CN102827895B - 一种偶联原位萃取樟芝活性产物Antrodin C的双液相发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种偶联原位萃取樟芝活性产物Antrodin C的双液相发酵方法，通过向液体培养基中添加不同的表面活性剂来改变樟芝菌细胞膜的通透性，降低目标产物Antrodin C合成的负反馈抑制作用，在此基础上通过偶联不同的萃取剂进行原位萃取双液相发酵，将胞内分泌出来依然附着在菌球表面的活性产物萃取到萃取剂相中，从而降低目标产物负反馈抑制的强度，采用这种表面活性剂偶联原位萃取发酵技术，可以在同一发酵周期内实现樟芝活性产物的高效合成与萃取，能够显著提高樟芝活性产物Antrodin C的产量，萃取剂相中的活性产物通过乙醇萃取到乙醇相中，后处理工艺简单，活性产物提取纯化方便，可有效的降低生产成本。

Description

一种偶联原位萃取樟芝活性产物Antrodin C的双液相发酵方法

技术领域

本发明涉及一种樟芝活性产物Antrodin C的发酵方法，特别是将调节细胞通透性的液态发酵与原位萃取相结合，建立合适的双液相耦合萃取发酵体系，属于发酵工程领域。

技术背景

樟芝（Antrodia camphorata）亦名牛樟菇、红樟芝，是一种中药界极端珍贵的食药用菌菇类，其子实体仅寄生于台湾特有树种牛樟树的中空心木材内壁，具有浓郁的樟树香气。

在过去的数年间，由于樟芝广泛的药理活性以及低毒性特质，使其在国际间渐渐受到关注，而由其萃取出具有药效的天然物也被各方学者及业界所重视，现今已有众多研究单位投入人力与物力，致力于樟芝菌活性成分的研究。樟芝人工培育大致可以分为椴木栽培法、固体培养法、液体发酵法三种，其中“椴木栽培法”获得的子实体与野生樟芝成份组成基本一致，但椴木栽培法生长周期长，产量低，难以弥补市场的巨大需求；若将樟芝菌种以太空包进行固态培养，太空包含有纤维物、醣类、五谷杂粮类等，培养成本较高；而目前通过樟芝细胞深层液态发酵已经成功地实现了樟芝菌体快速的人工培养，因此液态发酵生产樟芝活性产物将是一种有效地方法。

台湾、日本方面文献有报道，樟芝液态发酵得到的生理活性产物除了多糖、三萜类等常见的物质外，Nakamura等人在樟芝液态发酵的菌丝体中还分离出5种生理活性产物马来酸和琥珀酸衍生物（Antrodin A-E），其中Antrodin B和Antrodin C具有抑制肺癌LLC细胞的药效，而在其他药效的研究中，发现生理活性产物Antrodin A-E对于抗肝脏发炎方面也具有相当好的疗效，所以该类生理活性产物应用前景广阔。但是国内外关于液态发酵法生产并提高这些生理活性产物产量的研究非常少，特别是在樟芝液态发酵合成活性产物Antrodins的发酵调控方面。

目前公开号为CN102321684A（一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法）等专利文献公开了樟芝固态发酵通过代谢调控提高Antrodins类化合物的产量，或是樟芝液态发酵通过代谢调控提高三萜类或多糖类物质等内容，并没有关于樟芝液态发酵合成活性产物Antrodins类化合物的专利文献报道，也没有通过调控液态发酵提高活性产物Antrodins类化合物产量的方法专利报道。

在常规液态发酵法中，樟芝液态发酵合成活性产物Antrodins类化合物产量很低，难以实现工业化生产，所以如何有效地提高樟芝活性产物的产量已成为该领域的研究热点。

发明内容

本发明针对樟芝常规液态发酵合成的生理活性产物产量低和种类少等问题，提供一种采用表面活性剂偶联原位萃取发酵生产樟芝活性产物的双液相耦合发酵方法，先利用表面活性剂改变细胞膜的通透性，降低樟芝生理活性产物的负反馈抑制作用，可以有效地提高樟芝生理活性产物的种类与产量，而在发酵过程中由于此类产物难溶于水，所以从胞内分泌出来依然附着在菌球表面的活性产物可以通过萃取剂萃取富集到萃取剂相中，从而在同一发酵周期内实现樟芝活性产物的高效合成与萃取，萃取剂相中活性产物通过乙醇萃取到乙醇相中，使得樟芝生理活性产物的提取纯化简便，回收的萃取剂经过蒸馏除去残余乙醇后可以重复利用，从而降低了生产成本。

为达到发明目的，本发明采用以下技术方案：

樟芝（Antrodia camphorata）菌种经过液体种子培养基扩大培养，以一定的接种量接于液体发酵培养基中，在转速为80～180转/分钟，温度22～34℃条件下，发酵培养8～12天，在发酵过程中采用添加不同种类表面活性剂及萃取剂，建立调节细胞通透性耦合原位萃取的双液相发酵体系，降低生理活性产物负反馈抑制的强度，提高樟芝活性产物产量。其中所用液体发酵培养基为：葡萄糖50～100g/L，黄豆粉5～15g/L，玉米浆粉2～6g/L，硫酸镁0.1～1.5g/L，磷酸氢二钾0.1～1.5g/L。

所用表面活性剂为Span系列、Tween系列、曲拉通、PEG系列、皂角等，能够改变樟芝细胞膜的通透性，其中优选Span-80。

按照本发明优选的技术方案，表面活性剂Span-80的添加时间为樟芝液态发酵开始后24～96小时，其添加比例为0.1%～15%。

所选用萃取剂种类有油酸等长链不饱和脂肪酸及壬烷、辛烷、十二烷等长链烷烃类，该类萃取剂本身对菌体毒性较小，且难溶于水，可将附着在樟芝菌球表面活性产物萃取富集到萃取剂相中，以降低高浓度的胞外产物对其分泌的抑制作用，大幅度提高樟芝液态发酵合成活性产物的效率，其优选十二烷。

按照本发明优选的技术方案，萃取剂十二烷的添加时间是在发酵过程中添加表面活性剂后12～48小时，其添加量为5%～30%。

本发明实现了调节细胞膜通透性与原位萃取发酵相耦合，在发酵过程中加入表面活性剂Span-80，该物质对樟芝菌体生长有一定的抑制作用，但其较好的改善了樟芝细胞膜的通透性，使得大部分活性产物从胞内转移到胞外，降低胞内活性产物负反馈抑制作用，在添加表面活性剂Span-80的基础上加入萃取剂十二烷，在表面活性剂的去乳化作用下，十二烷能够与发酵液中的菌体充分混合接触，可以将樟芝菌球表面附着的活性产物不断萃取富集到十二烷相中，从而在同一发酵周期内实现樟芝活性产物的高效合成与萃取，大幅度提高樟芝活性产物的产量。

本发明采用表面活性剂偶联原位萃取发酵技术，将樟芝液态发酵生成的活性产物萃取进入萃取剂十二烷相中，最高达400～450mg/L，比空白对照组提高了300～350%，大大提高了樟芝活性产物的产量，十二烷相中的活性产物通过乙醇萃取到乙醇相中，使得樟芝活性产物的提取纯化简便，回收的十二烷经过蒸馏除去残余乙醇后可以重复利用，从而降低了生产成本，此过程简单，可实现大规模工业化应用，具有良好的工业化前景。

具体实施方式

以下实施例所用菌株和细胞培养按照上述方案所述，采用调节细胞通透性耦合原位萃取发酵生产樟芝活性产物，下面进一步说明本发明的实施例。

实施例一：

本实施例的培养基配方为：

斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁0.1g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,蛋白胨5g/L，琼脂20g/L。

液体种子培养基：葡萄糖20g/L，黄豆粉4g/L，玉米浆粉2g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。

液体发酵培养基：葡萄糖30g/L，黄豆粉5g/L，玉米浆粉4g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。

将樟芝菌种转接到斜面培养基中培养，培养温度30℃，培养1周，得新鲜樟芝菌，无菌操作，用一定量无菌水从斜面上洗下孢子，制备孢子悬浮液，以体积分数10%的接种量接入装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，置于30℃恒温摇床中，转速为110转/分钟，培养3天，得到处于生长对数期的樟芝种子液，再将种子液以体积分数为15%的接种量接入装有100ml液态发酵培养基的500ml三角瓶中，置于30℃恒温摇床上震荡培养，转速为110转/分钟，细胞培养48小时后，向培养液中加入一定量不同种类表面活性剂，继续培养8天结束发酵，不同种类表面活性剂对樟芝液态发酵合成活性产物Antrodin C有着不同的影响，其中表面活性剂Span-80效果显著，添加后樟芝活性产物Antrodin C产量达到220mg/L，比未加表面活性剂的空白对照组相比提高了80%。

实施例二：

与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.1%的表面活性剂Span-80，继续培养8天结束发酵，活性产物Antrodin C产量为200mg/L，与空白对照组相比提高了50%。

实施例三：

与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.3%的表面活性剂Span-80，继续培养8天结束发酵，活性产物Antrodin C产量为250mg/L，与空白对照组相比提高了90%。

实施例四：

与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.5%的表面活性剂Span-80，继续培养8天结束发酵，活性产物Antrodin C产量为300mg/L，与空白对照组相比提高了130%。

实施例五：

与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.7%的表面活性剂Span-80，继续培养8天结束发酵，活性产物Antrodin C产量为150mg/L，与空白对照组相比提高了了15%。

实施例六：

与上述实施例四的步骤相同，所不同的是：在细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.5%表面活性剂Span-80，再培养24小时时，添加一定量不同种类萃取剂，再继续培养6天结束发酵，其中十二烷萃取效果最佳，活性产物Antrodin C的产量为350mg/L，与空白对照组相比提高了190%。

实施例七：

与上述实施例四的步骤相同，所不同的是：在细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.5%表面活性剂Span-80，再培养24小时时，添加体积分数为5%的萃取剂十二烷，再继续培6天结束发酵，活性产物Antrodin C的产量为250mg/L，与空白对照组相比提高了105%。

实施例八：

与上述实施例四的步骤相同，所不同的是：在细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.5%表面活性剂Span-80，再培养24小时时，添加体积分数为10%的萃取剂十二烷，再继续培养6天结束发酵，活性产物Antrodin C的产量为400mg/L，与空白对照组相比提高了230%。

实施例九：

与上述实施例四的步骤相同，所不同的是：在细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.5%表面活性剂Span-80，培养24小时时，添加体积分数为15%的萃取剂十二烷，再继续培养6天结束发酵，活性产物Antrodin C的产量为470mg/L，与空白对照组相比提高了290%。

实施例十：

与上述实施例四的步骤相同，所不同的是：在细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.5%表面活性剂Span-80，培养24小时时，添加体积分数为20%的萃取剂，再继续培养6天结束发酵，活性产物Antrodin C的产量为510mg/L，与空白对照组相比提高了325%。

实施例十一：

与上述实施例四的步骤相同，所不同的是：在细胞培养48小时时，向培养液中加入体积分数为0.5%表面活性剂Span-80，培养24小时时，添加体积分数为25%的萃取剂，再继续培养6天结束发酵，活性产物Antrodin C的产量为350mg/L，与空白对照组相比提高了190%。

在上述实施例一至实施例十一可知在发酵过程中，通过优选的表面活性剂Span-80可以有效的改善细胞通透性，使活性产物Antrodin C大量的释放到胞外，缓解胞内产物的负反馈抑制作用，由于活性产物难溶于水，分泌到胞外的活性产物基本被萃取富集到十二烷相中，所以本发明将调解细胞通透性与原位萃取相结合，建立最佳的双液相耦合发酵体系，可以在同一个发酵周期内实现活性产物的高效合成与萃取，降低了生产成本，简化了发酵工艺，特别是当使用0.5%表面活性剂Span-80，与20%的萃取剂十二烷相偶联时，活性产物Antrodin C的产量可达到510mg/L，与空白对照组相比提高了325%，效果显著。此外本发明建立的耦合发酵体系生产的活性产物种类更为丰富，不仅含有活性产物Antrodins化合物，还检测到活性产物Antroquinonol类物质及辅酶类物质，另外发酵培养周期相对于固态培养大大缩短，生理活性物质种类及含量与固态发酵得到的相当，解决樟芝常规液态发酵合成的生理活性产物种类单一的问题，发酵结束后十二烷相中的活性产物可通过乙醇萃取出来，后处理工艺简单，得率高，萃取后的十二烷经过蒸馏除去残余乙醇后可以重复利用，具有一定的经济效益，相关领域的人员可以根据本发明提供的方法进行其他多种形式的改变、替换及组合，来实现该技术。

Claims (4)

1.一种偶联原位萃取樟芝活性产物Antrodin C的双液相发酵方法，其特征在于樟芝（Antrodiacamphorata）菌种经过液体种子培养基扩大培养后，进行液体发酵培养，控制转速为80～180转/分钟，温度22～34℃，发酵培养8～12天，在发酵过程中依次添加表面活性剂及萃取剂，建立调节细胞通透性耦合原位萃取的双液相发酵体系，降低生理活性产物负反馈抑制的强度，提高樟芝活性产物产量；其中萃取剂的添加时间晚于表面活性剂24小时；所述表面活性剂为Span-80；所述萃取剂为十二烷；所述表面活性剂Span-80的添加时间为液态发酵培养开始后48小时，Span-80的添加比例为0.1%～0.7%；所述十二烷的添加时间是在添加表面活性剂后24小时，添加量为5%～25%。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于表面活性剂Span-80的添加比例为0.5%。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于十二烷的添加量为20%。

4.权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述液体发酵培养基成分为：葡萄糖50～100g/L，黄豆粉5～15g/L，玉米浆粉2～6g/L，硫酸镁0.1～1.5g/L，磷酸氢二钾0.1～1.5g/L。