CN103290077A - 一种利用黄杆菌高效生产维生素k2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法。将黄杆菌原始菌株在培养基上活化后，采用低能离子束及低温等离子体复合诱变方式选育高产菌株，经过含维生素K2类似物平板初筛及摇瓶发酵复筛后，高产菌株发酵单位提高50～100%；在黄杆菌发酵过程中通过添加表面活性剂，使胞内维生素K2溶至胞外，维生素K2产量提高50～200%。本发明能够能够极大的提高维生素K2发酵水平，实现高效生物合成维生素K2，为实现维生素K2的大规模工业化发酵提供了可能，使用方便。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种利用黄杆菌诱变选育及提高发酵水平的方法，尤其涉及的是一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法。
背景技术
维生素K是一类脂溶性维生素，结构为一系列含有2-甲基-1,4-萘醌的多烯化合物，天然存在的维生素K根据其侧链形式不同可以分为维生素K1和维生素K2两种，维生素K1在绿色植物与动物肝脏中含量丰富，维生素K1为系列化合物,淡黄色晶体,主要由肠道细菌合成；维生素K2是根据C-3上异戊二烯侧链的长短来定义的,异戊二烯侧链一般含有4-13个异戊二烯单元，以MK-n表示（n指侧链上异戊二烯单位的个数；其中最重要的是MK-4和MK-7。维生素K2生物合成途径是由异戊二烯侧链合成途径与萘醌骨架合成途径组合而成的。维生素K2具有良好的促进凝血、预防和治疗骨质疏松的功效，同时还能改善动脉硬化，对肝癌和白血病也有预防和治疗作用，早在1995年日本已经将维生素K2作为骨质疏松治疗药物。目前，维生素K2主要用化学手段合成，利用微生物法生产维生素K2还处于起步阶段。由于化学法存在环境污染和产物生物活性低等问题，而生物法生产的维生素K2可使血清维生素K2保持较高水平。
从目前的文献看，能够进行发酵生产MK的菌种主要是属于革兰氏阴性菌的黄杆菌(Flavobacterium)，主要产MK-4；属于革兰氏阳性菌的枯草杆菌(Bacillus subtilis natto，日本文献称之为纳豆菌)，主要产MK-7。
由于黄杆菌是野生菌株，发酵水平低，时间长，需要进行诱变筛选提高产量。离子束注入和低温等离子照射是两种新兴的高效诱变手段，具有对生物体损伤小，突变谱广，正突变频率高的等特点。另外，在黄杆菌发酵过程中，由于MK-4在黄杆菌胞内积累，引起产物抑制，降低了MK-4的产量，需要能降低产物抑制的新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，提高黄杆菌发酵生产维生素K2的水平。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
（1）将黄杆菌原始菌株在培养基上活化；
（2）将黄杆菌菌液涂布于无菌平皿上，风干，进行N+或Ar+离子注入，洗脱后移至含维生素K2类似物的初筛平板培养基上培养，挑选生长旺盛菌落，作为初筛菌落，将初筛菌落转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选维生素K2产量高菌株作为复筛结果，并移至斜面培养基保藏；
（3）将上述高产菌株菌液，涂布于无菌平皿上，风干，进行低温等离子体照射，洗脱后移至初筛平板培养基上培养，挑选生长旺盛菌落，作为初筛菌落，将初筛菌落转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选维生素K2产量高菌株作为复筛结果，并移至斜面培养基保藏，重复步骤（2）和步骤（3）2～4次，获得维生素K2高产黄杆菌，发酵单位提高50～100%；
（4）将黄杆菌菌株接入种子培养基中培养，按接种量5～10%接入发酵培养基，在发酵培养基中添加0.1～5%表面活性剂，在30～37℃培养3天，胞内维生素K2溶至胞外，维生素K2产量提高50～200%。
所述步骤（1）中，黄杆菌由中国普通微生物菌种保藏中心提供，菌种保藏编号1.6859。
所述步骤（1）中，培养基为平面或斜面培养基，采用葡萄糖10～20g/L，马铃薯浸出液180～220g/L，甘油5～10g/L，琼脂20g/L，PH自然，培养温度30～37℃，时间3天。
所述步骤（2）中，将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释100倍至菌液中菌体浓度为每毫升含107个细胞，然后用微量移液器取该菌悬液均匀涂布于无菌平皿上。
所述步骤（2）中的N+或Ar+离子注入能量为10～60kev，剂量为1.3×1015～3.9×1015N+/cm2。
所述初筛平板培养基中添加30～150mg/L的维生素K2类似物，培养温度30～37℃，时间3天，所述维生素K2类似物选自2-甲基-1，4-萘醌、1,4-二羟基-2-萘甲酸、1-羟基-2-萘甲酸中的一种。
所述发酵培养基为甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L，培养温度30～37℃，摇瓶转速150～200转，时间3天。
所述种子培养基为甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO41.5g/L，K2HPO41.5g/L，培养温度30～37℃，培养时间1天。
所述步骤（3）中，低温等离子体照射使用的装置的主体为两个不锈钢圆柱形内外电极，内电极接射频电源，外电极接地，内电极是网状结构，在两各电极间产生的活性粒子扩散进入内电极腔体，与支架台上的样品碰撞并发生反应，采用的电源为13.56MHz的射频电源，功率为360W，时间10～30分钟，工作物质为空气。
所述步骤（4）中，表面活性剂选自聚氧乙烯醚POE、十二烷基苯磺酸钠SDBS、苯扎氯铵ADBAC、香柏油、生物表面活性剂中的一种或几种。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明能够能够极大的提高维生素K2发酵水平，实现高效生物合成维生素K2，为实现维生素K2的大规模工业化发酵提供了可能，使用方便。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
（1）以黄杆菌1.6859为出发菌株，将黄杆菌培养在如下平板培养基（g/L）中进行活化：葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，PH自然；温度37℃，培养时间3天；
（2）将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释100倍，达到菌液中菌体浓度为每毫升含107个细胞，用微量移液器取该菌悬液0.1mL均匀涂布于无菌平皿上，置于超净工作台上自然风干，将平皿放入低能离子注入机的靶室中进行N+注入，注入能量为15kev，剂量为2.0×1015N+/cm2；同时以真空环境下未接受离子注入的样品作为对照；离子注入辐照后，在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，1,4-二羟基-2-萘甲酸80mg/L）上培养，在35℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L）上摇瓶发酵，将维生素K2产量高的菌株移至斜面培养基保藏；
（3）将上步骤获得高产量黄杆菌菌液取0.1mL于无菌空平皿中涂布均匀，吹干；将平皿放入低温空气等离子体放电装置中，抽真空到30Pa时开始等离子体放电，电源为13.56MHz的射频电源，功率为360W，放电20分钟后放入过滤后的无菌空气恢复柜内压力，取出样品；同时以真空条件下不接受等离子体放电处理的真空对照和未处理对照；在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，1,4-二羟基-2-萘甲酸80mg/L）上培养，在35℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L）上摇瓶发酵；反复步骤（2）和步骤（3）2次后，获得黄杆菌菌株维生素K2产量提高80%；
（4）将步骤（3）获得的黄杆菌菌株接入种子培养基（甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO41.5g/L，K2HPO4 1.5g/L）中在35℃培养1天，按接种量5%接入发酵培养基，并在发酵培养基中添加2%表面活性剂POE，胞内维生素K2可溶至胞外；然后摇瓶转速200转，35℃培养3天，维生素K2总产量提高150%。
实施例2
本实施例包括以下步骤：
（1）以黄杆菌1.6859为出发菌株，将黄杆菌培养在如下平板培养基（g/L）中进行活化：葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，PH自然；温度35℃，培养时间3天；
（2）将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释100倍至菌液中菌体浓度为每毫升含107个细胞，用微量移液器取该菌悬液0.1mL均匀涂布于无菌平皿上，置于超净工作台上自然风干，将平皿放入低能离子注入机的靶室中进行Ar+离子注入，注入能量为10kev，剂量为3.9×1015N+/cm2；同时以真空环境下未接受离子注入的样品作为对照；离子注入辐照后，在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，2-甲基-1，4-萘醌150mg/L）上培养，在37℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L）上摇瓶发酵，将维生素K2产量高的菌株移至斜面培养基保藏；
（3）将上步骤获得高产量黄杆菌菌液取0.1mL于无菌空平皿中涂布均匀，吹干；将平皿放入低温空气等离子体放电装置中，抽真空到30Pa时开始等离子体放电，电源为13.56MHz的射频电源，功率为360W，放电10分钟后放入过滤后的无菌空气恢复柜内压力，取出样品；同时以真空条件下不接受等离子体放电处理的真空对照和未处理对照；在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，2-甲基-1，4-萘醌150mg/L）上培养，在37℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L）上摇瓶发酵；反复步骤（2）和步骤（3）4次后，获得黄杆菌菌株维生素K2产量提高50%；
（4）将步骤（3）获得的黄杆菌菌株接入种子培养基（甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO41.5g/L，K2HPO4 1.5g/L）中在37℃培养1天，按接种量8%接入发酵培养基，并在发酵培养基中添加0.1%表面活性剂SDBS，胞内维生素K2可溶至胞外；然后摇瓶转速180转，37℃培养3天，维生素K2总产量提高50%。
实施例3
本实施例包括以下步骤：
（1）以黄杆菌1.6859为出发菌株，将黄杆菌培养在如下平板培养基（g/L）中进行活化：葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，PH自然；温度30℃，培养时间3天；
（2）将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释100倍至菌液中菌体浓度为每毫升含107个细胞，用微量移液器取该菌悬液0.1mL均匀涂布于无菌平皿上，置于超净工作台上自然风干，将平皿放入低能离子注入机的靶室中进行Ar+离子注入，注入能量为60kev，剂量为1.3×1015N+/cm2；同时以真空环境下未接受离子注入的样品作为对照；离子注入辐照后，在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，1-羟基-2-萘甲酸30mg/L）上培养，在30℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L）上摇瓶发酵，将维生素K2产量高的菌株移至斜面培养基保藏；
（3）将上步骤获得高产量黄杆菌菌液取0.1mL于无菌空平皿中涂布均匀，吹干；将平皿放入低温空气等离子体放电装置中，抽真空到30Pa时开始等离子体放电，电源为13.56MHz的射频电源，功率为360W，放电30分钟后放入过滤后的无菌空气恢复柜内压力，取出样品；同时以真空条件下不接受等离子体放电处理的真空对照和未处理对照；在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，1-羟基-2-萘甲酸30mg/L）上培养，在37℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L）上摇瓶发酵；反复步骤（2）和步骤（3）3次后，获得黄杆菌菌株维生素K2产量提高100%；
（4）将步骤（3）获得的黄杆菌菌株接入种子培养基（甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO41.5g/L，K2HPO4 1.5g/L）中在30℃培养1天，按接种量10%接入发酵培养基，并在发酵培养基中添加5%表面活性剂苯扎氯铵ADBAC，胞内维生素K2可溶至胞外；然后摇瓶转速200转，30℃培养3天，维生素K2总产量提高200%。
Claims (10)
1.一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黄杆菌原始菌株在培养基上活化；
（2）将黄杆菌菌液涂布于无菌平皿上，风干，进行N+或Ar+离子注入，洗脱后移至含维生素K2类似物的初筛平板培养基上培养，挑选生长旺盛菌落，作为初筛菌落，将初筛菌落转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选维生素K2产量高菌株作为复筛结果，并移至斜面培养基保藏；
（3）将上述高产菌株菌液，涂布于无菌平皿上，风干，进行低温等离子体照射，洗脱后移至初筛平板培养基上培养，挑选生长旺盛菌落，作为初筛菌落，将初筛菌落转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选维生素K2产量高菌株作为复筛结果，并移至斜面培养基保藏，重复步骤2～4次，获得维生素K2高产黄杆菌，发酵单位提高50～100%；
（4）将黄杆菌菌株接入种子培养基中培养，按接种量5～10%接入发酵培养基，在发酵培养基中添加0.1～5%表面活性剂，在30～37℃培养3天，胞内维生素K2溶至胞外，维生素K2产量提高50～200%。
2.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，黄杆菌由中国普通微生物菌种保藏中心提供，菌种保藏编号1.6859。
3.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，培养基为平面或斜面培养基，采用葡萄糖10～20g/L，马铃薯浸出液180～220g/L，甘油5～10g/L，琼脂20g/L，PH自然，培养温度30～37℃，时间3天。
4.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释100倍至菌液中菌体浓度为每毫升含107个细胞，然后用微量移液器取该菌悬液均匀涂布于无菌平皿上。
5.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的N+或Ar+离子注入能量为10～60kev，剂量为1.3×1015～3.9×1015N+/cm2。
6.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述初筛平板培养基中添加30～150mg/L的维生素K2类似物，培养温度30～37℃，时间3天，所述维生素K2类似物选自2-甲基-1，4-萘醌、1,4-二羟基-2-萘甲酸、1-羟基-2-萘甲酸中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述发酵培养基为甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO4 0.3g/L，K2HPO4 4.5g/L，NaCl 3g/L，培养温度30～37℃，摇瓶转速150～200转，时间3天。
8.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述种子培养基为甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO4 1.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，培养温度30～37℃，培养时间1天。
9.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，低温等离子体照射使用的装置的主体为两个不锈钢圆柱形内外电极，内电极接射频电源，外电极接地，内电极是网状结构，在两各电极间产生的活性粒子扩散进入内电极腔体，与支架台上的样品碰撞并发生反应，采用的电源为13.56MHz的射频电源，功率为360W，时间10～30分钟，工作物质为空气。
10.根据权利要求1所述的一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，表面活性剂选自聚氧乙烯醚POE、十二烷基苯磺酸钠SDBS、苯扎氯铵ADBAC、香柏油、生物表面活性剂中的一种或几种。
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