CN103275892B

CN103275892B - 一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗放线菌及其微生物有机肥料

Info

Publication number: CN103275892B
Application number: CN201310177972.3A
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 王世梅; 梁银; 张瑞福
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: CN103275892A

Abstract

本发明公开一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗放线菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离得到的对黄瓜枯萎病病原真菌有显著拮抗作用的拮抗放线菌CT205属于白刺链霉菌（Streptomyces albospinus），其菌种保藏号为CGMCC NO.7434。该拮抗菌液体发酵后再与有机物料再进行固体发酵制成微生物有机肥料。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势菌群，在发病严重的黄瓜枯萎病土壤中生防效率达80%以上。

Description

一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗放线菌及其微生物有机肥料

技术领域

本发明涉及一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗放线菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术领域，专用于克服和消除连作黄瓜枯萎病问题。

背景技术

黄瓜是我国重要的经济作物，黄瓜枯萎病是黄瓜的主要病害之一，在全国各地均有发生，尤其在保护地种植中危害严重。黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的土传病害，广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖地区，于1943年首次在荷兰发现并报道。目前，在我国高度集约化的黄瓜种植地枯萎病发生严重时的产量损失在80%以上，黄瓜枯萎病的致病菌——尖孢镰刀菌能通过土壤、流水（灌溉等）、种子等方式传播，对环境有很强的适应能力。尖孢镰刀菌侵染黄瓜在高温高湿的条件下，病害发展迅速，造成黄瓜植株茎基部维管束坏死，然后整株枯萎，发病严重的田块发病率达90%以上，甚至造成绝收。目前南方很多蔬菜基地不再适合种植黄瓜，对我国黄瓜生产影响很大。目前没有防治黄瓜枯萎病的有效手段，利用土壤微生物防治病害是综合防治土传病害的重要措施之一。生物防治技术满足现代农业对环境保护，食品安全等的要求，是实现农业可持续的有效方法之一。

另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源（C、N、P、K、S及微量元素）流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗放线菌。

本发明的另一目的在于提供一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗微生物有机肥料。该有机肥料克服或消除连作黄瓜枯萎病效率达到80%以上，使大量的设施农业土壤和露地连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗放线菌，该菌株CT205属于白刺链霉菌（Streptomyces albospinus），其菌种保藏号为CGMCC NO.7434。该菌株于2013年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所），其主要生物学特性为在PDA培养基上最佳的生长温度28℃，培养5-7天，形成直径2-4mm的菌落，菌落早期呈白色，后期呈灰色，孢子丝松散螺旋状，分生孢子椭圆形，表面有刺。

上述生防菌株CT205在微生物有机肥料中的应用。

一种微生物有机肥料，该肥料中含有不低于1.0×10⁸个/g的上述的生防菌株CT205的菌落形成单位、全氮质量比含量为4%～5%、总氮磷钾养分质量比含量为6%～10%、有机质质量比含量为30%～35%，全氮中质量比90%以上为有机氮。

上述的微生物有机肥料的生产方法，包括以下步骤：

1）将上述的菌株CT205接种到培养液中进行液体发酵，得到CT205发酵液，所述CT205发酵液中菌株CT205的菌落形成单位≥1.0×10⁹个/ml；

2）将CT205发酵液分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，分别获得猪粪堆肥的CT205固体菌剂和菜粕微生物酶解混合物的CT205固体菌剂，这两种CT205固体菌剂中菌株CT205的菌落形成单位≥1.0×10⁸个/g；

3）按体积百分比计，将猪粪堆肥的CT205固体菌剂50%~80%与菜粕微生物酶解混合物的CT205固体菌剂20%~50%按比例充分混合，后熟，然后在温度不超过50℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，即得防除黄瓜枯萎病的微生物有机肥料。

步骤1）中所述的培养液中各组分的含量为：葡萄糖30g/L，黄豆粉5 g/L、可溶性淀粉50 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨4 g/L、MgSO₄.7H₂O 0.5 g/L、NaCl 2 g/L、碳酸钙5 g/L，pH调至7.5～8.0，121℃灭菌20 min。

步骤1）中所述液体发酵的发酵条件为：初始pH值为7.5~8.0，培养温度为28～30℃，在通入无菌空气并搅拌状态下，发酵时间60~130小时，发酵后期将菌丝全部打碎成该菌的菌落形成单位。无菌空气的通入量一般为培养液体积的30%~100%，搅拌速度一般为150~210转/分钟。

步骤2）所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数≥98%，有机质质量比含量≥35%，有机氮质量比含量为1.2%~2%，含水量质量比为25%~30%。

步骤2）中所述固体发酵的发酵条件为：每吨腐熟的猪粪堆肥或菜粕微生物酶解混合物中加入CT205发酵液30~70L，固体发酵温度为30~50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5~7天后结束。

步骤3）中后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次。

上述微生物有机肥料在防除连作黄瓜枯萎病中的应用。

上述的防除连作黄瓜枯萎病微生物有机肥料的详细生产方法为：

1）将菌株CT205接种到培养液，进行液体发酵生产，其发酵条件为：初始pH范围7.5-8.0，培养温度范围28～30℃，通入无菌空气（溶氧）并搅拌：无菌空气的通入量一般为培养液体积的30%~100%，搅拌速度一般为150~210转/分钟。发酵时间60~130小时得到CT205发酵液，发酵后期将菌丝全部打碎成该菌的菌落形成单位，发酵液中该菌的菌落形成单位≥1.0×10⁹个/ml；所用培养液配制方法为（以配制1L培养基为例）：葡萄糖30g，黄豆粉5 g，可溶性淀粉50 g，酵母粉10g，蛋白胨4 g， MgSO₄.7H₂O 0.5 g，NaCl 2 g，碳酸钙5g，用水定容至1L，pH调至7.5～8.0，121℃灭菌20 min。所述的碳酸钙优选为轻质碳酸钙。

2）将CT205发酵液分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入CT205发酵液30~70L，发酵温度为30~50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5~7天后结束，使该菌株的菌落形成单位≥1.0×10⁸个/g，分别获得猪粪堆肥的CT205固体菌剂和菜粕微生物酶解混合物的CT205固体菌剂；所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为≥98%，有机质含量≥35%，有机氮含量为1.2%~2%，含水量25%~30%。

3）按照体积百分含量计，将猪粪堆肥的CT205固体菌剂50%~80%与菜粕微生物酶解混合物的CT205固体菌剂按体积比20%~50%按比例充分混合，后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过50℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防除黄瓜枯萎病的微生物有机肥料。

所述微生物有机肥料可专用于防除连作黄瓜枯萎病。

本发明的有益效果：

本发明提供的能克服或消除连作黄瓜枯萎病的微生物有机肥料及其生产方法，利用猪粪堆肥和菜粕的微生物酶解氨基酸混合物，再与生物防治菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1）肥料产品中含有抑制黄瓜枯萎病病原真菌生长的专一性高效菌株（白刺链霉菌），其抑制效果非常显著，试验结果表明，在连作黄瓜枯萎病的土壤上施用本产品后，生物防治率达80%以上。

2）该肥料为生物有机肥，含有丰富的有机质（30%~35%），有机氮含量为3%~5%。本产品总磷含量为2%-4%，而且生物有效性特别高，在做成生物有机肥产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差；本产品中有机氮大部分为氨基酸和小分子多肽，确保了氮素持续稳定的供应，使黄瓜的生长和抗逆能力大大增强。生物肥料中丰富的营养也为其中的生物防治菌提供了十分优越的生长环境，极大地提高了外来功能菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。

3）由于是生物制剂，完全没有因为化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于黄瓜的无公害生产，农民可以减少其他防治枯萎病化学农药的使用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于提高农场品的质量，从而增加农民收入。

附图说明

图1为拮抗菌CT205对黄瓜枯萎病病原菌的抑制作用。

图2 为微生物有机肥对黄瓜枯萎病防治效果。

具体实施方式

1. 菌株的分离和鉴定

采集已经发生连作障碍并出现黄瓜枯萎病病症的植株和周围土壤，采用采用镰刀菌选择性培养基获得病原菌菌株——尖胞镰刀菌黄瓜专化型并验证其致病性。采集南京紫金山山林土壤分离放线菌，利用PDA培养基采用对峙法筛选拮抗菌株。再通过盆栽试验复筛高效拮抗菌株，最终获得高效拮抗菌株CT205，并进行鉴定，菌种保存于4℃冰箱。

菌株CT205属于白刺链霉菌（Streptomyces albospinus），主要生物学特性为：在PDA培养基上最佳的生长温度28℃，培养5-7天，形成直径2-4mm的菌落，菌落早期呈白色，后期呈灰色，孢子丝松散螺旋状，分生孢子椭圆形，表面有刺。

2. 菌剂生产

1）将菌株CT205接种到培养液，进行液体发酵生产得到CT205发酵液，其发酵生产条件为：初始pH范围7.5-8.0，培养温度范围28～30℃，通入无菌空气（溶氧）并搅拌：无菌空气的通入量一般为培养液体积的30%~100%，搅拌速度一般为180转/分钟。发酵时间96小时，发酵后期将菌丝全部打碎成该菌的菌落形成单位，发酵液中该菌的菌落形成单位≥1.0×10⁹个/ml；

所用培养液配制方法为（以配制1L培养基为例）：葡萄糖30g，黄豆粉5 g，可溶性淀粉50 g，酵母粉10 g，蛋白胨4 g， MgSO₄.7H₂O 0.5 g，NaCl 2 g，碳酸钙（轻质）5 g，用水定容至1L，pH调至7.5～8.0，121℃灭菌20 min。

2）将CT205发酵液分别接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物中进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入CT205发酵液50L，发酵温度为40~45℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7天后结束，使该菌株的菌落形成单位达到1.0×10⁸个/g以上，分别获得猪粪堆肥的CT205固体菌剂和菜粕微生物酶解混合物的CT205固体菌剂。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量≥35%，有机氮含量为1.2%~2%，含水量25%~30%。

其中菜粕的微生物酶解混合物制备方法为（公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品），将嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）37-1菌株发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65%和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65%和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解混合物（含氨基酸的混合材料）。

3）按质量百分含量计，将猪粪堆肥的CT205固体菌剂80%与菜粕微生物酶解混合物的CT205固体菌剂20%按比例充分混合，后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过50℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防除黄瓜枯萎病的微生物有机肥料。

上述所生产的CT205微生物有机肥产品中生物防治菌株CT205的菌落形成单位达到1.0×10⁸个/g以上、全氮质量比含量为4%~5%、总氮磷钾养分质量比含量为6%~10%、有机质质量比含量为30%~35%，全氮中质量比90%以上为有机氮。可专用于防除连作黄瓜枯萎病。

3. 温室防效试验

考察拮抗菌株CT205液体菌剂（CT205发酵液）或微生物有机肥（功能菌为CT205）防控黄瓜枯萎病的能力。试验土壤为连作土壤，枯萎病发病严重。黄瓜品种采用种植面积较大的“新津研4号”，试验设计如下：

CK：对照，黄瓜连作土壤；T1：黄瓜连作土壤+有机肥处理；T2：黄瓜连作土壤+CT205液体菌剂；T3：黄瓜连作土壤+微生物（CT205）有机肥处理

5Kg连作土/盆钵，每处理30盆，2棵苗/盆。T1：每盆施用2%有机肥（100g），T2：每盆施CT205液体菌剂（50mL），T3：每盆施用2%微生物有机肥（100g），采用移苗前穴施，对照及T2处理补施与2%有机肥营养成分相当的N、P、K化学肥料，所有处理均为等养分。

黄瓜品种为新津研4号，种子表面消毒后，播种到营养钵中进行育苗，长至2叶1心（30-35天），移栽到5公斤的大盆钵中，在大盆钵中生长至30天取样计算生物量，考察促生效果。生长至开花期，记录发病情况，统计病情指数，移栽40天后，对照植株的发病率达87.7%，而接种CT205发酵液、添加有机肥及含有CT205的微生物有机肥的处理均能降低枯萎病的发病率，其中T3：黄瓜连作土壤+微生物（CT205）有机肥处理表现出最好的防治效果（表1，图2），其发病率为19.2%，防病率达81.8%。结果表明，拮抗菌株CT205的施入，不仅可以起到防治黄瓜枯萎病的作用，而且具有减少土壤中病原真菌数量，增加有益微生物数量，改善根际微生物群落结构的功能（表2）。

表1 　温室盆栽实验各处理对黄瓜枯萎病的防治效果

注：黄瓜枯萎病发病等级分5级：分别为0级：植株正常生长，不发病；1级：植株有少于1/4的叶片萎蔫；2级：植株有多于1/4、少于2/4的叶片萎蔫；3级：植株有多于2/4、少于3/4的叶片萎蔫；4级：植株完全萎蔫死亡。病情指数的计算公式如下所示：

防治效果 = [(对照病情指数-处理病情指数) / 对照病情指数]×100%

表2 温室盆栽实验各处理对黄瓜根际微生物数量的影响（个/克）

4. 田间试验

为验证本发明的微生物有机肥在田间的防治效果，在南京麒麟镇后村黄瓜枯萎病发病大棚进行了田间试验。黄瓜品种为新津研4号，营养钵统一育苗。试验处理如下：1）对照（CK）；2）普通有机肥（不含功能微生物）；3）微生物有机肥（含有功能菌CT205）。将46×6m²的大棚随机分成12个小区，每个处理随机选取4个小区。普通有机肥及微生物有机肥肥采取穴施，施入量为100Kg/亩，对照用氮磷钾化肥补齐养分。

移栽后定期到田间采集数据，统计发病率，最后采收后计算不同处理的生物量差异。施入微生物有机肥处理，可以显著降低黄瓜枯萎病病的发病率，黄瓜产量增加40%（表3）。

表3 田间试验效果

本发明专利从改善土壤微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能显著降低连作黄瓜枯萎病发生的微生物有机肥料产品，防治率达80%以上。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品中的有效碳和有效氮源给产品中的功能菌的培育提供了很好的条件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了作物的立苗率和抗逆能力。

Claims

1.一种防除连作黄瓜枯萎病的拮抗放线菌，该菌株CT205属于白刺链霉菌（Streptomyces albospinus），其菌种保藏号为CGMCC NO.7434。

2. 权利要求1所述菌株CT205在微生物有机肥料中的应用。

3. 一种微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中含有不低于1.0×10⁸个/g的权利要求1所述的菌株CT205的菌落形成单位、全氮质量比含量为4%～5%、总氮磷钾养分质量比含量为6%～10%、有机质质量比含量为30%～35%，全氮中质量比90%以上为有机氮。

4. 权利要求2中或权利要求3所述的微生物有机肥料的生产方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将权利要求1所述的菌株CT205接种到培养液中进行液体发酵，得到CT205发酵液，所述CT205发酵液中菌株CT205的菌落形成单位≥1.0×10⁹个/ml；

5. 根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其特征在于步骤1）中所述的培养液中各组分的含量为：葡萄糖30g/L，黄豆粉5 g/L、可溶性淀粉50 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨4 g/L、MgSO₄.7H₂O 0.5 g/L、NaCl 2 g/L、碳酸钙5 g/L，pH调至7.5～8.0，121℃灭菌20 min。

6. 根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其特征在于步骤1）中所述液体发酵的发酵条件为：初始pH值为7.5~8.0，培养温度为28～30℃，在通入无菌空气并搅拌状态下，发酵时间60~130小时，发酵后期将菌丝全部打碎成该菌的菌落形成单位。

7. 根据权利要求4所微生物有机肥料的生产方法，其特征在于步骤2）所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数≥98%，有机质质量比含量≥35%，有机氮质量比含量为1.2%~2%，含水量质量比为25%~30%。

8. 根据权利要求4所微生物有机肥料的生产方法，其特征在于步骤2）中所述固体发酵的发酵条件为：每吨腐熟的猪粪堆肥或菜粕微生物酶解混合物中加入CT205发酵液30~70L，固体发酵温度为30~50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5~7天后结束。

9. 根据权利要求4所微生物有机肥料的生产方法，其特征在于步骤3）中后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次。

10. 权利要求2中或权利要求3所述的微生物有机肥料在防除连作黄瓜枯萎病中的应用。