CN110257277A - 一种复合菌剂zlm-11及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复合菌剂ZLM‑11，该复合菌剂由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL‑11和路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MJM‑11两株细菌组成。所述菌株均可以1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸（ACC）为唯一氮源生长。其中，粘质沙雷氏菌LJL‑11保藏号为CGMCC No.6290，路氏肠杆菌MJM‑11保藏号为CGMCC No.6295，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该复合菌剂的ACC脱氨酶活性最高可达45.81μmolα‑KA·(mg Pr·h)^‑1；随着L‑Trp的浓度增加，其合成IAA的量增加；并具有溶解无机磷、固氮的能力。该复合菌剂可在盐碱胁迫环境下促进植物生长，提高苜蓿产量；并能改善土壤微生态环境，使苜蓿根际土壤pH值、电导率下降，有机质含量增加。

Description

一种复合菌剂ZLM-11及其应用

技术领域

本发明属于微生物肥料领域，具体涉及一种复合菌剂及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是一个世界性的环境问题，我国盐碱地的面积逐年增加，盐碱对生态环境和农业耕种具有严重的胁迫作用。盐碱胁迫常引起植物体内代谢紊乱，表现为直接抑制植物生长发育，已经成为限制全球作物产量的重要因素之一。在当今提倡生态效益为重的前提下，利用生物方法改良盐碱地，对保持环境健康和维持土壤生产力具有发展潜力和研究价值。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）属于中等耐盐碱豆科植物，产量高，适口性好，能为畜牧提供优质的植物蛋白，其营养价值丰富，是一种极好的饲料作物，素以“牧草之王”著称。苜蓿根系发达，主根粗大，有较强的耐寒、抗旱、耐瘠薄和再生能力，同时还可以调节土壤的酸碱性，长期种植可促进土壤有机质、全氮在土壤表层的积累,能在盐碱地的改良中充分发挥生物固氮的功能，缓解污染，是改良中轻度盐碱荒地的理想植物，对农业可持续发展有及其重要的意义。

植物根际促生菌 (plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR) 作为一种优良的菌株被广泛应用到微生物肥料的生产中，既能防病又 能增产的PGPR生物制剂产业化前景广阔，尤其是PGPR菌株互作制成的复合菌剂更是深受研究者的青睐，比单一接种PGPR菌株的促生效果显著，能够增进肥效，从而大幅度提高农作物产量和品质，在增产的同时，能够减少化肥的使用，改善盐碱地土壤板结状况，对发展可持续农牧业、生态农牧业、绿色农牧业以及保护人类生存环境都有深远影响。

发明内容

本发明目的是提供一种复合菌剂，所述复合菌剂可在盐碱土壤中促进植物生长，植物具体为紫花苜蓿。

本发明所述两个菌株分离自植物根际土壤，以ACC为唯一氮源筛选得到。紫花苜蓿受到盐碱胁迫时，接种含ACC脱氨酶的PGPR，可以通过减少乙烯的合成量，减轻乙烯对植物生长的抑制作用。

本发明提供的复合菌剂ZLM-11，由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11和路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MJM-11两株细菌组成。

菌株MJM-11产生吲哚-3-乙酸能力强，IAA能促进植物生长，用该细菌接种苜蓿可以促进根的生长，可以增强植物对非生物胁迫的抗性，调节植物抗胁迫能力。

菌株LJL-11在ACC脱氨酶活性、溶磷、固氮方面表现出较强的能力，通过ACC脱氨酶活性可以降低胁迫诱导产生的乙烯，从而改善盐碱胁迫对苜蓿产生的危害；该菌株分泌有机酸能力强，可降低碱性土壤的pH值。

路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MJM-11具有以下特性：

在ADF培养基上形成圆形、不透明、淡黄色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落；革兰氏染色菌体呈红色，为革兰氏阴性菌；根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的菌株进行生理生化的检测和鉴定，表现出接触酶阳性，淀粉水解阳性，吲哚实验阳性。

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11具有以下特性：

在ADF培养基上形成红色、不透明、边缘不规则的菌落；革兰氏染色菌体呈红色，为革兰氏阴性菌；根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的菌株进行生理生化的检测和鉴定，鉴定出该菌具鞭毛、具荚膜、接触酶、利用柠檬酸盐、利用葡萄糖，可液化明胶，不具芽孢。

本发明提供的复合菌剂中粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11和路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MJM-11的有效菌数量比例为1：1。

本发明还提供了一种复合菌剂的制备方法。其制备方法包括如下步骤：

将上述粘质沙雷氏菌LJL-11和路氏肠杆菌MJM-11划线至LB培养基中，培养温度28-35℃，培养时间为12-16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，制备菌悬液；

将粘质沙雷氏菌LJL-11和路氏肠杆菌MJM-11以1:1的菌体数量比例混合作为种子液；

将种子液以1％的体积比接入发酵培养基，初始pH为7，培养温度为28℃，转速为180rpm，振荡培养12～24 h，所得到的培养液即为所述复合菌剂。

该复合菌剂除了具有ACC脱氨酶活性，还能够合成吲哚乙酸、嗜铁素、溶解无机磷。本发明公开了复合菌剂在促进植物生长方面的应用。所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.粘质沙雷氏菌LJL-11和路氏肠杆菌MJM-11对盐碱土壤有较好的适应性。

2.本发明的复合菌剂，充分发挥了菌种间的相互作用，相比于单一菌株，具有明显的促生优势。

本发明复合菌剂可以合成IAA、嗜铁素，溶解难溶无机磷，经大田实地验证，该复合菌剂配方合理，功效稳定，能在盐碱胁迫环境中有效促进植物吸收营养物质，促进植物生长，同时可以帮助植株清除过量超氧阴离子自由基等有害物质，积累渗透保护物质，提高植物的抗盐碱能力，改善作物品质，增加产量，提高土壤肥效。

保藏说明

本发明对上述两种菌种进行了下述保藏：

保藏时间：2012年6月26日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；粘质沙雷氏菌LJL-11保藏号为CGMCC No. 6290，路氏肠杆菌MJM-11保藏号为CGMCC No. 6295。

附图说明

图1为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11和路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii）MJM-11的拮抗反应测试结果；

图2为不同pH对复合菌剂生长的影响；

图3为不同盐度对复合菌剂生长的影响；

图4为复合菌剂ACC脱氨酶活性的测定；

图5为复合菌剂吲哚乙酸（IAA）合成含量；

图6为复合菌剂溶解无机磷含量；

图7为复合菌剂固氮能力的测定；

图8为复合菌剂在盐碱胁迫下对苜蓿的促生效果；

图9为接种PGPR菌肥对土壤微生态环境的影响。

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次以上重复实验，结果取平均值。

一、复合菌剂的制备

1、菌株间拮抗反应测试

将供试2株细菌进行抑菌实验，以无菌水作阴性对照。每个处理3次重复，1 d后观察抑菌圈的有无。有抑制圈，说明两菌株间有拮抗作用；无抑制圈，说明两菌株间无拮抗现象。

检测结果如图1，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11和路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MJM-11间无抑菌圈产生，这两个细菌可以共存，混合培养。

2、复合菌剂的制作

将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11和路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii）MJM-11划线至LB培养基中，培养温度28-35℃，培养时间为12-16h。

分别挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于全温培养摇床28℃，180r/min条件下培养24 h。等菌株充分生长后，用紫外分光光度计测菌株悬浮液OD值，在OD600下测吸光值，将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11和路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MJM-11以1:1的菌体数量比例混合作为种子液。

将种子液以1％的体积比接入发酵培养基，初始pH为7，培养温度为28℃，转速为180 rpm，振荡培养12～24 h，所得到的培养液即为所述复合菌剂。

二、复合菌剂对pH、盐度的适应性分析

1、pH值对菌株生长的影响

配制LB液体培养基，分别用NaOH和HCl依次调节pH，再将LB液体培养基进行分装，标上不同的pH，灭菌，备用。将供试菌株过夜培养，调菌悬液浓度OD₆₀₀=0.5±0.004，菌悬液微量转移到新的液体培养基，每个处理3个重复。将单独和混合培养菌株振荡培养12 h，测定菌液吸光值。

由图2可知，在pH值为10时，复合菌剂ZLM-11与单接种相比生长良好，可以适应更为碱性的土壤。

2、盐分对菌株生长影响

在LB培养基中加入不同剂量的NaCl，配成4个盐浓度，分别为4%、5%、6%、7%。灭菌后，将各个菌株处理接种到不同盐度液体培养基中，每个处理3个重复，观察菌体生长情况。

由图3可知，盐浓度为4%~6%时，单接种和复合菌剂ZLM-11生长良好，当盐浓度为7%时，复合菌剂ZLM-11与单接种相比，生长较好，说明菌株互作可以提高促生菌的耐盐性，有利于盐碱地微生物促生菌剂的开发。

三、复合菌剂ACC脱氨酶活性的测定

将供试菌株LJL-11、MJM-11及复合菌剂ZLM-11菌悬液接种到TSB液体培养基中，过夜培养，4℃离心收集菌体。用DF培养基洗涤3次，将菌体微量转移到ADF培养基中，28℃，180rpm，培养2 d后，8000 rpm离心收集菌体，用Tris-HCl（pH=7.6）洗涤3次，将菌体重悬于Tris-HCl（pH=8.0）缓冲液中，加入30 μL甲苯并在漩涡振荡器上振荡30 s以破碎细胞，吸取200 μL，剩余细胞提取物用作蛋白质含量的测定，在提取液中加入20 μL 0.5 mol/L ACC颠倒混匀，不添加ACC做空白对照，30℃培养15 min。添加1 mL 0.56 mol/L HCl，高速离心，取1 mL上清液，加入800 μL 0.56 mol/L HCl混匀，再加入300 μL2，4二硝基苯肼颠倒混匀，30℃恒温培养30 min，加入2 mL 2 mol/L NaOH终止反应，540 nm测吸光值。

结果如图4所示，供试菌株都含有ACC脱氨酶活性，复合菌剂ZLM-11的ACC脱氨酶活性为45.81 μmol α-KA·(mgPr·h)^-1，显著高于单接种（P < 0.05）。

四、复合菌剂吲哚乙酸（IAA）合成能力的测定

将供试菌株LJL-11、MJM-11及复合菌剂ZLM-11菌悬液接种到DF培养基中培养2 d，随之取其菌悬液的10%在分别添加0、200和500 µg/mL三个浓度的L-Trp新的DF中培养2 d，每个处理3次重复，进行菌株IAA合成量的测定。取菌液测OD600吸光值。剩余菌悬液进行离心，取上清，添加2 mL S试剂，暗反应20 min，测OD535吸光值。用DF空白对照。

结果如图5，所有供试菌株及复合菌剂的IAA合成量均随L-Trp浓度的增大而显著增加，在L-Trp浓度为0时，LJL-11几乎不能合成IAA，复合菌剂ZLM-11的IAA合成含量显著高于单接种；在L-Trp浓度为200、500μg/mL时，复合菌剂ZLM-11的IAA合成含量与单接种LJL-11相比差异显著（P < 0.05）。

五、复合菌剂溶解无机磷能力的测定

将供试菌株LJL-11、MJM-11及复合菌剂ZLM-11菌悬液接种于液体NBRIP培养基中，于28℃，180 r/min振荡培养5 d，菌悬液离心10000 rpm，10 min，取50 μL上清与2.5 mL钼锑抗混合显色剂混合，随后用去离子水定容至25 mL，反应30 min。在660 nm波长下测量OD值。

检测结果表明，粘质沙雷氏菌LJL-11和路氏肠杆菌MJM-11的菌落周围均能形成无色透明晕圈，说明菌株LJL-11和MJM-11具有溶解无机磷的能力。复合菌剂ZLM-11进行溶磷量的测定。如图6结果显示，复合菌剂ZLM-11与两单接种相比溶磷量明显提高，且差异显著（P < 0.05）。

六、复合菌剂固氮能力的测定

将单菌株和复合菌剂菌悬液分别接种到Ashby培养基中培养，28℃，180 r/min，培养24h后，菌株处理微量转移到新的50 mL Ashby培养基的锥形瓶中，置于28℃，180 r/min摇床上培养7 d，吸取一定量的样品到硝化管中，加入10 mL浓硫酸，180℃ 60 min，300℃ 120min。消化冷却后，再加入2 mL H₂O₂，消煮一段时间，保证澄清后无颗粒。分别以加等量灭活菌体和无菌水作为对照。含氮量根据以下公式进行计算:

公式中，V₁为样品滴定时消耗0.005 mol/L标准盐酸溶液体积；

V₂为空白滴定时消耗0.005 mol/L标准硫酸溶液体积；

14为每毫摩尔氮的毫克数；

V为菌悬液毫升数。

供试单菌株在Ashby固体平板上形成无色透明晕圈，说明单菌株具有固氮能力，对复合菌剂的固氮能力进行测定。结果如图7，所有菌株不仅能在无氮培养基中生长繁殖，而且还表现出较强的固氮能力，供试菌株能与宿主植物进行联合固氮。复合菌剂ZLM-11与其单接种相比表现出较高的固氮能力。

七、复合菌剂ZLM-11的盆栽实验

将单菌株LJL-11、MLM-11和复合菌剂ZLM-11菌悬液接种于LB培养基中过夜培养，离心收集菌体，重悬于无菌水中，调节菌浓度OD₆₀₀=0.5±0.04。挑选饱满、大小一致、无病害的健康紫花苜蓿种子，进行表面消毒，75%乙醇浸泡4 min后，无菌水冲洗5次，然后将种子浸于2%次氯酸钠溶液中5 min，再用无菌水冲洗5次，将表面杀菌的种子用菌悬液处理，对照组只用无菌水处理，室温培养至种子萌发后，种于盆中。

供试盐碱土壤采自黑龙江省农科院兰西基地，每盆装500 g土，种15粒发芽的种子，每处理设4次重复。实验组每7 d浇一次菌悬液，对照组浇等量无菌水。温室培养，适当补充水分。在盐碱环境下评价菌株处理对盆栽苜蓿的促生效果，种植60 d后取样，测植株的生物量，对植株的株高、根长、地上部分干鲜重和根干鲜重等指标进行比较（表1，图8）。

表1 盆栽实验中促生菌菌株组合对苜蓿生物量的影响

注：不同字母表示差异显著（P < 0.05）。

结果表明，无论单接种还是双接种均能不同程度地促进苜蓿生长。与不接菌处理的对照（CK）相比，复合菌剂ZLM-11使株高增加了17.94%，根长增加了62.02%，地上鲜重增加了67.45%，根鲜重增加了95.21%，地上干重增加了58.94%，根干重增加了45.83%。复合菌剂ZLM-11的促生效果与其单接种相比差异显著（P < 0.05）。

八、复合菌剂的田间实验

本实验于黑龙江省农科院草业所兰西基地进行，每处理设5次重复，每小区面积为1m×1m，小区内设有5行，相邻两小区间隔0.5m，播种时采用条播，实验区组内完全随即设置。四周种植保护行，施肥时把菌液均匀施用到小区各处，为保持菌体在土壤中的活性，以30天为一周期，对每小区紫花苜蓿多次施肥，施肥方法采用等量菌液灌根，每小区施肥量为1 L菌液，对照组采用等量蒸馏水处理。整个试验期内不再施除草剂、化肥等其他化学合成物质。

实验中共采用4种处理：CK为空白对照，1L为LJL-11液体菌肥，1M为MJM-11液体菌肥，1Z为ZLM-11复合菌剂。

在初花期对小区中的紫花苜蓿进行随机刈割，对其株高、产量进行测定，经各菌肥处理的苜蓿的株高、干鲜重均显著高于对照（表2）。与CK相比，株高增加了7.87%，鲜重增加了77.25%，干重增加了30.19%，产量增加了30.32%。经复合菌剂ZLM-11处理效果最优，较两单接种处理显著（P < 0.05）。

表2 大田实验中促生菌菌株组合对苜蓿生物量的影响

注：不同字母表示差异显著（P < 0.05）。

九、接种PGPR菌肥对土壤微生态环境的影响

1. 土壤pH值

在盐碱大田环境下，研究施加不同PGPR菌肥对苜蓿根际土壤pH值的变化影响。结果表明，施加单接种和复合菌剂均可以使苜蓿根际土壤的pH呈下降趋势（如图9a）。其中，经1Z（ZLM-11处理后的苜蓿根际土壤pH值最低，效果好于单接种，且与对照组（CK）相比差异显著（P < 0.05）。

2. 土壤电导率

近年来，土壤总盐量逐年升高，产生土壤酸化和次生盐渍化现象，测定土壤中的电导率可以直接反映出混合盐的含量。

研究了在盐碱环境下施加不同PGPR菌肥对苜蓿根际土壤电导率的影响。研究结果表明，施加单接种和复合菌剂均可以使苜蓿根际土壤的电导率呈下降趋势（如图9b）。同时，与未施加PGPR处理的对照组（CK）相比差异显著（P < 0.05）。其中，1Z（ZLM-11）处理组的苜蓿根际电导率值最低。

3.土壤有机质

土壤有机质是植物营养的主要来源之一，能促进植物的生长发育，改善土壤的物理性质，促进土壤中营养元素的分解，提高土壤肥力。

测定了在盐碱环境下施加PGPR菌肥对苜蓿根际土壤有机质含量的变化。结果表明，与未施加PGPR处理的对照组（CK）相比，施加不同PGPR菌肥后的苜蓿根际土壤有机质含量均呈现上升的趋势，且差异显著（P < 0.05）。其中，1Z（ZLM-11）处理后的苜蓿根际土壤有机质含量最高（如图9c）。

Claims (7)

1.一种复合菌剂ZLM-11，其特征在于，由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11和路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MJM-11两株细菌1：1复配组成：粘质沙雷氏菌LJL-11保藏号为CGMCC No. 6290，所述路氏肠杆菌MJM-11保藏号为CGMCC No. 6295，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的复合菌剂ZLM-11，其特征在于，提供了一种制备方法:

将粘质沙雷氏菌LJL-11和路氏肠杆菌MJM-11划线至LB固体培养基中，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，制备菌悬液；将粘质沙雷氏菌LJL-11和路氏肠杆菌MJM-11以1:1的菌体数量比例混合作为种子液；将种子液以1％的体积比接入发酵培养基，所得到的培养液即为所述复合菌剂。

3.权利要求1中所述的复合菌剂ZLM-11可以作为盐碱胁迫下促进植物生长菌剂的应用。

4.如权利要求3所述的复合菌剂ZLM-11的应用，其特征在于，所述的菌剂为促吲哚乙酸合成、促ACC脱氨酶合成、促进溶磷和固氮中菌剂的一种或几种。

5.权利要求1所述的复合菌剂ZLM-11在制备用于在盐碱胁迫下促进植物生长的菌剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于制备的菌剂为促吲哚乙酸合成、促ACC脱氨酶合成、促进溶磷和固氮中菌剂的一种或几种。

7.权利要求1所述的复合菌剂ZLM-11可以作为修复盐碱土壤、改善土壤微生态环境的微生物复合菌剂。