CN101891548A - 一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,是由三株地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)分别经过三级液体发酵达到放罐标准,再将上述的三株地衣芽孢杆菌经发酵所得的发酵液混合加工而成,所述的三株地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL-1 CGMCC No.1009菌株、地衣芽孢杆菌BL-8 CGMCC No.3925菌株和地衣芽孢杆菌BL-16 CGMCC No.1379菌株。本发明的有益效果为:本产品的活菌含量高,对小麦、玉米、水稻等多种作物具有很好的促生长增产、防虫防病作用,产品活菌在土壤中繁殖快、适应性强,可有效控制土传病害、虫害发生,提高土壤肥力,提高瓜菜含糖量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物肥料领域,尤其涉及一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥。
背景技术
随着人们生活水平的提高,农产品的安全性和品质受到前所未有的关注。病虫害生物防治与增产一直是农作物生长所关心的两大问题。近几年来,随着温室、大棚蔬菜种植面积的迅速扩大,霜霉病、枯萎病、根结线虫等病虫害的发生在逐年加重。黄瓜霜霉病是黄瓜生产中一种常发性严重病害,俗称“跑马病”,在适宜发病的环境下,病害发展极快,十几天内就可使植株枯死,一般减产20-50%,严重时整田毁灭,是世界范围内温湿性地区发生的重要病害;根结线虫寄主分布很广,我国各地均有发生。寄主植物较多,如黄瓜、丝瓜、苦瓜、冬瓜、西瓜、甜瓜、番茄、辣椒、茄子等多种作物,轻者减产10%左右,重者减产达60~70%,甚至造成全棚毁种。它不仅直接影响蔬菜作物的生长发育,还可通过根结线虫的危害,导致或加剧镰刀枯萎病的发生,促使植株快速死亡,给防治工作带来诸多困难。目前,防治方法仍是依靠化学农药防治,国内外还没有使用微生物活菌制剂能够有效防治霜霉病、枯萎病、根结线虫。化学农药用量加大,不仅严重污染环境和农产品安全,而且大量杀伤害虫天敌,引起农田生态平衡的恶性循环。
生长素在植物体内普遍存在,虽含量极微,但它是植物生长所必需的物质,研究表明,合理的应用植物生长物质的生产效果甚至比栽培与育种快得多。玉米素即属于植物细胞分裂素类生长物质。专利查新表明,美国从嫩玉米中提取天然细胞分裂素-玉米素,60000kg嫩玉米中仅含有1g玉米素,产品成本极高、产量极低;在美国玉米素化学合成工艺繁杂,提取困难,化学试剂商店玉米素售价383美元每0.5mg,折合人民币76000元/g,因玉米素价格昂贵无法在农作物生产上使用,大多只有在盆栽上用于细胞分裂素作用机制方面的科学研究。本发明人通过大量筛选研究试验,发现地衣芽孢杆菌CGMCC No.1009能够分泌出植物细胞分裂素-玉米素,并申请了名称为“用于产生植物细胞分裂素的地衣芽孢杆菌及植物生长调节剂”发明专利,专利号 ZL200310114330.5。
迄今为止,国内外尚未开发出具有防虫、防病、促生长、增产、提高果实品质多种功效的,同时可以保持生态平衡的农业上可以接受的低成本多效微生物菌肥。
发明内容
本发明的目的是提供一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,在保持生态平衡,降低成本的同时,具有防虫、防病、促生长、增产、提高果实品质的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,由三株地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)分别经过三级液体发酵达到放罐标准,再将上述的三株地衣芽孢杆菌经发酵所得的发酵液混合加工而成,所述的三株地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL-1 CGMCC No.1009菌株、地衣芽孢杆菌BL-8 CGMCC No. 3925菌株和地衣芽孢杆菌BL-16 CGMCC No.1379菌株。
所述的三株地衣芽孢杆菌的培养过程均包括以下步骤:
1)首先,将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基中,在培养箱中培养24h,所获斜面菌种在0-4℃的温度下保存,在一年内使用,所述的斜面培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖1-3%,蛋白胨0.1-0.5%,酵母粉0.3-0.5%,牛肉膏0.3-0.7%,(NH4)2HPO4 0.3-0.5%,K2HPO2 0.03-0.05%,MgSO4·7H2O 0.02-0.05%,NaCl 0.1-0.6%,MnSO4 0.001-0.003%,余量为水;
2)然后,将上一步所得菌种置于摇床的培养基中进行摇瓶培养24-30h,摇床转速为200转/min(rpm),所述的摇床的培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖2-6%,豆饼粉2-5%,棉饼粉1-3%,蛋白胨0.1-0.5%,酵母粉0.3-0.5%,牛肉膏0.3-0.7%,(NH4)2HPO4 0.3-0.5%,K2HPO2 0.03-0.05%,MgSO4·7H2O 0.02-0.05%,NaCl 0.1-0.6%,MnSO4 0.001-0.003%,余量为水。
所述的三级液体发酵时的培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖2-6%,豆饼粉2-5%,玉米粉1-3%,棉饼粉1-3%,蛋白胨0.1-0.5%,酵母粉0.3-0.5%,牛肉膏0.3-0.7%,(NH4)2HPO4 0.3-0.5%,K2HPO2 0.03-0.05%,MgSO4·7H2O 0.02-0.05%,NaCl 0.1-0.6%,MnSO4 0.001-0.003%,余量为水。
所述的三级液体发酵包括以下步骤:
1)一级液体发酵:将培养基加入小型发酵罐中进行高温灭菌,灭菌温度为121℃,压力为1.0kg/cm2,保压30min,pH值控制在消毒前为7.5,消毒后为6.5,待温度为35℃时往其中接种摇瓶培养后所获得菌液体积的3%,发酵时罐压为0.2kg/cm2,通气量为1:0.8v/v/min,比例符号前面的数字1代表发酵罐的体积,后面的数字代表通入空气的体积,培养24-30h,作为一级种子液;
2) 二级液体发酵:对中型发酵罐、小型发酵罐与中型发酵罐接种管道进行消毒,进气阀内压力为1.2kg/cm2,保压30min,然后冷却,发酵控制条件同上一步,得到二级种子液;
3)三级液体发酵:将二级种子液按1:100的比例压到大型发酵罐中,通气量为1:0.8v/v/min,培养66-72h,当检查无杂菌,95%以上的菌体形成芽孢,即可终止培养。
所述的地衣芽孢杆菌BL-1菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为35±1℃,停止发酵,用液相色谱仪(HPLC)检测的玉米素含量≥10ppm作为放罐标准。
所述的地衣芽孢杆菌BL-8菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为37±1℃,停止发酵,用血球计数板方法检测的芽孢含量≥50亿/mL作为放罐标准。
所述的地衣芽孢杆菌BL-16菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为32±1℃,停止发酵,用血球计数板方法检测的芽孢含量≥100亿/mL作为放罐标准。
所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,活菌含量≥50亿/mL,玉米素含量≥8μg/mL。
本发明的有益效果为:微生物农药杀菌剂地衣芽孢杆菌BL-16菌株,对多种作物、蔬菜瓜果、花卉等植物真菌性、细菌性病害具有很好的防治作用(例如:枯萎病、霜霉病、青枯病、软腐病等);天然植物生长调节剂地衣芽孢杆菌BL-1菌株,含有以植物细胞分裂素-玉米素为主的多种促植物生长物质,具有促进叶绿素形成,增强光合作用,刺激植物细胞分裂,加速植物新陈代谢和蛋白质合成,促使作物早熟丰产,增加瓜菜的含糖量,提高植物抗病抗衰抗寒能力;微生物农药杀虫剂地衣芽孢杆菌BL-8菌株,对多种蔬菜瓜果根结线虫具有很好的防治作用,对白粉虱、棉铃虫、烟青虫、小菜蛾具有很好的趋避作用;本产品的活菌含量高,施入土壤后,活菌生长发育快,适应性强,很快得到繁殖,迅速增加根际土壤的有益微生物菌群,促进植物根系营养快速吸收,提高土壤肥力,增强土壤渗水、保水、透气性,促进根系营养快速吸收,促使瓜果早熟丰产,提高果品质量;本发明对蔬菜瓜果、大田作物、园林花卉等多种植物具有很好的促生长增产、防虫防病作用;产品对人体安全,不污染环境。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明实施例所述的一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,由地衣芽孢杆菌BL-1 CGMCC No.1009菌株、地衣芽孢杆菌BL-8 CGMCC No. 3925菌株和地衣芽孢杆菌BL-16 CGMCC No.1379菌株分别经过三级液体发酵达到放罐标准,再将上述的三株地衣芽孢杆菌经发酵所得的发酵液混合加工而成。
所述的三株地衣芽孢杆菌的培养过程均包括以下步骤:
1)首先,将地衣芽孢杆菌接种于第一培养基中,在培养箱中培养24h,所获斜面菌种在0-4℃的温度下保存,在一年内使用,所述的培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖2%,蛋白胨0.3%,酵母粉0.4%,牛肉膏0.5%,(NH4)2HPO4 0.4%,K2HPO2 0.04%,MgSO4·7H2O 0.04%,NaCl 0.4%,MnSO4 0.002%,余量为水(补足100%);
2)然后,将上一步所得菌种置于摇床的培养基中进行摇瓶培养24-30h,摇床转速为200rpm,所述的摇床的培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖3%,豆饼粉3%,棉饼粉2%,蛋白胨0.3%,酵母粉0.4%,牛肉膏0.5%,(NH4)2HPO4 0.4%,K2HPO2 0.04%,MgSO4·7H2O 0.04%,NaCl 0.4%,MnSO4 0.002%,余量为水。
所述的三级液体发酵包括以下步骤:
1)一级液体发酵:将培养基加入500L种子发酵罐中进行高温灭菌,灭菌温度为121℃,压力为1.0kg/cm2,保压30min,pH值控制在消毒前为7.5,消毒后为6.5,待温度为35℃时往其中接种摇瓶培养后所获得菌液体积的3%,发酵时罐压为0.2kg/cm2,通气量为1:0.8v/v/min,比例符号前面的数字1代表发酵罐的体积,后面的数字代表通入空气的体积,培养24h,作为下一步骤的菌种源;
2) 二级液体发酵:对4000L种子发酵罐、500L种子发酵罐与4000L种子发酵罐接种管道进行消毒,进气阀内压力为1.2kg/cm2,保压30min,然后冷却,发酵控制条件同上一步,得到下一步骤的菌种源;
3)三级液体发酵:使用步骤2的菌种液作为菌种源,按1:100的比例压到20000L种子发酵罐中,通气量为1:0.8v/v/min,每小时登记一次罐温、通气量、罐压,在接种后12h开始,每4h取样进行镜检,测定玉米素含量、pH值,总共培养70h,当检查无杂菌,95%以上的菌体形成芽孢,即可终止培养。
所述的三级液体发酵时的培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖5%,豆饼粉3%,玉米粉2%,棉饼粉2%,蛋白胨0.3%,酵母粉0.5%,牛肉膏0.5%,(NH4)2HPO4 0.4%,K2HPO2 0.034%,MgSO4·7H2O 0.03%,NaCl 0.5%,MnSO4 0.002%,余量为水(补足100%)。
所述的地衣芽孢杆菌BL-1菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为35±1℃,三级液体发酵以镜检测的玉米素含量≥10ppm(10 μg/mL)作为放罐标准。
所述的地衣芽孢杆菌BL-8菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为32±1℃,三级液体发酵以镜检测的芽孢含量≥50亿/mL作为放罐标准。
所述的地衣芽孢杆菌BL-16菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为37±1℃,三级液体发酵以镜检测的芽孢含量≥100亿/mL作为放罐标准。
所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,活菌含量≥50亿/mL,玉米素含量≥8μg/mL。
本发明所述的地衣芽孢杆菌BL-1于2003年9月24日送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,其建议的分类名称为地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS),其登记入册编号为CGMCC No.1009,该菌种特性:细胞杆状,革兰氏阳性,大小为 0.8×1.5-3.5μm , 产生近中生的椭圆状芽孢,孢囊稍膨大。细胞内无聚-β-羚基丁酸盐 ( PHB )颖拉.在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶,24 h后菌落直径为 3 mm。产生乙酰甲基甲醉( V-P应阳性),pH5.4。接触酶阳性。卵磷脂阵阳性,还原硝酸盐。在 7 % NaCl和 pH5.7 中生长,营兼性厌氧生活。从葡萄糖、木糖和甘露酵产酸,但不从阿拉伯糖产酸。石蕊牛奶呈还原胨化反应,分解淀粉和酪素,并消耗柠稼酸盐;所述的地衣芽孢杆菌BL-8于2010年6月17日送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,其建议的分类名称为地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS),其登记入册编号为CGMCC No.3925,该菌种特性:同所述的地衣芽孢杆菌BL-1;所述的地衣芽孢杆菌BL-16于2010年5月27日送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,其建议的分类名称为地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS),其登记入册编号为CGMCC No.1379,该菌种特性:同所述的地衣芽孢杆菌BL-1。
毒性试验:
试验单位:河北省卫生检测中心
表1 多效微生物菌肥的安全性试验结果
毒性试验表明:地衣芽孢杆菌对人体安全、无害。地衣芽孢杆菌已被列为益生菌,可供食用。
应用例1
北京市农林科学院植保环保研究所对黄瓜大棚进行了试验。使用实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,将其分别稀释300倍、400倍、500倍后,按每亩施用30kg稀释液的施用量均匀喷洒在黄瓜及叶片上。统计其产量,同时以喷洒清水和使用市面上购来的植物生长调节进剂“云大120” 2000倍作为对照。结果如表2所示:
表2 多效微生物菌肥对黄瓜产量的影响
从表2可以看出,本发明的多效微生物菌肥对黄瓜有很好的促进生长作用,增产幅度最高可达34.8%,表2中数字为4次重复平均值,可在黄瓜定植缓苗后第一次施药,从初花期开始,每隔7天喷施1次,连续喷4次;施药浓度以300倍至400倍为宜。
应用例2
江苏省农药检定所试验对黄瓜大棚进行了试验。使用实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,将其分别稀释500倍、400倍、300倍后,按每亩施用30kg稀释液的施用量喷洒在黄瓜植株的叶子上,每隔7天喷洒一次,统计其产量,同时以喷洒清水和使用助壮素稀释300倍作为对照。结果如表3所示:
表3 多效微生物菌肥对黄瓜霜霉病和炭疽病抑制效果
从表3可以看出,本发明的多效微生物菌肥稀释300倍液对黄瓜霜霉病和炭疽病具有很好的抑制作用,最好的抑制率可达到64.1%,对白粉病也有同样的抑制效果。
应用例3
中国农科院郑州果树研究所对金帅苹果进行了试验,使用实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,将其分别稀释400倍、300倍、200倍后,按每亩施用45kg稀释液的施用量喷洒在苹果及叶片上,幼果初期,果实膨大期各喷一次。在幼果初期喷洒前用卡尺测量果实直径、横径并记录,喷洒后用测量果实直径、横径并记录,在果实膨大期(约幼果初期喷洒日2周)进行第二次喷施后再次测量果实直径、横径并记录。结果如表4所示:
表4 多效微生物菌肥对金帅苹果果实增长的影响
从表4可以看出施用各浓度的本发明的菌肥均比对照果实增长快,本发明的菌肥稀释300倍效果最好,直径增长率比对照增长35.86%,稀释400倍次之,稀释200倍增长稍慢。
应用例4
河北省廊坊市植保植检站对实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥(粉剂)在番茄根结线虫上进行防治试验,共设5个处理,本发明的菌肥20kg/亩、25 kg /亩、30kg/亩、6%奥罗蒎兹微乳剂和1.8%阿维菌素,第一次施药后2个月进行调查并记录结果,然后第二次施药后1个月内再次进行调查并记录结果。结果如表5所示:
表5 多效微生物菌肥防治温室番茄根结线虫病药效调查
从表5可以看出,在第一次施药后2个月本发明的菌肥20kg/亩、25kg/亩、30kg/亩、6%奥罗蒎兹微乳剂和1.8%阿维菌素的防效依次为62.9%、70.3%、77.6%、71%、64%;第二次施药1个月后的防效依次为70.4%、76.9%、84.9%、80.2%、71.2%。第一次施药2个月后,各处理均有线虫病发生,本发明的菌肥(粉剂)30kg/亩和6%奥罗蒎兹微乳剂750克/亩的防效较高,分别为77.6%和71%;第二次施药一个月后,本发明的菌肥(粉剂)30kg/亩制剂量处理的防效达到84.9%,有效抑制了根结线虫的发生及危害。
将本发明的微生物菌肥(水剂)产品按照与应用例1相同的稀释倍数和施用方法分别在新疆、北京、山东、河南、云南浙江、江苏、山西、内蒙、河北、吉林、黑龙江、广西、海南、福建等地进行了田间试验示范,试验结果表明:该产品对小麦、玉米、水稻、大豆、花生、棉花、苹果、香梨、荔枝、桂圆、芒果、柑橘、葡萄、香蕉、西瓜、甜瓜、番茄、黄瓜、辣椒、茄子、甘蓝、人参、茶叶、烟叶、啤酒花、苜蓿、月季花、海棠花、草坪、银杏树、油松等多种植物均有很好的促生长、防虫、防病、增产作用,同时产品活菌在土壤中繁殖快、适应性强,迅速增加根际土壤的有益微生物菌群,有效控制土传病害、虫害发生。
Claims (8)
1.一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:其由三株地衣芽孢杆菌分别经过三级液体发酵达到放罐标准,再将上述的三株地衣芽孢杆菌经发酵所得的发酵液混合加工而成,所述的三株地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL-1 CGMCC No.1009菌株、地衣芽孢杆菌BL-8 CGMCC No. 3925菌株和地衣芽孢杆菌BL-16 CGMCC No.1379菌株。
2.根据权利要求1所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:所述的三株地衣芽孢杆菌的培养过程均包括以下步骤:
1)将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基中,在培养箱中培养24h,所获斜面菌种在0-4℃的温度下保存,在一年内使用,所述的斜面培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖1-3%,蛋白胨0.1-0.5%,酵母粉0.3-0.5%,牛肉膏0.3-0.7%,(NH4)2HPO4 0.3-0.5%,K2HPO2 0.03-0.05%,MgSO4·7H2O 0.02-0.05%,NaCl 0.1-0.6%,以及MnSO4 0.001-0.003%,余量为水;
2)将上一步所得菌种置于摇床的培养基中进行摇瓶培养24-30h,摇床转速为200 rpm,所述的摇床的培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖2-6%,豆饼粉2-5%,棉饼粉1-3%,蛋白胨0.1-0.5%,酵母粉0.3-0.5%,牛肉膏0.3-0.7%,(NH4)2HPO4 0.3-0.5%,K2HPO2 0.03-0.05%,MgSO4·7H2O 0.02-0.05%,NaCl 0.1-0.6%,以及MnSO4 0.001-0.003%,余量为水。
3.根据权利要求1所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:所述的三级液体发酵时的培养基的配方包括以下重量百分比的原料:葡萄糖2-6%,豆饼粉2-5%,玉米粉1-3%,棉饼粉1-3%,蛋白胨0.1-0.5%,酵母粉0.3-0.5%,牛肉膏0.3-0.7%,(NH4)2HPO4 0.3-0.5%,K2HPO2 0.03-0.05%,MgSO4·7H2O 0.02-0.05%,NaCl 0.1-0.6%,以及MnSO4 0.001-0.003%,余量为水。
4.根据权利要求1所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:所述的三级液体发酵包括以下步骤:
1)一级液体发酵:将培养基加入小型发酵罐中进行高温灭菌,灭菌温度为121℃,压力为1.0kg/cm2,保压30min,pH值控制,消毒前为7.5,消毒后为6.5,待温度为35℃时往其中接种摇瓶培养后所获得菌液体积的3%,发酵时罐压为0.2kg/cm2,通气量为1:0.8v/v/min,比例符号前面的数字1代表发酵罐的体积,后面的数字代表通入空气的体积,培养24-30h,作为一级种子液;
2) 二级液体发酵:对中型发酵罐、小型发酵罐与中型发酵罐接种管道进行消毒,进气阀内压力为1.2kg/cm2,保压30min,然后冷却,发酵控制条件同上一步,得到二级种子液;
3)三级液体发酵:将二级种子液按1:100的比例压到大型发酵罐中,通气量为1:0.8v/v/min,培养66-72h,当检查无杂菌,95%以上的菌体形成芽孢,即可终止培养。
5.根据权利要求1所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:所述的地衣芽孢杆菌BL-1菌株的培养的三级液体发酵过程中采用的温度为35±1℃,三级液体发酵以液相色谱仪检测的玉米素含量≥10ppm作为放罐标准。
6.根据权利要求1所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:所述的地衣芽孢杆菌BL-8菌株的培养的三级液体发酵过程中采用的温度为32±1℃,三级液体发酵以血球计数板方法检测的芽孢含量≥50亿/mL作为放罐标准。
7.根据权利要求1所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:所述的地衣芽孢杆菌BL-16菌株的培养的三级液体发酵过程中采用的温度为37±1℃,三级液体发酵以血球计数板方法检测的芽孢含量≥100亿/mL作为放罐标准。
8.根据权利要求1所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥,其特征在于:所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥的活菌含量≥50亿/mL,玉米素含量≥8--g/mL。
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