CN103173368A - 一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种达玛烯二醇的生物合成方法，并提供了达玛烯二醇的生产菌株。本发明通过基因工程技术手段构建得到的毕赤酵母工程菌株，能高效重组表达达玛烯二醇合成酶，进而合成原人参二醇合成的前体物----达玛烯二醇，也为最终实现原人参二醇的生物合成及大规模工业化生产奠定了基础。

Description

一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株。

技术背景

几个世纪以来，天然产物尤其是高等植物的代谢产物一直是人类获得药物及其具有药理活性功能的活性物质的主要来源。世界上80%的人口主要依赖植物和植物提取成分维护生命和健康，天然药物及具有药理活性功能的天然产物在保障人类健康方面所发挥的作用愈加得到科学家的重视。

原人参二醇属于植物三萜皂苷类化合物，是传统名贵药材人参和西洋参的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用，还具有广泛抗肿瘤的作用。然而作为原人参二醇的主要来源植物，人参、西洋参需要4到15年的生长栽培阶段，生产上由于连作障碍和病虫害的困扰，品质及其生长环境受到严重限制；同时人参、西洋参等中具有独特药理活性的原人参二醇含量稀少，抗癌成分含量甚微。总之，原人参二醇的天然获得存在着生长周期长，原材料含量低，提取技术复杂，纯度较低等困境。

原人参二醇的人工合成是生物、化学和医药界长期关注和研究的领域。但由于这类化合物化学结构复杂，骨架上有多个手性结构，迄今为止，尚不能通过化学方法合成。近年来,通过基因工程手段在微生物中合成原人参二醇逐渐受到人们的关注。达玛烯二醇（Dammarenediol-II）是原人参二醇合成的前体物，可衍生出原人参二醇。本发明人通过基因工程手段构建重组菌株，用以生产达玛烯二醇。

发明内容

本发明的目的是提供一种达玛烯二醇的生物合成方法，并提供用于生产达玛烯二醇的重组菌株。

本发明设计思路和原理为：达玛烯二醇由2,3-环氧角鲨烯（2，3-oxidosqualene）在达玛烯二醇合成酶（Dammarenediol-II synthase，简称DS）的催化下合成。与其他微生物相比,毕赤酵母（Pichia.pastoris）生长快、安全性高,且为模式生物，其代谢调控研究得比较清楚，特别是发现毕赤酵母自身能够合成达玛烯二醇的前体2,3-氧化角鲨烯,因此本发明人选用毕赤酵母作为合成达玛烯二醇的异源表达宿主。

本发明提供了一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体。

本发明中，所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或者

（b）与SEQ ID NO:1具有95%序列同一性的核苷酸序列。

本发明的一个优选实施方案中，携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体为质粒pPICZa。

本发明的一个优选实施方案中，所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。

另一方面，本发明提供了另一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体和含2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体。

本发明中，所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

（b）与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。

本发明中，所述的2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

（b）与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。

本发明的一个优选实施方案中，所述的含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体为质粒pPicZa。

本发明的一个优选实施方案中，所述的含2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体为质粒Ppic9k。

本发明的一个优选实施方案中，所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。

另一方面，本发明提供了一种生物合成达玛烯二醇的方法，该方法包括：

（1）发酵培养本发明所述重组毕赤酵母工程菌；

（2）收集发酵液，获取达玛烯二醇。

在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养的具体操作为：在BMMY发酵培养基中30℃，200rpm，发酵培养，每隔24h加0.5%的甲醇诱导。所述获取达玛烯二醇的具体操作为：取发酵液，离心收集菌体，加入10ml20%NaOH乙醇溶液破碎，破碎30min，10ml正己烷混匀，室温静置10min，取上清浓缩。

本发明的有益效果

本发明利用基因工程技术手段，实现了达玛烯二醇的生物合成。利用本发明的重组工程菌能提高达玛烯二醇的产量，降低生产成本，为原人参二醇的大规模工业化生产奠定了基础。

附图说明：

图1：DS-pPicZa质粒图谱

图2：GS115-DS菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图

其中：泳道1为GS115-pPic9k（阴性对照）菌体胞内蛋白；泳道2为GS115-DS菌体胞内蛋白。箭头所指为达玛烯二醇合成酶。

图3：GS115-DS菌体胞内代谢产物TLC分析图谱

其中：泳道1为GS115-Ppic9k胞内代谢产物；泳道2，3为GS115-DS胞内代谢产物；泳道4为达玛烯二醇标准品。箭头所指为达玛烯二醇。

图4：MS质谱分析图谱

其中：A为空白溶剂乙腈质谱分析（阴性对照）；B为达玛烯二醇标准品质谱分析；C为GS115-DS菌体胞内目标产物质谱分析。图中框出的部分图谱表明产物为达玛烯二醇。

图5：GS115-DS-SS菌体胞内合成产物TLC分析图谱

其中：泳道1为GS115-pPic9k菌体胞内合成产物；泳道2为GS115-SS菌体胞内合成产物；泳道5为达玛烯二醇标准品；泳道3，4，6，7，8，9分别为经甲醇诱导24h、48h、72h、96h、120h、144h后的GS115-DS-SS菌体胞内合成产物。箭头所指为达玛烯二醇。

具体实施例

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实例中所用毕赤酵母GS115工程菌株，及其表达质粒均购自invrogen公司。实例中所用Cycle-pure试剂盒，Plasmid试剂盒，Gel Extraction试剂盒均购自OMEGA公司。限制性内切酶购自上海宝生Takara公司。

实施例1  达玛烯二醇合成酶表达载体的构建

将人参基因组中达玛烯二醇合成酶基因GenBank:AB265170.1依据毕赤酵母GS115密码偏爱进行密码子优化，优化后的达玛烯二醇合成酶基因序列为SEQ ID NO:1，该基因由上海青兰生物科技有限公司合成。

设计基因片段两端酶切位点AsuII和XbaI。分别利用引物F：

5’-TACTTCGAAATGGCCTGGAAGCAAAAAGGTGCTC-3’和R:

5’-GCCTCTAGATTAAATTTTCAACTGCTGATGTTAG-3’进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃，5min；94℃，30S，58℃，30S，30个循环；72℃，2.5min；72℃，10min。

将PCR扩增产物与毕赤酵母表达质粒pPicZa（购自Invitrogen公司），经AsuII和XbaI双酶切，37℃酶切过夜后，酶切产物琼脂糖胶回收纯化。以酶切PCR产物与酶切线性化质粒pPicZa摩尔浓度10:1的设计连接体系，加入0.5ul T4连接酶，16℃连接过夜，将连接产物加入100ul大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s转化。加入1ml LB培养基，37℃复壮1h，收集菌体涂于博来霉素抗性筛选LB平板中，37℃培养过夜。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，序列分析正确后，重组质粒命名为DS-pPICZa。质粒图谱如图1所示。

实施例2  达玛烯二醇合成酶重组表达工程菌的构建

将阳性转化子接种于LB培养基中，37℃，200rpm培养8h，收集菌体，常规方法提取重组质粒DS-pPICZa。SacI单酶切处理，37℃过夜，PCR纯化回收，收集于15ul水中，4℃保存待用。

制备毕赤酵母GS115感受态细胞，加入SacI酶切处理后的DS-pPICZa质粒，混匀，冰浴放置5min，转入电转杯，1.98kv，5.8ms，电击转化。加入1ml提前预冷的山梨醇，30℃，温浴30min。离心收集菌体，加入1ml YPD培养基，30℃200rpm复壮1h后，收集菌体，涂于100ug/ml博来霉素抗性筛选YPD平板，30℃，培养48h-72h。800ug/ml博来霉素抗性筛选高拷贝转化子，菌落PCR验证目的基因DS，成功转化的菌株命名为GS115-DS。

实施例3  发酵培养与达玛烯二醇的生产

将GS115-DS在BMMY发酵培养基中30℃，200rpm，发酵培养，每隔24h加0.5%的甲醇诱导。发酵96h后，离心收集菌体，溶于400ul超纯水中，超声破碎，SDS-PAGE分析检测GS115-DS胞内蛋白表达情况，实验结果如图2所示。已知达玛烯二醇合成酶蛋白分子量为88kda，图2中GS115-DS胞内蛋白所在泳道2与阴性对照泳道1相比，在90kda左右多出一条蛋白条带，即箭头所指位置，说明达玛烯二醇合成酶在GS115-DS胞内得到表达。

取发酵液2mL，离心收集菌体，加入400ul20%NaOH乙醇溶液，破碎30min，400ul正己烷混匀，室温静置10min，取上清浓缩。以苯：丙酮（19:1）为展开剂，0.5%磷钼酸甲醇溶液为显色剂，将GS115-DS胞内代谢产物进行TLC分析，实验结果如图3所示，与阳性对照达玛烯二醇标准样品所在泳道4相比，GS115-DS胞内代谢产物所在泳道2，3中出现与达玛烯二醇相同极性的物质（即箭头所指位置）。

取发酵液200ml，收集菌体，加入10ml20%NaOH乙醇溶液破碎，破碎30min，10ml正己烷混匀，室温静置10min，取上清浓缩。取上清浓缩点样制备TLC，以达玛烯二醇标准样品做对照。苯：丙酮（19:1）展开剂展开后，0.5%磷钼酸甲醇溶液显色。刮取与标准品相同位置处的硅胶，收集于1.5ml离心管中。丙酮萃取，离心取上清，蒸干，再溶于适量乙腈，进行MS分析。结果如图4所示，MS分析图谱与达玛烯二醇标准样品对应一致，说明本发明构建的毕赤酵母工程菌株GS115-DS可以体内合成天然产物达玛烯二醇。

实施例4  通过2，3-环氧角鲨烯合成酶(SS)和达玛烯二醇合成酶(DS)双基因共表达生物合成达玛烯二醇

以野生型酿酒酵母基因组为模板，设计PCR克隆上下游引物，分别为F：

ATCGGATCCATGTCTGCTGTTAACGTTGCACCTG；R：

ATCGCGGCCGCTTAACCAATCAACTCAC。PCR扩增条件如下表所示

将PCR扩增产物连接T载体，测序分析后，得知其核苷酸序列为SEQ ID NO:2

PCR扩增产物与毕赤酵母表达质粒Ppic9k分别用BamHI和NotI双酶切，37℃，4h，将双酶切产物分别进行琼脂糖电泳，切胶回收目的条带。以基因片段:表达质粒摩尔浓度为10:1设计连接体系,加入0.5μl T4连接酶，16℃连接过夜。连接后的重组质粒转化大肠杆菌DH5a，42℃热击90s，加1ml LB培养基，37℃培养1h复壮，涂于100ug/ml的氨苄霉素LB平板中，37℃培养过夜。隔天挑取转化子菌落PCR。琼脂糖电泳分析目的条带，有目的条带的相应菌株极为阳性转化子，挑取阳性转化子，接种于LB培养基中，37℃200rpm培养8h，提重组质粒，序列分析正确后，将重组质粒命名为SS-BN-pPic9K。

将重组质粒SS-BN-Ppic9k经过SalI单酶切，37℃过夜后，Cycle-pure试剂盒纯化回收，溶于15ul水中，保存待用。制备毕赤酵母GS115细胞感受态，将SalI单酶切后的SS-BN-Ppic9K质粒加于毕赤酵母GS115感受态细胞100ul中，冰浴20min，转入电转杯中，2kv，6.0ms电击，加入1ml冰浴山梨醇，30℃温浴30min，涂于组氨酸缺陷（MD）筛选平板。30℃，避光培养48h-72h，G418遗传霉素梯度筛选高拷贝转化子，菌落PCR验证目的基因SS，阳性转化子命名为GS115-SS。

挑取验证正确转化子在BMMY发酵培养基中进行发酵培养，每24h添加0.5%的甲醇诱导。发酵96h后离心收集菌体，溶于1mL超纯水中，超声破碎，12%SDS-PAGE凝胶电泳分析检测GS115-SS胞内蛋白表达情况，电泳结果显示2,3-环氧角鲨烯合成酶在GS115-SS中得到表达。

将重组表达质粒DS-pPICZa经SacI酶切，37℃过夜，酶切产物PCR纯化回收，溶于15ul水中，4℃保存待用。以上述工程菌株GS115-SS为母株，制备GS115-SS感受态细胞100ul，与SacI限制性内切酶处理后的DS-pPICZa充分混合，冰浴中放置30min，无菌条件下转入电转杯中，2.0kv，6.0ms，立即加入1ml冰浴的山梨醇，30℃温浴30min后，离心收集菌体，加入1ml YPD液体培养基，30℃200rmp复壮1h，离心收集全部菌体，涂于100ug/ml博来霉素抗性YPD平板，以800ug/ml高浓度博来霉素筛选高拷贝转化子，提取高拷贝转化子基因组，以基因组为模板，PCR分别扩增目的基因DS,SS。挑取两个基因均可扩增出的菌株，命名为GS115-DS-SS，

将GS115-DS-SS在BMMY培养基中30℃200rpm发酵培养，每隔24h添加0.5%的甲醇诱导。分别收集甲醇诱导24h，48h，72h，96h，120h及144h的发酵液，收集8mL菌体，加入400ul20%NaOH乙醇溶液破碎30min，400ul正己烷萃取，室温静置10min后，取上清浓缩，进行TLC图谱分析代谢产物，实验结果如图5所示，与阳性对照达玛烯二醇标准样品所在泳道5相比，GS115-DS-SS胞内代谢产物所在泳道3，4，6，7，8，9中出现与达玛烯二醇相同极性的物质（即箭头所指位置）。

结果表明，本发明构建的毕赤酵母工程菌株GS115-DS-SS通过共表达2，3-环氧角鲨烯合成酶和达玛烯二醇合成酶，能在体内高效合成达玛烯二醇。

序列表

 

<110>  青岛蔚蓝生物集团有限公司

 

<120>  一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  2307

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

 

<220>

<221>  基因

<222>  (1)..(2307)

 

<400>  1

atgtggaagc aaaaaggtgc tcagggtaat gacccatatc tttattcaac caacaatttc     60

 

gtcggtagac aatactggga gtttcagcca gatgctggta ctcctgaaga gagagaagag    120

 

gttgagaagg ccagaaaaga ctacgtcaac aataagaaat tgcatggtat tcacccatgt    180

 

tctgatatgc ttatgagaag acaattgatt aaggaatccg gaatcgactt gctttcaatt    240

 

ccacctttga gacttgatga aaacgagcaa gttaattatg acgcagttac tacagctgtc    300

 

aagaaagcct tgagacttaa cagagccatt caggcacatg atggtcactg gcctgctgag    360

 

aatgccggaa gtttgcttta caccccacct cttattatcg ctttgtacat ctctggtact    420

 

atcgatacaa tcttgaccaa gcaacataag aaagaattga tcagattcgt ttacaaccac    480

 

cagaatgaag acggtggatg gggtagttat atcgagggac attctactat gattggttca    540

 

gttcttagtt acgtcatgtt gagattgctt ggtgaaggat tggcagagtc cgatgacggt    600

 

aacggagctg ttgaaagagg tagaaagtgg atcttggatc acggtggagc tgccggtatt    660

 

ccatcatggg gaaaaactta ccttgctgtt ttgggtgtct atgaatggga gggatgtaat    720

 

ccacttccac ctgaattttg gttgttccct tcttcctttc cattccatcc tgctaagatg    780

 

tggatctact gtagatgcac ctatatgcca atgtcctact tgtatggtaa aagatatcac    840

 

ggacctatca ctgatttggt tctttcattg agacaagaaa tctacaacat cccatatgag    900

 

cagattaagt ggaaccaaca gagacataat tgttgcaaag aagacttgta ctatcctcac    960

 

actcttgttc aagatttggt ctgggacggt ttgcattact tttctgagcc attcttgaag   1020

 

agatggcctt tcaataagct tagaaagaga ggtttgaaga gagttgtcga attgatgaga   1080

 

tatggagcta cagagaccag attcattacc actggtaacg gagaaaaggc cttgcaaatt   1140

 

atgtcctggt gggcagaaga tccaaatggt gacgagttca aacatcacct tgcaagaatc   1200

 

cctgatttct tgtggattgc tgaagacggt atgacagttc aatcttttgg ttctcagctt   1260

 

tgggattgta ttttggcaac tcaagctatt atcgccacaa acatggtcga agagtacggt   1320

 

gacagtttga agaaagctca tttctttatc aaggaatctc agattaaaga gaacccacgt   1380

 

ggtgactttt tgaagatgtg tagacaattc accaaaggtg cttggacttt ttccgatcag   1440

 

gaccacggat gtgttgtctc agattgcact gccgaagcat tgaagtgctt gcttttgctt   1500

 

tctcaaatgc cacaggacat tgttggtgaa aaacctgaag tcgagagatt gtacgaggca   1560

 

gttaacgtct tgctttattt gcaatcaaga gttagtggtg gattcgctgt ttgggaacca   1620

 

cctgtcccaa agccttacct tgaaatgttg aatccttcag agatttttgc tgatatcgtt   1680

 

gtcgaaagag agcacatcga gtgtactgct tctgttatta agggtcttat ggccttcaaa   1740

 

tgcttgcatc caggacacag acaaaaggaa atcgaggata gtgttgctaa agccattaga   1800

 

tacttggaaa gaaaccagat gcctgacggt tcctggtacg gtttttgggg aatctgtttc   1860

 

ctttacggaa ctttctttac attgagtggt tttgcatctg ctggaagaac atatgataac   1920

 

tccgaagctg ttagaaaggg tgtcaaattt ttcttgtcaa cccaaaatga agagggtgga   1980

 

tggggagaat ctttggagtc ctgcccatca gagaagttca ctcctcttaa gggtaacaga   2040

 

acaaatttgg ttcaaacctc ttgggccatg cttggattga tgtttggtgg acaggcagaa   2100

 

agagacccaa ctcctttgca tagagctgct aagttgctta tcaacgccca aatggataat   2160

 

ggtgacttcc cacaacagga aatcacagga gtttactgta aaaactctat gttgcactac   2220

 

gctgagtata gaaatatttt tcctttgtgg gcattgggag agtatagaaa aagagtctgg   2280

 

cttcctaaac atcagcagtt gaaaatc                                       2307

 

 

<210>  2

<211>  1491

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

 

<220>

<221>  基因

<222>  (1)..(1491)

 

<400>  2

atgtctgctg ttaacgttgc acctgaattg attaatgccg acaacacaat tacctacgat     60

 

gcgattgtca tcggtgctgg tgttatcggt ccatgtgttg ctactggtct agcaagaaag    120

 

ggtaagaaag ttcttatcgt agaacgtgac tgggctatgc ctgatagaat tgttggtgaa    180

 

ttgatgcaac caggtggtgt tagagcattg agaagtctgg gtatgattca atctatcaac    240

 

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gaaaagaatg aggttgttgg tgccaaggtt gacattgatg gccgtggcaa ggtggaattc    600

 

aaagcccact tgacatttat ctgtgacggt atcttttcac gtttcagaaa ggaattgcac    660

 

ccagaccatg ttccaactgt cggttcttcg tttgtcggta tgtctttgtt caatgctaag    720

 

aatcctgctc ctatgcacgg tcacgttatt cttggtagtg atcatatgcc aatcttggtt    780

 

taccaaatca gtccagaaga aacaagaatc ctttgtgctt acaactctcc aaaggtccca    840

 

gctgatatca agagttggat gattaaggat gtccaacctt tcattccaaa gagtctacgt    900

 

ccttcatttg acgaagccgt cagccaaggt aaatttagag ctatgccaaa ctcctacttg    960

 

ccagctagac aaaacgacgt cactggtatg tgtgttatcg gtgacgctct aaatatgaga   1020

 

catccattga ccggtggtgg tatgactgtc ggtttgcatg atgttgtctt gttgattaag   1080

 

aaaattggtg acctagactt cagcgaccgt gaaaaggttt tggatgaatt actagactac   1140

 

catttcgaaa gaaagagtta cgattccgtt attaacgttt tgtcagtggc tttgtattct   1200

 

ttgttcgctg ctgacagcga taacttaaag gcattacaaa aaggttgttt caaatatttc   1260

 

caaagaggtg gcgattgtgt taacaaaccc gttgaatttc tgtctggtgt cttgccaaag   1320

 

cctttgcaat tgaccagggt tttctttgct gtcgcttttt acaccattta cttgaacatg   1380

 

gaagaacgtg gtttcttggg attaccaatg gctttattgg aaggtattat gatcttgatc   1440

 

acagctatta gagtattcac cccatttttg tttggtgagt tgattggtta a            1491

 

Claims (9)

1.一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体。

2.权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或者

（b）与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。

4.一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体和含2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体。

5.权利要求4所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或者

（b）与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。

6.权利要求4或5所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；或者

（b）与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。

7.权利要求4至6中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。

8.一种生物合成制备达玛烯二醇的方法，该方法包括：

（a）发酵培养权利要求1至7中任一项所述重组毕赤酵母工程菌；

（b）收集发酵液，获取达玛烯二醇。

9.权利要求8所述的制备达玛烯二醇的方法，其中所述的发酵培养的具体操作为：在BMMY发酵培养基中30℃，200rpm，发酵培养，每隔24h加0.5%的甲醇诱导。

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