CN116925932A - 一株真菌贵州木霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株贵州木霉(Trichoderma guizhouense)SL31，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.40632，本发明菌株具有很强的镉耐性，可开发为生物吸附剂，用于去除水体中重金属，其吸附符合Langmuir等温吸附模型和准二级动力学方程，为单分子层吸附，以化学吸附为主；本发明为处理水体中重金属污染提供了一条经济环保、可持续处理、处理时间短的途径，且本发明方法简单易操作，适用于工业化生产和市场推广应用。

Description

一株真菌贵州木霉及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株高镉抗性真菌贵州木霉(Trichodermaguizhouense)SL31及其应用。

背景技术

随着社会的不断发展进步，水体重金属污染问题日益严重。重金属污染物来源广泛，在自然环境中赋存稳定，能随食物链迁移、富集并最终影响人体健康。现阶段的污水重金属治理技术主要有物理法、化学法和生物法三大类型，每种技术类型都有许多不同的治理方法和相应的适用环境。生物法常用的生物载体有藻类、微生物、植物等，其中研究的比较多的是微生物。微生物修复常采用芽孢杆菌、磷酸盐溶菌等细菌类和酵母、木霉等真菌类微生物。微生物吸附方法具有处理成本低，操作简单，高效率，可回收等特点，是重金属水污染治理领域的研究热点。

发明内容

本发明提供一株贵州木霉(Trichoderma guizhouense)SL31，其于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40632，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明另一目的是将上述贵州木霉SL31作为生物吸附剂应用在去除水体中的重金属镉离子中。

本发明采用如下技术方案实现上述目的：

1、从云南省昆明市石林县采集得到富镉大型真菌灰褐牛肝菌(Boletusgriseus)，从其子实体中分离得到菌株SL31，菌株SL31在马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上的菌落初期为白色，絮状，致密，平伏，圆形，向四周扩展。培养7天后，从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色，菌落周围有白色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成绿色。镜检可见该菌株菌丝壁薄，透明，纤细，有隔膜，宽度为1.5～2.4μm，产分生孢子，分生孢子单生或簇生，呈光滑的球形，绿色；

将分离纯化后的菌株送测序公司进行菌种鉴定，通过ITS扩增，获得的序列与NCBI上序列进行BLAST比对，发现该菌菌株与贵州木霉(Trichoderma guizhouense)的相似性为100％，确定该菌株为贵州木霉(Trichoderma guizhouense)，命名为贵州木霉SL31；

2、将贵州木霉SL31接种到PDA培养基中28℃下活化复壮培养，将复壮后的菌种接种到马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中28℃下培养至少3天获得种子液，按2-3％的接种量将种子液接种到PDB培养基中28℃下扩大培养，培养液通过离心收集菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤2次以上，冷冻干燥后用打粉机打粉，制得贵州木霉SL31生物吸附剂；

3、将贵州木霉SL31生物吸附剂投加到含重金属的待处理水体中，实现水体中重金属的去除。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明明确了从野生灰褐牛肝菌子实体中分离得到一株对重金属镉有较强耐性的菌株为贵州木霉(Trichoderma guizhouense)，并命名为贵州木霉SL31；贵州木霉SL31通过简单液体培养即可获得大量的菌丝体，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能，可作为经济、高效、环境友好型的微生物吸附材料进行重金属镉污染的水体修复，本发明给出了贵州木霉SL31及其对重金属镉的吸附行为、条件和机理，为未来重金属的污染修复提供更多的理论依据；

2、本发明明确了贵州木霉SL31活体在有镉的生长环境中具有很强的镉耐性，在镉浓度为300mg/L的平板和摇瓶内，仍能生长，且在不同镉浓度的摇瓶中均对镉具有较高的清除率和生物吸附量；

3、本发明明确了贵州木霉SL31作为生物吸附剂对水体中镉具有较强的吸附能力，且吸附镉的最佳吸附条件为：pH6.0，吸附剂用量2g/L，吸附时间240min，镉初始浓度60mg/L；

4、本发明明确了贵州木霉SL31作为吸附剂的吸附过程更加符合Langmuir等温吸附模型和准二级动力学方程，说明其为单分子层吸附，吸附过程以化学吸附为主导；

本发明贵州木霉SL31制备条件简单，成本低廉的特点，适用于各种工业废水中镉离子的去除，显示出较好的工业应用前景。

附图说明

图1是贵州木霉SL31的形态特征图，其中：A图为菌株在PDA培养基培养3天的形态；B图为菌株在显微镜下的菌丝形态；C图为菌株在扫描电镜下的菌丝形态；D图为菌株在PDA培养基培养7天的形态；E图为菌株在显微镜下的孢子形态；F图为菌株在扫描电镜下孢子形态；

图2是贵州木霉SL31在不同镉浓度固体培养基上的生长情况，其中：A图为菌株在PDA培养基上培养5天的形态；B图为菌株在PDA培养基上培养10天的形态；

图3是贵州木霉SL31的生长曲线；

图4是贵州木霉SL31在不同镉浓度胁迫下菌丝体湿重和耐受指数；其中：A图为贵州木霉SL31在不同镉浓度胁迫下培养5天的菌丝体湿重和耐受指数；B图为贵州木霉SL31在不同镉浓度胁迫下培养10天的菌丝体湿重和耐受指数；

图5是贵州木霉SL31在不同镉浓度胁迫下对镉的清除率和吸附量；其中：A图为贵州木霉SL31在不同镉浓度胁迫下培养5天和10天对镉的清除率；B图为贵州木霉SL31在不同镉浓度胁迫下培养5天和10天对镉的吸附量；

图6是贵州木霉SL31作为生物吸附剂在不同pH下对镉离子的清除率；

图7是贵州木霉SL31作为生物吸附剂在不同添加量下对镉离子的清除率和吸附量；

图8是贵州木霉SL31作为生物吸附剂在不同处理时间对镉离子的清除率；

图9是贵州木霉SL31作为生物吸附剂在不同镉初始浓度对镉离子的清除率和吸附量；

图10是贵州木霉SL31的Langmuir吸附等温模型；

图11是贵州木霉SL31的Freundlich吸附等温模型；

图12是贵州木霉SL31的准一级动力学方程；

图13是贵州木霉SL31的准二级动力学方程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1：贵州木霉SL31的分离、筛选、鉴定与保存

1、从云南省昆明市石林县采集得到富镉大型真菌灰褐牛肝菌(Boletusgriseus)，随机挑选出发育成熟、完整、无虫的子实体。削除菌柄根部的泥土，用75％的乙醇喷洗子实体表面的杂质，随后用75％乙醇棉球擦拭子实体，再用无菌水冲洗，无菌纱布擦干子实体表面；

2、将处理好的子实体置于超净工作台中，紫外照射灭菌15min；每朵子实体选取菌盖中间和菌柄中间两侧三个部位，划开表皮层，切取组织块(3mm×3mm×3mm)，放置在PDA培养基中；于黑暗、28℃恒温培养箱中培养；观察平板内真菌的生长情况，待其菌丝体向周围扩展形成菌落时，用打孔器和接种针从菌落边缘打孔并挑取菌丝，采用点植法纯化培养菌株，共收集到57株内生真菌，编号为SL1-SL57；

3、在PDA培养基中加入CdCl₂溶液，灭菌，制得含Cd²⁺浓度为0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L的含镉PDA平板；将分离得到的57株内生真菌经PDA平板活化3天后，在菌落边缘用直径5mm打孔器打孔，接种至含镉PDA平板上，于黑暗、28℃恒温培养箱中培养，每个处理重复3次；根据菌株在不同镉浓度平板上的生长情况，筛选出具有高镉抗性的菌株。发现菌株SL31对重金属镉有着较强的耐受性，如图2所示，在培养5天镉浓度为600mg/L的含镉平板上仍可以萌发形成肉眼可见的菌落，是一株具有很强的耐镉性内生真菌，之后将菌种SL31保存于PDA斜面上备用；

4、菌株SL31的鉴定

①菌株SL31形态学特征：如图1所示，菌株SL31在PDA平板上的菌落初期为白色，絮状，致密，平伏，圆形，向四周扩展。培养7天后，从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色。菌落周围有白色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成绿色。镜检可见该菌株菌丝壁薄，透明，纤细，有隔膜，直径为1.5～2.4μm，产分生孢子，分生孢子单生或簇生，呈光滑的球形，绿色；

②分子鉴定：将分离纯化后的菌株送测序公司进行菌种鉴定，通过ITS基因序列鉴定，ITS基因PCR扩增引物为：ITS1(5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，将扩增获得的基因序列与NCBI数据库中的相关菌株序列进行BLAST对比，该株内生真菌被鉴定为子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、肉座菌科(Hypocreaceae)、木霉属(Trichoderma)的贵州木霉(Trichoderma guizhouense)；将菌株SL31接种于PDA斜面上保存；

5、贵州木霉SL31的生长曲线

将保存于PDA斜面上的贵州木霉SL31接种到PDA培养基中28℃下活化复壮培养3天，将复壮后的菌种接种到PDB培养基中28℃下培养至少3天获得种子液，按3％的接种量将种子液接种到PDB摇瓶中，分别在28℃恒温培养箱中培养2天、4天、6天、8天、10天、12天后测定真菌的生物量，绘制真菌生长曲线，每个时间点重复3次；结果如图3所示，0-4天为适应期，4-8天为对数生长期，8-12天为稳定期，12天以后进入衰亡期。

实施例2：贵州木霉SL31在不同镉浓度下的生长情况

1、将保存于PDA斜面上的贵州木霉SL31接种到PDA培养基中28℃下活化复壮培养3天；

2、在PDB培养基中加入CdCl₂溶液，灭菌，制得含Cd²⁺浓度为0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L的含镉PDB摇瓶；将复壮后的菌种接种到PDB摇瓶中28℃下培养至少3天获得种子液，按2％的接种量将种子液接种到含镉PDB摇瓶中，28℃培养5天和10天，每个处理重复3次；分别培养5天和10天后，取吸附后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液消解，测定其镉浓度；再将离心后的菌丝体用去离子水反复冲洗3次，烘干测定菌丝体中镉含量。

结果如图4和图5所示，在不同初始镉浓度的摇瓶中培养5天后，贵州木霉SL31在镉浓度为20mg/L的摇瓶中生物量达到最大10.64g湿重，高于空白未添加镉的生物量8.32g，表现出一定的促生作用。随着镉浓度的升高，木霉生长受到明显抑制，生长量呈显著下降的趋势。培养10天后，在不同镉浓度的摇瓶中，贵州木霉SL31的生物量均比培养5天的生物量高，并在未添加Cd²⁺的摇瓶中生物量达到最大16.43g湿重，随着镉浓度的升高，木霉生长受到明显抑制，生长量也呈显著下降的趋势。从培养天数来看，培养5天正处于贵州木霉SL31的适应期，生物量较少，而培养10天正处于贵州木霉SL31的稳定期，贵州木霉SL31通过对数增长期快速生长，生物量达到最大，结果与贵州木霉SL31生长曲线较契合。从摇瓶中的镉浓度来看，无论是培养时间是5天还是10天，贵州木霉SL31生物量在镉浓度为20mg/L的摇瓶中都达到最大，且随着镉浓度的升高，木霉生长均受到明显抑制，生长量也呈显著下降的趋势。同时贵州木霉SL31对镉的耐受指数与其生物量也有着明显的相似性。培养5天时，在Cd²⁺浓度为100mg/L的摇瓶中，贵州木霉SL31对镉的清除率和吸附量达到最大，分别为32.62％和9.49mg/g。培养10天后，在Cd²⁺浓度为80mg/L的摇瓶中，贵州木霉SL31对镉的清除率和吸附量达到最大，分别为33.33％和21.21mg/g。随着培养时间的增大，贵州木霉SL31对镉的清除率略有增长，对镉的吸附量增长很大，镉吸附量增加了一倍。综上所述，原因可能是在低浓度的镉环境中，Cd²⁺对贵州木霉SL31的毒害作用较小，真菌可以正常生长，在高浓度的镉环境中反之。

实施例3：贵州木霉SL31生物吸附剂的制备

1、将保存于PDA斜面上的贵州木霉SL31接种到PDA培养基中28℃下活化培养3天；

2、将复壮后的菌种接种到PDB培养基中28℃下培养至少3天获得种子液，然后按3％的接种量将种子液接种到PDB培养基中28℃下扩大培养5天，10000r/min下离心收集菌丝体，然后将菌丝体用去离子水洗涤3次后，冷冻干燥，打粉制得贵州木霉SL31生物吸附剂。

实施例4：贵州木霉SL31生物吸附剂在吸附水体中镉离子的应用

1、pH对贵州木霉SL31生物吸附剂处理液体中Cd²⁺效果的影响

在浓度为20mg/L的Cd²⁺溶液50mL中，加入0.05g SL31生物吸附剂，分别调节pH至2、3、4、5、6、7，28℃下恒温振荡12h，吸附后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液消解，测定其镉浓度；

结果如图6所示，水体中不同的pH环境会影响贵州木霉SL31生物吸附剂与镉离子的接触，进而影响贵州木霉SL31生物吸附剂对水体中镉离子的清除效果，由图可以看出，pH为2-3时，镉清除率很小，可能是因为过酸的酸性溶液中存在着大量的H⁺，使生物吸附剂表面的基团质子化，降低其对溶液中重金属离子的去除效果；pH为3-6时，镉清除率随着pH的增大而增大，pH在达到6之后清除率降低，pH＝6时清除率达到最大，为29.32％。

2、用量对贵州木霉SL31生物吸附剂处理液体中Cd²⁺效果的影响

在浓度为20mg/L、pH 6的Cd²⁺溶液50mL中，加入贵州木霉SL31生物吸附剂，使溶液中生物吸附剂的浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L，28℃下恒温振荡12h，吸附后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液和沉淀消解，测定其镉浓度；

结果如图7所示，由图可以看出在添加量为0.5-2g/L的范围内，清除率随着生物吸附剂添加量的增加而增加，当生物吸附剂添加量为2g/L时，清除率为最大达到35.55％；这可能是因为生物吸附剂的添加量增大使吸附位点也增多，清除率也随之升高。当生物吸附剂投加量超过2g/L后，随投加量的增加清除率不再提高，而是趋于平稳。其原因可能是随着生物吸附剂剂量的增加，生物吸附剂间的团聚作用减少了有效比表面积和吸附位点；另一方面可能是因为生物吸附剂的吸附位点已达到饱和。

3、处理时间对贵州木霉SL31生物吸附剂处理液体中Cd²⁺效果的影响

在浓度为20mg/L、pH6的Cd²⁺溶液50mL中，加入生物吸附剂使生物吸附剂浓度达到2g/L，28℃下恒温振荡60、120、240、360、480、600、720min，处理后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液和沉淀消解，测定其镉浓度；

结果如图8所示，由图可以看出240min以前镉吸附量随着吸附时间的增大而增加，到240min之后不再明显增加而是逐渐趋于平稳，240min的清除率最大为44.60％。

4、镉初始浓度对Cd²⁺处理效果的影响

分别在镉浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的50mL溶液(pH6)中，加入生物吸附剂使生物吸附剂浓度达到2g/L，于恒温培养箱中28℃下恒温振荡240min，吸附后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液和沉淀消解，测定其镉浓度；

结果如图9所示，由图可以看出，镉吸附量随着镉初始浓度的提高而增加，到60mg/L之后不再增加而是逐渐趋于平稳，这可能是因为初始浓度较高时可以提供更大的推动力，从而使镉离子更容易克服固液相之间的传质阻力，表现为较大的单位吸附量，但生物吸附剂上吸附位点的数量是一定的，所以吸附量最终趋于平稳，初始浓度60mg/L时生物吸附剂吸附量为14.43mg/g。

5、等温吸附研究

根据镉初始浓度对吸附剂吸附效果影响的实验数据，建立Langmuir和Freundlich模型分析其吸附，分析结果如图10、11所示；由图可以看出，贵州木霉SL31生物吸附剂的吸附过程更接近Langmuir模型，说明其吸附镉离子以单分子层吸附为主，Langmuir等温线的相关系数R²为0.9937，理论吸附饱和量Q_m＝14.77mg/g，吸附常数K_L＝0.1947。

6、吸附动力学研究

根据吸附时间度对贵州木霉SL31生物吸附剂吸附效果影响的实验数据，建立准一级动力学和准二级动力学方程分析其吸附，分析结果如图12、13；由图可以看出，吸附Cd²⁺的准二阶动力学模型线性拟合相关系数达0.9983，远大于准一阶动力学模型线性拟合的R²值，说明生物吸附剂的吸附过程更符合准二级动力学拟合，吸附过程由物理扩散过程及化学吸附过程两部分组成。准一级动力学方程采用0-240min的数据进行拟合，相关系数R²为0.9976，也能够较好的描述贵州木霉SL31生物吸附剂吸附的初始阶段。而准二级动力学则是更好地描述了贵州木霉SL31生物吸附剂吸附全过程的状态，R²＝0.9983。因此，贵州木霉SL31生物吸附剂的吸附过程是由物理吸附与化学吸附共同作用，物理吸附主要作用在吸附的初始阶段，可能发生静电吸附，而在整个吸附过程中还是以化学吸附为主，可能发生表面络合。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一株贵州木霉(Trichoderma guizhouense)SL31，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.40632。

2.权利要求1所述的贵州木霉SL31在去除水体重金属镉中的应用。