CN104997756B - 一种伊枯草菌素a微胶囊剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伊枯草菌素A微胶囊剂的制备方法，属于农业微生物技术领域，该iturin A微胶囊剂由活性物质iturin A水溶液为芯材，以海藻酸钠和γ‑聚谷氨酸为壁材，将芯材水溶液与壁材水溶液搅拌混匀，高压匀质15 min得到稳定的乳化液，通过喷雾干燥技术制备iturin A微胶囊剂。本发明制备的微胶囊剂可有效阻隔外界紫外线、温度等不良环境对iturin A生物活性的影响，具有良好的控缓释性及贮存稳定性，在生物农药领域具有良好的应用前景。

Description

一种伊枯草菌素A微胶囊剂的制备方法

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素A微胶囊剂的制备方法。

背景技术

微胶囊技术是利用高分子材料把固体、液体或气体包覆成具有半透性或密封囊膜的一种微型胶囊的技术。微胶囊具有能够改变物料的状态、质量、体积和性能，保护敏感成分，增强稳定性，控制芯材释放，降低或掩盖不良味道、降低挥发性，隔离组分等功能，微胶囊技术在食品、医药、纺织、涂料、农业、化妆品工业等方面得到广泛的应用。

伊枯草菌素A(iturin A)是由枯草芽胞杆菌产生的一种具有环脂肽结构的两亲化合物，由7个氨基酸和1个β-氨基脂肪酸组成。iturin A含有3种同系物，分子量分别为1043Da、1057Da和1071Da，它们的氨基酸序列相同，脂肪酸链长度依次相差-CH₂。iturin A化学结构式如下：

iturin A具有表面活性和强烈的抗真菌特性，并且具有抗菌谱广、稳定性好、低毒、低残留和低过敏性的特点，其抗菌机制是同时作用于病原菌的细胞壁和细胞膜，是一种潜在的具有极大开发应用价值的生物农药。

目前，尚未见有关iturin A微胶囊剂的报道。本发明所述的iturin A微胶囊剂具有良好的抗紫外线性能、控缓释性和贮存稳定性等，可延长iturin A抑菌时效性和保质期，为iturinA微胶囊剂的农业应用提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种伊枯草菌素A微胶囊剂的制备方法，利用该方法制备的伊枯草菌素A微胶囊剂，具有良好抗逆性、控缓释性和贮存稳定性。

为了达到以上目的，本发明采用了以下技术方法：

一种伊枯草菌素A微胶囊剂的制备方法，包括以下步骤：

取200ml 1.0％-2.0％(质量百分比)的海藻酸钠水溶液，在40℃下，330-825r/min磁力搅拌下缓慢加入20-50ml 120-130μg/ml伊枯草菌素A(iturin A)水溶液，相同条件下搅拌20min后，缓慢加入200ml～800ml 1.0％-2.0％(质量百分比)的γ-聚谷氨酸的水溶液，相同条件下持续搅拌5h后，15-30Mpa高压匀质10-15min，得到iturin A微胶囊乳化液；

将iturin A微胶囊乳化液，采用喷雾干燥技术制备iturin A微胶囊剂；

喷雾干燥条件：进风温度为180℃～200℃，出风温度为90±5℃，进料速度为300ml/h。

如上所述的方案中，优选的海藻酸钠的质量百分比为1.25％；伊枯草菌素A的质量为3200μg；γ-聚谷氨酸的质量百分比为1.25％；

如上所述的方案中，优选的，磁力搅拌时，转速为495r/min；喷雾干燥时，进风温度为180℃。

以上所述方案中，涉及的各类试剂或原料，均来源于商业渠道或已被公开制备方法。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂可以有效阻隔外界紫外线的不良影响，iturinA微胶囊剂经与其相距30cm、30W紫外线照射36h后，iturin A保留率大于90％，提高iturinA微胶囊剂的抗逆性。

2.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂具有良好的控缓释性，微胶囊剂中iturin A在第1d缓释速率很快，缓释率达到70％左右；之后缓慢释放，在第6d微胶囊剂中iturin A释放完全。iturin A微胶囊剂可持续缓释6d，具有良好的控缓释性，可延长iturinA的抑菌时效性。

3.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂，常温常压下，微胶囊中iturin A的浓度在90d贮存期内没有显著变化，具有良好的贮存稳定性。

4.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂具有良好的分散性，呈球形，表面有凹陷，粒径大小较均匀，直径约为1.0-10.0μm。

附图说明

图1为一种iturin A微胶囊剂的电镜扫描图

图2为一种iturin A微胶囊剂的抗紫外线性能曲线示意图

X轴表示紫外照射时间(h)，Y轴表示iturin A保留率(％)。

图3为一种iturin A微胶囊剂的缓释曲线示意图

X轴表示缓释时间(d)，Y轴表示iturin A缓释率(％)。

具体实施方式

以下结合具体的实施例和实验数据对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。

实施例1：

一种伊枯草菌素A微胶囊剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)微胶囊壁材水溶液的制备：

I.按照质量百分比，配制1.25％的海藻酸钠水溶液，备用；

II.按照质量百分比，配制1.25％的γ-聚谷氨酸的水溶液，备用。

(2)微胶囊乳化液的制备：

取200ml由步骤(1)制备得到的1.25％的海藻酸钠水溶液，在40℃下，495r/min磁力搅拌下缓慢加入25ml，128μg/ml iturin A水溶液，相同条件下搅拌20min后，缓慢加入步骤(2)制备得到的200ml 1.25％的γ-聚谷氨酸的水溶液，持续搅拌5h，20Mpa高压匀质(GYB30-6D型，上海东华高压匀质机厂)15min，得到iturin A微胶囊乳化液。

(3)将步骤(2)的iturin A微胶囊乳化液，采用喷雾干燥技术制备iturin A微胶囊剂，用于以下实施例2-6。

喷雾干燥条件：进风温度为180℃，出风温度为90℃，进料速度为300ml/h。

所述海藻酸钠购自青岛明月海藻集团有限公司，规格为LN液相，批号为2^#。

所述的γ-聚谷氨酸是以左、右旋光性的谷氨酸为单元体，以γ-位上的酰胺键聚合而成同质多肽(Homo-polypeptide)，聚合度约在1,000-15，000之间。

所述的iturin A水溶液的制备：

枯草芽胞杆菌菌株X-01(CCTCC NO：M 208067)保藏菌种在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线，28℃恒温培养箱中培养24h，挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28℃、180rpm摇床培养24h，制备X-01种子液。向X-01发酵培养基中接种X-01种子液，接种量为2％，置于28℃、180rpm摇床培养48h，发酵液离心(8000r/min、4℃、10min)，取上清调pH至2.0进行酸沉淀，置于4℃冰箱过夜，再离心(8000r/min、4℃、10min)，收集沉淀，沉淀溶于纯水中，调pH至7.0复性，再次离心(8000r/min、4℃、10min)，取上清即为iturin A水溶液。

实施例2：

iturin A微胶囊剂的表观形态

制样(离子溅射仪)→电镜扫描仪(SEM)观察

iturin A微胶囊剂电镜扫描图见图1。从图中可知，iturin A微胶囊剂具有良好的分散性，呈球形，表面有凹陷，粒径大小较均匀，直径约为1.0-10.0μm。

实施例3：

iturin A微胶囊剂的包埋率测定

I.微胶囊剂中iturin A的提取

0.20g微胶囊剂加入10ml甲醇(色谱纯)，37℃，160r/min摇床浸润4h后，超声波处理40min，离心(8000r/min，4℃，10min)取上清1.0ml，用过滤头过滤除菌2次，收集滤液，置于4℃冰箱保藏。

II.高效液相色谱法(HPLC)测定iturin A微胶囊剂包埋率

流动相：40％乙腈水溶液，加磷酸氢二钾10mM，用磷酸调pH到7。检测波长为200nm，流速为0.8ml/min，进样量为20μl。

实施例1制备的iturin A微胶囊剂的包埋效果见表1。

表1.iturin A微胶囊剂的制备参数及包埋率

实施例4：

iturin A微胶囊剂的抗紫外性能研究

iturin A微胶囊剂抗紫外线性能以iturin A保留率为衡量指标，iturin A保留率越高，微胶囊剂抗紫外线性能越好。

0.20g iturin A微胶囊剂，均匀平铺在玻璃平板上，放置于超净工作台，在距离30W紫外线30cm处，分别照射6h、12h、18h、24h、30h和36h，以未经紫外照射iturin A微胶囊剂为对照，实验3个重复。微胶囊剂中iturin A的提取及HPLC测定方法同上。计算微胶囊剂中iturin A的保留率，绘制iturin A微胶囊剂抗紫外线性能曲线，判断iturin A微胶囊剂的抗紫外线性能。

iturin A微胶囊剂抗紫外线性能研究结果见表2和图2。由表2和图2可知，微胶囊在紫外照射0-36h内，iturin A保留率在最初6h基本保持在100％，随着紫外照射时间的延长，保留率虽然有所下降，但始终保持在90％以上。实验结果表明微胶囊的囊壁可以有效阻隔紫外线对芯材iturin A的影响，微胶囊具有良好的抗紫外线性能。

表2 iturin A微胶囊抗紫外线性能实验结果

实施例5：

iturin A微胶囊剂的耐贮存性研究

iturin A微胶囊剂用PA瓶封装，放置于常温常压下，实验时间90d，每30d打开其中一个PA瓶进行取样。具体取样方法如下：

0.20g iturin A微胶囊剂加入10ml甲醇(HPLC)，37℃，160r/min摇床浸润4h后，超声波处理40min，离心(8000r/min，4℃，10min)取上清1.0ml，用小滤头过滤除菌2次，收集滤液，置于-20℃冰箱保存。

HPLC测定取样iturin A的浓度，以开始贮存的微胶囊剂中取样iturin A的浓度为对照，比较贮存期分别为30d、60d和90d的微胶囊剂中iturin A的浓度的变化，判断iturinA微胶囊剂的贮存稳定性。HPLC测定方法同上。实验结果见表3。

表3.iturin A微胶囊剂在不同贮存期的iturin A的浓度

从上述图表可知，微胶囊剂在贮存90d内，iturin A的浓度没有显著变化。实验结果表明，微胶囊体系为iturin A提供了很好的保护作用，微胶囊具有良好的贮存稳定性。

实施例6：

1.iturin A微胶囊剂的控缓释性研究

0.20g iturin A微胶囊剂加入20ml纯净水，室温静置，每天取样200μl，置于-20℃冰箱保存。同时向缓释原液补加200μl纯净水使其体积不变，连续取样7d。将所取缓释样品冻干，用200μl甲醇(HPLC)溶解，置于4℃冰箱浸润4h后，用超声波处理40min，12000r/min离心2min，取上清，用滤头过滤除菌1次，收集滤液，HPLC测定其iturin A浓度，计算每天iturin A缓释率，绘制缓释曲线。HPLC测定方法同上。

2.iturin A微胶囊的释放动力学

为了了解iturin A的释放机理及释放动力学，本实验采用Ritger-Peppas(1)和Higuchi(2)模型进行分析。

M_t是释放时间t对应的芯材释放量，t_∞表示芯材释放极限时长，M_t/M_∞是芯材释放率，n代表扩散系数，k₁为释放速率常数。ln(M_t/M_∞)与ln(t)成线性关系，斜率为n，截距为ln(k₁)。

公式(2)表示释放率与释放时间的平方根成线性关系，k₂表现为t^0.5的溶解速率常数。

iturin A微胶囊剂控缓释性研究结果见表4和图3。从缓释曲线图可知，微胶囊剂中iturinA在第1d缓释速率很快，缓释率达到70％左右；之后缓慢释放，在第6d微胶囊剂中iturinA释放完全。由此可判断iturin A微胶囊剂可持续缓释6d，具有良好的控缓释性。

表4 iturin A微胶囊控缓释性实验结果

为了研究微胶囊中iturin A的释放动力学，本实验根据Ritger-Peppas和Higuchi模型对实验结果进行分析，得到相关动力学参数(见表5)。

表5根据Ritger-Peppas和Higuchi模型分析药物释放实验结果获得的iturin A释放数据(n为扩散系数，k₁和k₂为动力学常数，R²为相关系数)

据报道，在Ritger-Peppas模型中，扩散系数n用于解释释放机制。对于球形微胶囊来说，当0.43<n<0.85时，释放机制为Fickan扩散和壁材溶蚀；当n<0.43时，释放机制为Fickan扩散；当n>0.85时，释放机制为壁材溶蚀。从表5可知，根据Ritger-Peppas模型，R²为0.893，n为0.191，小于0.45。Higuchi模型是通过扩散速率来描述药物释放动力学。通过Higuchi模型得到R²为0.939。研究结果表明，药物释放动力学机制为Fickan扩散，微胶囊中iturinA的释放是由扩散控制的。

实施例7：

不同壁材配比制得的iturin A微胶囊包埋率

海藻酸钠与γ-聚谷氨酸质量比分别设定为1：1、1：2、1：3和1：4，芯材iturin A添加量为20ml，120μg/ml，搅拌转速为495r/min，进风温度为190℃。其余参数按照实施例1所述方法制备iturin A微胶囊，通过HPLC测定iturin A微胶囊包埋率。

壁材配比对iturin A微胶囊包埋率的影响结果见表6。

表6不同壁材配比制得的iturin A微胶囊包埋率

从表6可知，继续增加γ-聚谷氨酸添加量，iturin A微胶囊包埋率没有明显变化。增加γ-聚谷氨酸的添加量，可以有效提高微胶囊包埋率。但是，γ-聚谷氨酸黏度过低、成膜性差，当其添加量过大，微胶囊的囊壁物理屏障作用弱，对芯材保护作用差，不利于微胶囊的贮存。因此，壁材配比应适宜，最佳壁材质量比为1：1。

实施例8：

搅拌转速对iturin A微胶囊包埋效果的影响

搅拌转速分别设定为330r/min、495r/min、660r/min、825r/min和990r/min，壁材质量比为1：1，两壁材浓度均为1.25％，芯材iturin A添加量为20ml，120μg/ml，进风温度为190℃。其余参数按照实施例1所述方法制备iturin A微胶囊，通过HPLC测定iturin A微胶囊包埋率。

搅拌转速对iturin A微胶囊包埋率的影响结果见表7。

表7搅拌转速对iturin A微胶囊包埋率的影响

从表7可知，搅拌转速对iturin A微胶囊化效果有一定的影响。当搅拌转速从330r/min增加至825r/min时，微胶囊包埋率变化范围是60.19％～66.06％，微胶囊化效率有一定的波动，波动范围相对较小。其中，当搅拌转速为495r/min时，iturin A微胶囊包埋率达到最高值。因此，本实验选择495r/min作为最佳搅拌转速。

Claims (3)

1.一种伊枯草菌素A微胶囊剂的制备方法，包括以下步骤：

取200ml 1.0％-2.0％质量百分比的海藻酸钠水溶液，在40℃下，330-825r/min磁力搅拌下缓慢加入20-50ml 120-130μg/ml伊枯草菌素A水溶液，相同条件下搅拌20min后，缓慢加入200ml～800ml 1.0％-2.0％质量百分比的γ-聚谷氨酸的水溶液，相同条件下持续搅拌5h后，15-30MPa高压匀质10-15min，得到iturin A微胶囊乳化液；

将iturin A微胶囊乳化液，采用喷雾干燥技术制备iturin A微胶囊剂；

喷雾干燥条件：进风温度为180℃～200℃，出风温度为90±5℃，进料速度为300ml/h。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的海藻酸钠的质量百分比为1.25％；伊枯草菌素A的质量为3200μg；γ-聚谷氨酸的质量百分比为1.25％。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的磁力搅拌时，转速为495r/min；喷雾干燥时，进风温度为180℃。