CN107794051A - 一种净化砷污染土壤的生物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种净化砷污染土壤的生物制剂，更具体地涉及一种复合微生物菌剂与纳米材料共同制备的生物制剂及其用途，目的在于解决单一方法难以高效修复砷污染的问题。本发明提供的生物制剂包括：复合微生物菌剂与纳米材料。本发明提供微生物复合菌剂能够耐受高剂量的砷，可以对土壤中的砷元素进行吸附、改性、富集，以提高生物修复的效果。
Description
技术领域
本发明涉及土壤修复领域，具体地涉及一种微生物与纳米粒子联合修复砷污染土壤的方法。
背景技术
日前，全球面临一个严重环境问题——砷污染。据统计，世界范围内亚洲地区砷污染最为严重，特别是孟加拉国、印度、中国等国家(Y.G.Zhu,et al.)。由于矿山排放和工、农业生产所使用的各种含砷化学物质的释放或排放，我国土壤、地下水及饮用水中的砷含量不断升高，最终通过“土壤/水到植物体/动物体到人体”这一食物链被人体摄入和富集，严重危害人体健康，致癌、致畸、致突变。
日前，针对土壤砷污染的修复方法主要有物理修复、化学修复、农业生态修复等。物理修复主要包括电动修复以及电热修复，化学修复主要为土壤热淋，由于物理修复及化学修复方法均有一定缺陷，生物修复成为砷污染土壤修复方法的研究热点。
本发明提供一种微生物与纳米粒子联合修复系统，通过所选微生物菌剂与改性纳米粒子的相互配合，组成稳定的生物修复系统，利用微生物菌剂与改性纳米粒子对土壤中砷元素的吸附、改性、富集的作用，有效清理或吸附污染土壤中的砷，实现对土壤的有效修复。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种净化砷污染土壤的生物制剂。
本发明是以如下技术方案实现的：
为实现上述目的，本发明提供一种净化砷污染土壤的生物制剂，包括复合微生物菌剂和纳米材料。
进一步地，所述纳米材料为纳米零价铁，所述复合微生物菌剂包括但不限于木糖氧化无色杆菌、恶臭假单胞菌、兼性厌氧砷氧化副球菌、气单胞菌、甲酸甲烷杆菌、类黄氢噬胞菌、尖孢镰刀菌、曲霉、无色菌、变形杆菌、尼青霉。
更进一步地，所述复合微生物菌剂为复合微生物菌剂A或复合微生物菌剂B，所述复合微生物菌剂A包括如下质量百分比的成分：木糖氧化无色杆菌15％、恶臭假单胞菌5％、兼性厌氧砷氧化副球菌7.2％、气单胞菌6.8％、甲酸甲烷杆菌3％、类黄氢噬胞菌2％、尖孢镰刀菌4％、曲霉1.5％、无色菌2.7％、变形杆菌3.8％、尼青霉2.1％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足；所述复合微生物菌剂B包括如下质量百分比的成分：木糖氧化无色杆菌10％、恶臭假单胞菌15％、兼性厌氧砷氧化副球菌15％、气单胞菌15％、甲酸甲烷杆菌5％、类黄氢噬胞菌1％、尖孢镰刀菌5％、曲霉4.5％、无色菌6％、变形杆菌2.5％、尼青霉1％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足；所述复合微生物菌剂A或复合微生物菌剂B的制备方法为：将菌种进行振荡培养，菌株接种到液体培养基中，28℃振荡培养至对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中离心，收集菌体，并用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD600≈1.0，将菌体按照上述复合微生物菌配比方式进行混合，得到复合微生物菌剂A和复合微生物菌剂B。
优选地，所述纳米材料的制备方法为：在容量为250ml的三角瓶中加入浓度为0.7mol/L的FeCl3·6H20溶液8mL、0.2g淀粉及0.1g氯化镁，搅拌使之混合均匀；然后称取适量NaBH4溶于8mL的去离子水中，最终形成终浓度为0.78g/L的水溶液；常温常压搅拌，以2mL/min的速度将NaBH4水溶液缓慢滴加到盛有FeCl3溶液的三角瓶中，溶液逐渐变为黑色，滴加完毕后保持反应60min，直至生成稳定黑色纳米铁颗粒。用去离子水洗涤黑色纳米铁颗粒三次，乙醇洗脱一次，抽滤后经真空干燥得到零价铁纳米颗粒；以醋酸钯乙醇溶液和氯化镍乙醇溶液作为分散剂对N-Fe0进行表面改性修饰，浓度均为5％，用量分别为0.1mL和0.2mL，进而制备出表面改性后的纳米零价铁。
进一步地，所述生物制剂的制备方法为：将纳米零价铁与复合微生物菌剂A均匀混合或将纳米零价铁与复合微生物菌剂B均匀混合。
为实现上述目的，本发明还提供一种生物制剂用于富集土壤中的砷元素的用途，所述生物制剂包括复合微生物菌剂和纳米材料。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种复合微生物菌剂与纳米材料共同制备的生物制剂及其用途，通过所选纳米材料与复合微生物菌剂的相互配合，组成稳定的修复系统，利用复合微生物菌剂对砷元素的转化及纳米材料对砷元素的吸附作用，实现对土壤砷污染的有效修复。
附图说明
图1是降解效果测试图，横坐标为日期，纵坐标为砷浓度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：微生物的选取
木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans可以将砷污染环境中的无机三价砷氧化为五价砷，且具有甲基化功能，极大地降低了环境中高毒性三价砷的毒性并增强了砷污染物的可吸附性及可去除性，菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC No.8512。
兼性厌氧砷氧化副球菌Paracoccus arsenicoxydans介导与硝酸盐还原耦合的三价砷氧化的酶促反应，具有砷氧化功能和硝酸盐还原活性的，菌种购买于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNo.M2014456。
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，革兰阴性杆菌，有些菌株为卵圆形，单端丛毛菌，运动活泼，专性需氧，最适生长温度25℃～30℃，42℃不生长，4℃生长不定，菌落与铜绿假单胞菌相似，但只产生荧光素(青脓素)，不产生绿脓素，其陈旧培养物有腥臭味，可产生次级代谢产物用于调节菌落结构，稳定微生物菌群结构稳定，菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，购买号CGMCC.5693。
气单胞菌Aeromonas革兰氏阴性、具有圆端的直杆菌到细胞接近球状，直径0.3-1.0μm。单个，成对或短链。菌落较小为淡黄色、边缘规则，表面光滑，兼性厌氧，化能异养。最适生长温度为30℃。氧化酶阳性，接触酶阳性，可降解纤维素类物质(羧甲基纤维素钠)为单糖，在刚果红培养基上形成透明圈，可产生次级代谢产物，促进其他细菌或真菌生长，菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，购买号CGMCC.1273。
甲酸甲烷杆菌Methanobacterium formicicum，甲烷杆菌是一种在厌氧条件下以甲烷为特异代谢产物的细菌，其代谢产物为甲烷和二氧化碳。有独特的16SrRNA寡聚核苷酸序列谱，细胞壁中没有其他细菌细胞壁中所共有的胞壁酸和D型氨基酸。产甲烷细菌是沼气发酵中最终的甲烷产生者，为沼气发酵的关键菌之一。中国普通微生物菌种保藏管理中心可以提供，购买号CGMCC.3784。
类黄氢噬胞菌Hydrogenophagaflava产生非水溶性黄色素，好氧，兼性嗜氢自养菌，以氧为末端电子受体的氧化型的糖代谢，具有厌氧硝酸盐呼吸，具反硝化作用。能在含有机酸、氨基酸或蛋白胨的培养基上良好生长，但很少利用碳水化合物，中国普通微生物菌种保藏管理中心可以提供，购买号CGMCC.5847。
除上述细菌外，还添加稳定菌群结构的如下真菌或细菌：尖孢镰刀菌、曲霉、无色菌、变形杆菌、尼青霉(市售菌株)。
实施例2：复合微生物菌剂的制备
用下列方法恢复培养冷冻干燥的菌种：
a.安瓿管开封：用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管；用火焰将安瓿管顶端加热；向安瓿管顶端滴加无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂；用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。
b.菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状；取约0.2ml菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜面培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内(3-4ml)，然后在建议的温度下培养。
c.注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在5-10℃的环境下；厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。
以不同质量百分比组合上述菌种以检测菌种组配效果，所述微生物复合菌剂中各菌种的接种量以百分比计为：
组合1：木糖氧化无色杆菌15％、恶臭假单胞菌5％、兼性厌氧砷氧化副球菌7.2％、气单胞菌6.8％、甲酸甲烷杆菌3％、类黄氢噬胞菌2％、尖孢镰刀菌4％、曲霉1.5％、无色菌2.7％、变形杆菌3.8％、尼青霉2.1％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足。
组合2：木糖氧化无色杆菌10％、恶臭假单胞菌15％、兼性厌氧砷氧化副球菌15％、气单胞菌15％、甲酸甲烷杆菌5％、类黄氢噬胞菌1％、尖孢镰刀菌5％、曲霉4.5％、无色菌6％、变形杆菌2.5％、尼青霉1％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足。
将菌种进行振荡培养，菌株接种到液体培养基中，28℃振荡培养对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中离心，收集菌体，并用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD600≈1.0，将菌体按照复合微生物菌配比方式进行混合，得到复合微生物菌剂A和复合微生物菌剂B。
实施例3：纳米材料的制备
砷和铁存在着强亲和力，铁能强吸附砷或与砷生成难溶沉淀。因此，铁盐(铁基化合物)最常被用于砷污染土壤的治理。铁固定土壤中砷的机理主要有以下3种：
1)含铁材料加入土壤后，生成铁氧化物或氢氧化物，吸附土壤中的砷，随之其表面的OH-、OH2等基团被砷取代，生成非晶态的砷酸铁沉淀或难溶的次级氧化态矿物。
2)土壤中的砷元素直接与游离铁离子反应生成难溶性铁砷化合物。
3)含铁材料的加入影响了土壤pH，从而影响砷的形态和土壤胶体的表面电荷，有利于砷的稳定化。
所述纳米材料的制备方法为：在容量为250ml的三角瓶中加入浓度为0.7mol/L的FeCl3·6H20溶液8mL、0.2g淀粉及0.1g氯化镁，搅拌使之混合均匀；然后称取适量NaBH4溶于8mL的去离子水中，最终形成终浓度为0.78g/L的水溶液；常温常压搅拌，以2mL/min的速度将NaBH4水溶液缓慢滴加到盛有FeCl3溶液的三角瓶中，溶液逐渐变为黑色，滴加完毕后保持反应60min，直至生成稳定黑色纳米铁颗粒。用去离子水洗涤黑色纳米铁颗粒三次，乙醇洗脱一次，抽滤后经真空干燥得到零价铁纳米颗粒；以醋酸钯乙醇溶液和氯化镍乙醇溶液作为分散剂对N-Fe0进行表面改性修饰，浓度均为5％，用量分别为0.1mL和0.2mL，进而制备出表面改性后的纳米零价铁。
将纳米零价铁分别与复合微生物菌剂A和复合微生物菌剂B混合获得复合微生物菌剂A-纳米零价铁混合物与复合微生物菌剂B-纳米零价铁混合物。
实施例4：生物制剂的吸附、富集效果检测
取花盆14个，每个花盆放置有高浓度砷污染土壤2000g，分别编号为Q1-Q14，检测初始砷浓度并记录，具体检测方法为：取10g土壤制作成土壤消解液，量取50mL的土壤消解液，加入浓硝酸调节样品pH值，建立适宜萃取反应发生的样品环境，将加酸后的混合溶液摇匀后静止待用；其次萃取土壤消解液中的砷元素；最后使用全反射X射线荧光光谱仪测试消解液中砷元素的含量。
向Q1-Q5号盆加入复合微生物菌剂A-纳米零价铁混合物10g，向Q6-Q10号盆加入复合微生物菌剂B-纳米零价铁混合物10g，Q11加入纳米零价铁粒子10g，Q12加入复合微生物菌剂A干粉10g，Q13加入复合微生物菌剂B干粉10g，Q14作为CK。上述花盆静置120天，于第30天检测、第60天检测、第90天检测、第120天检测土壤中的砷浓度并记录。检测结果如表1及图1所示，检测结果表明，复合微生物菌剂A-纳米零价铁可以有效吸附或富集土壤中的砷元素，复合微生物菌剂B-纳米零价铁对砷元素的吸附或富集效果劣于复合微生物菌剂A-纳米零价铁，但对砷元素也有一定的富集吸附作用，纳米零价铁粒子对砷元素有一定吸附作用但不显著，单纯加入复合微生物菌剂B干粉的试验组砷浓度有一定降低但降解富集效果不如复合微生物菌剂B-纳米零价铁，单纯加入复合微生物菌剂A干粉的试验组次之。
表1降解效果测试结果
从试验结果可见，本发明提供的生物制剂对砷污染有较强的富集和吸附效果，能够有效处理砷污染土壤，并且效果优于单一成分土壤修复剂。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (6)
1.一种净化砷污染土壤的生物制剂，其特征在于，包括复合微生物菌剂和纳米材料。
2.根据权利要求1所述净化砷污染土壤的生物制剂，其特征在于，所述纳米材料为纳米零价铁，所述复合微生物菌剂包括但不限于木糖氧化无色杆菌、恶臭假单胞菌、兼性厌氧砷氧化副球菌、气单胞菌、甲酸甲烷杆菌、类黄氢噬胞菌、尖孢镰刀菌、曲霉、无色菌、变形杆菌、尼青霉。
3.根据权利要求1或2任一所述净化砷污染土壤的生物制剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂为复合微生物菌剂A或复合微生物菌剂B，所述复合微生物菌剂A包括如下质量百分比的菌种：木糖氧化无色杆菌15％、恶臭假单胞菌5％、兼性厌氧砷氧化副球菌7.2％、气单胞菌6.8％、甲酸甲烷杆菌3％、类黄氢噬胞菌2％、尖孢镰刀菌4％、曲霉1.5％、无色菌2.7％、变形杆菌3.8％、尼青霉2.1％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足；所述复合微生物菌剂B包括如下质量百分比的成分：木糖氧化无色杆菌10％、恶臭假单胞菌15％、兼性厌氧砷氧化副球菌15％、气单胞菌15％、甲酸甲烷杆菌5％、类黄氢噬胞菌1％、尖孢镰刀菌5％、曲霉4.5％、无色菌6％、变形杆菌2.5％、尼青霉1％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足；所述复合微生物菌剂A或复合微生物菌剂B的制备方法为：将菌种进行振荡培养，菌株接种到液体培养基中，28℃振荡培养至对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中离心，收集菌体，并用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD600≈1.0，将菌体按照上述菌种配比方式进行混合，得到复合微生物菌剂A和复合微生物菌剂B。
4.根据权利要求3所述净化砷污染土壤的生物制剂，其特征在于，所述纳米材料的制备方法为：在容量为250ml的三角瓶中加入浓度为0.7mol/L的FeCl3·6H20溶液8mL、0.2g淀粉及0.1g氯化镁，搅拌使之混合均匀；然后称取适量NaBH4溶于8mL的去离子水中，最终形成终浓度为0.78g/L的水溶液；常温常压搅拌，以2mL/min的速度将NaBH4水溶液缓慢滴加到盛有FeCl3溶液的三角瓶中，溶液逐渐变为黑色，滴加完毕后保持反应60min，直至生成稳定黑色纳米铁颗粒。用去离子水洗涤黑色纳米铁颗粒三次，乙醇洗脱一次，抽滤后经真空干燥得到零价铁纳米颗粒；以醋酸钯乙醇溶液和氯化镍乙醇溶液作为分散剂对N-Fe0进行表面改性修饰，浓度均为5％，用量分别为0.1mL和0.2mL，进而制备出表面改性后的纳米零价铁。
5.根据权利要求1-4任一所述净化砷污染土壤的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的制备方法为：将纳米零价铁与复合微生物菌剂A均匀混合或将纳米零价铁与复合微生物菌剂B均匀混合。
6.一种生物制剂用于富集土壤中的砷元素的用途，其特征在于，所述生物制剂包括复合微生物菌剂和纳米材料。
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