CN104232530A

CN104232530A - 一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺

Info

Publication number: CN104232530A
Application number: CN201410436903.4A
Authority: CN
Inventors: 廖先清; 周荣华; 饶犇; 刘芳; 陈伟; 闵勇; 张先进; 张光阳; 杨自文
Original assignee: Hubei Biopesticide Engineering Research Center
Current assignee: Hubei Biopesticide Engineering Research Center
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺。地衣芽孢杆菌经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，在发酵过程中通过补料流加碳源增加芽孢杆菌的数量和转化率，显著提高单位产量，降低了单位成本；结束发酵，使用真空薄膜浓缩器浓缩发酵液，发酵液中的可溶性增效物质、促生物质、抑菌活性物质能有效回收；浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备干燥造粒，分选颗粒，旋风分离器捕集细粉返回再造粒，得每克菌粉CFU不少于2.0×10¹¹个的地衣芽孢杆菌产品。尾气处理，达标排放。本发明能最大程度保留发酵液中有效物质，产品质量高、设备利用率高，生物活性保持的比较好，废气，废水达标排放，能大规模产业化生产。

Description

一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺

技术领域

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺。

背景技术

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。在鸟类，特别是居住在地面的鸟类(如雀科)和水生的鸟类(如鸭)的羽毛中也能找到这种细菌，特别是在其胸部和背部的羽毛中。酶分泌的最适温度为37℃。它可能以孢子形式存在，从而抵抗恶劣的环境；在良好环境下，则可以生长态存在。

地衣芽孢杆菌具有多种用途，比如可以促进肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能；对肠道细菌感染具有特效，对轻型或重型急性肠炎，轻型及普通型的急性菌痢等，均有明显疗效；能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖；还可产杆菌肽A，产碱性蛋白酶，有机磷细菌肥料。地衣芽孢菌无毒，能分泌出活性强的蛋白质分解酵素，用以快速地分解水中之有机氮化物，亦能分解其它有机物，在水质净化上能担任重要的分解角色。

鉴于地衣芽孢杆菌如此多的用途，国内已有厂家生产地衣芽孢杆菌类产品，但是相关产品普遍质量不高。目前地衣芽孢杆菌制剂常见的生产方法是采用相关的地衣芽孢杆菌生产菌种，分批发酵培养，至其大部分或者全部形成芽孢时，采用板框过滤或者离心的方式进行浓缩，添加助剂后烘干或者喷雾干燥得到地衣芽孢杆菌的活菌制剂。这些方法存在着以下不足：

1、发酵罐装料系数为60％-70％，设备利用率不高；

2、由于采用的分批发酵，导致发酵初始培养基浓度过高，接种后延滞期较长，发酵过程中副产物形成较多，发酵产品浓度上不去，最终导致发酵成本较大；

3、发酵液的浓缩一般采用的絮凝/板框过滤或者离心技术，这两种技术一般都会产生大量的废水，后续处理成本较高；

4、采用絮凝/板框过滤或者离心技术还会造成发酵上清里面的有效成分丢失，造成产品效果的下降；

5、喷雾干燥一般设定的入口温度为180℃至200℃，出口温度为80℃到100℃，在这样较高的工作温度下，某些品种的菌数会有一定程度的下降，直接影响了产品的品质。

真空薄膜蒸发器是一类蒸发器的总称，特点是物料液体沿加热管壁呈膜状流动而进行传热和蒸发，优点是传热效率高，蒸发速度快，物料停留时间短，因此特别适合热敏性物质的蒸发。该类蒸发器包括MVR(机械式蒸汽再压缩)蒸发器，降膜式浓缩蒸发器和板式浓缩蒸发器等等。常常应用于中药活性物质浓缩，食品添加剂浓缩，抗生素浓缩，酶制剂浓缩等领域，但目前还没有用于活菌制剂浓缩方面。

多级低温喷雾流化干燥造粒相较于常规喷雾干燥塔，采用了多种先进的技术，比如塔内用了多个喷枪结构，喷枪采用的是高压喷嘴，喷出的雾滴分散效果好，且多个喷嘴喷出的雾滴相互碰撞，极易形成大颗粒；而没有形成颗粒的则被旋风分离器捕集，然后返回塔顶雾化区进行粉体的重新附聚和造粒；并且塔底有流化床可对形成的颗粒进行二次干燥，进一步降低颗粒的含水量；该系统要求进料有很高的固含量(10％-25％)，这样不需要粘合剂就能直接形成颗粒；由于是多级干燥系统，而且物料含水量不高，所以该设备的操作温度相比常规喷雾干燥塔要低，一般风温度控制在130℃-180℃，出口温度控制在60℃-80℃之间，这样该系统具备很好的干燥热敏性物料的能力，将该技术应用于活菌制剂的干燥上，可很好的保留产品中的生物活性，获得高质量的产品，以及环保，工序少等优点。

发酵和干燥造粒会产生大量的废气，里面常含有挥发性有机物(VOC)，硫化氢，氨气，硫醇类等各种污染物，同时伴有难闻的恶臭味，过去发酵企业一般将其直接排放或者简单的用水喷淋后排放，两种处理方式会造成对环境的严重污染。采用合适的化学试剂直接氧化废气中的相关污染物或者用物理方法分解其中的污染物是比较好的处理方法，能够解除废气中的恶臭味，减少环境污染。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种设备利用率高，产品质量提高，生物活性保持的比较好，废气，废水达标排放，能够大规模产业化生产，产品质量更加稳定，产量更高，生产成本明显降低的地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺。

本发明目的的实现方式为，一种地衣地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，具体步骤如下：

1)一级种子培养：5000ml三角瓶中装有2000ml一级种子培养基，115℃-121℃湿热灭菌15-30min,取10ml地衣芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在28℃-30℃培养12～16h；所用培养基的原料及用量为：淀粉0.5％-3％，牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，氯化钠0.5-1％，培养基pH为6.5-7.5；

2)二级种子培养：在400L发酵罐中装有150L或300L二级种子培养基，115℃-121℃湿热灭菌15-30min,将3000ml一级种子接种于二级种子培养基中；在28℃-30℃培养12～16h；所用培养基的原料及用量为：淀粉0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-2.5％，磷酸氢二钾0.02％-0.05％，氯化钠0.5％-1％，硫酸镁0.02％-0.1％，培养基pH调为6.5-7.5；

3)发酵：在5m³或40m³发酵罐中装有或4000L或30m³地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基，115℃-121℃湿热灭菌15-30min,将150L或300L二级种子接种于地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.05Mpa，在28℃-32℃培养45-50h；所用培养基的原料及用量为：葡萄糖1％-2％，豆粕1％-3％，玉米浆1％-3％，蛋白胨1％-4％，磷酸氢二钾0.01％-0.05％，硫酸镁0.1％-0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为6.5-7.5；

4)补料：当发酵至12-17h开始流加由葡萄糖20％-60％、水40％-80％配制成的葡萄糖补料培养基，发酵至40-44小时结束；

5)至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；

6)将发酵液加热到35℃-60℃时进入浓缩器，在真空度为-70kpa～-95kpa下进行浓缩，浓缩至含固量达到10％-25％时，开始出料；

7)浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔，得CFU不少于2.0×10¹¹个的地衣芽孢杆菌产品；所述进风温度130-180℃，出口温度60-80℃；

8)尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。

本发明有以下优点：

1、通过补料的方法，显著提高了单位产量，降低了单位成本，发酵罐装料系数由原先的60％-70％提高到80％-90％，设备利用率提高，单罐产量大大提升；通过补料发酵，达到高密度发酵，提高生物量，发酵液有效成分含量提高10-20％，高于分批发酵；

2、采用多级发酵技术，可使用于各种规模发酵罐上，缩短了芽孢杆菌的发酵周期，降低了发酵染菌风险；

3、采用低温真空薄膜浓缩器直接浓缩发酵液，相比采用传统的絮凝/板框过滤或者离心的浓缩方式，发酵液中可溶性的增效物质、促生物质、抑菌活性物质等得到有效回收；

4、采用低温多级干燥制粒新工艺，相比传统离心喷雾干燥生产工艺，进口风温和出口风温低，更好地保留了生物活性，而且一次性获得水分散颗粒剂产品而不是粉剂产品；

5、低温浓缩过程中产生的冷凝水，生化需氧量(BOD值)极低，一般在80以下，达到达标排放标准；而传统的絮凝/板框过滤或者离心的浓缩方法，会产生大量生化需氧量(BOD值)很高的废水，需要进行复杂的处理后才可能达到排放标准；

6、发酵尾气、干燥制粒尾气均通过收集系统收集，经化学氧化、等离子照射、紫外照射等去味、脱氨氮、脱硫化氢尾气处理方式处理后能达标排放。

具体实施方式

本发明取地衣芽孢杆菌种子冻干管菌种，接种于115-121℃湿热灭菌15-30min的一级种子培养基中，进行一级种子培养。将一级种子接种于经115-121℃灭菌15-30min，二级种子培养基的发酵罐中进行二级种子培养。发酵，在发酵过程中补料，结束发酵。

一、二级种子培养基，发酵培养基，补料培养基经湿热灭菌后，培养基要迅速降至30℃左右。

使用真空薄膜浓缩器浓缩发酵液，浓缩器为MVR浓缩器、降膜蒸发器或板式蒸发浓缩器。采用MVR浓缩器，从蒸发室出来的二次蒸汽经压缩机压缩，压力温度升高至100℃-115℃，送至加热室当加热蒸汽使用，加热发酵液至进料温度，加热蒸汽本身冷凝成水。

多级低温喷雾流化干燥造粒：浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔，得CFU不少于2.0×10¹¹个的地衣芽孢杆菌产品；所述进风温度130℃-180℃，出口温度60℃-80℃；

下面用具体实施例详述本发明：

实施例1：(以5m³发酵罐为例)

1)一级种子培养：5000ml三角瓶中装有2000ml一级种子培养基，121℃湿热灭菌30min,取10ml地衣芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，28℃培养12h；菌种未见染菌，菌体形态较好，再进行下一步操作。所用培养基的原料及用量为：淀粉0.5％，牛肉膏0.5％，蛋白胨3％，氯化钠0.5％，培养基pH为7.5。

2)二级种子培养：在400L发酵罐中装有150L二级种子培养基，121℃湿热灭菌30min,将3000ml一级种子接种于二级种子培养基中；在28℃培养12h；经检查，菌种未见污染和菌体形态较好的话，再进行下一步操作。所用培养基的原料及用量为：淀粉0.5％，酵母抽提物0.5％，蛋白胨2.5％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.02％，培养基pH调为7.5。

3)发酵：在5m³发酵罐中装有4000L地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基，121℃湿热灭菌30min，将150L二级种子接种于地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.05Mpa，在28℃培养45h；当芽孢形成有90％时放罐。所用培养基的原料及用量为：葡萄糖1％，豆粕1％，玉米浆1％，蛋白胨4％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.002％，培养基pH为7.5。

4)补料：当发酵至12h开始流加由葡萄糖60％，水40％配制成的葡萄糖补料培养基，发酵至40小时结束；

5)至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；

6)使用MVR浓缩器浓缩发酵液：将发酵液加热到35℃时进入真空薄膜浓缩器，在真空度为-95kpa下进行浓缩，浓缩至含固量达到15％-20％时，开始出料；从蒸发室出来的二次蒸汽经压缩机压缩，压力温度升高至100℃-115℃，送至加热室当加热蒸汽使用，加热发酵液至35℃，加热蒸汽本身冷凝成水。

7)多级低温喷雾流化干燥造粒：浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔；所述进风温度180℃，出口温度80℃；

本实施例所制的地衣芽孢杆菌干粉活菌制剂，经检验每克菌粉CFU不少于2.0×10¹¹个。

8)尾气处理：干燥制粒尾气通过收集系统收集，然后通过化学洗涤塔，与化学氧化剂如双氧水，次氯酸钠发生气-液接触，这个过程中气相中的臭味成分转移到液相，并被化学氧化剂氧化，从而达到去味、脱氨氮、脱硫化氢等目的，然后有组织达标排放。

实施例2、同实施例1，不同的是，

1)所用培养基的原料及用量为：淀粉0.5％，牛肉膏1％，蛋白胨2.5％，氯化钠0.5％，培养基pH为6.5；115℃灭菌30min，接种后30℃培养16h。

2)所用培养基的原料及用量为：淀粉0.5％，酵母抽提物1％，蛋白胨2％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠1％，硫酸镁0.1％，培养基pH调为6.5，121℃湿热灭菌15min，接种后30℃培养14h。

3)所用发酵培养基的原料及用量为：葡萄糖1.5％，豆粕1.1％，玉米浆1.7％，蛋白胨3％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为6.5。在32℃培养45h。

4)补料：当发酵至15h开始流加由葡萄糖40％，水60％配制成的葡萄糖补料培养基，发酵至44小时结束；

6)使用降膜蒸发器将发酵液加热到45℃时进入真空薄膜浓缩器，在真空度为-90kpa下进行蒸发，然后依次进入二效和三效蒸发器，浓缩至含固量达到10％-20％时，开始出料。

7)多级低温喷雾流化干燥造粒：浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔；所述进风温度130℃，出口温度60℃；

实施例3、同实施例1，不同的是，

1)所用培养基的原料及用量为：淀粉1％，牛肉膏1.5％，蛋白胨2％，氯化钠0.5％，培养基pH为6.5。

2)所用培养基的原料及用量为：淀粉1％，酵母抽提物1.5％，蛋白胨2％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.02％，培养基pH调为6.5。

3)所用培养基的原料及用量为：葡萄糖2％，豆粕2％，玉米浆1％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.002％，培养基pH为7.5。在28℃培养50h。

4)补料：当发酵至12h开始流加由葡萄糖20％，水80％配制成的葡萄糖补料培养基，发酵至44小时结束；

6)使用板式蒸发浓缩器浓缩发酵液：将发酵液加热到50℃时进入板式蒸发浓缩器进行浓缩，在真空度-86kp下进行蒸发浓缩。然后当发酵液浓缩至含固量达到15％-25％时，开始出料。

7)多级低温喷雾流化干燥造粒：浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔,所述进风温度150℃，出口温度70℃；

实施例4：(以40m³发酵罐为例)，同实施例1，不同的是

1)所用培养基的原料及用量为：淀粉2％，牛肉膏2％，蛋白胨2％，氯化钠0.8％，培养基pH为7.0；115℃湿热灭菌30min，接种后28℃培养14h。

2)在400L发酵罐中装有300L二级种子培养基，115℃湿热灭菌30min，将3000ml一级种子接种于二级种子培养基中；所用培养基的原料及用量为：淀粉2.5％，酵母抽提物2.5％，蛋白胨1.5％，磷酸氢二钾0.03％，氯化钠0.8％，硫酸镁0.08％，培养基pH调为7.0。

3)发酵：在40m³发酵罐中装有30m³地衣芽孢杆菌发酵培养基，接入300L二级种子。所用培养基的原料及用量为：葡萄糖1.5％，豆粕2.5％，玉米浆2.5％，蛋白胨2％，磷酸氢二钾0.04％，硫酸镁0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为7.0。在28℃培养48h。

4)补料：当发酵至17h开始流加由葡萄糖50％，水50％配制成的葡萄糖补料培养基，发酵至42小时结束；

7)多级低温喷雾流化干燥造粒：浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔；所述进风温度160℃，出口温度60℃；

9)尾气处理：干燥制粒尾气通过收集系统收集，然后通过等离子体反应区，该区富含极高化学活性的物质，如高能电子，离子，自由基和激发态分子等，废气中的污染物质与这些高能量物质产生反应，在极短时间内发生分解，从而达到去味、脱氨氮、脱硫化氢等目的，然后有组织达标排放。

实施例5：(以40m³发酵罐为例)同实施例1，不同的是，

1)所用培养基的原料及用量为：淀粉2％，牛肉膏3％，蛋白胨1％，氯化钠1％，培养基pH为7.5。

2)在400L发酵罐中装有300L二级种子培养基，121℃湿热灭菌30min，将3000ml一级种子接种于二级种子培养基中；所用培养基的原料及用量为：淀粉3％，酵母抽提物3％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠1％，硫酸镁0.1％，培养基pH调为6.5；接种后28℃培养16h。

3)发酵：在40m³发酵罐中装有30m³地衣芽孢杆菌发酵培养基，经121℃灭菌30min的地衣芽孢杆菌发酵培养基，接入300L二级种子，控制罐压0.02Mpa-0.04Mpa，在32℃培养45h；当芽孢形成有90％时放罐。所用培养基的原料及用量为：葡萄糖2％，豆粕3％，玉米浆3％，蛋白胨4％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为6.5。

4)补料：当发酵至17h开始流加由葡萄糖60％，水40％配制成的葡萄糖补料培养基，发酵至40小时结束；

6)使用降膜蒸发器将发酵液加热到60℃时进入真空薄膜浓缩器，在真空度为-70kpa下进行蒸发，然后依次进入二效和三效蒸发器，浓缩至含固量达到15％-25％时，开始出料。

9)尾气处理：发酵尾气、干燥制粒尾气通过收集系统收集，然后通过高能UV紫外线反应区，该区的空气中的氧分子会被分解产生游离氧，游离氧不稳定与氧分子结合产生臭氧。臭氧对有机物有极强的氧化作用，能与废气中的有机污染物产生分解氧化反应，使其降解转化成低分子化合物、水和二氧化碳，从而达到去味、脱氨氮、脱硫化氢等目的，然后有组织达标排放。

实施例6：(以40m³发酵罐为例)

1)所用培养基的原料及用量为：淀粉3％，牛肉膏3％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，培养基pH为7.5。

2)二级种子培养：在400L发酵罐中装有300L二级种子培养基，121℃湿热灭菌30min，将3000ml一级种子接种于二级种子培养基中；所用培养基的原料及用量为：淀粉3％，酵母抽提物3％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.02％，培养基pH调为7.5。

3)发酵：在40m³发酵罐中装有30m³地衣芽孢杆菌发酵培养基，经115℃灭菌30min的地衣芽孢杆菌发酵培养基，接入300L二级种子，控制罐压0.02Mpa-0.05Mpa，在32℃培养50h；当芽孢形成有90％时放罐。所用培养基的原料及用量为：葡萄糖2％，豆粕1％，玉米浆2％，蛋白胨4％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.002％，培养基pH为7.5。

5)结束发酵：至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；

6)使用板式蒸发浓缩器浓缩发酵液：将发酵液加热到50℃时进入板式蒸发浓缩器进行浓缩，在真空度-86kp下进行蒸发。浓缩至含固量达到10％-20％时，开始出料。

9)发酵尾气、干燥制粒尾气通过收集系统收集，然后通过高能UV紫外线反应区，该区的空气中的氧分子会被分解产生游离氧，游离氧不稳定与氧分子结合产生臭氧。臭氧对有机物有极强的氧化作用，能与废气中的有机污染物产生分解氧化反应，使其降解转化成低分子化合物、水和二氧化碳，从而达到去味、脱氨氮、脱硫化氢等目的，然后有组织达标排放。

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，其特征在于具体步骤如下：

5)至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；

2.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，其特征在于一、二级种子培养基，发酵培养基，补料培养基经湿热灭菌后，培养基要迅速降至30℃。

3.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，其特征在于浓缩器为MVR浓缩器、降膜蒸发器或板式蒸发浓缩器。

4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，其特征在于采用MVR浓缩器，从蒸发室出来的二次蒸汽经压缩机压缩，压力温度升高至100℃-115℃，送至加热室当加热蒸汽使用，加热发酵液至进料温度，加热蒸汽本身冷凝成水。