CN101831481B

CN101831481B - 一种新的伊枯草菌素a及其同系物的制备方法

Info

Publication number: CN101831481B
Application number: CN2009100585599A
Authority: CN
Inventors: 谭红; 钟娟; 周金燕; 李志东; 张晓勇; 杨杰; 肖亮; 付雯
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2029-03-10
Also published as: CN101831481A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素A(Iturin A)及其同系物的制备方法。本发明将能够产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属菌株及其遗传改良菌，在第一级液体培养基中培养，然后作为种子液接种到第二级液体培养基中；第二级液体培养基在接种种子液前，加入一定比例的吸附固定化细胞材料和黏稠剂；第二级液体培养基接种种子液后进行发酵培养和流加补料培养。发酵结束后，从发酵培养液中收集伊枯草菌素A及其同系物。本发明具有工艺简单、操作简便、产量高、易于工业化等特点。

Description

一种新的伊枯草菌素A及其同系物的制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素A(Iturin A)及其同系物的制备方法。

背景技术

伊枯草菌素A(Iturin A)及其同系物，主要来源于芽孢杆菌属(Bacillus)菌株例如枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)的次生代谢产物，具有广谱抗病性和不易产生抗药性等优点，被认为是一种天然的、具有高效抑制植物和动物病原菌的抗菌物质。尤其Iturin A具有强烈的抗真菌特性，也抑制部分细菌的活性。

通常芽孢杆菌属(Bacillus)菌株例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)产生两类次生代谢产物，一类是具有生物表面活性剂功能的生物表面活性素(Surfactin)，另一类是抗真菌活性的伊枯草菌素A(Iturin A)及其同系物。

伊枯草菌素类物质是多种同系物组成的混合物，其中主要成分为IturinA，基本结构(图2)是一个由7个α-氨基酸组成的环肽，在N-末端为β-氨基脂肪酸。其侧链上的脂链基团的大小差别，构成了其同系物。

Iturin A的结构与活性密切相关，其侧链上的脂链基团越大(n值越大)，活性越强；它的抗真菌活性还与目标细胞的细胞膜有关，它通过在细胞膜上形成离子通道，提高细胞膜的通透性从而作用于靶位点。医学上也用天然的IturinA在一些人和动物的皮肤真菌感染方面做临床实验。由于它的广谱抗真菌性以及低毒和低变态反应性，使其很有希望成为一种高价值的抗真菌药物。

然而，迄今为止，国内外均没有良好的伊枯草菌素A及其同系物的生产方法。尤其是伊枯草菌素A及其同系物的发酵生产技术没有突破，其产量低、成本高，发酵工艺控制难度较大，制约着其工业化生产和商业化应用。

从近几十年来国内外的报道看，伊枯草菌素A及其同系物的发酵工艺研究历程主要分三个阶段，第一阶段(1995年以前)是传统的液体深层发酵(submerged fermentation，SMF)，主要集中在探索发酵条件对生物量和产量的影响。Sandrin等人(1990)用枯草芽孢杆菌S499进行摇瓶培养生产伊枯草菌素A和surfactin，其最高产量分别为280mg/liter(培养72h时)和760mg/liter。Shoda等人(1991，1993)用枯草芽孢杆菌NB22进行小型罐液体发酵，通过改变发酵过程中温度和通气量来控制伊枯草菌素的产量，最高产量达到620mg/liter(培养72h时)。Hbid等人(1996)用枯草杆菌S499进行20L发酵罐发酵，通过改变发酵过程中氧传递的控制来控制伊枯草菌素的产量，最高产量达到1388mg/liter。在这一阶段的研究工作中主要面临的困难是泡沫溢出的问题，而化学消泡剂的使用又受到限制，因为化学消泡剂影响氧的传递速率并影响微生物的生理特性。

第二阶段(1992-2007)是固体发酵(solid stated fermentation，SSF)，日本东京技术学院资源利用研究室是该阶段的重要贡献者。Akihiro等人(1993，1995)用小麦麸皮作为底物进行伊枯草菌素的生产，其产量较深层发酵提高了5-6倍，之后他们尝试用豆腐下脚料作为发酵底物，其产量较深层发酵提高了6-8倍。Mizumoto等人(2006，2007)固体发酵生产iturin，其产量分别达到3300mg/kg湿固体培养基和5591μg/g湿固体培养基。固体发酵较深层发酵的优势是发酵过程简单，菌体和产物浓度更大，而且提取时要用的溶剂更少。但因为固态发酵生产设备受到诸多因素的限制，易污染杂菌等问题，使该技术应用于大规模发酵生产受到严重制约。

为了能够提高液态发酵的产量，研究工作者更多的是从发酵的新方法上去寻找出路，所以伊枯草菌素发酵工艺第三阶段(2004-)的研究主要是集中在发酵方法的创新上，该阶段研究的最大贡献者还是日本东京技术学院资源利用研究室的研究人员。2006年，该研究室Mohammad等人通过热激活诱导分批发酵晚期的孢子重新萌发进行二次发酵生产伊枯草菌素，其产量较一次发酵提高了1000mg/liter，达到了4000mg/liter。二次发酵是发酵方法上的巨大的革新，具有很大的应用潜力。也就在一年之后，2007年，还是Mohammad等人用重组菌株B.sutbtilis 168在生物膜上静置培养生产伊枯草菌素A，其产量较传统的深层发酵提高了2倍，达到800mg/liter。但在生物膜上，菌体的快速增长导致营养供应不足，结果导致产生较多的孢子，影响发酵效果。2004年日本昭和电工株式会社，Yoneda，Tadashi(米田正等)在申请的专利中(WO2004/029273；2005年CN1685056A)介绍了Iturin A及其同系物的制备方法。具体为使用菌株B.subtilis SD142及其突变株1、2，在含有2％或者更多浓度大豆粉的合成培养基中生产1.5g/L或更多产量的Iturin A及其同系物的方法。其进行了5L罐发酵研究，结果，在野生株SD142的发酵液中，Iturin A及其同系物的产量达到3.8g/L；用突变菌株1、2的发酵液中，Iturin A及其同系物的产量达到了6.7g/L。该专利是迄今为止，Iturin A及其同系物产量最高的制备方法。但该方法生产成本依然偏高，并且存在随着氮源的增加，发酵产生泡沫严重，增加发酵工艺难度等弊病，难以实现工业化生产。

本发明人长期从事枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的次生代谢产物研究工作。在对一株植物内生枯草芽孢杆菌(B subtilis)进行遗传改良后发现，突变株Bacillus subtilis ZK-H6具有高产Iturin A及其同系物，几乎不产或微量产生Surfactin的特性。

随后，本发明人对利用枯草芽孢杆菌(B subtilis)发酵制备Iturin A及其同系物的工艺参数和技术方法进行了研究，获得了提高发酵体系中菌株细胞密度、有效控制发酵产生的泡沫、高产Iturin A及其同系物的技术方法，因此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的：

本发明的目的之一，是提供一种“吸附固定化细胞批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产Iturin A及其同系物；

本发明的目的之二，是提供一种用于生产Iturin A及其同系物的新菌株；

本发明的目的之三，是提供用于生产Iturin A及其同系物的培养基。

更具体地说，本发明提供一种制备Iturin A及其同系物的方法，包含以下步骤：

将能够产生Iturin A及其同系物的细菌在一级液体培养基(例如，下文所述的培养基A)中培养，作为种子液；所述的细菌主要选自芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株及上述菌株的遗传改良菌株。

将在上述第一级液体培养基中培养好的种子液接种到第二级液体培养基 (例如，下文所述的培养基B)中培养；第二级液体培养基在接种第一级种子液前，加入一定比例的吸附固定化细胞材料(例如，下文所述的吸附固定化细胞材料)，以及一定比例的黏稠剂(例如，下文所述的黏稠剂)；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液C)的补料发酵培养。

发酵结束后，从上述发酵培养液中收集Iturin A及其同系物。

本发明的具体实施方案是，采用已知的产生Iturin A及其同系物的芽孢杆菌属菌种，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株及上述菌株的遗传改良菌；其中枯草芽孢杆菌如：野生型枯草芽孢杆菌及其遗传改良菌，枯草芽孢杆菌S499、NB22，遗传改良菌B.sutbtilis ZK-H6，ZK-3等，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基。在接种第一级种子液前，向第二级液体培养基中加入一定比例的吸附固定化细胞材料，(例如下文所述的吸附固定化细胞材料)，以及一定比例的黏稠剂(例如下文所述的黏稠剂)，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加Iturin A及其同系物产量的目的。在第二级发酵中，以适合于第二级发酵的液体培养基，例如下文所述的培养基B，作为发酵培养基。接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在26℃-37℃发酵培养4-30小时后，选用合适的补料液，例如下文所述的补料液C，进行流加补料发酵培养。

第二级液体培养流加补料(例如补料液C)的方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。

所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率(匀速或非匀速)将适合的补料液(例如补料液C)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止发酵(下罐)前大约10小时。

所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合的补料液(例如补料液C)流加入第二级发酵罐中。间歇时间优选为每隔3-24小时补料1-5次，更优选为大约间隔6小时补料1次。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。

发酵条件：温度26℃-37℃，PH：6-8

发酵时间：3～6天

发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水＝100∶5∶20)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，伊枯草菌素A及其同系物以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物产品。

采用高效液相色谱法检测Iturin A及其同系物，所用条件：色谱柱C18 10.7φ×250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。

采用本发明工艺，在第二级发酵时，液体培养基只流加补料而不用出料，可以维持发酵工艺需求的较好的碳氮比；通过采用吸附固定化细胞材料，以及一定比例的黏稠剂，提高发酵体系中细菌细胞的浓度，实现较高密度的发酵，大大减少发酵过程产生的泡沫，有利于控制溶解氧浓度、温度等技术参数，从而提高Iturin A及其同系物的产量。

在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高Iturin A及其同系物的产量。

在优选的本发明方法中，本发明特别提供一株用于生产Iturin A及其同系物的枯草芽孢杆菌的遗传改良菌株Bacillus subtilis ZK-H6；其已于2009年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2897)。该菌株几乎不产或微量产生Surfactin。

本发明适用的吸附固定化细胞材料，可以是具备以下性能的任何材料：有微孔、透气性能好、细菌细胞易于附着、无毒无害的天然或人工合成的材料。

本发明优选的吸附固定化细胞材料，有天然纤维材料、聚乳酸微体、PVA等高分子材料微胶囊、玉米芯、糠壳、活性碳、木屑、硅藻土、煤碴等材料，作为能产生Iturin A及其同系物的细菌的吸附固定化细胞材料。所采用的吸附固定化细胞材料颗粒粒径在0.1-5.0mm，优选颗粒粒径为0.5-2.0mm。加入吸附固定化细胞材料的比例为1.0-200.0g/L发酵液，优选比例为5.0-50.0g/L发酵液。

本发明还在发酵液中加入了黏稠剂，以增加发酵液黏稠度，增强了细菌细胞的吸附效果，同时大大减少了发酵过程中泡沫的产生。本发明所添加的黏稠剂可以是以下物质中的1种或2种以上按任意比例混合的混合物：明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶，海藻酸钠和羧甲基纤维素钠(CMC)等，添加的浓度范围为0.1-100.0g/L发酵液，优选浓度为0.5-20.0g/L发酵液。

本发明二级发酵所采用的培养基A、B，及补料液C，其具体组成如下：

培养基A(g/mL)：葡萄糖0.5％-5.0％蛋白胨0.3％-5.0％

牛肉膏0.1％-2.0％硫酸镁0.05％-1.0％

磷酸二氢钾0.1％-1.0％

培养基B(g/mL)：

补料液C(g/mL)：

成分	一般范围	优选范围
			蔗糖/糖蜜	0.1％-4.0％	0.3％-3.0％
甘油	0.1％-2.0％	0.5％-2.0％
			葡萄糖	0.1％-10.0％	0.5％-6.0％
乳糖	0.1％-3.0％	0.3％-3.0％
			蛋白胨	0.3％-10.0％	0.5％-8.0％
黄豆粉或黄豆粉水解液	0.1％-10.0％	0.5％-5.0％
			花生粉或花生粉水解液	0.1％-10.0％	0.5％-5.0％
生物氮素	0.1％-10.0％	0.5％-5.0％

本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为：

将活化后的芽孢杆菌属菌种接种于培养基A中，固体培养或装于三角瓶内26℃-37℃摇瓶培养10-30小时后，以5％-30％的接种量接种于已加有灭菌培养基B、吸附固定化细胞材料和黏稠剂的发酵罐中进行发酵生产。菌种接种于第二级发酵罐后于26℃-37℃，优选28℃-33℃发酵培养4-30小时后，开始补料液C流加补料。补料液C流加补料方式有两种，一种是连续(匀速或非匀速) 流加，一种是间歇式流加，连续流加方式是优选的。

采用前一种方式时，以0.01-5.0L/h的速度连续(匀速或非匀速)流加补料液C，直至停止发酵(下罐)前约10小时。

采用后一种方式时，即间歇式流加补料液C，间歇时间可为每隔3-24小时补料1-5次，优选为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％-1.0％，优选0.1％一0.5％。

发酵条件：温度26℃-37℃，PH：6-8

发酵时间：3-6天

本发明的全工艺流程见附图1。

采用本发明工艺，菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产Iturin A及其同系物，Iturin A及其同系物的产量可达7.0g/L以上。

本发明具有以下优点：

一.采用液体培养基流加补料发酵，可以维持发酵工艺需求的较好的碳氮比，可以大幅提高Iturin A及其同系物的产量。

二.采用吸附固定化细胞技术，以及添加一定比例的黏稠剂，有利于提高发酵体系中细菌细胞的浓度，实现较高密度的发酵，大大减少发酵过程产生的泡沫，有利于控制溶解氧浓度、温度等技术参数，从而提高Iturin A及其同系物的产率。

三.提取工艺流程简单，回收率高，操作方便

附图说明

图1为Iturin A及其同系物发酵生产的流程图，图2是Iturin A的结构图。

由图中可以清楚的看出先用Iturin A及其同系物生产菌种按照所需条件进行二级发酵培养，在第二级发酵培养过程中再进行流加补料，然后对发酵产物进行后处理获得Iturin A及其同系物的过程。

具体实施方式

实施例1

用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-H6菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、10g/L吸附固定化细胞材料(聚乳酸微体，或PVA等高分子材料微胶囊，或木屑)和2％黏稠剂(糊精，或黄原胶，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％乳糖1.0％蔗糖1.0％甘油0.5％葡萄糖1.0％蛋白胨1.0％花生粉5.0％黄豆粉水解液2.0％生物氮素3.0％磷酸二氢钾0.1％氯化钠0.5％硫酸铁0.5％)。在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵8-15小时后，以0.1-1.0L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：蔗糖2.0％甘油1.0％葡萄糖2.0％乳糖1.0％蛋白胨2.0％黄豆粉水解液3.0％花生粉水解液2.0％生物氮素2.0％)，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH 6-8，发酵周期4天。

发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水＝100∶5∶20)。收集合伊枯草菌素A及其同系物的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，伊枯草菌素A及其同系物以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物产品。

采用高效液相色谱法检测Iturin A及其同系物，所用条件：色谱柱C1810.7φ×250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。

经检测，经过4天发酵，Iturin A及其同系物产量可达到9.5g/L发酵液，产品回收率达80％以上。

实施例2

用1000mL三角瓶12个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-H6菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、15g/L吸附固定化细胞材料(天然纤维材料，或聚乳酸微体，或木屑)和5％黏稠剂(琼脂，或可溶性淀粉，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉3.0％乳糖2.0％甘油0.6％废糖蜜3.0％葡萄糖1.0％蛋白胨0.1％花生粉水解液5.0％黄豆粉水解液2.0％生物氮素2.0％磷酸二氢钾0.1％氯化钠0.5％硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以0.5-2.0L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：糖蜜3.0％甘油1.0％葡萄糖2.0％乳糖1.0％蛋白胨4.0％黄豆粉5.0％花生粉3.0％生物氮素3.0％)，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH 6-8，发酵周期5天。

发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水＝100∶5∶20)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，伊枯草菌素A及其同系物以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物产品。

经检测，经过5天发酵，Iturin A及其同系物产量可达到10.0g/L发酵液，产品回收率达85％以上。

实施例3

用1000mL三角瓶15个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120灭菌30分钟，冷却后接种活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-H6菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、30g/L吸附固定化细胞材料(聚乳酸微体，或PVA等高分子材料微胶囊，或玉米芯，或木屑)和8％黏稠剂(可溶性淀粉，或糊精，或海藻酸钠)的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％乳糖2.5％甘油1.5％废糖蜜3.0％葡萄糖1.0％蛋白胨0.5％花生粉5.0％黄豆粉2.0％生物氮素4.0％磷酸二氢钾0.1％氯化钠0.5％硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以间歇式流加培养基C(培养基C：蔗糖/糖蜜2.0％甘油1.0％葡萄糖2.0％乳糖1.0％蛋白胨2.0％黄豆粉水解液5.0％花生粉2.0％生物氮素3.0％)，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH 6-8，发酵周期5天。

经检测，经过5天发酵，Iturin A及其同系物产量可达到8.0g/L发酵液，产品回收率达85％以上。

实施例4

用1000mL三角瓶12个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)BF-I(本实验室保存)菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、10g/L吸附固定化细胞材料(天然纤维材料，或聚乳酸微体，或PVA等高分子材料微胶囊，或玉米芯)和4％黏稠剂(明胶，或糊精，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％乳糖2.5％甘油1.5％废糖蜜3.0％葡萄糖1.0％蛋白胨0.5％花生粉5.0％黄豆粉2.0％生物氮素4.0％磷酸二氢钾0.1％氯化钠0.5％硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以0.5-2.0L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：蔗糖3.0％甘油1.0％葡萄糖2.0％乳糖1.0％蛋白胨4.0％黄豆粉5.0％花生粉3.0％生物氮素3.0％)，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH 6-8，发酵周期5天。

发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH 值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水＝100∶5∶20)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，伊枯草菌素A及其同系物以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物产品。

经检测，经过5天发酵，Iturin A及其同系物产量可达到7.0g/L发酵液，产品回收率达85％以上。

实施例5

用1000mL三角瓶16个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-H6菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％乳糖2.5％甘油0.6％蔗糖3.0％葡萄糖2.0％蛋白胨0.5％花生粉水解液5.0％黄豆粉水解液2.0％生物氮素3.0％磷酸二氢钾0.1％氯化钠0.5％硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-20小时后，以0.3-1.5L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：蔗糖2.0％甘油1.0％葡萄糖2.0％乳糖1.0％蛋白胨2.0％黄豆粉水解液4.0％花生粉水解液2.0％生物氮素5.0％)，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH 6-8，发酵周期5天。

经检测，经过5天发酵，Iturin A及其同系物产量可达到9.0g/L发酵液，产品回收率达85％以上。

实施例6

用1000mL三角瓶15个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-3(2003年4月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，专利保藏号为CGMCCNo.0924，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，地址：北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、30g/L吸附固定化细胞材料(聚乳酸微体，或PVA等高分子材料微胶囊，或玉米芯，或木屑)和8％黏稠剂(可溶性淀粉，或黄原胶，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％乳糖2.5％甘油1.5％废糖蜜3.0％葡萄糖1.0％蛋白胨0.5％花生粉5.0％黄豆粉2.0％生物氮素4.0％磷酸二氢钾0.1％氯化钠0.5％硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以间歇式流加培养基C(培养基C：蔗糖/糖蜜2.0％甘油1.0％葡萄糖2.0％乳糖1.0％蛋白胨2.0％黄豆粉水解液5.0％花生粉2.0％生物氮素3.0％)，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH 6-8，发酵周期5天。

经检测，经过5天发酵，Iturin A及其同系物产量可达到6.5g/L发酵液，产品回收率达85％以上。

应用实例1 伊枯草菌素A及其同系物防治蔬菜真菌病害：用1％的伊枯草菌素A及其同系物水剂稀释100倍-400倍，作田间喷施，防治植物真菌病害，发病率分别降低70％，68％，72％，61％。

应用实例2：伊枯草菌素A及其同系物防治禾谷真菌病害

用1％的伊枯草菌素A及其同系物水剂稀释100倍-400倍，作田间喷施，防治植物真菌病害。若将伊枯草菌素A及其同系物与一定浓度的脱落酸(ABA)一起喷施，可以提高防治效果与防治的持效性。

Claims

1.一种伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：所用菌种为枯草芽孢杆菌的遗传改良菌株Bacillus subtilis ZK-H6 CGMCC No.2897或Bacillus subtilis ZK-3 CGMCC No.0924，制备工艺分为两级，第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B；第二级培养在接种种子液前，加入吸附固定化细胞材料和黏稠剂，接种种子液后，进行发酵培养和流加补料液C的补料发酵培养，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集伊枯草菌素A及其同系物；

按g/mL计，培养基及补料液的具体组成如下：

培养基A：葡萄糖0.5％-5.0％，蛋白胨0.3％-5.0％，牛肉膏0.1％-2.0％，硫酸镁0.05％-1.0％，磷酸二氢钾0.1％-1.0％；

培养基B：

补料液C：

2.根据权利要求1所述的伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：吸附固定化细胞材料为有微孔、透气性能好、细菌细胞易于附着、无毒无害的天然或人工合成的天然纤维材料、聚乳酸微体、PVA高分子材料微胶囊、玉米芯、糠壳、活性碳、木屑、硅藻土、煤碴；颗粒粒径为0.1-5.0mm；加入量为1.0-200.0g/L发酵液。

3.根据权利要求2所述的伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：吸附固定化细胞材料的颗粒粒径为0.5-2.0mm；加入量为5.0-50.0g/L发酵液。

4.根据权利要求1所述伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：黏稠剂为明胶或/和琼脂或/和可溶性淀粉或/和糊精或/和黄原胶或/和海藻酸钠或/和羧甲基纤维素钠CMC；添加黏稠剂的浓度范围为0.1-100.0g/L发酵液。

5.根据权利要求4所述伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：黏稠剂为明胶或/和琼脂或/和可溶性淀粉或/和糊精或/和黄原胶或/和海藻酸钠或/和羧甲基纤维素钠CMC；添加黏稠剂的浓度范围为0.5-20.0g/L发酵液。

6.根据权利要求1所述伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：流加补料液C的方式为连续流加方式或间歇式流加方式。

7.根据权利要求6所述伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：连续流加方式为匀速或非匀速连续流加方式，以0.01-5.0L/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前约10小时。

8.根据权利要求6所述伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：间歇式流加的间歇时间为每隔3-24小时补料1-5次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％-1.0％。

9.根据权利要求6所述伊枯草菌素A及其同系物的制备方法，其特征是：间歇式流加的间歇时间为每间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。