CN109706100A

CN109706100A - 一株巴氏葡萄球菌突变株及其在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用

Info

Publication number: CN109706100A
Application number: CN201910084383.8A
Authority: CN
Inventors: 袁红莉; 罗莹; 刘亮; 李宝珍
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Shandong Liangtu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: CN109706100B

Abstract

本发明公开了一株巴氏葡萄球菌突变株及其在制备5‑氨基乙酰丙酸中的应用。本发明的巴氏葡萄球菌突变株为能利用木质纤维素产生5‑氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌突变株Staphylococcus pasteuri PK8，该突变株的保藏编号为CGMCC No.16178，保藏日期为2018年7月30日。本发明还公开了该突变株利用经预处理的木质纤维素及土豆渣废料制备5‑氨基乙酰丙酸的方法。实验证明：该突变株遗传性状稳定，且可利用资源丰富、廉价的木质纤维素或土豆渣可发酵糖液为碳源合成5‑氨基乙酰丙酸，并耐受预处理过程中产生的抑制物良好的生长，不仅降低了工艺过程的成本，而且有利于生态环境保护，实现可持续发展。

Description

一株巴氏葡萄球菌突变株及其在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一株巴氏葡萄球菌突变株及其在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物体内合成四氢吡咯化合物(卟啉、叶绿素、血红素、维生素B12)的前体物质，广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。

ALA在农业、医药领域具有广泛用途。在农业领域中，ALA可以促进绿色植物的光合作用、调节植物的呼吸作用、促进植物组织分化、提高植物抗逆性、改善农产品质量。低浓度使用可以显著提高作物产量，而高浓度可以用作安全无污染的除草剂以及杀虫剂使用。在医药领域中，由于具有选择性杀死癌细胞的作用，被称为第二代光动力学药物。ALA对光敏剂原卟啉Ⅸ的刺激作用被用于光动力学癌症治疗和肿瘤定位。在皮肤病治疗和铅中毒的检测中也得到了广泛应用。基于ALA的功能和广泛的应用前景，其合成研究已经引起前所未有的重视。

以马尿酸和琥珀酸、糠醛等杂环类物质以及乙酰丙酸等物质为原料的化学合成工艺是目前生产ALA的主要方法。但是化学合成法工艺繁琐、副产物多、分离提纯难、得率低而且还会造成严重的环境污染。利用微生物发酵产ALA可以有效缓解化学合成所面临的困境。目前报道的能够产生ALA的微生物有光合细菌Rhodobacter sphaeroides、Rhodopseudanonas palustris、Rhodopseudomonas sp.，以及Propionibacteriumriboflauimc。光合细菌培养困难，工艺复杂，产业化受限，而且ALA产量普遍不高且培养过程需要高浓度葡萄糖为碳源，导致成本增加。因此新的菌种资源的挖掘、提高菌株产量并降低生产成本是微生物源ALA的主要研究方向。

葡萄球菌(Staphylococcus)虽然已被报道能产生ALA，但目前均是以葡萄糖作为发酵底物，而且产量低(6.88mg/L)，所以成本高，限制了未来的产业化可能。

利用物理诱变技术可以实现对菌株的随机突变，是提高微生物产生目标产物及扩大底物范围的有效手段。常压室温等离子体(ARTP)诱变技术是近年来发展起来的高效诱变技术，其原理是大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流，作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，ARTP诱变技术能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株；与分子操作手段相比，ARTP进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。

我国作为农业大国，每年约产生6-7亿吨的木质纤维素原料，如玉米芯、玉米秸秆和土豆渣等，其中含有丰富的纤维素和半纤维素类物质。木质纤维素原料的焚烧和随意堆置造成环境污染，有效地利用这些农业废弃物变废为宝，转化为其他高附加值产品成为研究热点。但是木质纤维素在高温和酸性条件下会产生很多抑制菌体生长和发酵的抑制物，主要包括有机酸类化合物，呋喃化合物以及酚类化合物。所以获得对抑制物高耐受性且稳定发酵的菌株具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK8。

本发明提供的巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK8的保藏编号为CGMCCNo.16178。

本发明提供的巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK8的分类命名为巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri，已于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

本发明提供的巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK8是以分离自马齿苋根际土的高产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK菌株为出发菌株，经紫外线诱变以及常压室温等离子体诱变处理，初筛、复筛后得到的PK菌株突变体。对所述巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK菌株进行诱变处理的方法可按照如下步骤进行：将PK菌株接种至LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养。用生理盐水稀释菌液浓度至10⁷个/ml。取15ml稀释后菌液置于无菌空平板中，在距离紫外灯(20w)20cm处分别照射1min、2min、3min、4min、5min。分别取经不同剂量紫外线处理后的菌液(10μl)置于ARTP诱变育种仪(以氦气作为工作载气，设定功率为120W，通气量为10L/min，等离子发射源与样品之间的距离为2mm)诱变15s、30s、40s、50s、60s、80s、100s、120s。相比于巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK菌株，本发明提供的巴氏葡萄球菌Staphylococcuspasteuri PK8的5-氨基乙酰丙酸产量(48.74mg/L)显著提高。

本发明的另一个目的是提供巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂的新用途。

本发明提供了巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。

本发明还提供了巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在以农业废弃物或葡萄糖为原料制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。

上述应用中，所述农业废弃物可为木质纤维素类农业废弃物或土豆渣；进一步的，所述木质纤维素类农业废弃物可为玉米芯、甘蔗渣或柳枝稷。在本发明的一个具体实施例中，所述农业废弃物为玉米芯或土豆渣。

本发明还提供了巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在提高5-氨基乙酰丙酸产量中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种用于制备5-氨基乙酰丙酸的产品。

本发明提供的用于制备5-氨基乙酰丙酸的产品的活性成分为巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂。

本发明的最后一个目的是提供一种制备5-氨基乙酰丙酸的方法。

本发明提供的制备5-氨基乙酰丙酸的方法包括如下步骤：以农业废弃物或葡萄糖为原料，利用巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri合成5-氨基乙酰丙酸。

上述制备5-氨基乙酰丙酸的方法中，所述农业废弃物可为木质纤维素类农业废弃物或土豆渣；进一步的，所述木质纤维素类农业废弃物可为玉米芯、甘蔗渣或柳枝稷。

上述制备5-氨基乙酰丙酸的方法可包括如下步骤：

1)将巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri接种至种子培养基中进行培养，得到种子液；

2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行培养，得到发酵产物；所述发酵产物中含有5-氨基乙酰丙酸；

上述制备5-氨基乙酰丙酸的方法中，所述种子培养基和所述发酵培养基中均含有农业废弃物水解物或葡萄糖。所述农业废弃物水解物可为将农业废弃物进行酸处理后得到的可发酵糖液。

对木质纤维素类农业废弃物进行酸处理的方法具体可按照如下步骤进行：取8g木质纤维素类农业废弃物样品(如玉米芯、甘蔗渣或柳枝稷)先用(0.5-1)％稀硫酸200ml，121℃处理(30-60)min，冷却后抽滤收集固体残渣，然后加入30ml(50-72)％硫酸30℃处理(30-60)min，再加入840ml水，121℃处理(30-60)min，冷却后抽滤收集滤液，用固体的Ca(OH)₂调滤液pH至7.0，过滤后得到的上清液即为可发酵糖液。

对土豆渣进行酸处理的方法具体可按照如下步骤进行：取20g土豆渣样品用(1.0-1.7)％稀硫酸200ml(固液比为1:10)，121℃处理(90-120)min，冷却后抽滤收集滤液，用固体的Ca(OH)₂调滤液pH至7.0，过滤得到的上清液即为可发酵糖液。

进一步的，

以葡萄糖为原料制备5-氨基乙酰丙酸时，

所述种子培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别如下：葡萄糖(1-5)g/L、胰蛋白胨(5-10)g/L、NaCl(5-10)g/L、酵母粉(3-5)g/L，初始pH 6.5-7.0。

所述发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别如下：葡萄糖(10-20)g/L、酵母粉(8-12)g/L、胰蛋白胨(10-20)g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH 6.5-7.0，去离子水配制。

以农业废弃物水解物为原料制备5-氨基乙酰丙酸时，

所述种子培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别如下：可发酵糖液(以葡萄糖计)(1-5)g/L、胰蛋白胨(5-10)g/L、酵母粉(3-5)g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH 6.5-7.0。

所述发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别如下：可发酵糖液(以葡萄糖计)(15-20)g/L、胰蛋白胨(10-20)g/L、酵母粉(8-12)g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH6.5-7.0。

更进一步的，以葡萄糖为原料制备5-氨基乙酰丙酸时，

所述1)中，所述培养的条件为(28-37)℃、(100-200)r/min培养(12-24)h；

所述2)中，所述培养的条件为(30-37)℃，(100-200)r/min培养(12-24)h。

以农业废弃物水解物为原料制备5-氨基乙酰丙酸时，

所述1)中，所述培养的条件为(28-37)℃，(180-220)rpm培养(12-24)h。

所述2)中，所述培养的条件为(30-37)℃，(180-220)rpm培养(2-4)d。

上述制备5-氨基乙酰丙酸的方法中，所述1)前还包括将巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri接种至活化培养基中进行活化培养的步骤。

进一步的，所述活化培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别如下：胰蛋白胨(5-10)g/L、NaCl(5-10)g/L、酵母粉(3-5)g/L、琼脂18g/L，pH 6.5-7.0。

更进一步的，所述活化培养的条件为(28-37)℃培养(24-36)h。

上述应用或产品或方法中，所述巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri为上述巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK8CGMCC No.16178。

本发明的有益效果如下：本发明以筛选出的高产5-氨基乙酰丙酸的PK菌株为出发菌株，经紫外线诱变以及常压室温等离子体诱变处理，初筛、复筛得到一株5-氨基乙酰丙酸产量提高约30％的菌株PK8，经过连续多次传代实验，该突变株遗传性状稳定，且可利用资源丰富、廉价的木质纤维素或土豆渣可发酵糖液为碳源合成5-氨基乙酰丙酸，并耐受预处理过程中产生的抑制物良好的生长。另外该突变株在发酵(24-48)h时得到最大产量，且在此时发酵液处于酸性条件，可有效防止ALA的分解。

本发明提供了一株筛选并经诱变得到的高产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌新菌株，以及利用此菌株以木质纤维素类农业废弃物制备5-氨基乙酰丙酸的方法。本发明以该突变株作为菌种，可利用木质纤维素或土豆渣废料为原料合成5-氨基乙酰丙酸，不仅降低了工艺过程的成本，而且有利于生态环境保护，实现可持续发展。

附图说明

图1为5-氨基乙酰丙酸的标准曲线。

保藏说明

拉丁名：巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri

菌株编号：PK8

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年7月30日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16178

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的玉米芯样品的制备方法如下：将玉米芯(来源于河南省宜阳县)晒干后，使用粉碎机(拜杰多功能粉碎机BJ-150)磨碎，过50目的筛子，得到玉米芯样品。

下述实施例中的土豆渣的制备方法如下：将土豆切碎放入水中，煮60min，4层纱布过滤后，剩余残渣放入烘箱烘干，得到土豆渣样品。

实施例1、PK8菌株的获得及保藏

一、PK菌株的获得及鉴定

1、PK菌株的获得

选取生长健康的马齿苋苗，轻拔出马齿苋苗，取其根际土壤样品约2g，悬浮于质量分数为0.9％的NaCl溶液中，稀释到10^-4、10^-5，涂布至LB平板，30℃培养24h。挑选单菌落，LB平板划线得到单菌落后采用葡萄糖为单一碳源进行摇瓶发酵，发酵36h后，对发酵液进行取样，离心，收集上清液。采用分光光度法定量测定5-氨基乙酰丙酸(ALA)浓度。通过筛选得到一株高产ALA的菌株，并将该菌株命名为PK。

2、PK菌株的鉴定

1)生理生化鉴定

对步骤一筛选的PK菌株按微生物学实验教程进行生理生化特性鉴定，结果见表1。

表1、生理生化特性鉴定结果对照表

鉴定项目	PK菌株
		葡萄糖产酸	+
甲基红实验	-
		V-P实验	+
硝酸盐还原	-
		产吲哚	-
产H<sub>2</sub>S	-
		明胶液化	-
柠檬酸钠	-

2)分子鉴定

提取PK菌株的基因组DNA，采用通用引物按分子生物学实验指南的方法对PK菌株进行16S rRNA基因鉴定，获得16S rRNA基因序列，该序列大小为1457bp，如序列表中序列1所示。

经过上述鉴定结果可确定PK菌株属于巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri。

二、PK菌株在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用

1、将巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK在活化培养基(活化培养基配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，初始pH 6.5)中37℃培养24h，得到活化后的PK。

2、用250ml三角瓶装50ml种子培养基(种子培养基配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、酵母粉5g/L，初始pH 6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并接种步骤1获得的活化后的PK，接种后于37℃、200r/min摇床培养15h，得到种子发酵液。

3、用500ml三角瓶装80ml发酵培养基(发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：酵母粉10g/L、葡萄糖10g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并按2％的接种量将步骤2获得的种子发酵液接入发酵培养基，接入后于37℃，200r/min摇床培养36h，得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液。

采用分光光度法定量测定含5-氨基乙酰丙酸的发酵液中的ALA含量。具体步骤如下：绘制5-氨基乙酰丙酸的标准曲线：分别取400μl的不同浓度的5-氨基乙酰丙酸标准品溶液(浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的5-氨基乙酰丙酸标准品)，加入200μl乙酸盐缓冲液和100μl乙酰丙酮，沸水浴15min。冷却至室温后，加入700μlEhrlich’s试剂(Ehrlich’s试剂配方如下：称1g对二甲氨基苯甲醛，加入30ml冰乙酸中，然后加入8ml高氯酸(70％)，用冰乙酸定容至50ml，并且现配现用)，反应20min，使用分光光度计在554nm下进行检测。以5-氨基乙酰丙酸标准品溶液的浓度为横坐标，OD_554nm值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线如图1所示。

取步骤3得到含5-氨基乙酰丙酸发酵液离心后的400μl上清液，加入200μl乙酸盐缓冲液和100μl乙酰丙酮，沸水浴15min。冷却至室温后，加入700μl Ehrlich’s试剂，反应20min，使用分光光度计在554nm下进行检测，并将得到的OD_554nm值代入标准曲线，计算得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液中的ALA含量为35.62mg/L。

三、突变株PK8的获得

1、挑取PK菌株的单菌落转接到活化培养基(活化培养基配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，初始pH 6.5)中，37℃，200rpm培养12h，得到PK菌液。

2、用生理盐水稀释PK菌液，使得细胞浓度约为10⁷个/ml，取15ml菌液置于无菌空平板中，在距离紫外灯(20w)20cm处分别照射1min、2min、3min，得到不同剂量紫外线处理后的PK菌液。

3、分别取10μl经不同剂量紫外线处理后的PK菌液，使用ARTP诱变育种仪(购自洛阳华清天木生物科技有限公司，仪器型号为ARTP-IIIS)按照ARTP诱变系统操作说明进行ARTP诱变处理。ARTP诱变处理的参数如下：以氦气作为工作载气，设定功率为120W，通气量为10L/min，等离子发射源与样品(紫外线处理后的PK菌液)之间的距离为2mm。设定如下不同的处理时间：0s、15s、30s、40s、50s、60s、80s、100s、120s。

4、诱变处理后的样品稀释涂布至LB平板，37℃倒置培养2d，通过平板菌落计数，以紫外处理过的PK菌液为对照。绘制致死率曲线，选择致死率约为大于80％的最佳处理时间进行菌株筛选。紫外诱变最佳处理时间为3min，致死率为96.19％。ATRP仪最佳处理时间为50s，致死率为98.6％。

5、挑取单菌落，接入发酵培养基(发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：酵母粉10g/L、葡萄糖10g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH 6.5-7.0)，接入后于37℃，200r/min摇床培养36h，得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液。检测发酵液中的ALA产量，选择ALA产量最高的突变菌株，并将其记作突变株PK8。突变株PK8发酵培养生产得到的ALA产量为48.74mg/L。

四、突变株PK8的遗传稳定性检测

将突变株PK8单菌落接入发酵培养基(发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：酵母粉10g/L、葡萄糖10g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH6.5-7.0)，37℃，200rpm培养36h，检测发酵液上清中ALA含量、并以1％接种量接入新的发酵培养基中，传代培养，37℃，200rpm培养36h，检测发酵液上清中ALA含量，并以1％接种量接入新的发酵培养基中进行连续传代培养，检测每代菌株发酵液上清中ALA含量。突变株PK8传代次数与ALA产量关系如表2所示。经过连续多次传代实验结果表明，该突变株PK8遗传性状稳定。

表2、突变株PK8传代次数与ALA产量关系

五、突变株PK8的保藏

突变株PK8的分类命名为巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri，该菌株已于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.16178。

实施例2、PK8菌株在以葡萄糖为原料制备5-氨基乙酰丙酸中的应用

1、将实施例1获得的巴氏葡萄球菌PK8在活化培养基(活化培养基配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，pH6.5)中37℃培养24h，得到活化后的PK8。

2、用250ml三角瓶装50ml种子培养基(种子培养基配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：葡萄糖2g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、酵母粉5g/L，初始pH 6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并接种步骤1获得的活化后的PK8菌落，接种后于37℃，200r/min摇床培养15h，得到种子发酵液。

3、用500ml三角瓶装80ml以葡萄糖为碳源的发酵培养基(发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、胰蛋白胨15g/L、NaCl2.5g/L，初始pH 6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并按2％的接种量将步骤2获得的种子发酵液接入发酵培养基，接入后于37℃，200r/min摇床培养36h，得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液。

4、测定发酵液中的ALA产量和pH。ALA产量的测定方法同实施例1中的方法。采用HORIBA B-71X笔式pH计测定发酵液pH的方法如下：将发酵液离心后，收集上清液；将200μl上清液滴注到检测池中。将检测池盖子盖好，水平放置约2分钟后读取所测得的pH值。

本实施例所获得的含5-氨基乙酰丙酸的发酵液中的ALA产量为45.89mg/L。发酵液pH值为4.36。

实施例3、PK8菌株在以木质纤维素为原料制备5-氨基乙酰丙酸中的应用

1、将实施例1获得的巴氏葡萄球菌PK8在活化培养基(活化培养基配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，初始pH 6.5)中37℃培养24h，得到活化后的PK8。

2、用250ml三角瓶装50ml种子培养基(种子培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：玉米芯水解可发酵糖液(以葡萄糖计)2g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、酵母粉5g/L，初始pH 6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并接种步骤1获得的活化后的PK8菌落，接种后于37℃，200r/min摇床培养15h，得到种子发酵液。

上述玉米芯水解可发酵糖液的制备方法如下：取8g玉米芯样品用200ml 1％的稀硫酸121℃处理60min，冷却后抽滤收集固体残渣，然后加入30ml 72％的浓硫酸30℃处理60min，再加入840ml的水后，121℃处理60min，冷却后抽滤收集滤液，用固体的Ca(OH)₂调滤液pH至7.0，过滤后得到的上清液即为玉米芯水解可发酵糖液。

3、用500ml三角瓶装80ml以玉米芯水解可发酵糖液为碳源的发酵培养基(发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：玉米芯水解可发酵糖液(以葡萄糖计)10g/L、酵母粉10g/L、胰蛋白胨15g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH 6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并按2％的接种量将步骤2获得的种子发酵液接入发酵培养基，接入后于37℃，200r/min摇床培养36h，得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液。测定发酵液中的ALA产量和pH。

本实施例所获得的含5-氨基乙酰丙酸的发酵液中的ALA产量为41.26mg/L。发酵液pH值为4.47。

实施例4、PK8菌株在以土豆渣为原料制备5-氨基乙酰丙酸中的应用

1、将实施例1获得的巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)PK8在活化培养基(活化培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，初始pH 6.5)中，37℃培养24h，得到活化后的PK8。

2、用250ml三角瓶装50ml种子培养基(种子培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：土豆渣水解可发酵糖液(以葡萄糖计)2g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl2.5g/L、酵母粉5g/L，初始pH 6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并接种步骤1获得的活化后的PK8，接种后于37℃，200r/min摇床培养15h，得到种子发酵液。

上述土豆渣水解可发酵糖液的制备方法如下：取20g土豆渣样品用200ml 1.7％的稀硫酸121℃处理90min，冷却后抽滤收集上清，用固体的Ca(OH)₂调滤液pH至7.0，过滤后得到的上清液即为土豆渣水解可发酵糖液。

3、用500ml三角瓶装100ml以土豆渣水解可发酵糖液为碳源的发酵培养基(发酵培养基的配方如下：溶剂为去离子水，溶质及浓度分别为：土豆渣水解可发酵糖液(以葡萄糖计)15g/L、酵母粉10g/L、胰蛋白胨15g/L、NaCl 2.5g/L，初始pH 6.5-7.0)，按常规方法灭菌、冷却、并按2％的接种量将步骤2获得的种子发酵液接入发酵培养基，接入后于37℃，200r/min摇床培养36h，得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液。测定发酵液中的ALA产量和pH。

本实施例所获得的含5-氨基乙酰丙酸的发酵液中的ALA产量为43.87mg/L。发酵液pH值为4.58。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株巴氏葡萄球菌突变株及其在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1457

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

agggctgcgc gtgctataca tgcaagtcga gcgaacagat aaggagcttg ctcctttgac 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg ataacctacc tataagactg ggataacttc 120

gggaaaccgg agctaatacc ggataacata ttgaaccgca tggttcaata gtgaaaggcg 180

gctttgctgt cacttataga tggatccgcg ccgtattagc tagttggtaa ggtaacggct 240

taccaaggca acgatacgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg gaactgagac 300

acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt cttcggatcg taaaactctg ttatcaggga 420

agaacaaatg tgtaagtaac tgtgcacatc ttgacggtac ctgatcagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540

cgtaaagcgc gcgtaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600

agggtcattg gaaactggaa aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag 660

cggtgaaatg cgcagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta 720

actgacgctg atgtgcgaaa gcgtggggat caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg 900

gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa 960

atcttgacat cctttgaccg ctctagagat agagtcttcc ccttcggggg acaaagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct taagcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaagttg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga tttgggctac 1200

acacgtgcta caatggacaa tacaaagggc agctaaaccg cgaggtcaag caaatcccat 1260

aaagttgttc tcagttcgga ttgtagtctg caactcgact acatgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgtag atcagcatgc tacggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc cggtggagta accatttatg gagctagccg 1440

tcgaaggtga caactcg 1457

Claims

1.一株巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK8，其保藏编号为CGMCC No.16178。

2.巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用；

或，巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在以农业废弃物或葡萄糖为原料制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述农业废弃物为木质纤维素类农业废弃物或土豆渣；

或，所述木质纤维素类农业废弃物为玉米芯、甘蔗渣或柳枝稷。

4.巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在提高5-氨基乙酰丙酸产量中的应用。

5.一种用于制备5-氨基乙酰丙酸的产品，其活性成分为巴氏葡萄球菌Staphylococcuspasteuri或其菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂。

6.一种制备5-氨基乙酰丙酸的方法，包括如下步骤：以农业废弃物或葡萄糖为原料，利用巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri合成5-氨基乙酰丙酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述农业废弃物为木质纤维素类农业废弃物或土豆渣；

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行培养，得到发酵产物；所述发酵产物中含有5-氨基乙酰丙酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述种子培养基和所述发酵培养基中均含有农业废弃物水解物或葡萄糖；

或，所述农业废弃物水解物是将农业废弃物进行酸处理后得到的可发酵糖液。

10.根据权利要求2-4任一所述的应用或权利要求5所述的产品或权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri为权利要求1所述的巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri PK8 CGMCC No.16178。