CN102816717B - 一株孔氏葡萄球菌及其制备5-氨基乙酰丙酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株孔氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）FJAT-13685，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其保藏编号为CGMCCNo.6323，保藏日期：2012年7月10日,以及对其进行发酵，并用于制备5-氨基乙酰丙酸的方法。本发明以该菌株作为菌种，采用碳源、氮源、无机盐和缓冲剂组成的发酵培养基，在优化后的培养条件下，5-氨基乙酰丙酸的产量可达19.8mg/L。

Description

一株孔氏葡萄球菌及其制备5-氨基乙酰丙酸的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一株筛选获得的孔氏葡萄球菌及其培养发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法。 

背景技术

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid, ALA）是生物体内合成四吡咯化合物（卟啉、叶绿素、血红素和维生素B12）生物合成的前体物质，是生物调节合成四吡咯物质的关键中间物，广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。

ALA作为一种光动力学剂（photodynamic agent，PDT），在农用化学品和医疗领域具有广泛的用途。在农业领域，ALA具有杀虫、除草、增加植物抗逆性和促进植物生长等多种功能，并且易降解无残留、对人畜无毒性，成为极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医疗领域，ALA具有选择性杀死癌细胞的作用，被称为第二代光动力学药物（photodynamic medicine），具有对正常细胞毒害小，病人避光时间短，疗效好等显著特点。另外，ALA还作为检验铅中毒的主要试剂，对吡咯紫质沉着症的临床诊断也有一定效果。基于ALA的功能和广泛的应用前景，其合成研究已经引起前所未有的重视。

目前，ALA的生产主要是通过化学合成实现。由于化学合成步骤繁琐，副产物难控制，得率较低等突出问题，造成成本偏高以及环境污染。近年来生物技术的迅速进步和发展，以廉价的可再生资源为底物，应用生物合成ALA受到了各界的极大重视。

用微生物法制备5-氨基乙酰丙酸的的研究已经有20余年的历史，但迄今为止，仅有为数不多的几种微生物被发现具有生物法制备5-氨基乙酰丙酸的功能，包括Rhodobacter sphaeroides（Sasaki K, et al. Journal of Fermentation Technology, 1987）、Rhodopseudomonas palustris（Saikeur et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2009）、Rhodovulumsp. (Noparatnaraporn et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2000)、Propionibacterium acidipropionici (Kiatpapan P, et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2011 )、Chlorella sp.( Sasaki K. et al. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1995)、Chlorella regularis (Ano et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 1999) 和基因工程菌（Choi et al. Biotechnology Letters, 1999; Qin et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006; Fu et al. Bioresource Technology, 2008；张德咏，等. CN1974758，2006；林建平，等. CN101063105, CN101041839，2007；林建平，等. CN1693466，2005）等。因此筛选新的微生物菌种进行生物法制备5-氨基乙酰丙酸成为研究者的新任务。 

发明内容

本发明的目的是筛选出一种能高效积累5-氨基乙酰丙酸的新菌株，并提供一种利用此菌株制备5-氨基乙酰丙酸的培养方法。

本发明的技术方案： 一株筛选自猪舍垫料的细菌，可以用于制备5-氨基乙酰丙酸（ALA），其分类命名为孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其保藏编号为CGMCC No. 6323，保藏日期：2012年7月10日。

微生物菌株的筛选与鉴定：

本发明从猪舍垫料中取样，接种到普通LB平板，30℃培养24 h，挑选单菌落，平板划线得到单菌落后采用D-葡萄糖为单一碳源进行摇瓶发酵，对发酵液离心上清采用下述分光光度法定量测定5-氨基乙酰丙酸浓度，最终筛选出目标菌株LA10。对LA10按伯杰氏手册第8版生理生化特性鉴定及精编分子生物学实验指南进行16s rDNA序列分析，确定其属于孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii），拟命名为孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685。

用所述孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685生产5-氨基乙酰丙酸的方法包括以下步骤：

1） 用孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685在活化培养基中28-35℃培养12-24 h后得到经活化的菌落，所述的活化培养基为胰蛋白胨6-10 g/L、酵母浸膏4-6 g/L、葡萄糖2-4 g/L、硫酸镁0.5-1 g/L、磷酸氢二钠1-1.5 g/L、琼脂1.8 g/L、初始pH 5-6.5；

2） 用250 mL三角瓶装20-100 mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、并接种经活化的菌落，接种后于28-35℃，100-200 r/min摇床培养12-24 h后得到种子发酵液；所述种子培养基为葡萄糖4-5 g/L、酵母浸膏7-10 g/L、胰蛋白胨5-8 g/L、NaCl 1-2 g/L、磷酸氢二钠1-1.5 g/L、磷酸二氢钠1-1.5 g/L；初始pH 5-6.5，去离子水配制；

3） 用250 mL三角瓶装20-100 mL发酵培养基，按常规方法灭菌、冷却、并按1%-5%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接入后于28-35℃，100-200 r/min摇床培养12-24 h得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液；所述发酵培养基为牛肉膏2-8 g/L、葡萄糖2-8 g/L、胰蛋白胨3-9 g/L、硫酸镁 0.1-1 g/L、氯化钠 1 -5g/L、磷酸二氢钠0.5- 3 g/L、磷酸氢二钠 0.5-3 g/L；pH 5-6.5，去离子水配制。

用该方法生产的5-氨基乙酸的检测方法：

取步骤3）得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液的上清液2 mL，加入1 mL的乙酸盐缓冲液，0.5 mL的乙酰丙酮，沸水浴15 min。冷却至室温后，取2 mL的反应液至新管中，之后加入2 mL的改良Ehrlich’s试剂，反应30 min，使用分光光度计在554 nm下进行检测。

本发明的有益效果：首次筛选出一种用于微生物法生产5-氨基乙酰丙酸的菌株，分类命名为孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）。本发明以该菌作为菌种，采用常见碳源、氮源、无机盐和缓冲剂组成的发酵培养基，可以在12-24 h即得到最大产量，且在此时发酵液处于酸性条件，可有效防止ALA的分解。

具体实施方式

以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此。

实施例 1

从福州北郊某不同猪舍垫料中取样，将取得的各种土样各称取约10 g，分别悬浮于0.9%NaCl溶液中，用8层纱布过滤去除较大的杂质颗粒，接种至含有50 ug/mL制霉菌素的LB平板，30℃培养24 h，挑选单菌落，LB平板划线得到单菌落后采用D-葡萄糖为单一碳源进行摇瓶发酵，对发酵液12小时开始，每3小时对发酵液取样，离心上清采用分光光度法定量测定5-氨基乙酰丙酸浓度。经过初筛，共分离获得4株能产ALA的细菌。结合ALA生产能力，最终选定LA10作为出发菌株。

 表1 各菌株ALA生产能力

菌株编号	ALA峰值浓度（mg/L）	达峰值浓度时间
			LA-02	1.557	20 h
LA-04	3.988	36 h
			LA-07	2.785	30 h
LA-10	6.88	21 h

 对筛选的LA-10按伯杰氏手册第8版生理生化特性鉴定，结果见表2。并按精编分子生物学实验指南的方法进行16S rDNA鉴定，结果见表3。实验结果可确定其属于孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii），拟命名为孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685。

表2 生理生化特性鉴定结果对照表

鉴定项目	菌株:LA-10
		葡萄糖产酸	-
乳糖产酸	-
		甲基红实验	+
V-P实验	-
		硝酸盐还原	-
产吲哚	-
		产H2S	-
明胶液化	-
		柠檬酸钠	-
淀粉水解	-

 表3 LA-10菌株的16S rDNA序列(1488 bp)

实施例 2

1） 用孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685在活化培养基中，28 ℃培养24 h，，活化培养基为胰蛋白胨10 g/L、酵母浸膏4 g/L、葡萄糖2 g/L、硫酸镁1 g/L、磷酸氢二钠1 g/L、琼脂1.8 g/L、初始pH 6.5；

2） 用250 mL三角瓶装50 mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、并接种经活化的菌落，接种后于30℃，180 r/min摇床培养18 h；种子培养基为葡萄糖5 g/L、酵母浸膏10 g/L、胰蛋白胨5 g/L、NaCl 2 g/L、磷酸氢二钠1.5 g/L、磷酸二氢钠1.5 g/L；初始pH 6.5，去离子水配制；

3）用250 mL三角瓶装50 mL发酵培养基，按常规方法灭菌、冷却、并按3%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接入后于30℃，180 r/min摇床培养24 h；发酵培养基为牛肉膏8 g/L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨8 g/L、硫酸镁1 g/L、氯化钠 1 g/L、磷酸二氢钠1 g/L、磷酸氢二钠1 g/L；初始pH 6.5，去离子水配制。

该实施例所得的ALA产量为6.88 mg/L。

实施例3

1） 用孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685在活化培养基中，28℃培养24 h，活化培养基为胰蛋白胨10 g/L、酵母浸膏4 g/L、葡萄糖2 g/L、硫酸镁1 g/L、磷酸氢二钠1 g/L、琼脂1.8 g/L、初始pH 6.5；

2） 用250 mL三角瓶装50 mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、并接种经活化的菌落，接种后于30℃，180 r/min摇床培养18 h；种子培养基为葡萄糖5 g/L、酵母浸膏10 g/L、胰蛋白胨5 g/L、NaCl 2 g/L、磷酸氢二钠1.5 g/L、磷酸二氢钠1.5 g/L；初始pH 6.5，去离子水配制；

3）用250 mL三角瓶装50 mL发酵培养基，按常规方法灭菌、冷却、并按1%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接入后于28 ℃，150 r/min摇床培养18 h；发酵培养基为牛肉膏6 g/L、葡萄糖4.5 g/L、胰蛋白胨4 g/L、硫酸镁 1 g/L、氯化钠 1g/L、磷酸二氢钠0.7 g/L、磷酸氢二钠 1 g/L；初始pH 6.0，去离子水配制。

该实施例所得的ALA产量为19.8mg/L。

<110> 福建省农业科学院

 

<120> 一株孔氏葡萄球菌

 

<160> 1

 

<170> BiSSAP 1.2

 

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 福建省农业科学院

 

<220>

<221> source

<222> 1..1488

<223> /organism="福建省农业科学院"

      /mol_type="unassigned DNA"

 

<400> 1

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcgaaca gataaggagc ttgctccttt      60

 

gacgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct acctataaga ctggaataac     120

 

tccgggaaac cggggctaat gccggataac atttagaacc gcatggttct aaagtgaaag     180

 

atggttttgc tatcacttat agatggaccc gcgccgtatt agctagttgg taaggtaacg     240

 

gcttaccaag gcaacgatac gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctggaactga     300

 

gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat gggcgaaagc     360

 

ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggtcttcgga tcgtaaaact ctgttattag     420

 

ggaagaacaa atgtgtaagt aactgtgcac gtcttgacgg tacctaatca gaaagccacg     480

 

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt     540

 

gggcgtaaag cgcgcgtagg cggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg     600

 

tggagggtca ttggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg     660

 

tagcggtgaa atgcgcagag atatggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct     720

 

gtaactgacg ctgatgtgcg aaagcgtggg gatcaaacag gattagatac cctggtagtc     780

 

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta     840

 

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac     900

 

ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac     960

 

caaatcttga catcctttga caactctaga gatagagcct tccccttcgg gggacaaagt    1020

 

gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa    1080

 

cgagcgcaac ccttaagctt agttgccagc attaagttgg gcactctaag ttgactgccg    1140

 

gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgatttgggc    1200

 

tacacacgtg ctacaatgga caatacaaag ggcagctaaa ccgcgaggtc atgcaaatcc    1260

 

cataaagttg ttctcagttc ggattgtagt ctgcaactcg actacatgaa gctggaatcg    1320

 

ctagtaatcg tagatcagca tgctacggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc    1380

 

cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agccggtgga gtaaccattt atggagctag    1440

 

ccgtcgaagg tgggacaaat gattggggtg aagtcgtaac aaggtagc                 1488

 

Claims (3)

1.一株孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其保藏编号为CGMCC No.6323，保藏日期：2012年7月10日。

2.如权利要求1所述的孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685的用途，其特征是用于制备5-氨基乙酰丙酸。

3.如权利要求2所述的孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685的用于制备5-氨基乙酰丙酸的用途，其特征包括如下步骤：

1）用孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FJAT-13685在活化培养基中，28-35℃培养12-24 h后得到经活化的菌落，所述的活化培养基为胰蛋白胨6-10 g/L、酵母浸膏4-6 g/L、葡萄糖2-4 g/L、硫酸镁0.5-1 g/L、磷酸氢二钠1-1.5 g/L、琼脂1.8 g/L、初始pH 5-6.5；

2）用250 mL三角瓶装20-100 mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、并接种经活化的菌落，接种后于28-35℃，100-200 r/min摇床培养12-24 h后得到种子发酵液；所述种子培养基为葡萄糖4-5 g/L、酵母浸膏7-10 g/L、胰蛋白胨5-8 g/L、NaCl 1-2 g/L、磷酸氢二钠1-1.5 g/L、磷酸二氢钠1-1.5 g/L；初始pH 5-6.5，去离子水配制；

3）用250 mL三角瓶装20-100 mL发酵培养基，按常规方法灭菌、冷却、并按1%-5%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接入后于28-35℃，100-200 r/min摇床培养12-24 h得到含5-氨基乙酰丙酸的发酵液；所述发酵培养基为牛肉膏2-8 g/L、葡萄糖2-8 g/L、胰蛋白胨1-9 g/L、硫酸镁 0.1-5 g/L、氯化钠 1 -5g/L、磷酸二氢钠0.5- 3 g/L、磷酸氢二钠 0.5-3 g/L；初始pH 5-6.5，去离子水配制。