagagctt cgtatagcgg acatactaga ccgttatggt 180
aaaccactat ccttgtcgca aattgtggag aacatagaag acgcaccctc cccagatgcc 240
tctcttctcc agagagtcct gagagtgatg gtgcgcagaa agatcttcag tgcacaagaa 300
tcagagacag gagaaaccct cttcggcttg acacgagcct cgaagtggat ccttcgcgac 360
acgaaaatga ccctagcacc catgttgctg ctggagaacc acccaattca cctgaaccct 420
gcgcactaca tcagtgagat tattagagaa ggcacaaaaa atggcactgc tttctttaag 480
tgccatggac atgagcaatt tgagatgacg ggtttggatc ctgagtataa taggttgttc 540
aatgagggca tggtgtgcac tgctagggtt gtgtccaagg ctgtgatcac tggctacaaa 600
gatgggttca accagattaa gtccttggtt gatgttggag gtggcattgg agggtctctt 660
tcggagattg ttagggctta tcctcatatc aatgccatca actttgactt gcctcatgtg 720
gttgccactg ctcctaagtt cgatgggatc acccatgttg gaggtgacat gttcgtgtcc 780
attcctagtg ctgatgctat ttacatgaag tggattctgc atgactggag cgacgagcac 840
tgcatcaaga tcttgaagaa ctgcaggaag gcaataccag agaagacagg aaaagtcata 900
atcgtggatc acgttcttcg acccgaaggc aacgaactct tcacagacgt tggcatcgca 960
ttcgacatga tgcttctcgc tcacaacgcc ggtggcaaag agaggaccga agagaactgg 1020
aagtggctgt tcaaggaaac cggtttcgcg cgttacaaca tcatcaagat caacgctctc 1080
ccttccatca ttgaggcgtt tccaatctga 1110
<210> 38
<211> 369
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 38
Met Glu Thr Val Leu Phe Asn His Ser Pro Pro Leu Glu Phe Lys Gly
1 5 10 15
Leu Ser Lys Glu Glu Glu Asp Ser Leu Leu Gly Gln Val Glu Ile Trp
20 25 30
Arg Tyr Met Thr Cys Phe Thr Asp Ser Val Ala Leu Lys Ala Val Ile
35 40 45
Glu Leu Arg Ile Ala Asp Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Pro Leu Ser
50 55 60
Leu Ser Gln Ile Val Glu Asn Ile Glu Asp Ala Pro Ser Pro Asp Ala
65 70 75 80
Ser Leu Leu Gln Arg Val Leu Arg Val Met Val Arg Arg Lys Ile Phe
85 90 95
Ser Ala Gln Glu Ser Glu Thr Gly Glu Thr Leu Phe Gly Leu Thr Arg
100 105 110
Ala Ser Lys Trp Ile Leu Arg Asp Thr Lys Met Thr Leu Ala Pro Met
115 120 125
Leu Leu Leu Glu Asn His Pro Ile His Leu Asn Pro Ala His Tyr Ile
130 135 140
Ser Glu Ile Ile Arg Glu Gly Thr Lys Asn Gly Thr Ala Phe Phe Lys
145 150 155 160
Cys His Gly His Glu Gln Phe Glu Met Thr Gly Leu Asp Pro Glu Tyr
165 170 175
Asn Arg Leu Phe Asn Glu Gly Met Val Cys Thr Ala Arg Val Val Ser
180 185 190
Lys Ala Val Ile Thr Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Asn Gln Ile Lys Ser
195 200 205
Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ser Glu Ile Val
210 215 220
Arg Ala Tyr Pro His Ile Asn Ala Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val
225 230 235 240
Val Ala Thr Ala Pro Lys Phe Asp Gly Ile Thr His Val Gly Gly Asp
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Pro Ser Ala Asp Ala Ile Tyr Met Lys Trp Ile
260 265 270
Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Ile Lys Ile Leu Lys Asn Cys
275 280 285
Arg Lys Ala Ile Pro Glu Lys Thr Gly Lys Val Ile Ile Val Asp His
290 295 300
Val Leu Arg Pro Glu Gly Asn Glu Leu Phe Thr Asp Val Gly Ile Ala
305 310 315 320
Phe Asp Met Met Leu Leu Ala His Asn Ala Gly Gly Lys Glu Arg Thr
325 330 335
Glu Glu Asn Trp Lys Trp Leu Phe Lys Glu Thr Gly Phe Ala Arg Tyr
340 345 350
Asn Ile Ile Lys Ile Asn Ala Leu Pro Ser Ile Ile Glu Ala Phe Pro
355 360 365
Ile
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 39
atggagactg ttcttttcaa 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 40
ttgaggcgtt tccaatctga 20
<210> 41
<211> 1098
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 41
atgggttcag cagctgagac tcagattact ccaacccatg tatctgatga agaggcaaac 60
ctttttgcca tgcaactagc cagtgcctct gtactcccta tggttctcaa atcagctctt 120
gagcttgatc tgttggaaat catagccaag gctggccctg gtgttcatct ttcccccact 180
gacatttctt ctcagcttcc aacacagaac cctgatgcac ccgttatgtt ggaccgcatt 240
ttgcggctct tggcttgcta caatatcctt tctttttctc tccgtactct ccctgatggc 300
aaggttgaga ggctctatgg tctcgccccc gttgctaagt acctggtcaa gaccgaagat 360
ggtgtctcca ttgctgctct taacctcatg aaccaggaca aagtcctcat ggaaagctgg 420
tactatttga aagatgctgt ccttgaaggg ggtattccat ttaacaaagc atatggaatg 480
acagcctttg aataccatgg aacagatcca aggtttaaca aggttttcaa caaggggatg 540
gctgatcact ccacaatcac aatgaagaaa attcttgaga cctacactgg ctttgagggt 600
cttaaatctc tggttgatgt tggtggagga actggagccg tagtcaacat gattgtctca 660
aagtatccca ctatcaaggg cattaatttt gatttgcccc atgtcattgg agatgcccca 720
tcttatccag gagtggagca tgtcggtgga gatatgtttg tcagtgttcc agaagctgat 780
gctattttta tgaagtggat ttgccacgat tggagtgatg agcactgctt gaagtttttg 840
aagaactgct atgaggcact tccagacaat gggaaggtaa ttgtggcaga atgcattctt 900
ccagtggctc cagactctag cttggccaca aaaggtgtgg ttcacatcga tgtgatcatg 960
ttggcacata atccaggtgg gaaagagaga acagagaaag agtttgaggc tctggccaaa 1020
gggtctggat tccaaggttt ccgagtcctg tgctgtgctt tcaataccta cgtcatggag 1080
tttctcaaaa aggtttaa 1098
<210> 42
<211> 365
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 42
Met Gly Ser Ala Ala Glu Thr Gln Ile Thr Pro Thr His Val Ser Asp
1 5 10 15
Glu Glu Ala Asn Leu Phe Ala Met Gln Leu Ala Ser Ala Ser Val Leu
20 25 30
Pro Met Val Leu Lys Ser Ala Leu Glu Leu Asp Leu Leu Glu Ile Ile
35 40 45
Ala Lys Ala Gly Pro Gly Val His Leu Ser Pro Thr Asp Ile Ser Ser
50 55 60
Gln Leu Pro Thr Gln Asn Pro Asp Ala Pro Val Met Leu Asp Arg Ile
65 70 75 80
Leu Arg Leu Leu Ala Cys Tyr Asn Ile Leu Ser Phe Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Pro Asp Gly Lys Val Glu Arg Leu Tyr Gly Leu Ala Pro Val Ala
100 105 110
Lys Tyr Leu Val Lys Thr Glu Asp Gly Val Ser Ile Ala Ala Leu Asn
115 120 125
Leu Met Asn Gln Asp Lys Val Leu Met Glu Ser Trp Tyr Tyr Leu Lys
130 135 140
Asp Ala Val Leu Glu Gly Gly Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met
145 150 155 160
Thr Ala Phe Glu Tyr His Gly Thr Asp Pro Arg Phe Asn Lys Val Phe
165 170 175
Asn Lys Gly Met Ala Asp His Ser Thr Ile Thr Met Lys Lys Ile Leu
180 185 190
Glu Thr Tyr Thr Gly Phe Glu Gly Leu Lys Ser Leu Val Asp Val Gly
195 200 205
Gly Gly Thr Gly Ala Val Val Asn Met Ile Val Ser Lys Tyr Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val Ile Gly Asp Ala Pro
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser Val
245 250 255
Pro Glu Ala Asp Ala Ile Phe Met Lys Trp Ile Cys His Asp Trp Ser
260 265 270
Asp Glu His Cys Leu Lys Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Glu Ala Leu Pro
275 280 285
Asp Asn Gly Lys Val Ile Val Ala Glu Cys Ile Leu Pro Val Ala Pro
290 295 300
Asp Ser Ser Leu Ala Thr Lys Gly Val Val His Ile Asp Val Ile Met
305 310 315 320
Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Phe Glu
325 330 335
Ala Leu Ala Lys Gly Ser Gly Phe Gln Gly Phe Arg Val Leu Cys Cys
340 345 350
Ala Phe Asn Thr Tyr Val Met Glu Phe Leu Lys Lys Val
355 360 365
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 43
atgggttcag cagctgagac 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 44
agtttctcaa aaaggtttaa 20
<210> 45
<211> 1065
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 45
atgtcttcca tggataacca aaaagcaatg gaactctttg agggccaatc tcttttgtac 60
atgcagctat atgggcacct aagacctatg tgtcttaagt gggctgttca actaggtatt 120
ccagacataa tacagaacca tgccaaaccc attactcttt ctgatttggt ctctactctt 180
caaattccac catctaaggc tggttttgtg cagcagttca tgcgcttttt ggcacacgat 240
ggaatctttg atatccgtga gagccaagat gatcatgaat tagcatatgc tctaacccct 300
gcttcaaagc ttctagttag ttgcagtgac cactgtttat ctccaatggt tcggatgaat 360
actgatccac ttctgatgac tacataccat cactttgggg aatggattcg tggggaagac 420
cccacagtac atgagacagc cttcggaaca agcttttggg gacttcttga gaaaaaccct 480
acgcaaatga gtctcttcaa tgaggctatg gcaagtgatt cccgaatggt agacttggca 540
ctcaaaaatt gcacttcagt ttttgaaggg ctagattcca tggtggatgt tggtggtgga 600
actggaacca cagccagaat tatctgtgag gcatttccga agttgaaatg tgttgtgctt 660
gaccttcctc atgttgtaga aaacttgaca ggaaccaata atttgagttt tgtcggtggt 720
gacatgttca actctttccc tcaaactgat gcagttctac taaagtgggt tttacataat 780
tggaatgacg aaaattgcat aaagatcctg aaaaagtgta aagattctat ttcaagcaaa 840
ggcaacagag gaaaagtgat tatcatagat ataataataa atgagaagct agatgacccg 900
gatatgactc gaacaaagct tagtttggat atagttatgt cgactatgaa tggaagagag 960
cgaagtgaaa aagaatggaa acaaatgttc attgaagcgg gattccaaca ctgcaaaata 1020
tttcccatct ttggtttcag atctctaatt gagctctatc cttag 1065
<210> 46
<211> 354
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 46
Met Ser Ser Met Asp Asn Gln Lys Ala Met Glu Leu Phe Glu Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Leu Tyr Met Gln Leu Tyr Gly His Leu Arg Pro Met Cys Leu
20 25 30
Lys Trp Ala Val Gln Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile Gln Asn His Ala
35 40 45
Lys Pro Ile Thr Leu Ser Asp Leu Val Ser Thr Leu Gln Ile Pro Pro
50 55 60
Ser Lys Ala Gly Phe Val Gln Gln Phe Met Arg Phe Leu Ala His Asp
65 70 75 80
Gly Ile Phe Asp Ile Arg Glu Ser Gln Asp Asp His Glu Leu Ala Tyr
85 90 95
Ala Leu Thr Pro Ala Ser Lys Leu Leu Val Ser Cys Ser Asp His Cys
100 105 110
Leu Ser Pro Met Val Arg Met Asn Thr Asp Pro Leu Leu Met Thr Thr
115 120 125
Tyr His His Phe Gly Glu Trp Ile Arg Gly Glu Asp Pro Thr Val His
130 135 140
Glu Thr Ala Phe Gly Thr Ser Phe Trp Gly Leu Leu Glu Lys Asn Pro
145 150 155 160
Thr Gln Met Ser Leu Phe Asn Glu Ala Met Ala Ser Asp Ser Arg Met
165 170 175
Val Asp Leu Ala Leu Lys Asn Cys Thr Ser Val Phe Glu Gly Leu Asp
180 185 190
Ser Met Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Arg Ile Ile
195 200 205
Cys Glu Ala Phe Pro Lys Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Leu Pro His
210 215 220
Val Val Glu Asn Leu Thr Gly Thr Asn Asn Leu Ser Phe Val Gly Gly
225 230 235 240
Asp Met Phe Asn Ser Phe Pro Gln Thr Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp
245 250 255
Val Leu His Asn Trp Asn Asp Glu Asn Cys Ile Lys Ile Leu Lys Lys
260 265 270
Cys Lys Asp Ser Ile Ser Ser Lys Gly Asn Arg Gly Lys Val Ile Ile
275 280 285
Ile Asp Ile Ile Ile Asn Glu Lys Leu Asp Asp Pro Asp Met Thr Arg
290 295 300
Thr Lys Leu Ser Leu Asp Ile Val Met Ser Thr Met Asn Gly Arg Glu
305 310 315 320
Arg Ser Glu Lys Glu Trp Lys Gln Met Phe Ile Glu Ala Gly Phe Gln
325 330 335
His Cys Lys Ile Phe Pro Ile Phe Gly Phe Arg Ser Leu Ile Glu Leu
340 345 350
Tyr Pro
<210> 47
<211> 1065
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
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atgtcttcca tggataacca aaaagcaatg gaactctttg agggccaatc tcttttgtac 60
atgcagctat atgggcacct aagacctatg tgtcttaagt gggctgttca actaggtatt 120
ccagacataa tacagaacca tgccaaaccc attactcttt ctgatttggt ctctactctt 180
caaattccac catctaaggc tggttttgtg cagcagttca tgcgcttttt ggcacacgat 240
ggaatctttg atatccgtga gagccaagat gatcatgaat tagcatatgc tctaacccct 300
gcttcaaagc ttctagttag ttgcagtgac cactgtttat ctccaatggt tcggatgaat 360
actgatccac ttctgatgac tgcataccat cactttgggg aatggattcg tggggaagac 420
cccacagtac atgagacagc cttcggaaca agcttttggg gacttcttga gaaaaaccct 480
acacaaatga gtctcttcaa tgaggctatg gcaagtgatt cccgaatggt agacttggca 540
ctcaaaaatt gcacttcagt ttttgaaggg ctagattcca tggtggatgt tggtggtgga 600
actggaacca cagccagaat tatccgtgag gcatttccga agttgaaatg tgttgtgctt 660
gaccttcctc atgttgtaga aaacttgaca ggaaccaata atttgagttt tgtcggtggt 720
gacatgttca actctttccc tcaaactgat gcagttctac taaagtgggt tttacataat 780
tggaatgacg aaaattgcat aaagatcctg aaaaagtgta aagattctat ttcaagcaaa 840
ggcaacagag gaaaagtgat tatcatagat ataataataa atgagaagct agatgacccg 900
gatatgactc gaacaaagct tagtttggat atagttatgt cgactatgaa tggaagagag 960
cgaagtgaaa aagaatggaa acaaatgttc attgaagcgg gattccaaca ctgcaaaata 1020
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<211> 354
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 48
Met Ser Ser Met Asp Asn Gln Lys Ala Met Glu Leu Phe Glu Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Leu Tyr Met Gln Leu Tyr Gly His Leu Arg Pro Met Cys Leu
20 25 30
Lys Trp Ala Val Gln Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile Gln Asn His Ala
35 40 45
Lys Pro Ile Thr Leu Ser Asp Leu Val Ser Thr Leu Gln Ile Pro Pro
50 55 60
Ser Lys Ala Gly Phe Val Gln Gln Phe Met Arg Phe Leu Ala His Asp
65 70 75 80
Gly Ile Phe Asp Ile Arg Glu Ser Gln Asp Asp His Glu Leu Ala Tyr
85 90 95
Ala Leu Thr Pro Ala Ser Lys Leu Leu Val Ser Cys Ser Asp His Cys
100 105 110
Leu Ser Pro Met Val Arg Met Asn Thr Asp Pro Leu Leu Met Thr Ala
115 120 125
Tyr His His Phe Gly Glu Trp Ile Arg Gly Glu Asp Pro Thr Val His
130 135 140
Glu Thr Ala Phe Gly Thr Ser Phe Trp Gly Leu Leu Glu Lys Asn Pro
145 150 155 160
Thr Gln Met Ser Leu Phe Asn Glu Ala Met Ala Ser Asp Ser Arg Met
165 170 175
Val Asp Leu Ala Leu Lys Asn Cys Thr Ser Val Phe Glu Gly Leu Asp
180 185 190
Ser Met Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Arg Ile Ile
195 200 205
Arg Glu Ala Phe Pro Lys Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Leu Pro His
210 215 220
Val Val Glu Asn Leu Thr Gly Thr Asn Asn Leu Ser Phe Val Gly Gly
225 230 235 240
Asp Met Phe Asn Ser Phe Pro Gln Thr Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp
245 250 255
Val Leu His Asn Trp Asn Asp Glu Asn Cys Ile Lys Ile Leu Lys Lys
260 265 270
Cys Lys Asp Ser Ile Ser Ser Lys Gly Asn Arg Gly Lys Val Ile Ile
275 280 285
Ile Asp Ile Ile Ile Asn Glu Lys Leu Asp Asp Pro Asp Met Thr Arg
290 295 300
Thr Lys Leu Ser Leu Asp Ile Val Met Ser Thr Met Asn Gly Arg Glu
305 310 315 320
Arg Ser Glu Lys Glu Trp Lys Gln Met Phe Ile Glu Ala Gly Phe Gln
325 330 335
His Cys Lys Ile Phe Pro Ile Phe Gly Phe Arg Ser Leu Ile Glu Leu
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Tyr Pro
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<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
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<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
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Ser Leu Leu Tyr Met Gln Leu Tyr Gly His Leu Arg Pro Met Cys Leu
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50 55 60
Ser Lys Ala Gly Phe Val Gln Gln Phe Met Arg Phe Leu Ala His Asp
65 70 75 80
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165 170 175
Val Asp Leu Ala Leu Lys Asn Cys Thr Ser Val Phe Glu Gly Leu Asp
180 185 190
Ser Met Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Arg Ile Ile
195 200 205
Cys Glu Ala Phe Pro Lys Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Leu Pro His
210 215 220
Val Val Glu Asn Leu Thr Gly Thr Asn Asn Leu Ser Phe Val Gly Gly
225 230 235 240
Asp Met Phe Asn Ser Phe Pro Gln Thr Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp
245 250 255
Val Leu His Asn Trp Asn Asp Glu Asn Cys Ile Lys Ile Leu Lys Lys
260 265 270
Cys Lys Asp Ser Ile Ser Ser Lys Gly Asn Arg Gly Lys Val Ile Ile
275 280 285
Ile Asp Ile Ile Ile Asn Glu Lys Leu Asp Asp Pro Asp Met Thr Arg
290 295 300
Thr Lys Leu Ser Leu Asp Val Val Met Ser Thr Met Asn Gly Arg Glu
305 310 315 320
Arg Ser Glu Lys Glu Trp Lys Gln Met Phe Ile Glu Ala Gly Phe Gln
325 330 335
His Cys Lys Ile Phe Pro Ile Phe Gly Phe Arg Ser Leu Ile Glu Leu
340 345 350
Tyr Pro
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<213> 引物(Primer)
<400> 52
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<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 53
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<211> 353
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
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Met Asp Asn Gln Asn Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Gln Asn Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Met Gln Ile Phe Gly Asn Leu Arg Pro Val Cys Leu Met Trp Ala
20 25 30
Cys Glu Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile Ser Asn His Gly Lys Pro Ile
35 40 45
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50 55 60
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165 170 175
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195 200 205
Thr Phe Pro Lys Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Leu Pro His Val Val
210 215 220
Ala Asn Leu Thr Gly Ser Asn Arg Leu Ser Phe Val Gly Gly Asp Met
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Phe Lys Ser Ile Pro Gln Ala Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp Val Leu
245 250 255
His Asp Trp Asn Glu Glu Asn Cys Ile Lys Ile Leu Lys Arg Cys Lys
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Leu Cys Met Asp Ile Ala Met Met Ile Ala Phe Asn Gly Lys Glu Arg
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Thr Glu Glu Glu Trp Lys Gln Leu Phe Ile Gly Ala Gly Phe Gln His
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Tyr Lys Ile Tyr His Thr Phe Gly Phe Arg Ser Leu Ile Glu Val Tyr
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Pro
<210> 55
<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 56
ttattgaggt ctatccttaa 20
<210> 57
<211> 1101
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 57
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atgaggttcc tggtgcaaag aaagatattc aaaggcgacg ggtgcagcag gggctattct 300
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gccaatggca acccctcatt tgcaaaggct cacggtgaag acgtgtggcg ctatgctgcc 480
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<211> 366
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 58
Met Gly Glu Ile Glu Arg Glu Glu Met Ser Ser Thr Arg Trp Glu Lys
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Gln Met Asp Ile Trp Lys Tyr
20 25 30
Ile Phe Gly Phe Val Glu Leu Ala Val Ile Lys Cys Ala Ile Glu Leu
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Gly Ile Ala Glu Ala Ile Glu Lys His Gly Ser Pro Met Thr Leu Ser
50 55 60
Glu Ile Ser Ser Gly Leu Gly Cys Asp Thr Ser His Leu Lys Arg Ile
65 70 75 80
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Arg Gly Tyr Ser Gln Ser Ala Leu Ser Arg Arg Leu Met Arg Asn Gly
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Glu His Ser Met Ala Ser Phe Leu Leu Leu Glu Ser Ser Pro Val Met
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Leu Ala Pro Trp His Ser Leu Ser Ala Arg Val Met Ala Asn Gly Asn
130 135 140
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165 170 175
Ala Lys Leu Val Met Pro Ile Ile Ile Gln Ser Cys Gly Glu Ala Phe
180 185 190
His Gly Leu Lys Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Asn Gly Thr Ala
195 200 205
Met Arg Ile Leu Ala Lys Ala Cys Pro Ser Ile Arg Pro Ile Asn Phe
210 215 220
Asp Leu Pro His Val Ile Ala Leu Cys Asp Gly Asp Gly Asp Gly Val
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Gln His Val Ser Gly Asp Met Phe Leu Ser Val Pro Lys Ala Asp Ala
245 250 255
Ala Phe Leu Met Trp Val Leu His Asp Trp Ser Asp Glu Glu Cys Ile
260 265 270
Gln Ile Leu Lys Lys Cys Arg Glu Ala Ile Ser Asn Ser Lys Glu Asn
275 280 285
Gly Arg Val Ile Ile Val Glu Ala Val Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly
290 295 300
Glu Gly Gly Lys His Asp Gly Leu Lys Asp Val Gly Leu Met Leu Asp
305 310 315 320
Met Val Met Met Ala His Thr Asn Phe Gly Lys Glu Arg Thr Leu Lys
325 330 335
Glu Trp Glu Tyr Val Ile Lys Met Ala Gly Phe Ser Ser Tyr Thr Val
340 345 350
Lys Pro Ile His Ala Val Gln Ser Val Ile Met Ala Phe Tyr
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<210> 59
<211> 20
<212> DNA
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<210> 60
<211> 20
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<213> 引物(Primer)
<400> 60
tcattatggc tttctactaa 20
<210> 61
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<212> DNA
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<400> 61
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<213> 大豆(Glycine max)
<400> 62
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Pro Met Val Leu Lys Ser Ala Leu Glu Leu Asp Leu Leu Glu Ile Ile
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Glu Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Gly Leu Lys Ser Leu Val Asp Val Gly
195 200 205
Gly Gly Thr Gly Ala Ile Ile Asn Met Ile Val Ser Lys Tyr Pro Thr
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 63
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<210> 64
<211> 20
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<213> 引物(Primer)
<400> 64
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gatcatagtt tgagattcat acactccatg tcccttaaat gtgcaattga cttaagcata 120
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ccaatccacc catccaagac ttgctacatc catcgcttga tgcgactctt gactcattcc 240
ggtttcttct ctcggcacga tttggtcgaa aacgaacaag aagtgatcac gtatgagcta 300
actgatgcat ctagactact cctcaaggac caccctttta gtttgaggcc tttgttgcta 360
gtcacacttg atccaagtgt gattaagtca tggtgtcaat tctctacttg gctcacaagt 420
gaagaccgta caccgtttca aacggagaat ggggtgacat attttgatta tgctaagcgt 480
gaccccaaat tcggtcactt ttacaatgat gcaatggcta aggacactcg attcgcttct 540
agtgtggtga ttgaaaacta caaggaagtg ttcgaggtat tgaagtcaat tgttgatgtt 600
ggaggaggaa tagggaccat ggctaaggcc attgctaagg cattcccaca agtgaagtgc 660
actgtgtttg atctcccaca tgttgttgat ggcttgcaag gaacagaaaa catagaatat 720
gtcggaggag acatgtttga agtaattcct gcagctgatt gcattatgct gaagtgggta 780
ttacattgtt ggaatgacga ggaatgcatg aaaatattga agaaatgcaa ggaggcaata 840
cctagcgacg gaaaggttat catcatggaa ttagtgatgg agcataacaa ggaagacaat 900
aaattaattg agatgcagct gtgctgtgat atgcttatga tgtcgctttt tgcaggaaaa 960
gatagaactg agaaagaatg ggcacatcta attgcctctg ctggtttcag taactacaag 1020
ataactcata ttttcgattt atatcatatc attgaggttt atccctag 1068
<210> 66
<211> 355
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 66
Met Ala Thr Gln Ser Glu Glu Asn Ala Thr Lys Phe Leu Gln Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Gln Ile Asp Asp His Ser Leu Arg Phe Ile His Ser Met Ser Leu
20 25 30
Lys Cys Ala Ile Asp Leu Ser Ile Pro Asp Ile Ile His Lys Tyr Gly
35 40 45
Gln Pro Met Pro Leu Ser Gln Leu Ile Ala Ser Leu Pro Ile His Pro
50 55 60
Ser Lys Thr Cys Tyr Ile His Arg Leu Met Arg Leu Leu Thr His Ser
65 70 75 80
Gly Phe Phe Ser Arg His Asp Leu Val Glu Asn Glu Gln Glu Val Ile
85 90 95
Thr Tyr Glu Leu Thr Asp Ala Ser Arg Leu Leu Leu Lys Asp His Pro
100 105 110
Phe Ser Leu Arg Pro Leu Leu Leu Val Thr Leu Asp Pro Ser Val Ile
115 120 125
Lys Ser Trp Cys Gln Phe Ser Thr Trp Leu Thr Ser Glu Asp Arg Thr
130 135 140
Pro Phe Gln Thr Glu Asn Gly Val Thr Tyr Phe Asp Tyr Ala Lys Arg
145 150 155 160
Asp Pro Lys Phe Gly His Phe Tyr Asn Asp Ala Met Ala Lys Asp Thr
165 170 175
Arg Phe Ala Ser Ser Val Val Ile Glu Asn Tyr Lys Glu Val Phe Glu
180 185 190
Val Leu Lys Ser Ile Val Asp Val Gly Gly Gly Ile Gly Thr Met Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Ala Lys Ala Phe Pro Gln Val Lys Cys Thr Val Phe Asp
210 215 220
Leu Pro His Val Val Asp Gly Leu Gln Gly Thr Glu Asn Ile Glu Tyr
225 230 235 240
Val Gly Gly Asp Met Phe Glu Val Ile Pro Ala Ala Asp Cys Ile Met
245 250 255
Leu Lys Trp Val Leu His Cys Trp Asn Asp Glu Glu Cys Met Lys Ile
260 265 270
Leu Lys Lys Cys Lys Glu Ala Ile Pro Ser Asp Gly Lys Val Ile Ile
275 280 285
Met Glu Leu Val Met Glu His Asn Lys Glu Asp Asn Lys Leu Ile Glu
290 295 300
Met Gln Leu Cys Cys Asp Met Leu Met Met Ser Leu Phe Ala Gly Lys
305 310 315 320
Asp Arg Thr Glu Lys Glu Trp Ala His Leu Ile Ala Ser Ala Gly Phe
325 330 335
Ser Asn Tyr Lys Ile Thr His Ile Phe Asp Leu Tyr His Ile Ile Glu
340 345 350
Val Tyr Pro
355
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
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<400> 67
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 68
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<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 69
atgggttcaa caggtgagac tcagattact ccaacccatg tatctgatga agaggcaaac 60
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ttgcgcctct tggcttgcta caatatcctc tctttttctc ttcgcactct ccctcatggc 300
aaggttgaga ggctctatgg tctcgcccct gttgctaagt acttggtcag gaacgaagat 360
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tactatttga aagatgcagt ccttgaaggg ggtattccat ttaacaaagc atatggaatg 480
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tcttatccag gagtggaaca tgttggtgga gatatgtttg tcagtgttcc aaaagctgat 780
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<210> 70
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<212> PRT
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Met Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gln Ile Thr Pro Thr His Val Ser Asp
1 5 10 15
Glu Glu Ala Asn Leu Phe Ala Met Gln Leu Ala Ser Ala Ser Val Leu
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Pro Met Val Leu Lys Ser Ala Leu Glu Leu Asp Leu Leu Glu Ile Ile
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Ala Lys Ala Gly Pro Gly Val His Leu Ser Pro Ser Asp Ile Ala Ser
50 55 60
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Leu Arg Leu Leu Ala Cys Tyr Asn Ile Leu Ser Phe Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Pro His Gly Lys Val Glu Arg Leu Tyr Gly Leu Ala Pro Val Ala
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115 120 125
Leu Met Asn Gln Asp Lys Ile Leu Met Glu Ser Trp Tyr Tyr Leu Lys
130 135 140
Asp Ala Val Leu Glu Gly Gly Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met
145 150 155 160
Thr Ala Phe Glu Tyr His Gly Thr Asp Pro Arg Phe Asn Lys Val Phe
165 170 175
Asn Lys Gly Met Ala Asp His Ser Thr Ile Thr Met Lys Lys Ile Leu
180 185 190
Glu Thr Tyr Thr Gly Phe Glu Gly Leu Lys Ser Leu Val Asp Val Gly
195 200 205
Gly Gly Thr Gly Ala Val Val Asn Met Ile Val Ser Lys Tyr Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val Ile Glu Asp Ala Pro
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser Val
245 250 255
Pro Lys Ala Asp Ala Ile Phe Met Lys Trp Ile Cys His Asp Trp Ser
260 265 270
Asp Glu His Cys Leu Lys Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Glu Ala Leu Pro
275 280 285
Asp Asn Gly Lys Val Ile Val Ala Glu Cys Ile Leu Pro Val Ala Pro
290 295 300
Asp Ser Ser Leu Ala Thr Lys Gly Val Val His Ile Asp Val Ile Met
305 310 315 320
Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Phe Glu
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Ala Leu Ala Lys Gly Ser Gly Phe Gln Gly Phe Gln Val Leu Cys Cys
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<212> DNA
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attgtgtttg atctaccaca tgttgtttct ggcttgaaag gaagtgagaa ccttaaatat 720
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<212> PRT
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1 5 10 15
Thr His Ile Trp Asn His Ile Phe Ser Phe Ile Asn Ser Met Ser Leu
20 25 30
Lys Cys Val Val Asp Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His Asn Tyr Gly
35 40 45
Gln Pro Met Pro Leu Leu Asn Leu Ile Ala Ser Leu Pro Ile His Pro
50 55 60
Ser Lys Thr Cys Phe Val His Arg Leu Met Arg Ile Met Ile His Ser
65 70 75 80
Gly Phe Phe Ser Leu Gln Asn His Asp Leu Glu Asn Glu Leu Glu Ala
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100 105 110
Met Ser Val Thr Pro Phe Leu His Ala Met Leu Asp Pro Ile Ser Thr
115 120 125
Asn Pro Trp Asn Gln Phe Ser Thr Trp Phe Lys Asn Gly Asp Pro Thr
130 135 140
Pro Phe Glu Thr Ala His Gly Lys Met Phe Trp Asp Tyr Ala Gly Ala
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Asp Pro Lys Leu Lys Tyr Leu Phe Asn Asp Ala Met Ala Ser Asp Ala
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180 185 190
Gly Leu Glu Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Ala Lys Ser Phe Pro Arg Val Glu Cys Ile Val Phe Asp
210 215 220
Leu Pro His Val Val Ser Gly Leu Lys Gly Ser Glu Asn Leu Lys Tyr
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Val Ala Gly Asp Met Phe Glu Ala Ile Pro Pro Ala Asp Ala Ile Leu
245 250 255
Leu Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Asn Asp Glu Glu Cys Val Asp Ile
260 265 270
Leu Lys Lys Cys Lys Glu Ala Ile Thr Arg Lys Gly Lys Glu Gly Lys
275 280 285
Val Ile Ile Ile Asp Met Val Val Glu Asn Glu Lys Arg Asp Asp Glu
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Ser Val Glu Thr Gln Leu Phe Phe Asp Met Leu Met Met Val Leu Val
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<211> 1077
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
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<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
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Met Glu Ser His Asp Glu Glu His Ala Thr Lys Leu Leu Arg Ala Gln
1 5 10 15
Thr His Ile Trp Asn His Ile Phe Ser Phe Ile Asn Ser Met Ser Leu
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35 40 45
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Gly Phe Phe Ser Leu Gln Asn His Asp Leu Glu Asn Glu Leu Glu Ala
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Arg Phe Val Thr Ser Leu Val Ile Glu Lys Cys Lys Gly Val Phe Met
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Gly Leu Glu Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Ala Lys Ser Phe Pro Arg Val Glu Cys Ile Val Phe Asp
210 215 220
Leu Pro His Val Val Ser Gly Leu Lys Gly Ser Glu Asn Leu Lys Asn
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Val Ala Gly Asp Met Phe Glu Ala Ile Pro Pro Ala Asp Ala Ile Leu
245 250 255
Leu Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Asn Asp Glu Glu Cys Val Asp Ile
260 265 270
Leu Lys Lys Cys Lys Glu Ala Ile Thr Arg Lys Gly Lys Glu Gly Lys
275 280 285
Val Ile Ile Ile Asp Met Val Val Glu Asn Glu Lys Arg Asp Asp Glu
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Ser Val Glu Thr Gln Leu Phe Phe Asp Met Leu Met Met Val Leu Val
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Thr Gly Lys Glu Arg Ser Lys Lys Glu Trp Ala Lys Leu Ile Ser Ser
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<400> 78
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<400> 79
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165 170 175
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195 200 205
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Pro His Val Val Ala Thr Leu Gln Gly Ser Glu Asn Leu Lys Tyr Val
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Gly Gly Asp Met Phe Glu Ser Ile Pro Ser Ala Asp Ala Ile Leu Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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100 105 110
Ser Met Val Pro Phe Leu His Ala Met Leu Asp Pro Thr Leu Ala Gln
115 120 125
Pro Trp Leu Gln Leu Pro Thr Trp Phe Lys Asn Asp Asp Pro Ser Pro
130 135 140
Phe Gln Thr Ala His Gly Met Lys Ile Trp Asp Tyr Ala Asp Arg Glu
145 150 155 160
Pro Arg Leu Asn Asp Leu Phe Asn Asp Ala Met Ala Ser Asp Thr Gln
165 170 175
Leu Val Ala Asn Val Val Ile Glu Arg Cys Lys Gly Val Phe Asn Gly
180 185 190
Leu Glu Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Met
195 200 205
Ala Ile Ala Lys Ser Phe Pro Gln Leu Glu Cys Thr Val Phe Asp Leu
210 215 220
Pro His Val Val Ala Thr Leu Gln Gly Ser Glu Asn Leu Lys Tyr Val
225 230 235 240
Gly Gly Asp Met Phe Glu Ser Ile Pro Ser Ala Asp Ala Ile Leu Leu
245 250 255
Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Asn Asp Glu Gln Cys Val Lys Ile Leu
260 265 270
Lys Lys Cys Lys Glu Ala Ile Lys Ser Lys Val Ile Ile Ile Asp Met
275 280 285
Val Val Glu Asn Glu Lys Gly Asp Asp Glu Ser Ile Glu Thr Gln Leu
290 295 300
Phe Ile Asp Met Val Val Met Val Leu Tyr Pro Gly Lys Glu Arg Thr
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Glu Lys Glu Trp Ala Lys Leu Ile Phe Ser Thr Gly Phe Ser Asp Tyr
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<212> DNA
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ggcttcttct ctcaacacaa ggtcaacgag aatgagctag aaatgggtta cgtgttgacc 300
gatgcatcta ctctactact taaggacaac cccttaagta tggtaccttt cctgcatgca 360
atgcttgatc caactttgac acagccatgg cttcaattgc caacatggtt caaaaatgat 420
gatccctcgc catttcaaac agcacatggg atgaaaattt gggattatgc tgaccgcgag 480
ccaaggctta atgacctttt taatgatgct atggcaagtg acactcaatt ggttgccaat 540
gtggtgattg agaggtgcaa aggagtgttc aatggattgg agtcacttgt tgatgttggg 600
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<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
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Met Glu Ala Gln Arg Asp Glu Arg Val Ser Lys Leu Leu Gly Ala Gln
1 5 10 15
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Lys Cys Ala Ile Glu Leu Asp Ile Pro Asp Ile Ile His Lys Tyr Gly
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65 70 75 80
Gly Phe Phe Ser Gln His Lys Val Asn Glu Asn Glu Leu Glu Met Gly
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Pro Arg Leu Asn Asp Leu Phe Asn Asp Ala Met Ala Ser Asp Thr Gln
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Leu Val Ala Asn Val Val Ile Glu Arg Cys Lys Gly Val Phe Asn Gly
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195 200 205
Ala Ile Ala Lys Ser Phe Pro Gln Leu Glu Cys Thr Val Phe Asp Leu
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Pro His Val Val Ala Thr Leu Gln Gly Ser Glu Asn Leu Lys Tyr Val
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Arg Gly Asp Met Phe Glu Ser Ile Pro Ser Ala Asp Ala Ile Leu Leu
245 250 255
Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Asn Asp Glu Gln Cys Val Lys Ile Leu
260 265 270
Lys Lys Cys Lys Glu Ala Ile Lys Ser Lys Val Ile Ile Ile Asp Met
275 280 285
Val Val Glu Asn Glu Lys Gly Asp Asp Glu Ser Ile Glu Thr Gln Leu
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Phe Ile Asp Met Val Val Met Val Leu Tyr Pro Gly Lys Glu Arg Thr
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Leu Val Ala Asn Val Val Ile Glu Arg Cys Lys Gly Val Phe Asn Gly
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Leu Glu Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Met
195 200 205
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Val Val Glu Asn Glu Lys Gly Asp Asp Glu Ser Ile Glu Thr Gln Leu
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<400> 88
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<212> DNA
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<213> 大豆(Glycine max)
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Leu Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Asn Asp Lys Glu Cys Val Asp Ile
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Leu Lys Lys Cys Lys Glu Ala Ile Thr Arg Lys Gly Lys Glu Gly Lys
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130 135 140
Ile Phe Glu Glu Leu Asp Ser Ile Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly
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Thr Thr Ala Arg Ile Ile Cys Glu Thr Phe Pro Lys Leu Lys Cys Val
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180 185 190
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Arg Gly Lys Ile Ile Ile Ile Asp Ala Val Ile Asn Glu Lys Leu Asp
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 97
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<400> 98
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Leu Gly Cys Ser Leu Trp Asp Phe Leu Asn Lys Asn Pro Ser Tyr Asn
115 120 125
Glu Leu Phe Asn Glu Ala Met Thr Arg Asp Ser Gln Val Ser Asn Leu
130 135 140
Ala Leu Arg Asp Cys Lys Leu Val Phe Glu Gly Leu Glu Ser Ile Val
145 150 155 160
Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Lys Met Ile Cys Glu Ala
165 170 175
Phe Pro Asp Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Arg Pro Arg Val Val Glu
180 185 190
Asn Leu Ser Gly Asn Asn Asn Leu Thr Tyr Val Ala Gly Asp Met Phe
195 200 205
Lys Thr Ile Pro Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp Ile Leu His
210 215 220
Asp Trp Ala Asp Lys Asp Cys Arg Lys Ile Leu Glu Asn Cys Lys Glu
225 230 235 240
Ala Ile Ser Ser Asn Asn Gly Lys Arg Gly Lys Ile Ile Val Ile Asp
245 250 255
Met Val Ile Asn Glu Lys Gln Asp Glu Gln Lys Ile Thr Glu Leu Lys
260 265 270
Leu Leu Trp Asp Val Ser Met Ala Cys Ala Phe Asn Gly Lys Glu Arg
275 280 285
Asn Glu Glu Glu Trp Asn Lys Leu Phe Met Glu Ala Gly Leu Gln Asp
290 295 300
Tyr Lys Ile Ser Pro Leu Thr Gly Tyr Leu Ser Leu Ile Glu Ile Tyr
305 310 315 320
Pro
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 99
atggttgagc ttgacatacc 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 100
ttattgagat ctatccttga 20
<210> 101
<211> 1068
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 101
atggcttcaa ataatggccg aaaagcaact gagatcttcc aaggacaagc tatcttatac 60
agatgcatgt ttgccttcct agattccatg tgtctcaaat cgattattga gcttggcata 120
ccagacataa tccacaagca tggccaaccc attactcttt ctgagttggt gtcaattctg 180
aatgttccac cagctagagt tggtcacgtg caaagtctca tgcgctacct tgcacaccat 240
ggattctttg aaagactaag aatccatctt gaaaaagaat cttatgctct cactgctgct 300
tcagagctac ttgtcaaaag cagtgagctt tgtttaactc caatggttga gaaagtgctt 360
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tcagtgtttg atatctcctt aggctgtagt ttgtgggatt ttcttaacaa aaacccttca 480
tacaatgagt tattcaatga ggcaatgact agagattctc aagtgagtaa cttggcattg 540
agagattgca agttggtgtt tgagggactg gaatccattg tggacgttgg tggtggaact 600
ggagccactg ccaagatgat cagtgaggca tttcctgact tgaaatgcgt tgttcttgac 660
cgtcctcggg ttgtggagaa cttgtcagga aacaacaatt tgacatatgt tgctggggac 720
atgttcaaaa ctattcctaa ggctgatgct gttctgctta agtggattct tcatgattgg 780
gctgataaag attgcagaaa gatattagag aattgtaaag aagctatttc ttcaaataat 840
ggcaaaagag gaaaaataat tgtcatagat atggtcatta acgaaaaaca agatgagcaa 900
aaaattactg aactaaagct cctttgggat gtaagcatgg catgtgcatt caatggaaaa 960
gagagaaatg aagaagaatg gaacaaactc ttcatggaag ccgggctcca agactacaaa 1020
atatctccct tgaccgggta tttgtctctt attgagatct atccttaa 1068
<210> 102
<211> 355
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 102
Met Ala Ser Asn Asn Gly Arg Lys Ala Thr Glu Ile Phe Gln Gly Gln
1 5 10 15
Ala Ile Leu Tyr Arg Cys Met Phe Ala Phe Leu Asp Ser Met Cys Leu
20 25 30
Lys Ser Ile Ile Glu Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His Lys His Gly
35 40 45
Gln Pro Ile Thr Leu Ser Glu Leu Val Ser Ile Leu Asn Val Pro Pro
50 55 60
Ala Arg Val Gly His Val Gln Ser Leu Met Arg Tyr Leu Ala His His
65 70 75 80
Gly Phe Phe Glu Arg Leu Arg Ile His Leu Glu Lys Glu Ser Tyr Ala
85 90 95
Leu Thr Ala Ala Ser Glu Leu Leu Val Lys Ser Ser Glu Leu Cys Leu
100 105 110
Thr Pro Met Val Glu Lys Val Leu Asp Pro Thr Leu Ser Ala Ser Phe
115 120 125
His Gln Met Lys Lys Trp Val Tyr Glu Glu Asp Leu Ser Val Phe Asp
130 135 140
Ile Ser Leu Gly Cys Ser Leu Trp Asp Phe Leu Asn Lys Asn Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Asn Glu Leu Phe Asn Glu Ala Met Thr Arg Asp Ser Gln Val Ser
165 170 175
Asn Leu Ala Leu Arg Asp Cys Lys Leu Val Phe Glu Gly Leu Glu Ser
180 185 190
Ile Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Lys Met Ile Ser
195 200 205
Glu Ala Phe Pro Asp Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Arg Pro Arg Val
210 215 220
Val Glu Asn Leu Ser Gly Asn Asn Asn Leu Thr Tyr Val Ala Gly Asp
225 230 235 240
Met Phe Lys Thr Ile Pro Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Lys Trp Ile
245 250 255
Leu His Asp Trp Ala Asp Lys Asp Cys Arg Lys Ile Leu Glu Asn Cys
260 265 270
Lys Glu Ala Ile Ser Ser Asn Asn Gly Lys Arg Gly Lys Ile Ile Val
275 280 285
Ile Asp Met Val Ile Asn Glu Lys Gln Asp Glu Gln Lys Ile Thr Glu
290 295 300
Leu Lys Leu Leu Trp Asp Val Ser Met Ala Cys Ala Phe Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Arg Asn Glu Glu Glu Trp Asn Lys Leu Phe Met Glu Ala Gly Leu
325 330 335
Gln Asp Tyr Lys Ile Ser Pro Leu Thr Gly Tyr Leu Ser Leu Ile Glu
340 345 350
Ile Tyr Pro
355
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 103
atggcttcaa ataatggccg 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 104
ttattgagat ctatccttaa 20

Claims (6)

1.一种利用甲基转移酶进行甲基转移的方法，其特征在于，包括：在甲基转移酶存在下，将甲基转移到黄酮类化合物的C-4’位，从而形成甲基化的黄酮类化合物，反应如下：
其中，R1为CH3，R2为H、CH3或糖基，R3为H、CH3或糖基，R4为H、CH3或糖基；
其中，所述的甲基转移酶为选自SEQ ID NO:8、6或34所示氨基酸序列的甲基转移酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲基来自甲基供体；所述的甲基供体包括：S腺苷-L-甲硫氨酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的甲基转移酶由核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的多核苷酸编码；
SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的甲基转移酶由核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的多核苷酸编码；或
SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的甲基转移酶由核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示的多核苷酸编码。
4.甲基转移酶的用途，用于将甲基转移到黄酮类化合物的C-4’位，从而形成甲基化的黄酮类化合物，反应如下：
其中，R1为CH3，R2为H、CH3或糖基，R3为H、CH3或糖基，R4为H、CH3或糖基；
其中，所述的甲基转移酶为选自SEQ ID NO:8、6或34所示氨基酸序列的甲基转移酶。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的甲基来自甲基供体；所述的甲基供体包括：S腺苷-L-甲硫氨酸。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的甲基转移酶由核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的多核苷酸编码；
SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的甲基转移酶由核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的多核苷酸编码；或
SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的甲基转移酶由核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示的多核苷酸编码。
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