CN107841477A - 一株砷氧化菌在降低稻米三价砷污染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株砷氧化菌及其在降低稻米三价砷污染中的应用，所述菌为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)YYS001，该菌株于2017年8月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.14583。该菌株可以显著加速三价砷污染稻田土壤溶液中高毒性三价砷的氧化速率，抑制高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒的迁移，在降低稻米三价砷污染方面具有较好的应用前景。

Description

一株砷氧化菌在降低稻米三价砷污染中的应用

技术领域

本发明属于环境化学和环境微生物技术领域，具体涉及一株砷氧化菌及其在降低稻米三价砷污染中的应用。

背景技术

稻田土壤重金属污染已成为人们普遍关注的焦点。研究显示，我国已有近2000万公顷耕地受到镉、砷、铬、铅等重金属污染，面积接近全国耕地总面积的1/5。据报道，目前世界范围内亚洲国家砷污染最为严重，特别是孟加拉国、印度、中国等。湖南郴州工业区附近的稻田砷含量最高达866 mg/kg，台湾、山西、新疆、内蒙古等地区的地下水中砷污染物浓度甚至高达2 mg/L。由于农田砷污染的不断加剧、水稻淹水耕作的条件及其自身的生理特性，农田水稻在种植过程中不断吸收水体及土壤中的砷元素并在植株体内富集加重，稻米砷污染正引起世界各国的普遍关注。

砷是毒性很强的类金属元素，长期接触砷可以导致肺、外周神经、皮肤或心血管损伤，长期食用砷污染的稻米会引起皮肤癌、膀胱癌、肝癌或肺癌。大量研究表明，稻田土壤中砷污染物的浓度及存在形态会直接影响水稻对砷的吸收富集等特性，砷污染区大米累积的砷污染物浓度显著高于非污染区。农田淹水种植情况下，稻田土壤溶液中的砷污染物主要以高毒性三价砷形态存在，中国稻米累积的砷污染物主要是无机砷，特别是高毒性的三价砷。全世界有50%的人口以稻米为主食，降低稻米砷污染已成为国内外研究的重点。

当前国内外对于开展稻田土壤中砷的形态转化研究以降低稻米砷污染的方法有化学转化法和微生物转化法。化学转化法主要是利用土壤pH值、氧化还原电位或者共存元素实现对高毒性三价砷的氧化或者配位，如：氧、铁、锰、磷、硫、有机质等。研究表明，随着土壤pH值或者氧化还原电位的降低，土壤中有效态砷浓度将增大，且土壤中无机砷主要以高毒性三价砷存在，增加了砷污染物在水稻体内的迁移和富集。水稻根际泌氧、有氧栽培及土壤中存在的Fe、Mn等氧化性物质会氧化三价砷成五价砷，五价砷可以吸附在土壤表面或者与Fe、Mn配位结合后被固定在土壤中，从而被抑制迁移；低磷、高硫有助于水稻根表铁膜的形成，也可以抑制五价砷迁移。但是，在水稻淹水种植的还原性环境中，化学转化法氧化三价砷的效率低，且土壤中未被氧化的三价砷迁移无法被抑制，实践中迫切需要解决这一技术瓶颈，高效砷氧化菌是一个很好的选择。

本发明的木糖氧化无色杆菌YYS001可以显著加速三价砷污染稻田土壤溶液中高毒性三价砷的氧化速率，抑制高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒的迁移，达到降低稻米三价砷污染的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一株砷氧化菌及其在降低稻米三价砷污染中的应用。研究表明，本发明的菌株在降低稻米三价砷污染方面具有较好的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明人富集、分离、筛选到一株砷氧化细菌，该菌株被命名为YYS001，属一种木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)，该菌株于2017年8月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.14583，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。

菌株的筛选步骤如下：

(1) 采集砷污染土壤：2015年07月底采集福建省上杭县紫金山山脚下的砷污染土壤，测定砷污染土壤中砷污染物的含量。采用四分法缩分土壤样品，将砷污染样品保存于-80℃冰箱中，备接下来的菌株分离使用。

(2) 富集砷抗性菌：精确称取砷污染土壤1 g于装有150 mL含25 mg 三价砷[As(III)]/L灭菌富集培养基的三角瓶中，30℃摇床培养(128 rpm)一周，观察菌株生长情况。当培养基出现浑浊时，按10%比例(体积比)依次接种于下一个更高As(III)浓度的富集培养基中，As(III)的浓度分别为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，400 mg/L，以达到富集的目的。将最后一个富集培养基用无菌水稀释100倍，取0.2 mL稀释液，接种于含400 mgAs(III)/L的液体培养基D中，长出的菌株为砷抗性菌，置4℃冰箱中待用。富集培养基参照Santini等的配方作进一步改进后进行配制(J. M. Santini, et al. A newchemolithoautotrophic arsenite-oxidizing bacterium isolated from a gold mine:Phylogenetic, Physiological and preliminary bioehemical studies. Applied andEnvironmental Microbiology, 2000, 66(1): 92-97)，配方如下：100g富集培养基由99.38g溶液A，0.10g溶液B、0.50g溶液C和0.02g酵母浸出物组成，最终pH值为8.0。100g含400 mg As(III)/L的液体培养基D由99.86g溶液A，0.10g溶液B和0.04g酵母抽提物组成，最终pH值也是8.0。

其中，溶液A(Na₂SO₄·10H₂O 0.07 g/L; (NH₄)₂SO₄ 0.1 g/L; KCl 0.05 g/L;MgCl₂·6H₂O 0.04 g/L; CaCl₂·H₂O 0.05 g/L; KH₂PO₄ 0.17 g/L; NaHCO₃ 0.5 g/L;NaAsO₂ 0.04~0.69 g/L)，溶液B(Na₂EDTA·2H₂O 5.2 g/L, FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L, ZnCl₂0.07 g/L, MnCl₂·4H₂O 0.1 g/L, CoCl₂·6H₂O 0.19 g/L, CuCl₂·2H₂O 0.017 g/L,NiCl₂·6H₂O 0.024 g/L, H₃BO₃ 0.062 g/L, Na₂MoO₄·2H₂O 0.036 g/L)，溶液C(维生素B0.01 g/L, 核黄素0.04 g/L; 维生素B₁ 0.02 g/L,维生素B₅ 0.12 g/L, 烟硫胺0.2 g/L,维生素H₁₂0.04 g/L,维生素H 0.2 g/L,维生素H₆ 0.02 g/L, p-氨基苯酸0.02 g/L)，所有溶液用去离子水配制，溶液A 121℃灭菌20分钟，溶液B和溶液C过滤灭菌。

(3) 划线分离：将步骤(2)中得到的砷抗性菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆菌株。划线用培养基D平板，每次置30℃温箱中倒置培养2天，待菌长出后，再反复划线分离，直至获得单克隆菌株，将单克隆菌株置4℃冰箱中待用，并用甘油冷冻管保存一份于-80℃冰箱。培养基D平板配方如下：称2g琼脂，加100mL含400 mg As(III)/L的液体培养基D，121℃灭菌20分钟。

(4) 砷氧化菌筛选：采用IC-ICP-MS联用技术测定菌株液体培养基中不同形态砷化合物的浓度，进行高效砷氧化菌的筛选。

具体步骤：挑取步骤(3)中的单克隆菌株至最适液体培养基E中，添加NaAsO₂，使培养基中As(III)浓度达到200 mg/L，同时，以不添加单克隆砷抗性菌的培养基为对照，培养24小时，离心，取培养基上清液，过0.22 μm聚乙烯滤膜，按照李向美等的报导(Li, X.M.,Chen, Y.X., Ye, J., Fu, F.F., Pokhrel, G.R., Zhang, H., Zhu, Y.G., Yang,G.D., 2017. Determination of different arsenic species in food gradespirulina powder by ion chromatography combined with inductively coupledplasma mass spectrometry. Journal of Separation Science. 2017, 40(18), 3655-3661.)，测定上清液中三价砷和五价砷的浓度，分析单克隆砷抗性菌的三价砷氧化能力。培养基E配方如下：100mL液体培养基E中含0.3g 4-羟基苯甲酸、1g蛋白胨、0.5gNaCl和0.02gAs(III)，超声溶解后，用氢氧化钠固体调pH值至8。根据上清液中三价砷和五价砷的比例，筛选具有高效三价砷氧化能力的砷氧化菌。

(5) 砷氧化菌的分类鉴定：一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物27F(5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′)和1492R(5′GGYTACCTTGTTACGACTT3′)做PCR，扩增其16S rDNA (PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 70s，32个循环后，72℃延伸10min)。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送上海铂尚生物技术有限公司测序，再与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库比对，核苷酸同源性为99%，鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)；二是利用扫描电镜形态鉴定(见附图1)、革兰氏染色分析和生长特性鉴定。

菌学特征如下：菌体短杆状~杆状，长0.8-1.8 μm，宽0.4-0.6 μm，革兰氏阴性菌，适宜生长温度25-40℃，适宜pH 5-10，兼性好氧，在LB、培养基D和培养基E等固体培养基上均为白色、圆形、突起的菌落。

砷氧化菌对稻田三价砷污染物迁移转化调控的方案：先采集中国福建省福建农林大学常规种植水稻土壤作为研究材料，按每千克风干土壤样品外源添加100 mg As(III)的标准，制备砷污染土壤。接着设计不同接种比例的木糖氧化无色杆菌YYS001，考察YYS001对三价砷污染土壤中三价砷的加速氧化效果。最后，在最佳接种比例下，以广优明118水稻作为研究对象，全生育期盆栽土培，考察YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移过程中的抑制效果。

更详细的方法步骤如下：

(1) 制备三价砷污染土壤：2016年07月底采集福建农林大学常规种植水稻土壤作为研究材料，按每千克风干土壤样品外源添加100 mg As(III)的标准，制备砷污染土壤。

(2) 砷氧化菌YYS001菌液悬浮液的制备：配制100mL的最优液体培养基（10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、3g/L对羟基苯甲酸，pH 8.0），加入500μL 20000 mg/L的As(III)母液，使培养基砷达到100mg/L的浓度。接种0.25%的砷氧化菌YYS001单克隆菌液，置于转速为200rpm的30℃摇床上培养。24小时后，取出20mL菌液于离心管中进行离心，去除基体二次，得到YYS001菌液悬浮液。通过紫外可见光分光光度计测定悬浮菌液在600nm处吸光度。当吸光度OD₆₀₀等于0.8，平板菌落计数法计数得菌体数在1.00×10⁸ cfu/mL时，即可使用。

(3) YYS001对三价砷污染土壤中三价砷的加速氧化效果：在三价砷污染土壤中接种不同比例的木糖氧化无色杆菌YYS001，保持水稻土壤表面2cm淹水层，每个处理4个重复。静置培养24小时，原位取样土壤表层下10 cm处的土壤溶液，测定土壤溶液中不同形态砷化合物的浓度，考察YYS001接种比例对其三价砷氧化速率的影响。

(4) YYS001对三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移的影响：以广优明118水稻作为研究对象，设计三价砷污染土壤和接种最佳YYS001比例的三价砷污染土壤的实验方案，全生育期盆栽土培，考察YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移过程中的抑制效果。

具体步骤：设计二个实验方案，第一个方案，在三价砷污染土壤中不加YYS001菌株，作为三价砷毒害处理组AT；第二个方案，在每100g三价砷污染土壤中添加4.00 mLYYS001菌液(YYS001菌液的初始浓度约为1×10⁸ cfu/mL)，作为YYS001修复组GT。每个方案4个重复，全生育期栽培。水稻成熟期时，测定各个实验方案中广优明118稻米和谷壳中富集的不同形态砷化合物的浓度，观察YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移过程中的抑制效果。

本发明的优点在于：

据报导，稻田土壤中砷污染物的浓度及存在形态会直接影响水稻对砷的吸收富集等特性。本发明分离筛选到的木糖氧化无色杆菌YYS001可以显著加速三价砷污染稻田土壤溶液中高毒性三价砷的氧化速率，对抑制高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒的迁移起到关键作用，在降低稻米三价砷污染方面发挥重要作用。

附图说明

图1是本发明的木糖氧化无色杆菌YYS001的扫描电镜照片，放大倍数和比例尺已标示。

具体实施方式

实施例1：木糖氧化无色杆菌YYS001在三价砷污染稻田土壤溶液中对三价砷的加速氧化效果

采用福建农林大学稻田土壤作为研究材料，参考福建省上杭县紫金山山脚下砷污染土壤中砷污染物的浓度（105 mg/kg），外源添加100 mg/kg三价砷到福建农林大学稻田土壤中，制备三价砷污染土壤。接着设计不同接种比例的木糖氧化无色杆菌YYS001，考察YYS001对三价砷污染土壤中三价砷的加速氧化效果。具体做法如下：准备28个水桶（上口直径30cm，下口直径21cm，桶高25cm），每个桶中放置12 kg三价砷污染土壤，按照0.00、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0和100.0 mL/kg(土壤)的接种比例，往水稻桶中添加单克隆YYS001的培养菌体(YYS001菌液的初始浓度约为1×10⁸ cfu/mL)，搅匀。参考水稻淹水种植的常规条件，保持水稻土壤表面2cm淹水层，每个处理4个重复。静置培养24小时，毛细管取土壤孔隙水（土壤表面下方10cm处），离心，过0.22 μm聚乙烯滤膜，按照本课题组前期的报导测定土培液中三价砷和五价砷的浓度(Li, X.M., Chen, Y.X., Ye, J., Fu, F.F., Pokhrel,G.R., Zhang, H., Zhu, Y.G., Yang, G.D., 2017. Determination of differentarsenic species in food grade spirulina powder by ion chromatography combinedwith inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of SeparationScience. 2017, 40(18), 3655-3661.)。以未添加YYS001的砷污染土壤作为对照，分析YYS001在三价砷污染稻田土壤溶液中对三价砷的加速氧化能力。结果见表1。

由表1可以看出，三价砷污染土壤中不接种YYS001时，添加三价砷24小时后，也会有部分三价砷被氧化成五价砷，但是，土壤溶液中94%以上是高毒性三价砷。三价砷污染土壤中接种不同比例YYS001后，土壤溶液中三价砷的氧化率显著升高，达到48~86%左右，其中，以每kg土壤接种2.50mL YYS001的土壤溶液中游离三价砷的浓度最低，三价砷的氧化率最高，显示出最好的应用前景。由表1还可以看出，不管有无接种YYS001，土壤溶液中五价砷浓度维持在一个较低水平，这主要是由于生成的五价砷易于吸附在土壤表面或者与土壤溶液中的阳离子生成沉淀进而沉积到土壤表面，从而大大降低砷污染物的有效性和毒性。

表1 YYS001对三价砷污染土壤中三价砷的加速氧化效果

实施例2：木糖氧化无色杆菌YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移过程中的抑制效果

采用福建农林大学稻田土壤作为研究材料（对照土壤），参考福建省上杭县紫金山山脚下砷污染土壤中砷污染物的浓度（105 mg/kg），外源添加100 mg/kg三价砷到福建农林大学稻田土壤中，制备三价砷污染土壤。以广优明118水稻作为研究对象，设计三价砷污染土壤和YYS001修复三价砷污染土壤的实验方案，全生育期盆栽土培，考察YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移过程中的抑制效果。

具体做法如下：准备8个水桶（上口直径30cm，下口直径21cm，桶高25cm），每个桶中放置12 kg三价砷污染土壤。设计二个实验方案，第一个方案，在三价砷污染土壤中不加YYS001菌株，作为三价砷毒害处理组AT；第二个方案，在每100 g三价砷污染土壤中添加4.00 mL YYS001菌液(YYS001菌液的初始浓度约为1×10⁸ cfu/mL)，作为YYS001修复组GT。每个方案4个重复，全生育期盆栽。水稻成熟期时，收获稻谷，分离稻米和谷壳，密闭微波辅助提取稻米和谷壳中不同形态的砷化合物，采用IC-ICP-MS联用技术，测定各个实验方案中广优明118稻米中富集的不同形态砷化合物的浓度，观察YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移过程中的抑制效果。结果见表2和表3。

由表2 可以看出，广优明118水稻在100mg/kg三价砷污染土壤与YYS001修复土壤中生长到成熟期时，稻米中主要富集的都是4种形态的砷化合物，即：二甲基砷酸[DMA(V)]、三价砷[As(III)]、一甲基砷酸[MMA(V)]和五价砷[As(V)]，其中，DMA(V)都是占主导地位的砷形态，大约占砷形态总和的71~81%。但是，与三价砷污染土壤相比，YYS001修复组中，广优明118稻米中富集的高毒性三价砷浓度显著降低，大约只有三价砷毒害处理组的43%，显示本发明在抑制高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移方面具有很好的应用前景。

表2 YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向广优明118稻米迁移过程中的抑制效果

^*平行测定平均值±标准偏差，^** p<0.01显著。下同。

表3 YYS001对高毒性三价砷污染物从污染土壤向广优明118谷壳迁移过程中的抑制效果

由表3 可以看出，广优明118水稻在100 mg/kg三价砷污染土壤与YYS001修复土壤中生长到成熟期时，谷壳中主要富集的是5种形态的砷化合物，即：三甲基砷氧[TMAO(V)]、二甲基砷酸[DMA(V)]、三价砷[As(III)]、一甲基砷酸[MMA(V)]和五价砷[As(V)]，其中，DMA(V)和As(V)是占主导地位的砷形态，DMA(V)大约占砷形态总和的36~39%，As(V)大约占砷形态总和的37~45%，二者浓度的总和约占砷形态的74~84%。相似地，与三价砷污染土壤相比，YYS001修复组中，广优明118谷壳中富集的高毒性三价砷浓度显著降低，大约只有三价砷毒害处理组的24%，同样显示本发明在抑制高毒性三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移方面具有很好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株砷氧化菌在降低稻米三价砷污染中的应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

ggytaccttg ttacgactt 19

Claims (2)

1.一株木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)YYS001在降低稻米三价砷污染中的应用，所述菌株其保藏号为CGMCC NO.14583。

2.一株木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)YYS001在抑制三价砷污染物从污染土壤向水稻籽粒迁移的应用。