CN102296043B - 高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。该组合物由A菌株、B菌株和C菌株组成：A菌株为玫瑰红红球菌（Rhodococcusrhodochrous）R-D3菌株，B菌株为微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonasacidaminiphila）G1菌株，C菌株为台湾嗜铜菌（Cupriavidustaiwanensis）X1菌株；分别将A菌株、B菌株和C菌株接种到LB液体培养基中培养制得：A菌液、B菌液、C菌液；将三种菌液按体积配比1～2：1～2：1～2混合均匀，得到高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。本发明的多菌株组合物可在1～7天内快速降解不同程度的有机磷农药残留，降解率达到95％以上，有效清除有机磷农药污染。

Description

高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物
技术领域
本发明属于环境生物工程，具体涉及高效降解环境中残留的有机磷农药的混合菌剂。
背景技术
我国是一个农业大国，农药的生产量和使用量均呈逐年递加之势。农药在农业生产上的大量应用，对于防治农作物病虫害方面起到了极其重要的作用，为粮食丰收提供了可靠的保证。但是，长期大量地使用农药使得环境中的农药污染日益严重，危及人们身体健康、食品安全及其他环境问题。有机磷类农药得到长期、广泛、大量的应用，其中毒死蜱是世界上使用量最大的农药之一。在我国，毒死蜱是甲胺磷和甲基对硫磷等高毒农药的新型高效、低毒替代品种，生产量和使用量很大。虽然毒死蜱是低毒的农药，但是使用量之大、使用范围之广，已对我国大部分地区的土壤、水体造成了严重的污染。存储在土壤、水体中的毒死蜱不仅对动植物、微生物等生命体产生毒害作用，而且，毒死蜱还直接和间接地影响了人类的健康，所以，需要研发高效清除毒死蜱等有机磷残留污染的生态修复技术，为农业安全生产和环境安全提供技术支持和参考。
国内外一般采用的技术，是从长期受有机磷农药污染的环境中筛选出降解残留农药的高效菌株，制成微生物制剂或酶制剂，将该类菌剂应用到受农药污染的土壤和水体中，降解残留的有机磷农药，实现生物修复。该类技术和菌剂是一种可靠低成本的措施。
在有机磷农药残留的生物修复领域中存在以下主要问题。①、不同环境中有机磷农药残留的浓度存在差异，不同实验室筛选获得的菌株的降解能力也存在差异，有的菌株对10mg/L～50 mg/L低浓度的有机磷残留降解较快，有的菌株对50mg/L～100 mg/L的较高浓度的有机磷残留降解较快，使用这类单一菌株的制剂，不易快速清除环境中的有机磷农药残留。②、现有的技术中缺乏快速降解高于100 mg/L有机磷农药残留的高效降解菌株。③、一般采用的菌株降解速度较慢，需要7天～30天以上的处理时间才能发挥充分降解效果。
发明内容
为了实现快速降解环境中的有机磷农药残留，本发明提供一种高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物，发挥不同微生物菌株活性，高效降解环境有机磷农药残留，实现污染的生物修复。
具体操作方法如下：
高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物包括下列A菌株、B菌株和C菌株：
（1）、A菌株为玫瑰红红球菌（Rhodococcus rhodochrous）R-D3菌株，可在24小时～48小时内降解10mg/L～20mg/L的有机磷农药残留；
（2）、B菌株为微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）G1菌株，可在24小时～48小时内降解50mg/L～100mg/L的有机磷农药残留；
（3）、C菌株为台湾嗜铜菌（Cupriavidus taiwanensis）X1菌株，可在24小时～48小时内降解100mg/L～300mg/L的有机磷农药残留；
分别将三种菌株接种到LB液体培养基中，30℃～37℃、120转/分钟震荡培养24小时～48小时，制得细胞浓度5.0×108/mL～1.0×1010/mL的A菌液、5.0×108/mL～1.0×1010/mL的B菌液、5.0×108/mL～1.0×1010/mL的C菌液；
A菌液、B菌液、C菌液按体积配比A：B：C为1～2：1～2：1～2混合均匀，得到高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。
本发明的多菌株组合物所能降解的有机磷农药包括：毒死蜱、或甲基对硫磷、或马拉硫磷、或杀螟硫磷。
将多菌株组合物释放到受有机磷农药污染的环境中，发挥多菌株组合物降解有机磷农药残留的生理功能，在2～4天的时间内，将残留的农药降解90％以上。
本发明的多菌株组合物可应用的环境包括：农田、或池塘、或果园、或草场、或河流、或人造水体。
本发明的多菌株组合物可以制成悬浮细胞多菌株组合物，具体操作方法如下：分别取100mL的A菌液、B菌液、C菌液，采取离心法获取菌液中的细胞，离心机转速为4000转/分钟～6000转/分钟，离心15分钟～30分钟；弃上清液，用0.85％的氯化钠溶液100mL将离心沉淀的细胞悬浮，分别制得A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞；将A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞按照体积配比为A：B：C为1～2：1～2：1～2混合均匀，制得悬浮细胞多菌株组合物。
悬浮细胞多菌株组合物主要适用于对水体质量要求较高的城乡水体，包括池塘、公园水面、河流。
本发明的多菌株组合物可以制成固态多菌株组合物，具体操作方法如下：
取所述A菌液100mL、B菌液100mL、C菌液100mL，混合，加入固态吸附剂150g~450g，混匀，即得固态多菌株组合物；所述的固态吸附剂包括泥炭、草木灰、粉碎的作物秸秆。
固态多菌株组合物的剂型主要适用于农田土壤，包括旱地、或水田、或果园、或草场。
本发明使用的菌种已按专利法实施细则第二十五条第三款的规定在国家知识产权局专利局指定的保藏单位——中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学；玫瑰红红球菌（Rhodococcus rhodochrous）R-D3菌株的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010232，并附具存活性报告书；微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）G1菌株的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010231，并附具存活性报告书；台湾嗜铜菌（Cupriavidus taiwanensis）X1菌株的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010233，并附具存活性报告书。
本发明具有以下方面优越性：
1、充分发挥具有不同降解特性的降解有机磷农药降解菌株的降解能力，可适应不同污染程度环境治理的需要；
2、制备的多菌株组合物可在1～7天内快速降解不同程度的有机磷农药残留，降解率达到95％以上，有效清除有机磷农药污染。
具体实施方式
下面对本发明作进一步地说明。
实施例1：多菌株组合物对水样中100mg/L高浓度农药毒死蜱的降解
1. 菌液制备
分别制备A菌液、B菌液和C菌液：
（1）、A菌株为玫瑰红红球菌（Rhodococcus rhodochrous）R-D3菌株，
（2）、B菌株为微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）G1菌株，
（3）、C菌株为台湾嗜铜菌（Cupriavidus taiwanensis）X1菌株，
制备LB液体培养基，分别从A菌株的斜面上、B菌株的斜面上和C菌株的斜面上无菌操作取一环菌种接种到LB液体培养基中；将接种后的培养基置于恒温震荡培养箱中培养，培养条件为：30℃、120转/分钟、培养24小时；分别制得细胞浓度5.0×109/mL的A菌液、细胞浓度8.0×109/mL的B菌液和细胞浓度6.0×109/mL的C菌液，温度4℃备用。
2. 多菌株组合物制备
将A菌液、B菌液和C菌液按体积比1:1:2混合，即制得多菌株组合物，置4℃备用。
3. 多菌株组合物对农药毒死蜱的降解
取5支比色管，分别吸取1mg/mL的毒死蜱石油醚溶液500μL加入到比色管底，用洗耳球吹干；加入4.5mL无菌基础培养基，即制得模拟农药毒死蜱水样；基础培养基的配方为：硫酸镁0.4 g，磷酸氢二钾0.2 g，硫酸铵0.2 g，磷酸钙0.08 g，磷酸亚铁0.002 g，蒸馏水1L，pH 7.2，121℃灭菌20分钟。
在第1支模拟农药毒死蜱水样中接入0.5mL多菌株组合物，制得多菌株组合物降解农药毒死蜱水样；在第2支模拟农药毒死蜱水样只加入0.5mL基础培养基为对照组；在另外3支模拟农药毒死蜱水样，分别接进A菌液、B菌液、C菌液0.5mL，为单一菌株降解农药毒死蜱水样；以上所有处理体积为5mL，农药毒死蜱含量为100mg/mL；将所有比色管置于35℃、120转/分钟的摇床中避光培养24小时；
4. 从水样中提取降解后的农药毒死蜱残留量
用石油醚萃取残留的农药毒死蜱。向所有水样中分别加入石油醚5mL，涡旋振荡2分钟，静置5分钟；待水样和石油醚分层，用胶头滴管吸取上层石油醚，经无水硫酸钠过滤至10mL容量瓶中，用石油醚将滤液定容至10 mL；分别制得多菌株组合物降解后农药毒死蜱残留样品、单一菌株降解后农药毒死蜱残留样品和对照组残留样品；
5. 测定农药毒死蜱残留量
采用气相色谱法测定多菌株组合物降解后农药毒死蜱残留样品中农药毒死蜱的残留量和对照组残留样品中的残留量；
气相色谱工作条件：用氮气作载气，流速：27 mL·min-1，柱流量4.00 mL·min-1；进样口SPL，分流比1：5，进样体积1 μL；色谱柱：Agilent DB-5毛细色谱柱，内径0.23 mm、长度30 m、膜厚0.25 μm；使用ECD检测器；进样口、色谱柱、检测器的温度分别为240 ℃、210 ℃、280 ℃；
计算多菌株组合物降解农药毒死蜱的降解率R：
Figure 567362DEST_PATH_IMAGE001
式中，R为多菌株组合物降解农药毒死蜱的降解率；C为水样中农药毒死蜱残留量；Cck为对照组水样中农药毒死蜱残留量；
6. 降解试验结果
一次试验结果如下表，所有水样中原初农药毒死蜱的浓度均为100mg/L，
Figure 330044DEST_PATH_IMAGE002
上表说明，经过24小时，对照组水样中的毒死蜱浓度为99 mg/L；处理3、4和5均为单一菌株降解试验，采用3个菌株单独处理都不能有效降解模拟水样中的农药毒死蜱，而本实施例的多菌株组合物对水中农药毒死蜱残留的降解效率最高，达到98％。
 实施例2：悬浮细胞多菌株组合物对水样中50mg/L高浓度农药毒死蜱的降解
1. 菌液制备
分别制备A菌液、B菌液和C菌液：
分别从A菌株的斜面上、B菌株的斜面上和C菌株的斜面上无菌操作取一环菌种接种到LB液体培养基中；将接种后的培养基置于恒温震荡培养箱中培养，培养条件为：30℃、120转/分钟、培养30小时；分别制得细胞浓度6.0×109/mL的A菌液、细胞浓度9.0×109/mL的B菌液和细胞浓度7.0×109/mL的C菌液，温度4℃备用。
采取离心法获取菌液中的细胞，离心机转速为5000转/分钟，离心20分钟；弃上清液，用0.85％的氯化钠溶液100mL将离心沉淀的细胞悬浮，分别制得A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞；将A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞按照体积配比为A：B：C为1～2：1～2：1～2混合均匀，制得悬浮细胞多菌株组合物。
2. 多菌株组合物制备
将A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞和C菌株悬浮细胞按体积比1:1:1混合，即制得菌株悬浮细胞多菌株组合物，置4℃备用。
3. 多菌株组合物对农药毒死蜱的降解
取5支比色管，分别吸取1mg/mL的毒死蜱石油醚溶液250μL加入到比色管底，用洗耳球吹干；加入4.5mL无菌基础培养基，即制得模拟农药毒死蜱水样。
在第1支模拟农药毒死蜱水样中接入0.5mL悬浮细胞多菌株组合物，制得悬浮细胞多菌株组合物降解农药毒死蜱水样；在第2支模拟农药毒死蜱水样只加入0.5mL基础培养基为对照组；在另外3支模拟农药毒死蜱水样，分别接进A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞0.5mL，为单一菌株降解农药毒死蜱水样；以上所有处理体积为5mL，农药毒死蜱含量为50mg/mL；将所有比色管置于35℃、120转/分钟的摇床中避光培养24小时。
4. 从水样中提取降解后的农药毒死蜱残留量
方法同实施例1，略；
5. 测定农药毒死蜱残留量
方法同实施例1，略；
6. 降解试验结果
一次试验结果如下表，所有水样中原初农药毒死蜱的浓度均为50mg/L，
Figure 998923DEST_PATH_IMAGE003
上表说明，经过24小时，对照组水样中的毒死蜱浓度为49 mg/L；处理3、4和5均为单一菌株降解试验，采用3个菌株单独处理都不能有效降解模拟水样中的农药毒死蜱，而本实施例的多菌株组合物对水中农药毒死蜱残留的降解效率最高，达到97.6％。
悬浮细胞多菌株组合物主要适用于对水体质量要求较高的城乡水体，包括池塘、公园水面、河流，使用量5mL～50mL/平方米。
 实施例3：固态多菌株组合物对土壤中20mg/L低浓度农药毒死蜱的降解
1. 菌液制备
A菌液、B菌液和C菌液的制备同上，分别制得细胞浓度5.0×109/mL的A菌液、细胞浓度8.0×109/mL的B菌液和细胞浓度6.0×109/mL的C菌液。
2. 固态多菌株组合菌物制备
分别取A菌液100mL、B菌液50mL和C菌液50mL，混合，即按体积比2:1:1混合均匀，加入固态吸附剂泥炭250g，混匀，即得固态多菌株组合物；温度4℃备用。
3. 多菌株组合物对土壤中农药毒死蜱的降解
取风干土壤500g置于塑料盆中，取200mL蒸馏水，加进10 mg/mL浓度的农药毒死蜱1mL、固态多菌株组合物40g，与水混合，将混合液体接进土壤中，与土壤混合均匀；空白对照处理如下，取风干土壤500g置于塑料盆中，取230mL蒸馏水，加进10 mg/mL浓度的农药毒死蜱1mL，不加多菌株组合物，将混合液体接进土壤中，与土壤混合均匀；另取3份土壤500g置于3个塑料盆中，分别取200mL蒸馏水，加进10 mg/mL浓度的农药毒死蜱1mL，分别接进A菌液、B菌液、C菌液30mL，为单一菌株降解农药毒死蜱土样；土壤中毒死蜱含量均为20mg/公斤干土，用8层纱布封口放置于30℃培养箱培养3天。
4. 从土壤中提取残留农药毒死蜱
对5种土壤样品分别进行如下处理：
（1）萃取：取上述接种降解后的土壤风干，准确称取风干土样10g，置于100mL具塞离心管中，加入50mL乙睛，振荡60分钟，再用离心机4000转/分钟离心5分钟，从离心管上层取乙睛25mL过无水硫酸钠后收集于浓缩瓶中，40℃下浓缩干燥。
（2）净化：用正己烷和丙酮溶解上述浓缩干燥物，用无水硫酸钠、弗罗里硅土过滤洗涤溶解物，收集样品，用正己烷定容至10mL，待测。
6. 农药毒死蜱残留测定
方法同实施例1，略。
7. 菌株组合物对毒死蜱的降解
一次土壤毒死蜱残留3天降解试验的结果如下表，土壤样品中农药毒死蜱的原始浓度为20 mg/公斤干土，
Figure 116921DEST_PATH_IMAGE004
上表说明，经过3天，对照组土样中的农药毒死蜱浓度为19.2mg/公斤，处理3、4和5分别为单一菌株降解试验，降解农药毒死蜱的程度不同；可以明显看出本实施例的多菌株组合物对土壤中农药毒死蜱残留的降解效率最高，达到95.2％。
固态多菌株组合物的剂型主要适用于农田土壤，包括旱地、或水田、或果园、或草场，使用量1kg～10kg/亩。

Claims (1)

1.高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物，其特征在于包括A菌株、B菌株和C菌株：
（1）、A菌株为玫瑰红红球菌（Rhodococcus rhodochrous），
（2）、B菌株为微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila），
（3）、C菌株为台湾嗜铜菌（Cupriavidus taiwanensis），
玫瑰红红球菌（Rhodococcus rhodochrous）的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010232；微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010231；台湾嗜铜菌（Cupriavidus taiwanensis）的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010233；
分别将A菌株、B菌株和C菌株接种到LB液体培养基中，30℃～37℃、120转/分钟震荡培养24小时～48小时，制得细胞浓度5.0×108/mL～1.0×1010/mL的A菌液、5.0×108/mL～1.0×1010/mL的B菌液、5.0×108/mL～1.0×1010/mL的C菌液；
A菌液、B菌液、C菌液按体积配比1～2：1～2：1～2混合均匀，得到高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。
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CN102851225B (zh) * 2012-03-15 2014-07-16 青岛农业大学 一株微嗜酸寡养单胞菌及其在防治苹果树腐烂病中的应用
CN105967436B (zh) * 2016-04-21 2019-04-26 南通职业大学 生物降解有机磷农药废水的方法
CN106422149A (zh) * 2016-09-23 2017-02-22 杭州富阳佳畅机械有限公司 降解有机磷农药残留的生物制剂
CN106434442A (zh) * 2016-09-23 2017-02-22 杭州富阳佳畅机械有限公司 一种有机磷农药的降解修复剂的制备方法
CN107019140A (zh) * 2017-05-22 2017-08-08 青岛天工智造创新科技有限公司 果蔬残留农药降解机
CN108410759B (zh) * 2018-03-06 2021-06-22 中国农业大学 一株高效降解氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌及其应用
CN109337877B (zh) * 2018-10-31 2021-11-12 安徽农业大学 二氯苯酚降解酶TcpA及其编码基因与生产菌的应用
CN110938569B (zh) * 2019-12-11 2021-06-15 山东科技大学 用于六价铬污染治理的微生物菌剂、六价铬污染治理方法

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