CN116948882A - 一种马德普拉塔无色杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis）HH‑15，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.27406，本发明菌株作为处理剂可用于去除水体和土壤中的重金属镉，实验结果显示菌株吸附镉过程以细胞内的生物累积为主，本发明为处理水体和土壤中重金属镉污染提供了一条经济环保、可持续处理的途径，且本发明方法简单易操作，适用于工业化生产和市场推广应用。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis）HH-15及其应用。
背景技术
近年来，镉污染已成为重要的环境问题。重金属镉（Cd）可以在环境中活跃地运移，它不是植物体和人体生长所需的必要元素，但是可通过土壤-作物-食品链-人体这个路径，从环境中运移并蓄积至各类生物体，对各类生物体有较大的毒害作用。例如，当镉在植物组织中含量达到1.0 mg/kg时，会阻碍植物根系生长、抑制水分和养分的吸收等，引起一系列生理代谢紊乱，如阻碍蛋白质、糖和叶绿素的合成，降低光合强度和改变酶活性等，使植物表现出叶色减褪、植物矮化、物候期延迟等症状，最终导致作物品质下降和减产，甚至死亡。而人类通过摄入受镉污染的食物过多会对包括肺和肝脏在内的重要器官造成严重损害，还会导致癌症和其他致命的健康疾病。1986年日本发生的世界十大公害病之一的“痛痛病”，其主要原因就是当地居民摄食了受污染地区种植的水稻，体内蓄积镉，从而影响了维生素D的代谢，扰乱体内钙的平衡，导致骨骼内矿物质含量的减少，从而引发骨质疏松症和骨软化症。
目前国内外采取物理修复、化学修复和生物修复等方法来处理重金属污染。其中，物理修复需要耗费大量资金、人力物力，且移除的污染土壤又容易引起二次污染，而化学修复则是容易再度活化重金属。生物修复包括有植物、动物和微生物修复，其中微生物修复属原位修复，可改善土壤环境，改良土壤，且成本低，成为近些年研究的热点。
无色杆菌属普遍存在于土壤、水体等环境中，一些菌株被研究证明可降解、转化环境中的一些污染物，如CN 103031261 A提供了一株新型高效降解酰胺类除草剂乙草胺的无色杆菌属D-12；CN109810923 B提供了一株用于污水脱氮的好氧反硝化菌SLY2-21（Achromobacter marplatensis）；CN 115851530 A提供了一株可以有效降解阿特拉津、缓解土壤中阿特拉津对大豆药害的马德普拉塔无色小杆菌AD111。同时研究证明，无色杆菌属的一些菌株能降解土壤中难溶性有机磷和无机磷，如CN 111763637 A提供了一种有机无机磷降解复合菌剂，其中无色杆菌属的相对丰度为10.43%。更进一步的，研究证明无色杆菌属的一些菌株能净化环境中重金属污染，如CN 105062926 A公开了一种用于重金属镉污染治理的无色杆菌属H380（Achromobacter sp. H380）；CN 115404179 A提供了一种含有无色杆菌属（Achromobacter insuavis）SL8和肠杆菌（Enterobacter cancerogenus）SL12的、具有高效去除镉的复合菌剂；CN 101063097 A公开了一株对无机三价砷有氧化作用的木糖氧化无色杆菌SY8，可用于净化环境砷污染。
目前未见与本发明相关的报道。
发明内容
本发明提供一种马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis）HH-15，其于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 27406，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明另一目的是将上述马德普拉塔无色杆菌HH-15应用于处理重金属镉污染。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1、本发明从云南省昆明市石林县采集得到野生可食大型真菌灰褐牛肝菌（Boletus griseus），采用常规培养手段，从其根际土壤中分离、纯化、标记、保藏，获得灰褐牛肝菌的根际细菌；将收集的根际细菌菌株接种于含镉离子0-600mg/L的LB固体培养基上，筛选得到在含镉离子400mg/L LB固体培养基上仍能生长的菌株，其标记为HH-15，即镉抗性菌株；
2、菌株HH-15在无镉LB固体培养基上的菌落为较规则的圆形且有凸起，表面光滑，菌落直径2.0-3.5mm，菌落颜色呈半透明的乳黄色；在光学显微镜下观察菌体为短杆状，可活动，长度为0.5-1.0μm，宽度0.2-0.5μm，革兰氏染色为阴性；经扫描电镜观察，菌体为长杆状，菌体表面具有凸起褶皱。
将分离纯化后的菌株送测序公司进行菌种鉴定，通过细菌16S rDNA进行扩增测序，其中扩增引物为：27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT），获得的序列与NCBI上序列进行BLAST比对发现，菌株HH-15与Achromobacter marplatensis（MN733002）的16S rDNA序列相似度为100%，因此确定该菌株为马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis）；
3、将保藏的菌株HH-15接种到NB固体培养基上30℃下活化2天，将活化后的菌种接种到NB液体培养基中30℃下培养36h，得到菌种悬液；
4、将上述HH-15菌种悬液投加到含重金属镉的水体或土壤中，HH-15在生长过程中能吸收或固化镉离子，实现水体或土壤重金属镉污染的原位修复。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明从灰褐牛肝菌根际土壤中分离得到一株对重金属镉有较强抗性的菌株，经BLAST对比同源性，鉴定为马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis）。本发明镉抗性马德普拉塔无色杆菌HH-15可作为经济、高效、环境友好型的活体原位净化材料，用于处理水体或土壤中污染的重金属镉。进一步的，本发明明确了马德普拉塔无色杆菌HH-15作为吸附剂对重金属镉的吸附行为及机理，为未来重金属镉的污染修复提供更多的理论依据；
（2）本发明通过测定EDTA提取剂提取吸附在HH-15细胞表面的镉含量，以及经提取、离心、干燥后细菌颗粒的镉含量，说明马德普拉塔无色杆菌HH-15吸附镉过程以细胞内的生物累积为主导，可能具有镉净化更稳定、更高效的效益；
（3）本发明明确了马德普拉塔无色杆菌HH-15在含1000mg/kg镉污染土壤中仍可生长，且对土壤中的游离态镉和有效态镉具有较强固化能力，其显著降低了土壤中植物可利用态镉含量，即DTPA提取态镉含量；
本发明马德普拉塔无色杆菌HH-15具有可直接使用，成本低廉的特点，适用于污染环境中镉离子的去除，有较好的工业应用前景。
附图说明
图1是马德普拉塔无色杆菌HH-15在含不同浓度镉培养基上的生长情况；
图2是马德普拉塔无色杆菌HH-15的形态特征图，其中A图为菌株在LB固体培养基上的形态；B图为菌株在显微镜下的形态；C-D图为菌株在扫描电镜下的形态；
图3是不同pH水体环境中马德普拉塔无色杆菌HH-15对镉离子清除率结果示意图；
图4是不同处理时间下马德普拉塔无色杆菌HH-15对镉离子清除率结果示意图；
图5是不同初始镉离子浓度下马德普拉塔无色杆菌HH-15对镉离子清除率结果示意图；
图6是马德普拉塔无色杆菌HH-15在不同镉浓度水体环境中吸收镉的胞外吸附与胞内累积的分布情况；
图7 是马德普拉塔无色杆菌HH-15对含1000mg/kg镉污染土壤中游离态镉的固化作用示意图；
图8 是马德普拉塔无色杆菌HH-15对含1000mg/kg镉污染土壤中DTPA提取态镉的固化效果示意图；
图9 是马德普拉塔无色杆菌HH-15在300mg/L Cd2+浓度下的扫描电镜图；
上述图中不同的大写（A-C）和小写（a-c）字母表示同组数据间有显著性差异（p<0.05），其中A和a为最小值。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
实施例1：马德普拉塔无色杆菌HH-15的分离、筛选与鉴定
A、从云南省昆明市石林县用抖土法采集得到灰褐牛肝菌（Boletus griseus）根际土壤并于干冰盒保存带回实验室；
B、于超净工作台中按每1g土壤样品加入9mL无菌水的比例放入事先已灭菌并装有玻璃珠的250mL具塞三角瓶中，然后置于37℃恒温摇床上以180r/min的转速震荡30min，取制好的土壤悬浮液1mL逐级稀释至10-6倍，分别取10-4、10-5、10-6浓度的土壤悬浮液均匀地涂于不同的分离培养基平板上，每个浓度梯度重复3皿，置恒温培养箱中于30℃下恒温下培养2~3天，从平板上挑取不同培养性状的单菌落，在LB平板上划线纯化，获得细菌纯培养物。给纯化后菌株编号（HH-xx）后接种于比克曼磁珠菌种保藏管中，置于-80℃超低温冰箱中保藏；
C、在LB培养基中加入一定量的CdCl2溶液，灭菌，制得含0~600mg/L 镉离子的LB平板。将分离得到的根际细菌经LB平板活化2d后，挑取单个菌落采用连续划线法转接到上述含镉LB平板上，30℃培养2-3d，每个处理做5个平行；结果见图1，结果显示编号为HH-15的菌株对重金属镉有着较强的耐受性，在镉浓度为400mg/L的含镉平板上仍可以萌发形成肉眼可见的菌落，是一株耐镉的根际细菌；
D、菌株HH-15的鉴定
①菌株HH-15形态学特征：如图2所示，该菌株在LB固体培养基上的菌落为较规则的圆形且有凸起，表面光滑，菌落直径2.0-3.5mm，菌落颜色呈半透明的乳黄色；在光学显微镜下观察菌体为短杆状，可活动，长度为0.5-1.0μm，宽度0.2-0.5μm，革兰氏染色为阴性；经扫描电镜观察，菌体为长杆状，菌体表面有凸起褶皱；
②分子鉴定：将分离纯化后的菌株送测序公司进行菌种鉴定，通过细菌16S rDNA进行扩增测序，其中扩增引物为：27F (AGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，获得的序列与NCBI上序列进行BLAST比对，该株根际细菌属于变形菌门（Proteobacteria），β-变形菌纲（Betaproteobacteria），伯克氏菌目（Burkholderiales），产碱菌科（Alcaligenaceae），无色杆菌属（Achromobacter）的马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis）；因此经过形态学、分子学鉴定以及生理生化特性比对确定该菌株为马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis），标记为马德普拉塔无色杆菌HH-15。
实施例2：马德普拉塔无色杆菌HH-15菌种悬液的制备
1、将保存于磁珠菌种保藏管的马德普拉塔无色杆菌HH-15接种到NB固体培养基中30℃下活化培养2天；
2、将活化后的马德普拉塔无色杆菌HH-15接种到NB液体培养基中，30℃下培养36h，得到菌种悬液。
实施例3：马德普拉塔无色杆菌HH-15在处理水体中镉离子的应用
1、不同pH水体环境中HH-15对镉离子的清除率
制备镉离子浓度为300mg/L的NB液体培养基，分装100mL至250mL三角瓶，边振荡边缓慢滴加盐酸或氢氧化钠，分别调节pH至4、5、6、7、8、9，灭菌，不加或加入5%马德普拉塔无色杆菌HH-15菌种悬液，30℃、180r/min下振荡培养36h，10000r/min离心5min，离心后测定上清液中的镉浓度，以不加HH-15菌种悬液的处理为对照，计算HH-15在不同pH水体环境中对镉离子的清除率，结果如图3所示。
水体环境的pH不仅会影响镉离子的赋存形态，也会影响HH-15菌体表面基团的活性，进而影响镉离子对HH-15的生物有效性，以及HH-15对金属离子的生物利用能力。由图3可以看出HH-15对镉离子的清除率随着水体环境pH的增大而增加，pH在达到7之后清除率逐渐趋于平稳，pH=8时清除率最高，为69.1 %。其原因可能是两个方面，一方面，随着pH的增加，镉离子逐渐水合，其生物有效性逐渐降低，减弱了对HH-15生长的影响；另一方面，随着pH的增加，菌体表面的基团被溶液中的H+包围、质子化的程度降低，其对金属离子吸附能力增强。
2、不同处理时间下HH-15对镉离子的清除率
制备镉离子浓度为300mg/L的NB液体培养基，分装100mL至250mL三角瓶，调节pH至8，不加或加入5%马德普拉塔无色杆菌HH-15菌种悬液，30℃、180r/min下振荡培养4、8、12、24、36、48、60、72、84、96 h，10000r/min离心5min，离心后测定上清液中的镉浓度，以不加HH-15菌种悬液的处理为对照，计算不同处理时间下HH-15对镉离子的清除率，结果如图4所示。
由图4可以看出，HH-15对镉离子的清除率随着处理时间的延长而增加，到36 h后不再明显增加而是逐渐趋于平稳，清除率为68.6%。
3、不同初始镉离子浓度下HH-15对镉离子的清除率
制备初始镉离子浓度为10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L的NB液体培养基，分装100mL至250mL三角瓶，调节pH至8，不加或加入5%马德普拉塔无色杆菌HH-15菌种悬液，30℃、180r/min振荡培养36h，10000r/min离心5min，离心后测定上清液中的镉浓度，以不加HH-15菌种悬液的处理为对照，计算不同初始镉离子浓度下HH-15对镉离子的清除率，结果如图5所示；同时，本实验过程收集菌泥沉淀，用去离子水洗涤三次后烘干，测定其干重及其镉含量，用以表征菌体对镉的吸收能力，结果如图5所示。
由图5可以看出，初始镉离子浓度300mg/L时HH-15对镉离子的清除率为67.2 %，HH-15菌体对镉离子的吸附量随着初始镉浓度的增加而增大，到300mg/L之后逐渐趋于平稳。这可能是因为初始镉浓度较高时HH-15菌体与镉离子接触机率更高，表现为更大的单位吸附量，但菌体上吸附位点的数量是一定的，所以吸附量最终趋于平稳，最高吸附量为8.79mg/g。
4、马德普拉塔无色杆菌HH-15吸附镉过程中胞外吸附与胞内累积的分布情况
制备初始镉离子浓度为50mg/L、150mg/L、300mg/L的NB液体培养基，分装100mL至250mL三角瓶，调节pH至8，加入5%马德普拉塔无色杆菌HH-15菌种悬液，30℃、180r/min振荡培养36h，10000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌泥沉淀，用去离子水洗涤三次后重悬于5mM灭菌后的EDTA中，所有悬浮液以200rpm/min震荡30min，之后10000 r/min离心5min，离心后测定EDTA上清液中的镉浓度，计算不同初始镉离子浓度下HH-15在吸附镉的过程中细胞表面镉的生物吸附量，结果如图6所示；同时收集EDTA处理后的菌泥沉淀，用去离子水洗涤三次后烘干，测定其干重及其镉含量，计算不同初始镉离子浓度下HH-15在吸附镉的过程中细胞内镉的生物累积量，结果如图6所示。
由图6可以看出，初始镉离子浓度300mg/L时HH-15细胞表面镉的生物吸附量为5.61mg/g，细胞内镉的生物累积量为7.29mg/g，可知HH-15在镉离子生物吸附过程涉及了细胞外吸附和细胞内累积的方式，且细胞内累积在整个吸附过程起主要作用。这可能是因为细胞内有一些金属离子转运相关的信号通路以及信号因子在协助镉生物累积的过程中发挥了重要作用，亦或是菌株HH-15与镉离子发生了生物矿化，以至于EDTA浸提剂无法将细菌吸收的镉提取出来，如图9所示。
实施例4：马德普拉塔无色杆菌HH-15在处理土壤环境中镉离子中的应用
1、制备镉污染土壤
取农业用地的风干土壤，除掉大块石子和杂草，过20目筛，将重金属镉粉配成悬液，少量多次添加至过筛土壤中，拌匀，使土壤中镉终浓度为1000mg/kg，然后置于25℃下恒温培养稳定2月；
2、菌株HH-15对镉污染土壤中游离态镉以及DTPA提取态镉的固化能力测定
制备NB液体培养基，分装100mL至250mL三角瓶中，加入10g上述镉污染土壤，调节pH至8，不加或加入5%马德普拉塔无色杆菌HH-15菌种悬液，30℃、180r/min振荡培养24、36、48h，10000r/min离心5min，离心后测定上清液中的镉浓度，以不加HH-15菌种悬液的处理为对照，用以表征菌株HH-15固化镉污染土壤中游离态镉的含量，结果如图7和表1所示；同时收集土壤沉淀，根据中华人民共和国国家标准GB/T 23739-2009中“土壤质量有效态铅和镉的测定”中方法测定菌株HH-15固化镉污染土壤中DTPA提取态镉的含量，结果如图8和表1所示。
表1 菌株HH-15对镉污染土壤中镉的固化率（%）
由图7、图8和表1可以看出，马德普拉塔无色杆菌HH-15对镉污染土壤中游离态镉以及DTPA提取态镉均具有固化作用，上清中溶出的土壤中游离态镉浓度随着HH-15孵育时间的增加逐渐降低，同时，土壤中植物可利用态镉含量也随HH-15孵育时间的延长而降低，其总固化率可达47.41%。大量研究表明重金属元素能否被生物体吸收利用，主要取决于该元素的赋存形态，土壤中DTPA提取态镉是植物能够从土壤中吸收利用的镉的赋存形态，菌株HH-15孵化后显著降低了土壤中DTPA提取态镉含量，表明菌株HH-15是一种能原位净化土壤镉污染的生物体，可以开发作为土壤镉污染的生物策略，减少植物体对镉的吸收，减轻镉对植物体的损害。
Claims (2)
1.一种马德普拉塔无色杆菌（Achromobacter marplatensis）HH-15，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 27406。
2.权利要求1所述的马德普拉塔无色杆菌HH-15在处理重金属镉污染中的应用。
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- 2023-06-30 CN CN202310792365.1A patent/CN116948882A/zh active Pending
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