CN103704069A - 一种立体防控番茄青枯病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业集约化生产技术，公开了一种立体防控番茄青枯病的方法。一种立体防控番茄青枯病的方法，包括在番茄育苗期根部施用含有拮抗菌QL-18的微生物有机肥料，移栽前在番茄茎部注射NJQL-A6菌剂。本发明方法成本低，生产工艺简便；QL-18在番茄根部大量定殖，同青枯病病原菌竞争根部位点，释放抗菌物质抑制青枯病番茄青枯病生长扩增，NJQL-A6在番茄茎部繁殖扩增，同青枯病病原菌竞争营养，限制青枯病原菌的生长，盆栽和大田试验表明，茎部注射NJQL-A6疫苗和根部施用QL-18微生物有机肥料配合使用，防控番茄青枯病效率不受季节的影响，稳定的维持在70%以上。

Description

一种立体防控番茄青枯病的方法

技术领域

本发明属于农业集约化生产技术，涉及一种立体防控番茄青枯病的方法，目的是提高生物防控番茄青枯病的效率。 

背景技术

番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum，以下简称青枯菌）引起的细菌性维管束土传病害。在我国，番茄青枯病主要发生在温暖湿润的南方，随着气候变暖和高效农业发展，青枯病逐渐向我国北方发展。青枯菌能通过土壤、流水（灌溉等）、种子等方式传播，对环境有很强的适应能力。土壤中存在青枯菌后，初期由于病菌数量少，植株生长受到限制，矮小，果实小，农民往往认为是养分问题而加大氮肥投入，导致土壤中微生物群落进一步失衡，番茄连作3季以上，病原菌在根际成优势，就能侵染番茄。在高温高湿的条件下，病害发展迅速，发病严重的田块发病率达100%，造成绝收。当前普遍采用的方式是向土壤中浇灌农用抗生素来控制病害，该方法在很大程度上造成土壤和水体污染，还会引起病原菌的抗药性，导致病害难以防控。利用有益微生物防治土传病害技术能满足现代农业对环境保护，食品安全等的要求，是实现农业可持续农业发展的有效方法之一。 

青枯菌受番茄根系分泌物的诱导，向番茄根际聚集，伺机侵染番茄根系。根据这一特点，以往人们采取根际施用拮抗菌，比如施用微生物有机肥后，微生物有机肥料中的拮抗微生物能在番茄根际定殖，抵御青枯菌的侵染，能有效降低发病率；但当根际青枯菌聚集的数量大大增加时，根系被青枯菌入侵的几率增加，一旦入侵到根系内部，根际拮抗微生物的作用将丧失，即微生物有机肥料对病原菌的抵抗只局限在地下，导致其田间防控番茄青枯病的效果不稳定。 

从理论上讲，防控一种维管束细菌病害，除了在植物根际阻碍病菌的侵染外，还要考虑被侵染后如何减缓侵染扩散的速度，降低病症发展速度。事实证明仅靠根部防治而不针对被侵染的茎部采取相应措施使得该方法防治青枯病效果极低，广大农民急需一种新的有效的防控策略。 

发明内容

1.技术问题 

本发明的目的在于开发一种番茄青枯病的立体防控策略，通过根部施用微生物有机肥料和茎部注射植物疫苗的方法，生物修复连作障碍土壤，克服或消除连作番茄作物青枯病，确 保集约化农业的顺利发展。 

2.技术方案 

一种立体防控番茄青枯病的方法，包括在番茄育苗期根部施用含有拮抗菌QL-18（菌种保藏号为CGMCC NO.3177）的微生物有机肥，移栽前在番茄茎部注射NJQL-A6（菌种保藏号为CGMCC NO.6628）菌剂。 

本发明立体防控番茄青枯病的方法，在育苗期时，育苗基质中加入2%（w/w）含有5×10⁸个/g以上QL-18拮抗菌的微生物有机肥料。 

所述NJQL-A6菌剂的接种量为0.5～1.5×10⁶个/株，优选1×10⁶个/株，在每株苗第一片真叶叶柄处注射NJQL-A6菌剂。 

防除连作番茄青枯病的拮抗菌QL-18属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2009年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3177，见发明专利ZL200910183360.9。 

用拮抗菌QL-18所生产的防除连作番茄青枯病的微生物有机肥料，该肥料中含有5×10⁸个/g以上的拮抗菌QL-18、全氮含量质量比为4～5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分为6～10%、有机质含量为35～40%。 

所述的防除连作番茄青枯病的微生物有机肥料，其生产方法包括： 

1）选用拮抗菌QL-18，接种到菜粕培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围自然，培养温度范围25～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml；所用菜粕培养液配制方法为：称用10g菜粕至100ml去离子水中，121℃灭菌20min； 

2）选择菜粕微生物酶解混合物为拮抗菌的有机载体物料，将拮抗菌与菜粕微生物酶解混合物（一次发酵产物）进行二次固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液10～50L，发酵温度为30～50℃，发酵5～7天，使拮抗菌含量达到5×10⁸个/g以上，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防除连作番茄青枯病的微生物有机肥料（简称BOF）。 

其中菜粕微生物酶解混合物制备方法为（公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品），菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55～65%和pH6.0～7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35～50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55～65%和6.0～7.0，发 酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解混合物（含氨基酸的混合材料）。 

防除连作番茄青枯病的生防菌NJQL-A6属于皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii），2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.6628，见发明申请201210466659.7。 

所述的NJQL-A6菌剂的生产方法包括： 

选用生防菌NJQL-A6，接种到KB（20g蛋白胨，10ml甘油，1.5g MgSO4·7H2O，1.5g FeSO4·7H2O，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min)或CPG(10g蛋白胨，1g水解络蛋白，5g葡萄糖，18g琼脂，1L蒸馏水，pH7.2，115℃，高压灭菌30min)培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围6-8，培养温度范围25～37，℃搅拌速度为170～300转/分钟，发酵液含菌量≥5×10⁹个/ml。 

3.有益效果 

本发明为一种能克服或消除连作番茄青枯病的生物立体防治方案，在育苗期根部施用微生物有机肥料，移栽前茎部注射NJQL-A6菌剂，同目前普遍采用的农艺措施相比有如下优点： 

1、降低劳动力投入，该方案操作简便，在苗期就完成了立体防控，不需要大规模排土客土，土壤暴晒、农药播撒等手段。 

2、采用生物防治手段，减少甚至免除农药施用，降低成本和劳动力投入的同时，减少环境污染，属环境友好型措施。 

3、成本低。生产工艺简便，固定资产投入少，生产过程中耗电耗水极少。菜粕微生物酶解混合物含有丰富的养分资源，QL-18在适宜条件下2-3天可以达到10⁹个/ml，微生物有机肥料中的拮抗菌数量非常高，在育苗时只需在普通基质中加入2%的微生物有机肥料即可。NJQL-A6菌剂每株接种量仅10μl（10⁸个/ml），NJQL-A6在适宜条件下48小时每毫升菌量可达到10⁹个以上，即每毫升菌液至少可以接种1000株番茄。 

4、防治效果稳定高效，根部化学药剂防治是目前农民们普遍采用的青枯病防治手段，本发明中的QL-18菌剂在有机肥的营养支持下能在番茄根部大量定殖，同青枯病病原菌竞争根部位点，同时释放的脂肽类抗菌物质能极大抑制青枯病番茄青枯病生长扩增。番茄青枯病是一种茎部维管束病害，但当前防治方案普遍缺少对青枯菌在地上部扩散的阻抗处理，NJQL-A6能够在番茄茎部繁殖扩增，同青枯病病原菌竞争营养，极大限制了青枯病原菌的生长，盆栽和大田试验结果均表明，该种立体防治番茄青枯病策略比单独使用一种方法效果更 优越，防控番茄青枯病效率不受季节的影响，防病效率稳定的在70%以上。 

附图说明

图1为接种青枯菌35天后，无菌水（CK）、茎部注射疫苗NJQL-A6（疫苗）、育苗施用微生物有机肥料（BOF）和两者配施处理（BOF+疫苗）番茄青枯病防治效果图。 

图2为温室条件下接种青枯菌后不同时间各处理（CK、疫苗、BOF和BOF+疫苗）的番茄青枯病发病率。 

图3为春季和秋季田间不同处理（CK、疫苗、BOF和BOF+疫苗）的番茄青枯病发病率。 

图4为春季和秋季田间不同处理（疫苗、BOF和BOF+疫苗）的生防率。 

具体实施方式

（一）菌株的分离和鉴定 

防除连作番茄青枯病的拮抗菌QL-18，分离来自于连作番茄青枯病发病的田块健康番茄植株根际土壤。通过采集已经发生连作障碍并出现番茄青枯病病症的植株和周围土壤，样品低温保存，采用SMSA青枯病选择性培养基获得病原菌株，分别利用NA改良培养基、PDA改良培养基和LB改良培养基利用对峙法进行拮抗试验，初筛拮抗菌株、通过盆栽试验复筛高效拮抗菌株，鉴定属种，菌种冻干-20℃保存。 

该菌株QL-18属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），主要生物学特性为革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为短杆状，＜1μm，形成芽孢，兼性厌氧生长，接触酶反应阳性、石蕊牛乳产酸胨化、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨糖、纤维二糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖产酸并产气，不能利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。 

防除连作番茄青枯病的植物疫苗NJQL-A6，分离来自于连作番茄青枯病发病的田块健康番茄植株根际土壤。通过采集已经发生连作障碍并出现番茄青枯病病症的植株和周围土壤，样品低温保存，采用M-SMSA青枯病选择性培养基获得病原菌株和大量供试生防菌（疑似非致病性青枯菌），分别利用CPG，TZC和M-SMSA培养基通过平板对峙实验初筛，根际和茎基部定殖能力实验复筛，最后通过盆栽试验确定高效生防菌株，鉴定属种，菌种冻干-20℃保存。 

该菌株NJQL-A6属于皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii），主要生物学特性为革兰氏染色阳性G^-，细胞形状为短杆状，0.5～0.6×1.5～3.0μm，单一极生鞭毛，不形成芽孢，严格好氧生长，在平板上不产色素，氧化酶、接触酶反应阳性，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阴 性，明胶水解阴性，精氨酸双水解酶阴性，卵黄反应阴性，脂肪酶，磷酸酶，脯氨酸氨肽酶等呈阳性。发酵丙三醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖；己二酸，L-色氨酸，L-络氨酸、γ-氨基丁酸、L-天冬氨酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸和苏氨酸、L-丝氨酸、能利用核酸盐、L-谷氨酸盐、葡萄糖酸盐，奎酸盐，苹果酸盐，柠檬酸盐，乙酸盐、丙酸盐，丁酸盐、马尿酸盐等。 

（二）QL-18微生物有机肥及NJQL-A6菌剂生产 

1、防除连作番茄青枯病的QL-18微生物有机肥料，其生产方法包括： 

1）用拮抗菌QL-18，接种到菜粕培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围自然，培养温度范围25～35，℃搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml；所用菜粕培养液配制方法为：称用10g菜粕至100ml去离子水中，121℃灭菌20min。 

2）选择菜粕微生物酶解混合物为拮抗菌的有机载体物料，将拮抗菌与菜粕微生物酶解混合物进行二次固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液10～50L，发酵温度为30～50，℃发酵5～7天，使拮抗菌含量达到5×10⁸个/g以上，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防除连作番茄青枯病微生物有机肥料（简称为BOF）。 

其中菜粕微生物酶解混合物制备方法为（公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品），菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55～65%和pH6.0～7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35～50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55～65%和6.0～7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解混合物（含氨基酸的混合材料）。 

该肥料产品中含有5×10⁸个/g以上的拮抗菌QL-18、全氮含量质量比为4～5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分为6～10%、有机质含量为35～40%。 

2、NJQL-A6菌剂生产 

选用生防菌NJQL-A6，接种到KB（20g蛋白胨，10ml甘油，1.5g MgSO4·7H2O，1.5gFeSO4·7H2O，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min)或CPG(10g蛋白胨，1g水解络蛋白，5g葡萄糖，18g琼脂，1L蒸馏水，pH7.2，115℃，高压灭菌30min)培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围6-8，培养温度范围25～37，℃搅拌速度为 170～300转/分钟，发酵液含菌量≥5×10⁹个/ml。 

（三）温室防效试验 

设置四个处理：（1）对照（CK）：育苗基质中不加入QL-18微生物有机肥料，移栽前茎部注射无菌水；（2）疫苗：育苗基质中不加入QL-18微生物有机肥料，茎部注射NJQL-A6菌剂；（3）BOF：育苗基质中加入2%（w/w）QL-18微生物有机肥料，茎部注射无菌水；（4）BOF+疫苗：育苗基质中加入2%（w/w）QL-18微生物有机肥料，茎部注射NJQL-A6菌剂。 

具体实施方案如下： 

番茄品种为合作903，种子表面消毒后播种，育苗基质购自淮安农业科技有限公司，微生物有机肥料按2%（w/w）加入育苗基质中，（育苗基质中加入2%QL-18微生物有机肥料或不加入，所有处理均为等养分，氮磷钾用化肥补全）。 

育苗35天后，在每株苗第一片真叶叶柄处注射NJQL-A6菌剂，接种量为10⁶个/株。5天后，将番茄苗移栽到装有1kg土的盆钵中，每钵1株苗。供试土壤采自南京市麒麟镇后村番茄种植大棚。移栽5天后灌根法接种青枯菌，每钵病原菌浓度约为10⁵个/克土。接种青枯菌后每天观察发病情况，考察35天后试验结束。 

统计发病率和生防率：根据植株叶片萎蔫程度，将发病级别分5级：0表示植株正常；1表示植株叶片萎蔫≤25%；2表示26%≤植株叶片萎蔫≤50%；3表示51%植株叶片萎蔫≤75%；4表示76%≤植株叶片萎蔫或死亡。每天记录番茄青枯病发病程度。发病率（DI）和生防率（BCE）的计算如下： 

$\mathrm{DI}=\frac{\mathrm{\Σ}(n_i*i)}{N*i_{\max }}*100\%;$

BCE＝(DI_CK-DI_t/DI_CK)×100％； 

其中i为发病等级代表数值，i_max为发病最高等级代表值，n_i为发病等级为i的株数，N为某处理考察总株数。DI_CK和DI_t分别为对照和处理发病率。 

盆栽试验结果表明，与对照（CK）比较，育苗施用BOF或茎部注射NJQL-A6菌剂均能降低青枯病发病率，两者配施（BOF+疫苗）效果最好（见图1）。 

试验结束后（接种病原菌35天），疫苗、BOF和BOF+疫苗处理的发病率分别为33.3%、24.2%和15.8%，而对照发病率高达81.7%，BOF+疫苗处理发病率显著低于单独处理（见图2）。 

（四）田间试验 

为验证本发明方法在田间防治效果，在南京麒麟镇后村番茄青枯病发病大棚进行了田间 试验，番茄品种为合作903，2011年2-6月和7-11月分别进行春季和秋季田间试验。设置四个处理：（1）对照（CK）：育苗基质中不加入QL-18微生物有机肥料，移栽前茎部注射无菌水；（2）疫苗：育苗基质中不加入QL-18微生物有机肥料，茎部注射NJQL-A6菌剂；（3）BOF：育苗基质中加入2%（w/w）QL-18微生物有机肥料，茎部注射无菌水；（4）BOF+疫苗：育苗基质中加入2%（w/w）QL-18微生物有机肥料，茎部注射NJQL-A6菌剂。QL-18微生物有机肥料施用和NJQL-A6菌剂注射处理同温室盆栽，秋季育苗25-30d后移栽到田间，春季育苗35-40d后移栽到田间，在每株苗第一片真叶叶柄处注射NJQL-A6菌剂，NJQL-A6菌剂注射处理后的第五天移栽番茄幼苗至大田中，每处理设置5个小区，每小区种植40棵番茄。番茄收获时对田间发病率进行统计。 

田间试验结果（见图3）表明，BOF+疫苗处理在春季和秋季均能稳定降低青枯病发病率，发病率显著低于单独施用BOF或疫苗处理。春季CK、疫苗、BOF和BOF+疫苗处理青枯病发病率分别为21.0%、14.3%、9.5%和5.9%，秋季发病率分别为48.2%、9.7%、33.5%和7.0%。各处理发病率均显著低于对照。BOF+疫苗处理生防率在春季和秋季均最高，分别为71.7%和85.5%（见图4）。单独注射疫苗NJQL-A6和单独施用BOF有机肥料生防效率不稳定，受季节影响大。 

由温室盆栽和田间试验结果可知，本发明通过根部以及茎部的立体防控对番茄青枯病起到良好的控制效果，相比单独根部或茎部防治效果更佳，防治效果不受季节影响，稳定地维持在70%以上。只需在育苗基质中加入2%生物有机肥料，无需在田间大量施用生物有机肥料，综合成本低、操作简便、环境友好等多种特点，本发明是一种可以普遍推广使用的番茄青枯病防控策略。 

Claims (6)

1.一种立体防控番茄青枯病的方法，其特征在于它包括在番茄育苗期根部施用含有拮抗菌QL-18（菌种保藏号为CGMCC NO.3177）的微生物有机肥，移栽前在番茄茎部注射NJQL-A6（菌种保藏号为CGMCC NO.6628）菌剂。

2.根据权力要求1所述的立体防控番茄青枯病的方法，其特征在于在育苗期时，育苗基质中加入2%w/w含有5×10⁸个/g以上NJQL-18拮抗菌的微生物有机肥料。

3.根据权力要求1所述的立体防控番茄青枯病的方法，其特征在于所述NJQL-A6菌剂的接种量为0.5～1.5×10⁶个/株，在每株苗第一片真叶叶柄处注射NJQL-A6菌剂。

4.根据权力要求3所述的立体防控番茄青枯病的方法，其特征在于所述NJQL-A6菌剂的接种量为1×10⁶个/株。

5.根据权力要求1所述的立体防控番茄青枯病的方法，其特征在于所述的微生物有机肥料中含有5×10⁸个/g以上的拮抗菌QL-18、全氮含量质量比为4～5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分为6～10%、有机质含量为35～40%。

6.根据权力要求5所述的立体防控番茄青枯病的方法，其特征在于所述的微生物有机肥料，其生产方法包括：

1）选用拮抗菌QL-18，接种到菜粕培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH生长范围自然，培养温度范围25～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的拮抗菌液含菌或芽孢量≥5×10⁹个/ml；所用菜粕培养液配制方法为：称用10g菜粕至100ml去离子水中，121℃灭菌20min；

2）选择菜粕微生物酶解混合物为拮抗菌的有机载体物料，将拮抗菌与菜粕微生物酶解混合物进行二次固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液10～50L，发酵温度为30～50℃，发酵5～7天，使拮抗菌含量达到5×10⁸个/g以上，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防除连作番茄青枯病的微生物有机肥料。

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