CN107971336A - 一种土壤铅污染原位生物修复方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤铅污染原位生物修复方法，属于土壤修复技术领域。该修复方法，包括：(1)将土壤和硫酸盐还原菌菌液按照固液比为100g:(2‑10)ml的比例混合，在25‑37℃下厌氧培养2‑10d；(2)按照固液比为100g:(1‑10)ml的比例将脱氮硫杆菌菌液泼洒至经过步骤(1)处理后的土壤表层，培养1‑15d。本发明利用不同细菌对硫价态调控进而实现污染土壤的全面治理工作不仅效率高而且无需额外装置、成本低、无二次污染。

Description

一种土壤铅污染原位生物修复方法

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种土壤铅污染原位生物修复方法。

背景技术

随着全球经济和社会的快速发展，环境污染问题已经成为世界性问题。土壤污染作为环境污染问题之一变得日益严重。与此同时，我国土壤污染的问题也逐渐凸显出来。被称为“土十条”的《土壤污染防治行动计划》在2016年5月28日出台，这充分体现了国家对土壤污染问题的重视程度越来越高。重金属污染是土壤污染的重要类型之一，重金属污染不仅能够引起土壤的成分、结构和功能发生变化，还能抑制作物根系生长和光合作用，致使作物产量降低甚至绝产。更为重要的是重金属还可通过食物链的富集作用，迁移到动物、人体内，严重危害动物以及人体健康，给人类的生产、生活和甚至生存带来重大威胁。土壤中重金属污染重要特点之一是很难在短时间内得到修复。

目前针对重金属污染的治理技术主要包括物理修复、化学修复、植物修复和微生物修复等。利用微生物修复土壤重金属污染作为一种新型修复技术，因具有处理成本低、效率高以及无二次污染等优点，受到研究人员的广泛研究。研究人员公开了多种利用微生物技术去除重金属离子的专利方法，但是各有弊端，例如，某些生物菌(如芽孢杆菌)只能进行好氧方面的处理，对于深层土壤中的重金属污染则没有修复作用；或者，仅仅是在密闭的容器中隔离除氧，以保证厌氧生物菌对重金属的固定，而没有进行真正的原位修复，并且修复土壤面积过大，给容器制造增加了成本；又或者，利用生物菌固定后的重金属因为人为扰动土壤而暴露于土壤表层，被氧化后的重金属离子再次释放至土壤中，失去修复效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种土壤铅污染原位生物修复方法，以解决现有修复方法修复效果不佳的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种土壤铅污染原位生物修复方法，包括：

(1)将土壤和硫酸盐还原菌菌液按照固液比为100g:(2-10)ml的比例混合，在25-37℃下厌氧培养2-10d；

(2)按照固液比为100g:(1-10)ml的比例将脱氮硫杆菌菌液泼洒至经过步骤(1)处理后的土壤表层，培养1-15d。

重金属离子铅进入土壤后，在土壤中长期积累而不易去除主要与土壤的复杂结构以及成分不同有关。

研究发现硫酸盐还原菌在厌氧条件下，利用SO₄ ^2-把高价态的S⁶⁺转化形成S^2-，利用转化过程产生的能量从而实现自身的生长。而S^2-与许多的重金属离子均是以沉淀的形式稳定存在于自然界的矿山以及土壤中。Pb²⁺可以与S^2-形成稳定的PbS沉淀，根据研究结果可知PbS在土壤中稳定存在，不易迁移。由于硫酸盐还原菌只能在厌氧条件下进行。因此对于表层的兼性以及好氧的条件下，硫酸盐还原菌则不能进行生长。

脱氮硫杆菌是一种典型的化能自养菌。它的生长pH条件为中性土壤，这与硫酸盐还原菌的生长pH基本一致。脱氮硫杆菌可以在兼性条件下生存。在好氧的条件下，利用O作为能量来源，把低价态的S^2-、S以及S₂O₃ ^2-氧化形成SO₄ ^2-，实现自身的生长。因此，在土壤表层的好氧以及中层的兼性条件下，脱氮硫杆菌产生的SO₄ ^2-可以与土壤中存在的Pb²⁺形成PbSO₄沉淀。PbSO₄作为一种矿化产物可以稳定的固定在土壤中。实验结果显示脱氮硫杆菌矿化土壤中的铅可以使铅稳定的固定在土壤中，减少了Pb从土壤中的流出，实现了土壤的治理。

本发明中利用硫的调控把不同土壤层的铅离子分别用不同硫细菌进行去除，之后再进行更进一步的去除。具体方法是首先利用硫酸盐还原菌在厌氧环境下对铅的高效矿化作用，可将深层土壤中的重金属进行矿化固定，矿化沉积铅离子为硫化铅，之后利用脱氮硫杆菌在好氧环境下对铅的高效矿化作用，可将浅层土壤中的重金属进行矿化固定，矿化沉积铅离子形成硫酸铅。

采用本发明的修补方法即使在农田(旱田)等耕地进行农耕等操作也同样适用，如耕地过程中受到人为扰动导致不同的土壤层发生改变，即使如此翻耕数次，不同土壤层的PbS不会被氧化，可以稳定的存在，而另外一种PbSO₄则在硫酸盐还原菌的作用下逐步稳定的由PbSO₄形成更稳定的PbS。对从而把不同土壤层的Pb均稳定地固定在土壤中，实现了对不同土壤层中的Pb的稳定固定，显著降低生物有效性。这种利用不同细菌对硫价态调控进而实现污染土壤的全面治理工作不仅效率高而且无需额外装置、成本低、无二次污染。这些独有的优势可以让本发明为应对土壤铅污染的处理提供新的有力参考。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述修复方法还包括：(3)对土壤进行耕作。

经耕作的人为扰动以后，硫酸盐还原菌对重新混合后的铅沉淀物硫酸铅进行再次矿化固定形成更稳定的硫化铅，从而实现对铅污染土壤的的全方位高效固定，极大的减少了铅离子在土壤中的迁移转化。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述硫酸盐还原菌菌液的制备方法包括：利用硫酸盐还原菌选择培养基从土壤中分离出硫酸盐还原菌并在25-37℃、厌氧条件下进行扩大培养，制得所述硫酸盐还原菌菌液；其中，所述硫酸盐还原菌选择培养基的制备方法为：分别称取下列重量份组分：0.2-1.0份K₂HPO₄、0.5-1.5份Na₂SO₄、1.5-2.5份CaCl₂·2H₂O、1.5-2.5份MgSO₄·7H₂O、1.5-2.5份C₃H₅O₃Na、0.5-1.5份酵母膏和0.5-1.5份C₁₂H₇NO₄，然后定容于超纯水中，调节pH至6.5-7.0，121℃高温灭菌20min，称取0.05-0.15份抗坏血酸溶于其中，制得硫酸盐还原菌选择培养基。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，分离硫酸盐还原菌的土壤来源于铅污染的深层土壤。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述脱氮硫杆菌菌液的制备方法包括：利用脱氮硫杆菌选择培养基从土壤中分离出脱氮硫杆菌并在25-37℃、好氧条件下进行扩大培养，制得所述脱氮硫杆菌菌液；其中，所述脱氮硫杆菌选择培养基的制备方法为：分别称取下列重量份组分：4.0-6.0份Na₂S₂O₃·5H₂O，1.0-3.0份KNO₃，0.5-2.0份KH₂PO₄，0.2-1.0份NaHCO₃和0.2-0.3份MgCl₂·6H₂O，然后定容于超纯水中，调节pH值6.5-7.5，121℃高温灭菌20min，制得脱氮硫杆菌选择培养基。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，分离脱氮硫杆菌的土壤来源于铅污染的表层土壤。

本发明具有以下有益效果：

本发明采用的硫酸盐还原菌-脱氮硫杆菌联合治理的方法可以稳定地固定土壤中不同深度的Pb污染，尤其适用于存在人为扰动的中性农耕土壤。

本发明使用的硫酸盐还原菌分离自铅污染的深层土壤，脱氮硫杆菌分离自表层土壤，经过分离、驯化，两种菌对铅离子均有较强耐受性，耐受浓度高达1000mg/L。

本发明采用土壤表层兼性菌脱氮硫杆菌处理重金属铅污染是对微生物治理浅层土壤重金属污染的新拓展。

本发明利用不同硫细菌生长过程中硫价态的转化进而与铅离子发生不同的矿化作用，最终实现不同土壤层的铅离子均能得到显著、稳定的固定，是一种高效治理土壤铅污染的新方法，且利用硫价态的双向调控治理土壤铅污染是对传统单一菌落以及多菌联合修复的一种新的补充。

本发明可实以现大面积、大宗量铅离子污染土壤的快速治理，无需额外装置，真正实现原位修复。

本发明充分利用自然界中的微生物，不仅种类丰富，易于实际应用，无二次污染、成本低廉。

本发明无污染、成本低、高效易行，为重金属铅离子污染的土壤治理提供了新思路，有广阔的应用前景。

附图说明

图1是硫酸盐还原菌的生长曲线；

图2是硫酸盐还原菌/脱氮硫杆菌分别对土壤中不同形态Pb的转化效果；

图3是采用本实验方法对不同编号土壤中Pb的最终转化去除效果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1、硫酸盐还原菌菌液的制备：

硫酸盐还原菌取自西南科技大学污水处理厂污泥池及附近土地。将厌氧污泥按2％的接种量接于装有液体富集培养基的150mL三角瓶中至几乎充满状态，然后加入少量的液体石蜡，密封30℃进行厌氧培养。待培养基变成墨汁色且瓶口处散发着臭鸡蛋味时，表明富集液中已有大量SRB繁殖，之后采用稀释涂布-叠皿夹层法进行厌氧分离培养。培养4-5d后，平皿上长出黑色球状小菌落即为硫酸盐还原菌，挑取单个菌落接入液体培养基进行厌氧培养。如此重复进行稀释涂布、夹层厌氧培养、挑选、液体厌氧培养等多次，可获得纯化的硫酸盐还原菌菌株。

硫酸盐还原菌的培养基配方为：0.5g K₂HPO₄、1.0g Na₂SO₄、2.0gCaCl₂·2H₂O、2.0gMgSO₄·7H₂O、2.0g C₃H₅O₃Na、1.0g酵母膏、1.0gC1₂H₇NO₄、0.1g抗坏血酸，超纯水1000mL，pH值7.0-7.5。

2、脱氮硫杆菌菌液的制备：

脱氮硫杆菌取自西南科技大学污水处理厂污泥池，将稀释后的土样采用平板夹层培养法进行分离。培养2-3d长出单菌落后，挑取单菌落，利用Hungate厌氧培养技术进行液体厌氧培养3～5d，再将菌液稀释用平板夹层培养法进行菌株纯化，如此反复操作5次后，得到纯化后的脱氮硫杆菌。

脱氮硫杆菌的培养基配方为：5.0g Na₂S₂O₃·5H₂O，2.0KNO₃g，1.0gKH₂PO₄，0.5gNaHCO₃，0.25g MgCl₂·6H₂O定容于1000mL超纯水中，pH值6.5-7.5。

3、土壤铅污染原位生物修复方法：

配置铅离子浓度为300mg/kg含铅土壤作为模拟，硫酸盐还原菌和脱氮硫杆菌的培养按照上述方法配置。

将污染土壤、硫酸盐还原菌菌液按照固液质量体积比为100g：5mL进行配比添加，并通过搅拌的方式进行充分混合。之后在32℃条件下厌氧培养，使硫酸盐还原菌与被污染土壤充分作用5d，之后将污染土壤、脱氮硫杆菌菌液按照固液质量体积比为100g：4mL进行配比添加，使脱氮硫杆菌均匀的喷洒在土壤表层，并充分与被污染土壤作用7d，最终硫酸原盐还原菌、脱氮硫杆菌对铅离子的转化率分别为90％和93％。

实施例2

本实施例的硫酸盐还原菌、脱氮硫杆菌的菌液的培养方法同实施例1，区别在于，培养基的配方不同，具体如下：

硫酸盐还原菌的培养基配方为：0.2g K₂HPO₄、0.5g Na₂SO₄、1.5gCaCl₂·2H₂O、1.5gMgSO₄·7H₂O、1.5g C₃H₅O₃Na、0.5g酵母膏、0.5g C1₂H₇NO₄、0.05g抗坏血酸，超纯水1000mL，pH值7.2-7.5。

脱氮硫杆菌的培养基配方为：4.0g Na₂S₂O₃·5H₂O，1.0g KNO₃，0.5gKH₂PO₄，0.2gNaHCO₃，0.2g MgCl₂·6H₂O定容于1000mL超纯水中，pH值6.5-7.2。

本实施例的土壤铅污染原位生物修复方法：

配置铅离子浓度为600mg/kg含铅土壤作为模拟，硫酸盐还原菌和脱氮硫杆菌的培养按照上述方法配置。

将污染土壤、硫酸盐还原菌菌液按照固液质量体积比为100g：8mL进行配比添加，并通过搅拌的方式进行充分混合。之后在30℃条件下厌氧培养，使硫酸盐还原菌与被污染土壤充分作用6d，之后将污染土壤、脱氮硫杆菌菌液按照固液质量体积比为100g：8mL进行配比添加，使脱氮硫杆菌均匀的喷洒在土壤表层，并充分与被污染土壤作用7d，最终硫酸原盐还原菌、脱氮硫杆菌对铅离子的转化率分别为91％和95％。

实施例3

本实施例的硫酸盐还原菌、脱氮硫杆菌的菌液的培养方法同实施例1，区别在于，培养基的配方不同，具体如下：

硫酸盐还原菌的培养基配方为：1.0g K₂HPO₄、1.5g Na₂SO₄、2.5gCaCl₂·2H₂O、2.5gMgSO₄·7H₂O、2.5g C₃H₅O₃Na、0.5g酵母膏、1.5g C1₂H₇NO₄、0.15g抗坏血酸，超纯水1000mL，pH值7.3-7.5。

脱氮硫杆菌的培养基配方为：6.0g Na₂S₂O₃·5H₂O，3.0g KNO₃，2.0gKH₂PO₄，1.0gNaHCO₃，0.3g MgCl₂·6H₂O定容于1000mL超纯水中，pH值7.4-7.5。本实施例的土壤铅污染原位生物修复方法：

配置铅离子浓度为1000mg/kg含铅土壤作为模拟，硫酸盐还原菌和脱氮硫杆菌的培养按照上述方法配置。

将污染土壤、硫酸盐还原菌菌液按照固液质量体积比为100g：10mL进行配比添加，并通过搅拌的方式进行充分混合。之后在35℃条件下厌氧培养，使硫酸盐还原菌与被污染土壤充分作用7d，之后将污染土壤、脱氮硫杆菌菌液按照固液质量体积比为100g：10mL进行配比添加，使脱氮硫杆菌均匀的喷洒在土壤表层，并充分与被污染土壤作用10d，最终硫酸原盐还原菌、脱氮硫杆菌对铅离子的转化率分别为95％和95％。

实施例4

硫酸盐还原菌、脱氮硫杆菌的菌液获取同实施例1。

本实施例的土壤铅污染原位生物修复方法：

配置铅离子浓度为1000mg/kg含铅土壤作为模拟，硫酸盐还原菌和脱氮硫杆菌的培养按照上述方法配置。

将污染土壤、硫酸盐还原菌菌液按照固液质量体积比为100g：6mL进行配比添加，并通过搅拌的方式进行充分混合。之后在35℃条件下厌氧培养，使硫酸盐还原菌与被污染土壤充分作用10d，之后将污染土壤、脱氮硫杆菌菌液按照固液质量体积比为100g：10mL进行配比添加，使脱氮硫杆菌均匀的喷洒在土壤表层，并充分与被污染土壤作用10d，最终硫酸原盐还原菌、脱氮硫杆菌对铅离子的转化率分别为94％和92％。

实施例5

硫酸盐还原菌、脱氮硫杆菌的菌液获取同实施例1。

本实施例的土壤铅污染原位生物修复方法：

配置铅离子浓度为2000mg/kg含铅土壤作为模拟，硫酸盐还原菌和脱氮硫杆菌的培养按照上述方法配置。

将污染土壤、硫酸盐还原菌菌液按照固液质量体积比为100g：10mL进行配比添加，并通过搅拌的方式进行充分混合。之后在35℃条件下厌氧培养，使硫酸盐还原菌与被污染土壤充分作用10d，之后将污染土壤、脱氮硫杆菌菌液按照固液质量体积比为100g：10mL进行配比添加，使脱氮硫杆菌均匀的喷洒在土壤表层，并充分与被污染土壤作用10d，最终硫酸原盐还原菌、脱氮硫杆菌对铅离子的转化率分别为96％和97％。

图1是硫酸盐还原菌的生长曲线，从图中可以看出，当培育时间超过30h后，硫酸盐还原菌的生长速度变缓，当超过90h后，生长数量开始呈下降趋势，因此，在培育硫酸盐还原菌时，优选在30-90h之间，约1-5d。

图2为上述实施例的联合硫酸盐还原菌/脱氮硫杆菌的修复方法分别对土壤中不同形态Pb的转化效果，从图中可以看出，本发明实施例的修复方法对不同形态Pb，其转化效果至少达到90％，个别实施例超过95％，体现出良好的修复效果。

图3为上述实施例对Pb的最终转化效果，均超过95％，具有明显的修复效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种土壤铅污染原位生物修复方法，其特征在于，包括：

(1)将土壤和硫酸盐还原菌菌液按照固液比为100g:(2-10)ml的比例混合，在25-37℃下厌氧培养2-10d；

(2)按照固液比为100g:(1-10)ml的比例将脱氮硫杆菌菌液泼洒至经过步骤(1)处理后的土壤表层，培养1-15d。

2.根据权利要求1所述的土壤铅污染原位生物修复方法，其特征在于，所述修复方法还包括：(3)对土壤进行耕作。

3.根据权利要求1或2所述的土壤铅污染原位生物修复方法，其特征在于，所述硫酸盐还原菌菌液的制备方法包括：

利用硫酸盐还原菌选择培养基从土壤中分离出硫酸盐还原菌并在25-37℃、厌氧条件下进行扩大培养，制得所述硫酸盐还原菌菌液；其中，所述硫酸盐还原菌选择培养基的制备方法为：

分别称取下列重量份组分：0.2-1.0份K₂HPO₄、0.5-1.5份Na₂SO₄、1.5-2.5份CaCl₂·2H₂O、1.5-2.5份MgSO₄·7H₂O、1.5-2.5份C₃H₅O₃Na、0.5-1.5份酵母膏和0.5-1.5份C₁₂H₇NO₄，然后定容于超纯水中，调节pH至6.5-7.0，121℃高温灭菌20min，称取0.05-0.15份抗坏血酸溶于其中，制得所所述硫酸盐还原菌选择培养基。

4.根据权利要求3所述的土壤铅污染原位生物修复方法，其特征在于，分离硫酸盐还原菌的土壤来源于铅污染的深层土壤。

5.根据权利要求1或2所述的土壤铅污染原位生物修复方法，其特征在于，所述脱氮硫杆菌菌液的制备方法包括：

利用脱氮硫杆菌选择培养基从土壤中分离出脱氮硫杆菌并在25-37℃、好氧条件下进行扩大培养，制得所述脱氮硫杆菌菌液；其中，所述脱氮硫杆菌选择培养基的制备方法为：

分别称取下列重量份组分：4.0-6.0份Na₂S₂O₃·5H₂O，1.0-3.0份KNO₃，0.5-2.0份KH₂PO₄，0.2-1.0份NaHCO₃和0.2-0.3份MgCl₂·6H₂O，然后定容于超纯水中，调节pH值6.5-7.5，121℃高温灭菌20 min，制得所述脱氮硫杆菌选择培养基。

6.根据权利要求5所述的土壤铅污染原位生物修复方法，其特征在于，分离脱氮硫杆菌的土壤来源于铅污染的表层土壤。