CN109554308A - 一种Rhizobium pusense F3-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种Rhizobium pusense F3‑1及其应用，可有效解决在酸性、碱性环境、氮源缺乏以及重金属污染条件下，对多环芳烃降解的微生物修复问题；技术方案是，一种Rhizobium pusense F3‑1，分类命名为Rhizobium pusense，2018年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16332，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；根瘤菌F3‑1，在酸性、碱性环境、氮源缺乏以及重金属污染条件下，对多环芳烃降解中的应用。

Description

一种Rhizobium pusense F3-1及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是一种Rhizobium pusense F3-1及其应用。

背景技术

多环芳烃（PAHs）是一种广泛存在的有机化合物。很多PAHs会在生物体内积累，通过细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性对生物体产生致癌、致畸、致突变作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁。美国环保局在20世纪80年代已将16种不带分支的PAHs列入优先污染物名单中，我国也把PAHs列入环境污染物的黑名单中。重金属（heavy metals, HMs）作为典型的无机污染物，不能被降解，只能被转化，二者均易被土壤颗粒吸附，并能长期存在于土壤与水环境中，不断累积，具有很强的生态毒性，两者通过食物链转移与富集，最终威胁人类的健康。

重金属和多环芳烃是环境中的两类典型污染物，多数情况下会产生联合作用，形成复合污染。由于重金属和多环芳烃污染物之间相互作用的存在，两者之间的物理化学性质相差比较大，且复合存在时由于阳离子-π作用、竞争吸附和氧化还原等复杂的相互作用，使得彼此的行为特性发生变化，增加了其复合污染研究和修复的难度。生物修复作为重金属和多环芳烃单一污染的重要修复手段，在二者复合污染的修复中也同样因其成本低、无二次污染等优势被人们所重视。然而两者复合污染位点经常伴随着酸性pH值或营养条件缺乏的限制，极端pH值或营养物质通过影响修复位点的生理生化性质和生态系统，进而影响微生物对复合污染物的修复和降解。经查新，这方面相关的研究未有报道，因此筛选出在这些极端环境存在的条件下能够很好的降解多环芳烃的菌株尤为重要。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种Rhizobium pusense F3-1及其应用，可有效解决在酸性、碱性环境、氮源缺乏以及重金属污染条件下，对多环芳烃降解的微生物修复问题。

本发明解决的技术方案是，一种Rhizobium pusense（根瘤菌）F3-1，分类命名为Rhizobium pusense，2018年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16332，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

根瘤菌F3-1，在酸性、碱性环境、氮源缺乏以及重金属污染条件下，对多环芳烃降解中的应用，其中所述的酸性、碱性环境pH5.0-7.4，重金属为Cr⁶⁺和Cu²⁺，所述的多环芳烃为菲和芘。

根瘤菌F3-1在各种不良环境条件和重金属双重作用下降解多环芳烃，在重金属（Cr⁶⁺和Cu²⁺浓度分别为20 - 40mg L^-1）、pH5.0-7.4和氮源缺乏条件下，菲和芘的初始浓度均为50mg/L，经过5天降解后液相色谱检测，菲的降解率为20-50%，芘的降解率为50-70%。

本发明根瘤菌F3-1能够在酸性、碱性环境、氮源缺乏以及重金属污染等逆境条件下高效降解菲和芘等类多环芳烃，其中所述的酸性、碱性环境pH5.0-7.4，重金属为Cr⁶⁺和Cu²⁺，所述的多环芳烃为菲和芘，有效解决目前在各种不良环境条件且同时有重金属双重污染作用下对多环芳烃降解的微生物修复；本发明所述根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性杆状细菌，既可与豆科植物共生，也可以在土壤中以腐生菌的状态长期生存，或作为内生菌寄存于非豆科植物体内，根瘤菌可以在作物根部大量生长繁殖，减小病原微生物的繁殖机会；同时根瘤菌还可诱导植物产生系统抗性，减轻作物发病的几率，提高其抗病性，经济和社会效益显著。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1 菌株的筛选及鉴定

1、初筛

采取河南省南阳市油田污染土壤，土壤样品过2 mm筛子，准确称取10.00 g，加入50 mLM9液体培养基中，放入摇床25℃、180 rpm培养24 h，取5 mL上层培养液转接于45 mL M9液体培养基中，该培养基中含有浓度为250 mg L^-1菲和芘，当看见微生物增长明显时，再次取5mL培养液转接到含有菲和芘新鲜的M9培养基中，经过几次的转接培养后梯度稀释，取0.1mL梯度稀释的培养液涂布M9固体培养基上，固体培养基含有100 mg L^-1菲和芘，放置37℃培养箱培养。待长出菌落后挑取培养基上的细菌平板划线得出细菌单菌落。通过多次的富集培养和分离纯化，从污染土壤中共筛选出14株细菌，这些细菌能够在以菲和芘为唯一碳源时进行生长。

所述的M9液体培养基(1L)：Na₂HPO₄ 6 g，KH₂PO₄ 3 g，NaCl 0.5 g，NH₄Cl 1 g，在加入2.5mL营养液，pH 7.2-7.4。营养液组成(L)：MgCl₂ 10.75 g，CaCO₃ 2.0g，FeSO₄ 4.5 g，ZnSO₄ 1.44 g，MnSO₄ 1.12 g，CuSO₄ 0.25 g，CoSO₄ 0.24 g，H₃BO₄ 0.06 g，HCL 51.3 mL。固体培养基加入1.5%琼脂粉。菲和芘用正己烷配置成母液，用0.22 µm有机滤膜过滤灭菌后加入灭好菌的M9培养基中作为唯一碳源。

2、复筛

金属离子分析：考察金属离子Cr⁶⁺和Cu²⁺对菌株生长的影响，分别用去离子水配置10 gL^-1Cr⁶⁺和1g L^-1Cu²⁺母液。挑取上述筛选出的14株单菌落接种于OMM固体培养基中，在培养基中加入0.5%葡萄糖作为唯一碳源，加入金属离子Cr⁶⁺和Cu²⁺，使其终浓度均为为40 mg L^-1，放置培养箱培养1-3 d，观察菌株的生长情况。

pH分析：考察酸性环境对菌株生长的影响，用过滤灭菌的HCl将M9固体培养基的pH调至5.0。挑取上述筛选出的14株单菌落接种于M9固体培养基中，培养基的pH分别为7.4和5.0，在培养基中加入0.5%葡萄糖作为唯一碳源，观察菌株的生长情况。

营养缺乏分析：用Ca₃(PO₄)₂代替M9固体培养基中的NH₄Cl，pH7.4，其他成分不变，培养基中加入0.5%葡萄糖作为唯一碳源。

经上述复筛最终得到即耐金属离子Cr⁶⁺和Cu²⁺又能在pH5.0-7.4和缺乏氮源的条件下生长的菌株1株，将其命名为F3-1。

OMM 固体培养基(1 L): KH₂PO₄ 0.1 g， HNa₂PO₄ 0.1 g， NH₄NO₃ 0.5 g，NH₄SO₄0.5 g ， MgSO₄ 0.2 g，CaCl₂ 0.02 g， FeCl₂ 0.002 g ，MnSO₄ 0.002 g，琼脂15-20 g，pH6.5。

3、菌株鉴定

通过菌落形态和分子生物学16s DNA对菌株F3-1进行鉴定；

挑取单菌落接种于LB培养基中，37°C、180rpm培养24 h，用菌液直接进行PCR扩增。用于PCR扩增反应的引物序列：前引物 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），后引物 1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

PCR扩增程序：95℃预变性10 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72 ℃延伸1min，35个循环。PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测后送华大基因公司进行测序分析。将测序结果在Genbank中用Blast进行同源性比较。

通过将菌株F3-1的16S rRNA序列与Genbank中已知序列比对分析所分离的菌株为根瘤菌属。

实施例2 菌株F3-1的耐金属试验

考察不同浓度Cr⁶⁺和Cu²⁺对菌株生长的影响，分别用去离子水配置10 g L^-1Cr⁶⁺和1g L^-1Cu²⁺母液。挑取F3-1单菌落接种于OMM培养基中，在培养基中加入0.5%葡萄糖作为唯一碳源，放置摇床培养16-20 h，然后吸取1mL转接入灭菌的装有6mL OMM培养基的试管中，该培养基含有0.5%葡萄糖和不同浓度的Cr⁶⁺或Cu²⁺，每个处理三个重复，之后放置摇床25℃、180rpm培养，在不同时间段取样，用96孔板在OD 600检测菌株的生长情况。

本试验所选的金属离子Cr⁶⁺浓度为0、1、3、5、7、10、20、50、100 mg L^-1，结果表明菌株在0-50 mg L^-1均可以生长，当Cr⁶⁺浓度为100 mg L^-1时，菌株几乎没有生长。Cu²⁺离子浓度分别设置为0、2、4、6、8、10、20、40 mg L^-1，结果表明菌株在0-40 mg L^-1均可以生长。

实施例3 菌株R. pusense F3-1在各种不良环境和重金属条件下对多环芳烃的降解

1、菌株R. pusense F3-1在各种不良环境和重金属条件下对菲的降解

菌液的制备：从M9固体培养基中挑取菌株F3-1，接种于LB液体培养基中，180 rpm，37℃，摇床培养16-24 h，之后离心弃上清，加入含有0.5%葡萄糖的M9液体培养基使菌株的OD600为1.0备用。该M9液体培养基中用Ca₃(PO₄)₂代替M9液体培养基中的NH₄Cl，同时加入金属离子Cr⁶⁺和Cu²⁺使其终浓度分别为20 - 40 mg L^-1,^，pH5.0-7.4。

用正己烷配备菲标品浓度为150 mg L^-1，在棕色玻璃瓶中加入1 mL菲标品溶液，待正己烷完全挥发后，取OD_600nm=1.0的3 mL细胞菌液加入棕色玻璃瓶中，对照样为在吸附菲的玻璃瓶中加入3 mL相同浓度的热杀菌，置于25℃，180 rmp的恒温摇床中进行降解实验。每批样品3组平行样。降解率％=(对照样浓度-降解样浓度)/对照样浓度×100%。

液相样品预处理方法：萃取相用色谱级的正己烷，每样品中加入3 mL正己烷萃取，旋涡震荡10 min，摇床震荡20 min，静置待样品分层稳定后，取上层有机相加入一定量无水硫酸钠分析。

HPLC分析：本发明采用安捷伦 LC-1200 型高效液相色谱仪测定PAHs含量。样品注入量为20 µL，分离柱为 ZORBAX SB-C18 column ( 0.46×150mm，安捷伦) ，柱温 30℃，紫外检测波长254 nm，流动相为乙腈和水( 体积比为 80%∶20% ) ，流速 1. 0 mL min^-1。

结果表明，经过5天后液相检测，菲的降解率为20-50%。

2、菌株R. pusense F3-1在各种不良环境和重金属条件下对芘的降解

菌液的制备：从M9固体培养基中挑取菌株F3-1，接种于LB液体培养基中，180 rpm，37℃，摇床培养16-24 h，之后离心弃上清，加入含有0.5%葡萄糖的M9液体培养基使菌株的OD600为1.0备用。该M9液体培养基中用Ca₃(PO₄)₂代替M9液体培养基中的NH₄Cl，同时加入金属离子Cr⁶⁺和Cu²⁺使其终浓度分别为20 - 40 mg L^-1,^，pH 5.0-7.4。

用正己烷配备芘标品浓度为150 mg L^-1，在棕色玻璃瓶中加入1 mL芘标品溶液，待正己烷完全挥发后，取OD_600nm=1.0的3 mL细胞菌液加入棕色玻璃瓶中，对照样为在吸附芘的玻璃瓶中加入3 mL相同浓度的热杀菌，置于25℃，180 rmp的恒温摇床中进行降解实验。每批样品3组平行样。降解率％=(对照样浓度-降解样浓度)/对照样浓度×100%。

液相样品预处理方法：萃取相用色谱级的正己烷，每样品中加入3 mL正己烷萃取，旋涡震荡10 min，摇床震荡20 min，静置待样品分层稳定后，取上层有机相加入一定量无水硫酸钠分析。

HPLC分析：本研究采用安捷伦 LC-1200 型高效液相色谱仪测定PAHs含量。样品注入量为20 µL，分离柱为 ZORBAX SB-C18 column ( 0.46×150mm，安捷伦) ，柱温 30℃，紫外检测波长254 nm，流动相为乙腈和水( 体积比为 80%∶20% ) ，流速 1. 0 mL min^-1。

结果表明，经过5天后液相检测，芘的降解率为50-70% 。

本发明经多次反复实验，均取得了与上述实验相同或相近似的效果，表明本发明微生物能在重金属Cr⁶⁺和Cu²⁺存在以及酸碱和氮源缺乏条件下能够有效去除多环芳烃菲和芘。预示着该菌株在不良环境条件下对多环芳烃复合污染体系的生物修复方面具有潜在的应用价值。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：首先，本发明提供的菌株根瘤菌R. pusense F3-1在酸性、碱性环境和氮源缺乏条件下能够高效降解重金属和多环芳烃复合污染中的菲和芘等类多环芳烃，其中重金属为Cr⁶⁺和Cu²⁺，其浓度分别为20 - 40 mg L^-1，菲和芘的初始浓度为50 mg L^-1；在pH5.0-7.4和氮源缺乏条件下，多环芳烃菲和芘的降解率高达50-70%；其次，本发明提供的菌株为根瘤菌，与其他细菌相比，根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性杆状细菌，既可与豆科植物共生，也可以在土壤中以腐生菌的状态长期生存，或作为内生菌寄存于非豆科植物体内，根瘤菌可以在作物根部大量生长繁殖，减小病原微生物的繁殖机会；同时根瘤菌还可诱导植物产生系统抗性，减轻作物发病的几率，提高其抗病性，经济和社会价值显著。

序列表

<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120> 一种根瘤菌Rhizobium pusense F3-1及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1168

<212> DNA

<213> 根瘤菌(Rhizobium pusense )

<400> 1

agccccccga ctacgtggtt agctgcctcc ttgcggttag cgcactacct tcgggtaaaa 60

ccaactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagca 120

tgctgatctg cgattactag cgattccaac ttcatgcact cgagttgcag agtgcaatcc 180

gaactgagat ggcttttgga gattagctcg acatcgctgt ctcgctgccc actgtcacca 240

ccattgtagc acgtgtgtag cccagcccgt aagggccatg aggacttgac gtcatcccca 300

ccttcctctc ggcttatcac cggcagtccc cttagagtgc ccaactaaat gctggcaact 360

aagggcgagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 420

acagccatgc agcacctgtt ctggggccag cctaactgaa ggacatcgtc tccaatgccc 480

ataccccgaa tgtcaagagc tggtaaggtt ctgcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc 540

tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc 600

ccaggcggaa tgtttaatgc gttagctgcg ccaccgaaca gtatactgcc cgacggctaa 660

cattcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt 720

cgcacctcag cgtcagtaat ggaccagtaa gccgccttcg ccactggtgt tcctccgaat 780

atctacgaat ttcacctcta cactcggaat tccacttacc tcttccatac tcaagatacc 840

cagtatcaaa ggcagttccg cagttgagct gcgggatttc acccctgact taaatatccg 900

cctacgtgcg ctttacgccc agtaattccg aacaacgcta gcccccttcg tattaccgcg 960

gctgctggca cgaagttagc cggggcttct tctccgacta ccgtcattat cttcatcggt 1020

gaaagagctt tacaacccta aggccttcat cactcacgcg catgctggat cagcttgcgc 1080

catgtcatat cccactgctg cctcccgtag agtttgggcg tgttctcagt cccatgtgct 1140

gatcatcctc ctcaaacagc tattggat 1168

Claims (2)

1.一种Rhizobium pusense F3-1，分类命名为Rhizobium pusense，2018年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16332，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述的Rhizobium pusense F3-1，在酸性、碱性环境、氮源缺乏以及重金属污染条件下，对多环芳烃降解中的应用，其中所述的酸性、碱性环境pH5.0-7.4，重金属为Cr⁶⁺和Cu²⁺，所述的多环芳烃为菲和芘。