CN103834589A - 一株木糖氧化无色杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株对无机三价砷有氧化作用和甲其化作用的木糖氧化无色杆菌GD03及其在修复苗期水稻砷毒害方面的初步应用，该菌株于2013年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏号为CGMCCNo.8512。本发明的特征是从砷污染模拟稻田土壤中富集分离得到一株对无机三价砷有氧化和甲基化作用的木糖氧化无色杆菌GD03。该菌株可以将砷污染环境中的无机三价砷氧化为五价砷，且具有甲基化功能，极大地降低了环境中高毒性三价砷的毒性并增强了砷污染物的可吸附去除性。

Description

一株木糖氧化无色杆菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株对无机三价砷有氧化作用的木糖氧化无色杆菌GD03的筛选及其在缓解苗期水稻生长砷毒害方面的用途。

背景技术

砷污染已成为全球面临的一个严重环境问题。据报道，目前世界范围内亚洲国家砷污染最为严重，特别是孟加拉国、印度、中国等(Y. G. Zhu, et al. Exposure to inorganic arsenic from rice: A global health issue Environmental Pollution, 2008, 154(2): 169-171)。在我国，由于矿山排放和工农业生产所使用的各种含砷化学物质等因素使土壤、地下水、饮用水中砷含量不断升高，最终通过“土壤/水→植物体/动物体→人体”食物链被富集和摄入，严重危害人体健康。

当前国内外对于砷污染的治理主要采用物理、化学、植物修复法和微生物修复法(M. I. Litter, et al. Possible treatments for arsenic removal in Latin American waters for human consumption. Environmental Pollution, 2010, 158(5): 1105-1118)。吸附、过滤、客土法等物理方法耗时、费用高，不利于大规模净化；化学沉淀、化学氧化/还原成本高、易于带入二次污染；植物修复法（如蜈蚣草）可以将土壤中高浓度的砷污染物富集到体内，但是，不适宜砷污染地下水的处理，而且，砷超富集植物的种植和后续处理工作量也比较大；微生物修复法主要利用微生物对重金属离子的氧化/还原、甲基化/去甲基化等代谢作用达到砷污染治理的目的，是一种廉价、安全又最有效的修复方式且不会造成环境结构的破坏，符合可持续发展的需要，是当前最有前景的一种砷污染治理方法(蔡林, 王革娇. 净化砷污染的木糖氧化无色杆菌SY8及用途. 2007, 专利号: ZL200710052064.6)。但是，该法常需结合土壤或活性污泥对五价无机砷的强吸附性才能达到高去除率，而环境中高毒性的三价砷因不带电荷不易从环境中去除，所以，处理含砷的废水、污灌水、土壤时，迫切需要将三价砷高效氧化成五价砷，而化学氧化法又往往效率不够高，实践中迫切需要解决这一技术瓶颈，高效砷氧化菌是一个很好的选择。

砷污染物的毒性和迁移性与它在环境中的化学形态密切相关。环境中高毒性的砷污染物主要以三价无机砷和五价无机砷存在，其中，三价无机砷在环境介质pH值下不带电荷，不易被吸附去除，移动性强，毒性远远高于五价无机砷，本发明的木糖氧化无色杆菌GD03可以将高毒性的三价砷高效氧化为易被吸附去除、弱毒性的五价砷，不但大大降低了环境中砷的毒性，抑制了高毒性三价砷在环境－生物系统的迁移，而且可以配合新兴的微生物活性污泥法，达到对砷污染环境的净化。

发明内容

本发明的目的在于提供一株对无机三价砷有氧化作用和甲其化作用的木糖氧化无色杆菌GD03及其在修复苗期水稻砷毒害方面的初步应用。本发明的特征是从砷污染模拟稻田土壤中富集分离得到一株对无机三价砷有氧化和甲基化作用的木糖氧化无色杆菌GD03。该菌株可以将砷污染环境中的无机三价砷氧化为五价砷，且具有甲基化功能，极大地降低了环境中高毒性三价砷的毒性并增强了砷污染物的可吸附去除性。本发明菌株被命名为木糖氧化无色杆菌GD03(Achromobacter xylosoxidants)，是一种新发现的砷氧化菌，其保藏号为CGMCC No.8512。初步研究表明，本发明的菌株在修复苗期水稻砷毒害方面具有较好的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株木糖氧化无色杆菌，该菌株被命名为木糖氧化无色杆菌GD03，属一种木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans，该菌株于2013年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏号为CGMCC No.8512。

该菌株可应用于修复苗期水稻砷毒害方面。

先采集中国福建省福州市某地稻田土壤样品，加入一定浓度NaAsO₂ (As(III))，按照As(III)浓度逐渐增加的方式(见后面的详细描述，下同)进行富集培养，再对富集培养的土样进行稀释并接种于含有一定浓度As(III)的液体培养基中，培养长出砷抗性菌，挑取不同形态的菌落划线得单克隆，先用AgNO₃氧化法定性检测单克隆砷抗性菌的砷氧化能力(M.C. Lett, et al. A simple and rapid method for arsenite and arsenate speciation. In: Ciminelli VST, Garcia O, Jr. (eds.), Biohydrometallurgy: Fundamentals, Technology and Sustainable Development. Part B Biosorption and Bioremediation Chapter IV, 1 ^st  edition. Elsevier Science. 2001, New York, NY. pp. 541-546)，再用毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱(CE-ICP-MS)联用技术定量分析单克隆砷抗性菌的砷氧化能力，获得具有砷氧化能力的砷氧化菌，再对筛选出的砷氧化菌做形态学和16S核榶体RNA基因(16S rDNA)等相关鉴定工作，最终得到木榶氧化无色杆菌GD03。

木糖氧化无色杆菌GD03的保藏：

木糖氧化无色杆菌GD03可以在LB或培养基E的液体或固体培养基上28℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。若长期保藏，使用甘油冷冻管保藏菌株更合适。

本发明的优点在于：

据报导，无机三价砷的毒性远远高于无机五价砷，是强致癌性物质，在环境介质pH<9情况下，无机三价砷均以分子型体存在，具有很强的移动性，易于毒害其中生长的生物体，不易去除。本发明分离筛选到的木糖氧化无色杆菌GD03可以将无机三价砷氧化为无机五价砷，无机五价砷在环境介质pH>2情况下，均以阴离子形体存在，易于被吸附去除，极大地降低了环境中高毒性砷污染物的危害。本发明菌株是从稻田土砷污染模拟土样中分离筛选得到的，对砷污染环境具有较强的抗性和适应性，有望在修复稻田砷污染方面发挥重要作用。

附图说明

图1：是本发明的木糖氧化无色杆菌GD03的砷氧化曲线图，X轴代表时间（小时），Y轴左边代表木糖氧化无色杆菌GD03的吸光度值(OD₆₀₀)，Y轴右边代表砷氧化率(%)。

图2：是本发明的木糖氧化无色杆菌GD03的扫描电镜照片，放大倍数和比例尺在图中已标明。

具体实施方式

实施例1：从砷污染模拟土壤中分离木糖氧化无色杆菌GD03

实验土壤取自福建省福州市某地稻田土的表层土壤，按照1 g As(III)/kg土的比例加入NaAsO₂，混合均匀后于暗处放置3个月，获得砷污染模拟土样，具体操作步骤如下：

(1)砷抗性菌富集：精确称取砷污染模拟土样1 g于装有150 ml含25 mg As(III)/L灭菌富集培养基的三角瓶中，30℃摇床培养(128 rpm)一周，观察菌株生长情况。当培养基出现浑浊时，按10%比例(体积比)依次接种于下一个更高As(III)浓度的富集培养基中，As(III)的浓度分别为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，400 mg/L，以达到富集的目的。将最后一个富集培养基用无菌水稀释100倍，取0.2 ml稀释液，接种于含400 mg As(III)/L的液体培养基D中，长出的菌株为砷抗性菌，置4℃冰箱中待用。富集培养基参照Santini等的配方作进一步改进后进行配制(J. M. Santini, et al. A new chemolithoautotrophic arsenite-oxidizing bacterium isolated from a gold mine: Phylogenetic, Physiological and preliminary bioehemical studies. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(1): 92-97)，配方如下：100ml富集培养基由99.38ml溶液A，0.10ml溶液B、0.50ml溶液C和0.02ml酵母抽提物组成，最终pH值为8.0。100ml含400 mg As(III)/L的液体培养基D由99.86ml溶液A，0.10ml溶液B和0.04ml酵母抽提物组成，最终pH值也是8.0。其中，溶液A(Na₂SO₄·10H₂O, 0.07 g/L; (NH₄)₂SO₄, 0.1 g/L; KCl, 0.05 g/L; MgCl₂·6H₂O, 0.04 g/L; CaCl₂·H₂O, 0.05 g/L; KH₂PO₄, 0.17 g/L; NaHCO₃, 0.5 g/L; NaAsO₂, 0.025~0.4 g As(III)/L)，溶液B(Na₂EDTA·2H₂O, 5.2 g/L, FeCl₂·4H₂O, 1.5 g/L, ZnCl₂, 0.07 g/L, MnCl₂·4H₂O, 0.1 g/L, CoCl₂·6H₂O, 0.19 g/L, CuCl₂·2H₂O, 0.017 g/L, NiCl₂·6H₂O, 0.024 g/L, H₃BO₃, 0.062 g/L, Na₂MoO₄·2H₂O, 0.036 g/L)，溶液C(维生素B, 0.01 g/L, 核黄素, 0.04 g/L; 维生素B₁, 0.02 g/L,维生素B₅, 0.12 g/L, 烟硫胺, 0.2 g/L,维生素H₁₂, 0.04 g/L,维生素H, 0.2 g/L,维生素H₆, 0.02 g/L, p-氨基苯酸, 0.02 g/L)，所有溶液用去离子水配制，溶液A 121℃灭菌20分钟，溶液B和溶液C过滤灭菌。

(2) 划线分离：将步骤(2)中得到的砷抗性菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆。划线用培养基D平板，每次置30℃温箱中倒置培养2天，待菌长出后，再反复划线分离，直至获得单克隆菌株，将单克隆菌株置4℃冰箱中待用并用甘油冷冻管保存一份于-80℃冰箱。培养基D平板配方如下：称2g琼脂，加100ml含400 mg As(III)/L的液体培养基D，121℃灭菌20分钟。

(3) 砷氧化菌筛选：本发明同时采用2种技术方案进行砷氧化菌的筛选，一个是AgNO₃氧化法，另一个是CE-ICP-MS联用技术。

a、AgNO₃氧化法：挑取步骤(3)中的单克隆菌株，于培养基D平板上进行划线培养，培养2天后，用质量浓度为0.1%的AgNO₃溶液漫布培养基D以检查砷抗性菌的砷氧化能力，以培养基的黑度强弱来评价单克隆砷抗性菌对三价砷的氧化能力大小，黑度越大，菌株氧化三价砷的能力越强，反之越小(因为Ag⁺与AsO₄ ^3-沉淀的颜色比Ag⁺与AsO₂ ^-沉淀的颜色更深，所以，培养基D中如果存在NaAsO₂，则与Ag⁺反应后，生成沉淀的黑度弱，反之，则黑度强)。

b、CE-ICP-MS联用技术：挑取步骤(3)中的单克隆菌株至最适液体培养基E中，添加NaAsO₂，使培养基中As(III)浓度达到200mg/L，同时，以不添加单克隆砷抗性菌的培养基为对照，培养24小时，离心，取培养基上清液，过0.22 μm聚乙烯滤膜，按照杨桂娣等的报导测定三价砷和五价砷的含量(G. D. Yang, et al. Speciation analysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry. Talanta, 2009, 78(2): 471-476)，分析单克隆砷抗性菌的砷氧化能力。培养基E配方如下：100ml最适液体培养基E中含0.3g 4-羟基苯甲酸、1g蛋白胨、0.5gNaCl和0.02g As(III)，超声溶解后，用氢氧化钠固体调pH值至8。

根据AgNO₃氧化法中琼脂培养基的黑度和CE-ICP-MS联用技术中测定的三价砷和五价砷含量的比例共同筛选具有高效三价砷氧化能力的砷氧化菌。

(4) 砷氧化菌的分类鉴定：一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物27F(5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′)和1492R (5′GGYTACCTTGTTACGACTT3′)做PCR扩增其16S rDNA (PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃，30s，50℃，45s，72℃，70s，32个循环后，72℃延伸10min)。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送上海铂尚生物技术有限公司测序，再与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库比对，核苷酸同源性为99%，鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)；二是利用扫描电镜形态鉴定(见附图2)、革兰氏染色分析和生长特性鉴定。菌学特征如下：菌体短杆状，长0.6-0.9μm，宽0.3-0.5 μm，革兰氏阴性菌，适宜生长温度20-40℃，适宜pH 7-10，兼性好氧，在LB、培养基D和培养基E等固体培养基上均为白色、圆形、突起的菌落。

实施例2：木糖氧化无色杆菌GD03的砷氧化曲线

挑取木糖氧化无色杆菌GD03单克隆，接种到100ml含100mgAs(III)/L的最适液体培养基E中，置28℃摇床中振荡培养48小时，以5%的接种量从中吸取5ml到100ml新鲜含150mgAs(III)/L的最适液体培养基E中，置28℃摇床中振荡培养24小时，再从中吸取5ml到100ml新鲜含200mgAs(III)/L的最适液体培养基E中，置28℃摇床中振荡培养24小时，此时GD03的OD₆₀₀约为0.8左右，保存在4℃冰箱，作为种子菌液用于接种。以5%的接种量从种子菌液中吸取5ml到100ml新鲜含1000mgAs(III)/L的最适液体培养基E中，置28℃摇床中振荡培养9小时后开始取样，每隔1小时取一次样，直至As(III)完全氧化为止，每次分别取1.2ml和0.5ml，用分光光度法测定GD03的OD₆₀₀，现取现做；用CE-ICP-MS联用技术测定最适液体培养基E中无机三价砷和无机五价砷的浓度，取样后，三天内完成测定。具体做法如下：一是测定GD03的生长指标OD₆₀₀，以未添加GD03的最适液体培养基E作为参比溶液，每次取1.2ml，直接测定其在600nm处的吸光值。二是无机三价砷和五价砷浓度，取0.5ml，离心，上清液过0.22 μm聚乙烯滤膜，按照杨桂娣等的报导测定含GD03的最适液体培养基E中三价砷和五价砷的含量(G. D. Yang, et al. Speciation analysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry. Talanta, 2009, 78(2): 471-476)。绘制的木糖氧化无色杆菌GD03砷氧化曲线见附图1。

实施例3：木糖氧化无色杆菌GD03在模拟砷污染水稻水培液中对三价砷的氧化效果

采用水稻常规N、P、K营养水培液（含N 23mg/L、P 7mg/L、K 21mg/L）作为对照，参照我国砷污染地下水最大含砷水平大约为2-3 mg/L，往水稻水培营养液中加NaAsO₂，使水培液中三价砷浓度达到3mg/L，设计水稻水培营养液中不同接种比例的木糖氧化无色杆菌GD03，考察GD03对三价砷的氧化效果。具体做法如下：准备8个250ml三角瓶，4个装100ml水稻常规N、P、K营养水培液（121℃灭菌20分钟），其余4个分别装100ml不灭菌的水稻常规N、P、K营养水培液，按照0%、0.25%、0.50%和1%的接种比例(体积比)，往三角瓶中补加木糖氧化无色杆菌GD03的培养菌体，每瓶再补加NaAsO₂母液，使三价砷终浓度达到3mg/L，置28℃摇床中振荡培养24小时，取样，离心，过0.22 μm聚乙烯滤膜，按照杨桂娣等的报导测定水培液中三价砷和五价砷的含量(G. D. Yang, et al. Speciation analysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry. Talanta, 2009, 78(2): 471-476)，分析GD03的砷氧化能力。结果见表1。

表1 CE-ICP-MS联用法检测模拟砷污染水稻水培液中的结果

     由表1可以看出，水稻常规N、P、K营养水培液不管有无灭菌，不加GD03时，28℃摇床中振荡培养24小时后，三价砷均不被氧化，砷氧化率为0，说明水稻常规N、P、K营养水培液本身氧化三价砷的速率非常慢。但是，当水稻常规N、P、K营养水培液中接种0.25%木糖氧化无色杆菌GD03后，不管有无其他菌株共存，GD03在24小时内能将3 mg/L的As(III)完全氧化，说明，木糖氧化无色杆菌GD03无论在单一存在下还是在与其他微生物共存时，均对三价砷有很好的氧化效果，显示本发明具有较好的应用前景。

实施例4：木糖氧化无色杆菌GD03对水稻水培液中三价砷胁迫下苗期水稻生长的解毒效果

采用水稻常规N、P、K营养水培液（含N 23mg/L、P 7mg/L、K 21mg/L）作为对照，往水稻水培营养液中加NaAsO₂，使水培液中三价砷浓度达到3 mg/L，以汕优63苗期水稻作为研究对象，设计常规N、P、K营养水培液、常规N、P、K营养水培液加3mgAs(III)/L和常规N、P、K营养水培液加3mgAs(III)/L和0.25%木糖氧化无色杆菌GD03三个试验方案，考察GD03对三价砷胁迫下汕优63苗期水稻生长的修复作用。具体做法如下：按照杨桂娣等的报导种植水稻到二叶一芯期(杨桂娣, 等. 营养调控对三价砷胁迫下苗期水稻叶绿素SPAD值的影响. 福建农林大学学报(自然科学版), 2013, 42(5):453-458)，移至盛有0.5 L水培营养液的塑料碗中。设计三个试验方案，第一个方案，只有常规N、P、K营养水培液，不加NaAsO₂和GD03菌株，作为CK对照组；第二个方案，在常规N、P、K营养水培液中只加NaAsO₂，但不加GD03菌株，作为砷毒害处理组；第三个方案，在常规N、P、K营养水培液中同时加NaAsO₂和GD03菌株(0.25%接种，体积比)，作为GD03修复组。每个方案3个重复，处理6 d，测定各实验方案中汕优63苗期水稻的根长和株高，观察GD03对三价砷胁迫下苗期水稻生长的解毒作用。结果见表2。

表2 GD03对三价砷胁迫下汕优63苗期水稻生长的解毒作用

^*平行测定平均值±标准偏差

由表2 可以看出，汕优63苗期水稻在3mg As(III)/L胁迫6天时，便对汕优63根长、株高有显著的毒害作用，对根长生长的毒害性远大于株高。但是，当水培液中存在0.25%木糖氧化无色杆菌GD03时，三价砷对汕优63根长和株高生长的抑制作用被显著缓解，根长、株高基本上与对照组差不多，对根长生长的恢复率要高于对株高生长的恢复率(即：1-抑制率)，显示本发明具有很好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>福建农林大学

 

<120>一株木糖氧化无色杆菌及其应用

 

<130>2

 

<160>2    

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

agagtttgat cmtggctcag                                                20

 

 

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

ggytaccttg ttacgactt                                                  19

 

Claims (2)

1.一株木糖氧化无色杆菌，其特征在于：一株砷氧化细菌，该菌株被命名为木糖氧化无色杆菌GD03，属一种木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans，该菌株于2013年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏号为CGMCC No.8512。

2.如权利要求1所述的一株木糖氧化无色杆菌的应用，其特征在于：可应用于修复苗期水稻砷毒害方面。

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