CN106011097A

CN106011097A - 粗裂地钱氧甲基转移酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN106011097A
Application number: CN201610334622.7A
Authority: CN
Inventors: 程爱霞; 许瑞雪; 刘慧�
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2016-05-19
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-05-19
Also published as: CN106011097B

Abstract

本发明公开了一种粗裂地钱氧甲基转移酶及其编码基因与应用。该粗裂地钱氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明提供的MpaOMT1基因是首次发现的在粗裂地钱中能够表达氧甲基转移酶的基因，其编码的氧甲基转移酶具有广谱的催化活性，能够用于制备生产甲基化的苯丙素、香豆素或黄酮等多类化合物，其中对槲皮素、杨梅素及木犀草素等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的甲基化产物，具有较高的应用价值和广阔的应用前景。

Description

粗裂地钱氧甲基转移酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种粗裂地钱氧甲基转移酶及其编码基因与应用。

背景技术

植物体内含有丰富的次生代谢产物，例如黄酮、苯丙素、香豆素和萜类等。这些化合物在植物体内参与生长发育过程、响应生物和非生物胁迫、氧化应激的调节及植物激素的调节等。在适应从水生到陆生的环境变化过程中，苔类植物积累了各种类型的化合物，许多新骨架成分及新药也从苔类植物中被发现。次生代谢产物的后修饰需要氧甲基转移酶的参与，以生成多种苯环上含氧甲基的产物，改变了含芳香类化合物的生理特性和化学活性，扩大了代谢产物的多样性，对于开发植物源药用成分意义重大。

目前已研究的氧甲基转移酶多数来源于含有维管组织的高等植物，而苔藓植物中的氧甲基转移酶极少被鉴定。

粗裂地钱(Marchantia paleacea)为地钱科(Macrhantineae)一种苔类植物的叶状体，属于苔藓植物中的一种，广泛分布于各地，多生于阴暗潮湿的地方。我国苔藓植物资源十分丰富，已报道的约有3000多种。但目前对于粗裂地钱这一植物资源的研究还相对较少，已有的研究多集中于粗裂地钱中化学成分的分离纯化，而从粗裂地钱中分离鉴定出具有广谱催化活性的氧甲基转移酶还未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一个来源于粗裂地钱的氧甲基转移酶及其编码基因与应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供的一种粗裂地钱氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：

(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

上述粗裂地钱氧甲基转移酶的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因(MpaOMT1)中，其核苷酸序列为以下之一：

(1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(2)与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

进一步的，本发明还提供了含有上述编码基因的表达载体。

上述表达载体为重组原核表达载体或重组植物表达载体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述重组原核表达载体为：在表达载体pET32a中插入上述编码基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述重组植物表达载体为：在表达载体pGWB5中插入上述编码基因。

本发明还提供了含有上述表达载体的重组细胞、转化体。

优选的，所述重组细胞为含有上述表达载体的细胞BL21(DE3)或细胞EHA105。

本发明还提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示。

上述粗裂地钱氧甲基转移酶在制备生产甲基化的苯丙素、香豆素或黄酮类化合物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果：

本发明提供的MpaOMT1基因是首次发现的在粗裂地钱中能够表达氧甲基转移酶的基因，本发明利用PCR技术从cDNA获得了其全长序列，通过构建GFP定位载体，用烟草瞬时转化法发现该基因定位于细胞质和细胞核。构建该基因的原核表达载体，IPTG诱导蛋白表达。结果发现其编码的氧甲基转移酶具有广谱的催化活性，能够用于制备生产甲基化的苯丙素、香豆素或黄酮等多类化合物，其中对槲皮素、杨梅素及木犀草素等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的甲基化产物，具有较高的应用价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1：表达基因MpaOMT1扩增产物电泳图，其中，A：从cDNA中扩增MpaOMT1全长结果，B：MpaOMT1ORF扩增结果。

图2：MpaOMT1蛋白SDS-PAGE电泳图；

其中：泳道1：MpaOMT1的上清液；

泳道2：MpaOMT1的沉淀；

泳道3：MpaOMT1的纯化蛋白。

图3：咖啡酰辅酶A、辅酶A、咖啡酸紫外吸收示意图。

图4：MpaOMT1的底物及反应产物。

图5：MpaOMT1的亚细胞定位。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.表达基因MpaOMT1的克隆

1.1 CTAB-PVP法提取粗裂地钱总RNA

(1)取新鲜粗裂地钱植物材料，洗净后用滤纸吸干多余水分。加液氮研磨材料，反复2-3次至材料成粉末状，取少量至提前预冷的离心管中。

(2)加1ml 65℃预热的CTAB-PVP提取液，振荡缓和均匀。

上述CTAB-PVP提取缓冲液配制方法：100mM Tris·HCl(pH 8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；以上溶液用DEPC处理过的ddH₂O配制，高压灭菌后备用。

(3)65℃温浴30min，期间每隔6-10min振荡一下。

(4)冷却后加入600μl氯仿，振荡混合均匀。

(5)4℃13,000rpm离心10min。

(6)取上清转移至新离心管，加入600μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。

(7)重复上步(即用氯仿抽提三次)。

(8)小心吸取上清转移至新的1.5ml离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，-20℃静置3h以上(或4℃静置过夜)。

(9)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。

(10)加入800μl 75％乙醇洗涤沉淀。离心弃上清后挥干剩余乙醇。

(11)加入40μl Proteinase K处理后的灭菌水溶解RNA，制得总RNA。使用BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度及质量。

1.2 cDNA的合成

以提取的粗裂地钱的总RNA为模板，以PrimeScript RT Master Mix逆转录体系通过PCR技术获得cDNA模板链。将下列各组分加入进口PCR管中，轻轻混匀，离心，使混合液集中于PCR管底部。

在PCR仪中逆转录程序如下：37℃,15min；85℃,15s；4℃保温。逆转录产物保存于-20℃，使用前稀释10倍。

1.3 MpaOMT1全长基因的克隆

以稀释的粗裂地钱cDNA为模板，以MpaOMT1 F1/R1为引物，采用PrimeSTAR DNApolymerase体系扩增MpaOMT1目的片段。

MpaOMT1 F1：GCAAGCAGCAGCAGCATAT；(SEQ ID No.3)

MpaOMT1 R1：TTTCTCACCAACCTCGGAC；(SEQ ID No.4)

体系如下：

将以上组分加入进口PCR管混合均匀后，低转速离心，按照以下程序扩增：

①94℃，3min；

②94℃，10S；

③52℃，15S；

④72℃，30S；

⑤Go to②，33times；

⑥72℃，10min。

PCR结果同样进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1-A)，将目的条带切胶回收，方法如下。

将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％，W/V)，并用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：

(1)电泳结束后溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色5min，于紫外灯下快速切下含有目的条带的胶块，将胶块放入1.5mL离心管。

(2)加入500μL Binding Buffer(XP2)，55℃温浴5min至胶块完全溶解。期间每隔2-3min颠倒震荡离心管一次。

(3)将HiBind DNA column置于2mL的收集管中，然后将上述溶胶液转移至HiBindDNA column，室温12,000rpm离心1min。

(4)弃掉收集管中的滤液，HiBind DNA column中加入300μL Binding Buffer(XP2)。室温12,000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液。

(5)加入700μL SPW Wash Buffer，室温12,000rpm离心1min。

(6)重复上步一次。

(7)弃掉滤液，空HiBind DNA column室温12,000rpm离心2min挥干剩余乙醇。

(8)将HiBind DNA column置于新的1.5mL离心管中。在柱子膜中央加入30μLddH₂O，室温静置2min，12,000rpm离心1min。

(9)测定回收率：使用Biophotometer plus核酸蛋白测定仪测定样品浓度及质量，回收片段立即使用或-20℃保存。

1.4目的片段T载体连接

上述胶回收产物依次进行加A连T实验，

加A体系：

各组分混匀后甩一下，按如下PCR程序：72℃，40min；4℃，10min。然后将加A产物与T载体(购自Takara公司)进行连接，反应体系如下：

将各组分轻轻混匀，16℃放置2-3h。

1.5转化

-80℃取出大肠杆菌DH5α感受态细胞(50μL)置于冰上解冻，加入10μL连接产物，轻柔吹打混匀，冰上静置30min；42℃水浴中热击90s后迅速置于冰上，待2min后加入600μL LB培养基，37℃振荡培养1h，待其复苏后取200μL转化液涂于LB固体培养基(含100μg/mL Amp)上，37℃静置培养12-16h。

LB培养基组分(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g，加水溶解后，调pH至7.0，定容。固体培养基加入琼脂(12g/L)后，高压蒸汽灭菌。

1.6重组子阳性克隆鉴定

随机挑选10个单克隆于200uL培养基，37℃振荡培养4h，以菌液为模板进行菌落PCR。体系如下：

扩增程序：

①94℃，5min；

②94℃，30S；

③56℃，30S；

④72℃，60S；

⑤Go to②，33times；

⑥72℃，10min。

菌落PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，能扩增出目的片段大小条带的为阳性克隆，将能扩增出大小合适条带的克隆送博尚生物技术有限公司测序。阳性克隆存菌：菌液930μL加DMSO 70μL，混和均匀后于-80℃保存。

实施例2、原核表达分析

2.1提取MpaOMT1-pMD19-T质粒

分别用质粒小量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒：

(1)将MpaOMT1-pMD19-T-DH5α划LB板(含100μg/mL Amp)，将单克隆挑到4mL抗性LB培养基中，37℃200rpm培养10h，

(2)取菌液室温10,000×g离心1min，弃上清，收集菌体，尽可能倒干上清。

(3)加250μL溶液I(含RNase A)，涡漩震荡至菌体完全悬浮。

(4)加入250μL溶液II，温和颠倒离心管4～6次，得到澄清的裂解液。室温孵育2min。

(5)加入350μL溶液III，立即温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀。

(6)室温13,000g离心10min。小心吸取上清，移至吸附柱(装配好容积2mL收集管)中。室温13,000g离心1min，弃滤过液。

(7)加500μL Buffer HB，13,000g离心1min，清洗吸收柱以除去残余蛋白质，弃滤过液。

(8)加700μL Wash Buffer清洗吸收柱，13,000g离心1min，弃滤过液。

(9)重复步骤8一次。

(10)空柱13,000g离心1min，室温放置3min，除去残留乙醇。

(11)将吸收柱放入干净1.5mL离心管，在滤膜中央加30-50μL无菌去离子水，室温静置2min。10000g离心1min洗脱质粒，立即实验或者-20℃保存。

(12)使用BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪测定提取的DNA浓度及质量。

注意：

a)使用前，将试剂盒中的RNA酶全部加入溶液I，4℃保存。

b)Wash Buffer中加入80mL乙醇，室温保存。

c)溶液II和III使用前检查是否有盐析出，若析出，37℃加热使溶解。

2.2扩增MpaOMT1ORF

以MpaOMT1-pMD19-T质粒为模板，用引物对MpaOMT1-F/R和PrimeSTAR Max DNA聚合酶分别扩增了MpaOMT1的ORF。

MpaOMT1-F：CGGGATCCATGGCGACCGAAGCCGCTGT(SEQ ID No.5)；

MpaOMT1-R：CCCTCGAGTCATACCACTCTGCGGCAAA(SEQ ID No.6)；

体系如1.3。将组分加入进口PCR管混合均匀后，按照以下程序扩增：

①94℃，3min；

②94℃，10S；

③55℃，15S；

④72℃，30S；

⑤Go to②，33times；

⑥72℃，10min。

PCR产物经凝胶电泳分离后，切下目的片段并回收(结果见图1-B)。

2.3酶切

用限制性内切酶BamH I和Xho I分别消化MpaOMT1的扩增产物和载体pET32a，体系如下：

将以上组分混合均匀后，37℃反应3h，然后用凝胶电泳进行分离，切胶并回收酶切产物。

2.4连接、转化及阳性验证

用T4 DNA连接酶连接目的片段与载体：

上述各组分混合均匀后，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，将单克隆验证阳性并送测序，取测序正确的单克隆存菌并提取质粒。

2.5 MpaOMT1蛋白表达

2.5.1原核表达

(1)将构建好的MpaOMT1-pET32a和空载体pET32a用热激法转入表达型大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆。

(2)挑取阳性单克隆接种于4mL含Amp抗性的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，转速为200rpm。

(3)取菌液按1:100的比例接种到200mL含Amp抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600≈0.5，加入1M的IPTG使其终浓度为0.5mM。

(4)18℃继续培养18h诱导蛋白表达。

(5)将菌液分几次加入到50mL离心管中，5,000rpm离心5min后弃上清，收集菌体。

2.5.2蛋白的分离纯化

(1)洗涤菌体：收集的菌体用适量结合缓冲液(Binding buffer)重悬，5,000rpm离心5min，弃上清。洗涤两次。

Binding buffer(pH 8.0):20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5mM imidazole。

(2)重悬菌体：称重，按每克加5-10mL的比例加入Binding buffer。

(3)机械裂解：菌液置于冰水混合物中，超声波均质裂解菌体。超声条件：3s破碎，5s停，破碎时间3min。

(4)裂解产物离心：4℃下12,000rpm离心20min。收集上清液进行纯化，留部分上清液和沉淀备电泳。

(5)过柱纯化：竖直固定好柱子并用10mL Binding buffer平衡柱子。加入上清液，先用10mL Binding buffer洗脱掉杂蛋白，再用4mL稀释过的Elution buffer(咪唑浓度为250mM)洗脱，收集馏分。

Elution buffer(pH 8.0):20mM Tris-HCl,500mM NaCl,500mM imdazole。

(6)蛋白换液浓缩：干燥超滤管中加入适量三蒸水，冰浴预冷几分钟。倒掉水加入收集液，4,000g离心10min，离心加速度调至最低。总蛋白液浓缩至1mL时，加入4mL Bindingbuffer再浓缩至1mL左右，连续两次。整个过程都应在较低温度下进行。最后，轻轻插入枪头轻轻吹打混匀蛋白液，吸取浓缩液，测定蛋白浓度，并留样电泳。

(7)蛋白保存：立即使用或者加入适量80％甘油使甘油终浓度为20％，将蛋白分装成20μL/管。

(8)处理超滤管：用三蒸水轻轻洗几遍，加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，5,000g离心10min。倒出残留液，将管芯浸入装有2L三蒸水的烧杯中，放置几小时，再换新的水，如此几次不断稀释NaOH的浓度。最后管芯和收集管中都加满三蒸水，4℃保存。

2.5.3蛋白的浓度测定

采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。

(1)完全溶解蛋白标准品BSA，取10μL用0.9％NaCl稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL作为标准品。

(2)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板中，加0.9％NaCl补足到20μL。各做三个平行。

(3)用0.9％NaCl适当稀释留取的蛋白样品，同样加20μL。各做3个平行。

(4)各孔加入200μL G250染色液，室温放置3-5min。

(5)用酶标仪测定595nm处的吸光值(A595)，根据标准品蛋白浓度和对应的吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

2.5.4蛋白电泳

目的蛋白的表达及分离纯化情况用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium DodecylSulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)进行检测。

(1)采用垂直板式电泳。将玻璃板固定到胶架上。

(2)配分离胶：按照下表中的比例配制12％分离胶，加水封闭，静置直至凝固。

(3)配浓缩胶：倒出上层水并用滤纸吸尽多余的水。配制5％的浓缩胶，混匀后立即倒入，将梳子插入到玻璃板间，注意不要产生气泡，凝固后拔出梳子。

SDS-PAGE分离胶和浓缩胶的配制溶液及比例如下：

(4)样品处理及上样：将蛋白上清液和纯化的蛋白分别与5×loading buffer按比例混合，沸水煮5min，12,000rpm离心10min，取上清20μL上样。同时吸取蛋白Marker 5μL点样。

(5)电泳：向电泳槽中加入电泳缓冲液，加样后120V恒压电泳，约2h溴酚蓝至胶的下沿，停止电泳。

(6)染色：取下胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，室温下轻摇染色2h。

(7)脱色：用蒸馏水冲洗掉胶表面的染色液，然后置于脱色液中脱色1-2h，其间更换脱色液数次，至背景干净。

(8)观测结果：照相保存并分析，见图2。

实施例3、蛋白体外活性分析

3.1咖啡酰辅酶A的合成

蛋白MpaOMT1的底物咖啡酰辅酶A无市售，参考文献并结合4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase，4CL)的催化特征，以酶法催化获得，过程如下：

按上述体系30℃反应过夜后，煮沸2分钟，待温度降至室温时加1mL 6N HCl，混匀后用等体积乙酸乙酯萃取三次除去咖啡酸，待乙酸乙酯挥发完后，加44％醋酸铵至4％(W/V)，5000rpm离心5分钟，将上清加到预处理的1000mg LC-18 SPE柱(Supelco,Bellefonte,USA)中。

先加10mL 4％的乙酸铵除去CoA(至紫外分光光度计检测流出的滤液无CoA)，再用三蒸水将咖啡酰辅酶A冲下(每管接1ml液体，冲洗速度≤5ml/min)，边接边检测，弃掉第1管(含大量CoA及微量的咖啡酰辅酶A)，将含咖啡酰辅酶A的2-10管依次合并到玻璃瓶中，-80℃预冻后冻干；将冻干后的粉末用三蒸水溶解后，紫外分光光度计检测最大吸收波长处的吸光度，应用郎伯-比尔定律公式计算咖啡酰辅酶A的浓度：A＝εCL(A：吸光度；ε：吸光系数，Caffeoyl-CoA ε_346nm＝18000M^-1cm^-1；C：样品浓度；L：光程)。将咖啡酰辅酶A溶液稀释到364nm处的吸光度为0.3-0.7，根据稀释倍数和吸光度计算咖啡酰辅酶A的浓度。图3为咖啡酰辅酶A、CoA、咖啡酸紫外吸收曲线。

附：

(1)LC-18 SPE柱预处理：依次用5个柱体积(约用10ml)的甲醇/乙腈、蒸馏水、4％醋酸铵冲洗。

(2)SPE柱用完后依次用三蒸水，50％的甲醇，纯甲醇冲洗。

3.2体外酶活

测定MpaOMT1的体外酶活功能，以加入pET32a蛋白的反应体系为对照组。底物包括：咖啡酰辅酶A、咖啡酸、咖啡醛、咖啡醇、5-羟基阿魏酸、5-羟基松柏醛、5-羟基松柏醇、秦皮乙素、木犀草素、槲皮素、圣草酚、山奈酚、二氢山奈酚、杨梅素、甘草素、柚皮素。体系如下：

将上述组分混匀后，最后加蛋白开始计时，37℃孵育1.0h，加入CH₃CN(100μL)终止反应。当以咖啡酰辅酶A为底物时，加5M NaOH(12μL)终止反应，40℃孵育20min水解咖啡酰辅酶A的硫酯键；用6M HCl(28μL)中和后，等体积的乙酸乙酯萃取咖啡酸和阿魏酸，乙酸乙酯挥发后加甲醇(50μL)重溶。

Mg²⁺依赖性试验是在上述反应体系的基础上用相同浓度的EDTA二钠替换MgCl₂进行。

3.3酶活产物分析

反应产物用反向HPLC鉴定，分析柱为：ZORBAX SB-C18，5μm，4.6×150mm(Agilent)色谱柱；流速1.0mL/min；进样量20μL；检测波长包含254nm、280nm、320nm、346nm；流动相如下：

a.苯丙素类化合物及秦皮乙素的分析条件

b.黄酮类化合物的分析条件(木犀草素、槲皮素、圣草酚、山奈酚、二氢山奈酚、杨梅素、甘草素、柚皮素)

结果显示MpaOMT1对山奈酚、二氢山奈酚、甘草素、柚皮素不含有邻苯二酚结构的黄酮没有催化活性，对咖啡醛活性极小，可催化的底物及生成的产物见图4，催化效率见表1。

表1 MpaOMT1对部分底物的催化效率

3.4以杨梅素为底物时催化产物制备及结构鉴定

以杨梅素为底物，PaOMT1为催化剂，将酶活体系扩大到200mL，37℃反应4h，依次用200mL乙酸乙酯、160mL乙酸乙酯加40mL石油醚、120mL乙酸乙酯加80mL石油醚萃取，将乙酸乙酯和石油醚减压蒸干，用甲醇重溶，过0.22μm的滤膜，HPLC制备。制备柱：ZORBOX SB C18，5μm，9.4×250mm(Agilent)色谱柱；57％的甲醇(H₂O)，流速1.5mL/min；进样量70μL；检测波长为370nm。分离得到产物1和2的混合物、产物3、产物4。将产物1和2的混合物蒸干后用相同的制备柱二次制备：50％的甲醇(H₂O)，流速1.5mL/min；进样量35μL。分离得到产物1、产物2。取微量测质谱，剩余部分用氘代丙酮重新溶解后检测核磁数据，以确定产物结构，产物结构及测试方法如表2所示。

表2

实施例4基因亚细胞定位

4.1 MpaOMT1定位载体的构建

用Gateway构建MpaOMT1的定位载体MpaOMT1-pGWB5-GFP：

(1)扩增：以MpaOMT1-pET32a为模板，MPaOMT1-GFP-F/R为引物；

MpaOMT1-GFP-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAACCATGGCGACCGAAGCCGCTGT；(SEQ ID No.7)

MpaOMT1-GFP-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACCACTCTGCGGCAAAGTG。(SEQID No.8)

(2)BP反应：

混匀后，25℃孵育1h，加0.5μL Proteinase K solution终止反应，轻轻涡旋后，37℃水浴10min；

(3)反应产物转化DH5α(Gent 100μg/mL)；

(4)验证阳性，送测序；

(5)LR反应：

25℃孵育1h后，加0.5μL Proteinase K solution终止反应，37℃培养10min；

(6)转化DH5α(Kan 100μg/mL)，阳性鉴定。

4.2农杆菌感受态制备

(1)取冻存于-80℃的农杆菌EHA105(购自Invitrogen公司)划含利福平100μg/mL的YEP固体培养基，30℃静置培养36h；

YEP固体培养基：酵母提取物10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水定容至1L。分装后加琼脂至2％，高压蒸汽灭菌。

(2)挑单克隆于Rif抗性的液体YEP培养基中，30℃，摇过夜，制得培养液；

YEP液体培养基：酵母提取物10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水定容至1L。高压蒸汽灭菌。

(3)将步骤(2)制得的培养液按体积比1:50的比例接种至50mL Rif抗性的液体YEP培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.4～0.6；

(4)菌液冰浴30min后，4℃5,000rpm离心5min，弃掉上清；

(5)收集的菌体重悬于6mL预冷的0.15M氯化钠溶液中，4℃5,000rpm离心5min，弃上清；

(6)收集的菌体再次用600μL 20mM预冷的氯化钙溶液重悬，分装成100μL/管，制得农杆菌感受态细胞，液氮速冻后-80℃保存备用。

4.3冻融法转化农杆菌

(1)取出农杆菌感受态细胞，冰上融化，分别加入2μL质粒MpaOMT1-pGWB5用移液枪轻柔地吹打混匀，冰上放置25min；

(2)液氮速冻60s，然后于37℃水浴保温3min；

(3)加入400μL无抗性YEP液体培养基，30℃振荡培养4h；

(4)待其复苏后，取200μL菌液涂于含利福平100μg/mL，含卡那霉素50μg/mL的YEP固体培养基上。30℃静置培养36h；

(5)挑取长出的单克隆进行小量振荡培养，菌落PCR鉴定其阳性，制得携带质粒MpaOMT1-pGWB5的农杆菌EHA105。

4.4亚细胞定位

应用烟草瞬时转化法确定目的基因的亚细胞定位：

(1)目的基因重组载体用热激发转入根癌农杆菌EHA105中；

(2)将阳性的EHA105菌株和P19分别接种到10mL的YEP液体培养基(Kan 100μg/mL，Rif 50μg/mL)中，28℃180rpm培养至OD600＝0.5；

(3)4000rpm，25℃离心20min收集菌体，然后用等体积的转化液洗涤；

(4)菌体用少量转化液重悬，使OD600＝1；分别取1mL的P19和EHA105混合，置于室温下放置2-5h；

(5)用1mL的注射器将农杆菌渗透到烟草叶片的下表皮细胞中；

(6)36h后，取经农杆菌渗透的叶片在激光共聚焦显微镜上检测下表皮细胞的荧光信号(设置488nm的氩激发光，GFP信号的发射光波长495-570nm，叶绿体发出的信号波长650-760nm)。结果见图5。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种粗裂地钱氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：

(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2.权利要求1所述粗裂地钱氧甲基转移酶的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为以下之一：

(1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组原核表达载体或重组植物表达载体。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述重组原核表达载体为：在表达载体pET32a中插入权利要求2或3所述编码基因；

所述重组植物表达载体为：在表达载体pGWB5中插入权利要求2或3所述编码基因。

7.含有权利要求4、5或6所述表达载体的重组细胞、转化体或转基因细胞系。

8.如权利要求7所述的重组细胞、转化体或转基因细胞系，其特征在于，所述重组细胞为含有权利要求4、5或6所述表达载体的细胞BL21或细胞EHA105。

9.用于扩增权利要求2或3所述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

10.权利要求1所述的粗裂地钱氧甲基转移酶在制备生产甲基化的苯丙素、香豆素或黄酮类化合物中的应用。