CN107815428A - 一株镉去除根瘤菌kg2、含有所述根瘤菌的菌剂及其用途 - Google Patents

一株镉去除根瘤菌kg2、含有所述根瘤菌的菌剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株镉(Cd)去除根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2、含有所述根瘤菌的菌剂及其在固定或去除土壤或水体中Cd2+的应用。本发明证实根瘤菌KG2具有高效Cd固定能力和较强的固氮功能，其能够促进豆科作物长、增加豆科作物抗逆性、减少植株对土壤Cd的富集吸收量。本发明的根瘤菌KG2以菌剂或菌肥的形式应用于农田镉污染土壤的生物修复中，减少农耕土壤中的农作物对镉的富集吸收，促进重金属污染土壤中农作物得生长，以提高农作物的产量与品质。

Description

一株镉去除根瘤菌KG2、含有所述根瘤菌的菌剂及其用途
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种根瘤菌，还涉及所述根瘤菌的用途。
【背景技术】
随着矿产资源的大量开发利用，工业生产的迅猛发展和各种化学产品、农药及化肥的广泛使用，含重金属的污染物通过各种途径进入环境，造成土壤，尤其是农田土壤重金属污染日益严重。我国每年因重金属污染导致的粮食减产超过1×107t，被重金属污染的粮食多达1.2×107t，合计经济损失致死为200亿元。重金属污染在土壤中移动性很小，不易随水淋滤，不为微生物降解，通过食物链进入人体后，潜在危害极大。
重金属镉以其移动性大、毒性高、污染面积最大被称为“五毒之首”而成为最为关注的元素，镉污染农耕土壤被认为对人类健康最大的威胁。据报道我国有五分之一的农耕土壤被镉污染，污染面积达1.36×105公顷。因此，寻找合适的且有效的修复镉污染土壤的方法十分必要。
目前对重金属镉的污染农耕土壤的修复方法包括化学修复，物理修复及生物修复，其中，生物修复因为环境友好型及无二次污染的优点而成为重金属镉污染修复的主要方法，包括植物修复和微生物修复。其中，微生物修复的最终目的是通过在作物根际周围接种重金属吸附或者固定的微生物来减少作物对重金属的吸收(钱春香,王明明,许燕波.土壤重金属污染现状及微生物修复技术研究进展[J].东南大学学报(自然科学版),2013,43:670-674)。
研究表明，微生物去除镉的机制主要是吸附和固定，有活性或者死的细菌都可以去除重金属。因此可以利用镉去除细菌固氮农田土壤中最低水平的镉离子。但是，重金属镉对微生物会产生一定的毒害作用，所以菌株对镉耐受性和吸附性的测试是十分必要的。因此，对镉具有较强耐受性和较高吸附性的菌株是去除农田镉的主要微生物来源。
相关的报道研究发现植物根际促生菌(PGPR)可以提高植物对重金属的富集，有些PGPR菌株可以和植物建立一定的共生关系，比如根瘤菌可以与豆科植物建立共生关系。因此，筛选出具有对镉具有较强耐受性和较高吸附性的PGPR可以应用到豆科植物类的农耕土壤的污染修复。
中国发明专利申请CN 102936574A公开了一株根瘤菌W33，及其在尾矿区植物修复中的应用，和在重金属污染土壤的植物修复中的应用。根据其说明书的记载，根瘤菌W33能够提高植物中重金属Cu含量，特别是接种在重金属铜污染环境中的印度芥菜，能够提高蜘蛛地上部和根对Cu的富集量；或者接种在重金属铜污染环境中的进苜蓿，能够提高苜蓿的株高、根重和地上部干重。然而，该菌株对于豆科作物不能取得相应效果。
《镉胁迫下豆科植物接种AM真菌和根瘤菌的生长及生理指标变化》(刁亚南等人，贵州农业科学，201442(12)，74-78)公开在镉胁迫环境下，根内球囊霉和根瘤菌为CCBAUA.25072双接种绿豆在镉胁迫环境下的影响，实验表明单接种根瘤菌时根瘤数及根瘤鲜重均显著低于CK1(空白对照)，即单接种根瘤菌并不能显著改善绿豆植株的根瘤数及根瘤鲜重受镉胁迫的不利影响(见表2)，而双接种根内球囊霉和根瘤菌的效果则优于单接种。
综上所述，现有技术尚未发现能够良好改善镉胁迫环境中豆科作物品质、能够应用到农田镉污染土壤的微生物修复及固定技术的根瘤菌。
【发明内容】
本发明的目的是提供一株对重金属镉具有高效去除作用且具有较强固氮功能的根瘤菌菌株，并通过其对大豆镉的去除效率的评估，确认其可以增加大豆植株的生物量和降低大豆对重金属的吸收，从而确认可以将其应用到农田镉污染土壤中，达到微生物修复农耕镉污染重金属污染土壤的效果。
为了实现上述目的，本发明从种植在攀枝花新九乡尾矿库边缘的大豆根瘤中分离到一株菌株KG2，经过对其进行测序分析(16S rRNA，nifH和持家基因atpD-recA-glnII)确定其为根瘤菌属(Rhizobiumpusense)，该菌株已于2017年8月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.14489。
本发明还提供一种根瘤菌KG2菌剂制备方法，该方法的步骤如下：
(1)制备无菌的YEM培养基
制备无菌的YEM固体平板和TY液体培养基：取胰蛋白胨1.5g、甘露醇1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.2g和NaCl 0.1g，用水定容到1.0L；再使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至7.2，分装后按质量体积比18.0g/L所述溶液加琼脂粉，灭菌后获得无菌的YEM培养基，降温后获得无菌的YEM固体培养基平板；取胰蛋白胨5.0g、酵母粉3.0g和CaCl2·2H2O 0.7g，用水定容至1.0L，再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至7.2，灭菌后获得无菌的TY液体培养基；
(2)菌株活化
通过平板划线法将低温保存的根瘤菌KG2接种到无菌的固体YEM培养皿中，28-30℃培养箱中培养2-3天以活化低温保存的根瘤菌KG2，并获得KG2单菌落；
(3)根瘤菌培养
用灭菌接种环从步骤(2)的平板上挑取单菌落，接种到灭菌的TY液体培养基中，在28-30℃摇床培养箱中以150rpm的转速培养1-2天，得到所述的根瘤菌KG2菌剂。
进一步地，本发明通过根瘤菌KG2对大豆镉的去除效率的评估，发现其可以增加大豆植株的生物量和降低大豆对重金属的吸收，从而可以将其应用到镉污染农田土壤中，实现微生物修复农耕镉污染重金属污染土壤技术。据此，本发明还提供根瘤菌(Rhizobiumpusense)KG2在固定土壤或水体(特别地工业污水水体)中重金属离子的应用、以及在降低土壤或水体(特别地工业污水水体)中重金属、特别是重金属Cd2+浓度的用途，以及根瘤菌(Rhizobiumpusense)KG2在豆科作物中的应用，特别是根瘤菌(Rhizobiumpusense)KG2在重金属污染土壤中降低豆科作物中重金属、特别是重金属Cd2+含量的用途。
在本发明中，豆科作物应当理解为大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、赤豆、豇豆、菜豆、木豆、扁豆或落花生。
进一步地，本发明的根瘤菌(Rhizobiumpusense)KG2还可应用于制备菌肥。
本发明涉及的根瘤菌(Rhizobiumpusense)KG2于2017年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.14489，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
【附图说明】
图1为根瘤菌KG2(Rhizobiumpusense)对水中50mg/L和100mg/L重金属Cd2+去除效率评估，其中，图1a为不同时间的去除效率；图1b为不同接种量的去除效率；图中线条上方的a、b、c等字符是显著性差异(P<0.05)；
图2为不同Cd浓度下的大豆生长指标与重金属含量变化，其中，图2a为在不同Cd浓度下大豆植株生长指标；图2b为不同Cd浓度下大豆地上部分和地下部分的重金属Cd含量的变化。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”均为重量百分比，用于说比例的“：”均为重量比，“份”均为重量份。
本发明涉及以下培养基：
YEM固体培养基：胰蛋白胨1.5g，甘露醇1.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.1g，琼脂粉18.0g，用H2O定容至1.0L，pH值为7.2，按质量体积比18.0g/L加琼脂粉，灭菌并降温。
TY液体培养基：胰蛋白胨5.0g、酵母粉3.0g、CaCl2·2H2O 0.7g，用H2O定容至1.0L，pH值为7.2。
实施例1菌株的筛选与鉴定
从攀枝花新九乡龙蟒尾矿坝边缘的种植的大豆根瘤中分离获得镉去除根瘤菌KG2(Rhizobiumpusense)。
分离采用平板划线法，对表面灭菌大豆根瘤组织液在YEM固体培养基上进行平板划线，通过菌落形态特征和镜检菌细胞形态特征观察，获得纯化的根瘤菌KG2。按照GUTC方法进行DNA的提取，通过16S rRNA，三种持家基因(atpD-recA-glnII)和固氮基因nifH基因和nodA基因测序与系统进化树分析将其确定为Rhizobiumpusense。其中，用于检测根瘤菌KG2的16SrRNA、atpD、recA、glnII、nifH和nodA基因序列在GeneBank数据库的序列编号分别为：MF141000，MF141003，MF141005，MF141004，MF141001和MF141002。
实施例2含有根瘤菌KG2的菌剂的制备
(1)制备无菌的YEM固体和TY液体培养基：将胰蛋白胨1.5g，甘露醇1.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，并用水定容到1.0L；再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至7.2，分装后加琼脂粉(18.0g/L)，121-125℃高压蒸汽灭菌30min，获得无菌的YEM培养基，待温度降至50℃左右倒制无菌的YEM固体培养基平板；将胰蛋白胨5.0g、酵母粉3.0g、CaCl2·2H2O0.7g，用水定容至1.0L，再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至7.2，121-125℃高压蒸汽灭菌30min，获得无菌的TY液体培养基。
(2)菌种活化与菌剂制备：将甘油管或斜面低温保存的KG2菌种在YEM固体培养基平板上进行划线活化，并确定菌种的纯度；用接种环从平板上挑取活化的KG2菌落接种到小容积的无菌TY液体培养基中，28-30℃摇床中摇培12-18小时，获得新鲜的菌种(细胞浓度约108cells/mL)，再以1：100的接种量接种到大容积的无菌TY培养液当中，28-30℃摇床中摇培1-3天，以获得大量含有根瘤菌KG2的液态菌剂。
实施例3根瘤菌KG2的耐受性分析
对根瘤菌KG2进行重金属耐受性分析。
取实施例1获得的根瘤菌KG2，将108菌细胞数接种到含重金属Cd2+浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，150和200mg/L TY液体培养基中。在150r/min、28℃下培养48h，然后在600nm测定各培养基中的菌落OD值，结果显示重金属Cd2+浓度为120mg/L的TY液体培养基中的根瘤菌KG2的OD600值为0，即重金属Cd2+对根瘤菌KG2的最小致死浓度(MLC)为120mg/L。
实施例4根瘤菌KG2对培养基中的重金属的去除率
取实施例1的根瘤菌KG2。
将2、4、8、12、16、20、24×1010个根瘤菌KG2细胞数分别接种到4mL含重金属Cd2+浓度分别为50mg/L和100mg/L的水溶液中，每隔2h测定一次水溶液中的重金属Cd2+浓度，计算根瘤菌KG2对重金属Cd2+去除效率，其计算公式如下：(Ct-Cr)/Ct×100％，其中，Ct：溶液中Cd2+的初始浓度；Cr：不同处理后溶液中Cd2+剩余浓度。
表1不同菌细胞数的根瘤菌KG2对Cd2+的去除效率(％)(去除时间：6h)
如表1、图1所示，根瘤菌KG2对水溶液Cd2+的去除效率受到去除时间和细胞数量的影响。为了分析根瘤菌KG2对水溶液重Cd2+的最佳去除时间，将接菌量为2×1010细胞到50mg/L和100mg/L的Cd2+水溶液中，在前6小时Cd2+去除率急剧增加，6小时后去除率分别为66.30％和25.31％(图1)，且随着时间的推移Cd2+去除效率只是缓慢增加，这说明根瘤菌KG2对水溶液中Cd2+的最佳去除时间是6小时。不同细胞数量的根瘤菌KG2对50mg/L和100mg/L的Cd2+水溶液中Cd2+的去除效率不同，当根瘤菌KG2的细胞数低于4×1010时Cd2+的去除效率呈急剧上升的趋势，当细胞数量大于4×1010时Cd2+的去除效率不再急剧增加，这说明根瘤菌KG2对50mg/L和100mg/L Cd2+的去除效率最佳细胞数量是4×101(表1、图1)。在相同时间、相同细胞数量的根瘤菌KG2对50mg/LCd2+水溶液中Cd2+的去除效率始终高于100mg/L的Cd2+水溶液中Cd2+的去除效率，这说明相对低浓度的Cd2+水溶液中Cd2+更容易被根瘤菌KG2去除。6小时后，2.4×1010个根瘤菌KG2细胞对50mg/L和100mg/L的Cd2+水溶液中Cd2+的去除效率分别可达85.7％和76.21％，表明根瘤菌KG2对于水体中的Cd2+具有良好的去除率。
实施例5根瘤菌KG2减少镉污染农田土壤中农作物Cd的吸收量。
为了准确地验证根瘤菌KG2对重金属Cd污染农田土壤中Cd2+的固定作用，本试验用Leonardjars装置模拟含有50mg/kg和100mg/kg Cd2+的土壤。
称取干燥蛭石1kg装满Leonardjars装置的上部倒置的开口玻璃瓶中，计算出50mg/kg和100mg/kg Cd2+的土壤所需Cd2+的量分别为50mg和100mg；通过测试将玻璃瓶中的蛭石用水侵湿到饱和状态但不会溢出所需水的体积约为1升，然后将分别称取50mg和100mgCd2+溶于1升水中形成含有Cd2+的水溶液，然后将水溶液浇到装有1kg蛭石的花盆中，并充分拌匀，以获得50mg/kg和100mg/kg Cd2+的土壤。Leonardjars装置的下部塑料瓶中装无氮营养液(0.5g L-1KCl,0.2gL-1,KH2PO4,0.2g L-1MgSO4·7H2O,0.2g L-1CaSO4·2H2O,2g L- 1CaCO3,1mg L-1H3BO3,1mg L-1ZnSO4·7H2O,0.5mg L-1,0.1mg L-1Na2MoO4·2H2O)，并通过在中央放置棉线来帮助上部土壤吸收下部的水分与营养，然后将上下部旋紧，在上部玻璃瓶口加盖玻璃纸封口膜后，放置在121-125℃高压蒸汽锅中灭菌30分钟。
将大豆种子放置在95％的乙醇3分钟、1‰的升汞5分钟，以进行表面灭菌，再用无菌水进行多次润洗去除残留的乙醇和升汞。然后将表面灭菌的种子播种于灭菌的Leonardjars装置上部玻璃瓶的蛭石中，封好封口膜，放置在温室中，待其发芽出土2-3cm后，将实施例2得到的根瘤菌KG2菌剂用无菌水稀释10倍得到菌剂稀释液，按照20mL/植株接种到大豆根际，然后在蛭石表面铺上约1cm厚度的无菌石英砂，以隔绝杂菌污染。试验的每个处理重复三次，并以施用相同体积的无菌水作为对照CKN-。
将装置放在温室(模拟条件：白天，25℃，16h；夜晚，17℃，8h)培养35天后，收获大豆植株，测定大豆植株的株高、根长、生物量(干重)、根瘤数、氮含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及重金属Cd含量。
为了评估大豆植株的抗逆性，采集大豆新鲜叶片冷冻研磨后用氮蓝四唑反应法(Moon-ai W,Niyomploy P,Boonsombat R,Sangvanich P,Karnchanatat A.A superoxidedismutase purified from the rhizome of Curcuma aeruginosa Roxb.as inhibitorofnitric oxide production in the macrophage-like RAW264.7cell line.ApplBiochem Biotech,2012,166(8):2138–2155)测定大豆植株抗逆酶SOD活性。将大豆植株分地上部分和地下部分杀青烘干至恒重，再用粉粹机将烘干的地上部分和地下部分粉粹后测定植株氮含量和Cd含量。大豆植株的氮含量主要采用凯氏定氮法进行测定，再用H2SO4-H2O2进行消煮，再用凯氏定氮仪(Kjeltec 8400,FOSS,Sweden)测定大豆植株的氮含量。为分析大豆植株地上部分和地下部分的重金属Cd含量，将粉碎的大豆植株地上部分和地下部分用HNO3/HClO4(体积比4:1)分别消煮后，用ICP-AES(IRIS Intrepid II,Thermo ElectronCorporation,USA)测定消煮液中的重金属Cd含量，然后再计算出大豆植株地上部分和地下部分中的Cd含量。大豆植株对土壤Cd的富集系数为大豆地下部分Cd浓度与土壤Cd浓度的百分比。大豆植株对Cd的转移系数为大豆地上部分Cd浓度与大豆植株地下部分Cd浓度的百分比。
表2不同浓度Cd土壤中大豆的生长指标、SOD酶活与Cd富集能力(时间：35天)
KG2是接菌处理，CKN-是对照处理；表格中的字母是在P<0.05水平下方差分析。
根据表2可以看出，接种根瘤菌KG2能与大豆根系共生结瘤，说明菌株KG2能与大豆建立起共生固氮关系。在不含Cd2+土壤中大豆植株的结瘤数明显高于含Cd2+土壤中的植株，说明土壤Cd2+能够抑制大豆植株于根瘤菌KG2建立共生关系，且不同的处理表现出不同的共生效应与生物量(表2)。在不含Cd2+的盆栽土壤中，接种KG2大豆的氮含量明显比不接菌的处理植株增加64.0％，表明在不含Cd2+的土壤中，根瘤菌KG2能够有效提高大豆植株的氮营养。在Cd2+含量为50mg/L和100mg/L接种KG2大豆的氮含量分别明显增加34.3％和20.7％比对照处理，表明在Cd2+胁迫下根瘤菌KG2也能够有效提高大豆植株的氮含量。同时，在三种土壤中根瘤菌KG2能显著增加大豆的株高、根长(图2a)，这说明了根瘤菌KG2有很好的促生作用，能促进大豆生长，提高大豆植株的氮营养与生物量。
随着土壤中Cd2+含量的增加，大豆的结瘤数、氮含量、生物量、SOD酶活都逐渐降低(表1)，且大豆的长势也会受到Cd抑制，这说明土壤中的Cd2+会影响大豆植株生长与共生效应。在Cd2+土壤中的抗逆酶活显著低于不含Cd2+土壤中的抗逆酶活，且Cd2+浓度越高SOD酶活性越低，说明土壤Cd2+对抗逆酶SOD活性有抑制作用(表2)。但在不含Cd2+土壤和含镉土壤中，根瘤菌KG2能够显著提高大豆植株的抗逆酶SOD的活性(表2)，说明根瘤菌KG2可显著提高大豆植株的抗逆性。
根瘤菌KG2还能显示降低大豆地上部分和地下部分的镉含量(图2)。接种根瘤菌KG2不仅可以使在重金属Cd2+含量为0，50和100mg/kg土壤中的大豆植株生物量分别增加了25.9％，34.8％和54.2％，还能使种植在含Cd土壤中的大豆镉含量显著降低；在50mg/kg的Cd2+土壤中的大豆根富集了131.8mg/kg的Cd，但根瘤菌KG2使大豆植株根部Cd含量降低了45.9％；而在100mg/kg的Cd2+土壤中的大豆根富集了340.0mg/kg的Cd，而根瘤菌KG2使大豆植株根部Cd含量降低了35.3％。从地上部分重金属Cd含量来看，约10％的Cd从大豆根部转移到地上部分(图2)，且根瘤菌KG2也能显著降低大豆地上部分的Cd含量。
综上所述，本发明的根瘤菌KG2具有较强的对重金属镉的吸附和固定能力，能有效固定水体或土壤中的Cd2+，实现水体或土壤中的Cd2+的去除；应用到作物中，根瘤菌KG2能够显著减少大豆植株对污染土壤中Cd的富集吸收量，增强植株在镉胁迫环境下的抗逆性，表现为提高植株的氮含量、促生植株生长和提高植株的生物量和SOD酶活，实现了单接种根瘤菌KG2就能显著提高结瘤数、减少镉胁迫对作物的不利影响，明显优于现有技术。由此可见，可将根瘤菌KG2应用到镉污染农耕土壤的作物的修复中，为利用微生物修复重金属污染、特别是镉污染农田土壤提供技术支持，以提高重金属污染农田中农作物的产量与品质。

Claims (9)

1.一株根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2，该菌株已于2017年8月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.14489。
2.根瘤菌KG2菌剂制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：
(1)制备无菌的YEM固体平板和TY液体培养基：取胰蛋白胨1.5g、甘露醇1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.2g和NaCl 0.1g，用水定容到1.0L；再使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至7.2，分装后按质量体积比18.0g/L所述溶液加琼脂粉，灭菌后获得无菌的YEM培养基，降温后获得无菌的YEM固体培养基平板；取胰蛋白胨5.0g、酵母粉3.0g和CaCl2·2H2O0.7g，用水定容至1.0L，再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至7.2，灭菌后获得无菌的TY液体培养基；
(2)菌株活化：通过平板划线法将低温保存的根瘤菌KG2接种到无菌的YEM固体培养平板上，28-30℃培养箱中培养2-3天以活化低温保存的根瘤菌KG2，并获得KG2单菌落；
(3)根瘤菌培养：用灭菌接种环从步骤(2)的平板上挑取单菌落，接种到灭菌的TY液体培养基中，在28-30℃摇床培养箱中以150rpm的转速培养1-2天，得到所述的根瘤菌KG2菌剂。
3.根据权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2在固定土壤或水体中重金属离子或降低土壤或水体中重金属离子浓度的用途。
4.根据权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2在豆科作物中的应用。
5.根据权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2在重金属污染土壤中降低豆科作物中重金属含量的用途。
6.根据权利要求3或5所述的用途，其特征在于所述重金属是Cd2+。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述豆科作物是大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、赤豆、豇豆、菜豆、木豆、扁豆或落花生。
8.根据权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2促进大豆作物生长的用途。
9.根据权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2在制备菌肥中的应用。
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