CN114456952B - 一种金孢菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金孢菌（Hypomyces chrysospermus）C200，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.23900，本发明菌种作为处理剂用于去除水体中重金属，且其吸附符合Langmuir等温模型和准二级动力学方程，为单分子层吸附，以化学吸附为主，本发明为处理重金属污染提供了一条经济环保、可持续处理的途径，且本发明方法简单易操作，适用于工业化生产和市场推广应用。

Description

一种金孢菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种金孢菌（ Hypomyces chrysospermus）C200及其应用。
背景技术
近年来，国内水体重金属污染问题十分突出，尤其江河湖泊水库底质的污染率，黄河、淮河、松花江等十大流域重金属超标污染程度均超V类，而国外同样存在着水体重金属污染严重问题，因而含重金属废水的处理至关重要，而处理技术的开发就成了当前社会的焦点。重金属对环境的污染已日趋严重，采取合适的处理技术对重金属废水进行有效处理，是降低重金属污染的重要途径之一。在众多的重金属处理方法中，微生物吸附法，因其具有环境友好及成本低的特点而受到广泛的关注和研究，其中微生物吸附材料的开发，改性最为活跃。
发明内容
本发明提供一种金孢菌（ Hypomyces chrysospermus）C200，其于2021年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23900，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明另一目的是将上述金孢菌C200应用在去除水体中的重金属离子中。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1、本发明从云南省采集得到灰褐牛肝菌（ Boletus griseus）并从其子实体中分离获得菌株C200。菌株C200在马铃薯葡萄糖固体培养基上的菌丝体初期为白色、絮状，平伏，边缘规则，菌丝壁薄，呈透明状；培养3d后菌落出现黄色孢子层，镜检可见椭圆形的分生孢子，以及顶生、呈球状的组织；经扫描电镜观察，球状组织为直径10mm左右的、壁厚、明显瘤状的厚垣孢子；
将分离纯化后的菌株送测序公司进行菌种鉴定，通过ITS扩增，其中扩增引物为：ITS1(5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，获得的序列与NCBI上序列进行BLAST比对，确定该菌株为金孢菌（ Hypomyces chrysospermus）；
2、将金孢菌C200接种到马铃薯葡萄糖固体培养基中28℃下活化培养，将活化后的菌种接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中28℃下培养至少3天获得种子液，按2-3%的接种量将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中28℃下扩大培养，培养液通过离心收集菌丝体，菌丝体用去离子水洗涤2次以上，冷冻干燥后制得金孢菌粉体；
3、将金孢菌粉体投加到含重金属的待处理水体中，实现水体中重金属的去除。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明从灰褐牛肝菌中分离得到一株对重金属镉有较强抗性的菌株，经BLAST对比同源性，鉴定为金孢菌( Hypomyces chrysospermus)，金孢菌可作为经济、高效、环境友好型的生物吸附材料进行重金属镉污染的水体修复，本发明给出了金孢菌C200作为吸附剂对重金属镉的吸附行为及机理，为未来重金属的污染修复提供更多的理论依据；
（2）本发明明确了金孢菌粉体吸附镉的最佳吸附条件为：pH6.0，吸附剂用量2g/L，吸附时间600min，镉初始浓度60mg/L；
（3）本发明通过建立并对比分析Langmuir和Freundlich模型，吸附剂的吸附过程更加符合Langmuir等温模型，说明其为单分子层吸附，建立吸附准一级动力学和准二级动力学方程方程，发现吸附过程更加符合准二级动力学方程，说明吸附过程以化学吸附为主导；
本发明金孢菌C200吸附剂具有可直接使用，制备条件简单，成本低廉的特点，适用于各种工业废水中镉离子的去除，显示出较好的工业应用前景。
附图说明
图1是金孢菌C200在不同浓度含镉培养基上的生长情况；
图2是金孢菌C200的形态特征图，其中A图：菌株在马铃薯葡萄糖固体培养基上的形态；B图：菌株在显微镜下的菌丝形态；C图：菌株在显微镜下的孢子形态；D-E图：菌株在扫描电镜下厚垣孢子形态；
图3是不同pH下金孢菌C200粉体对镉离子的去除率结果示意图；
图4是不同添加量金孢菌C200粉体对镉离子的去除效果示意图；
图5是不同处理时间金孢菌C200粉体对镉离子的去除效果示意图；
图6是金孢菌C200粉体对不同浓度含镉离子溶液处理效果示意图；
图7是Langmuir吸附等温模型；
图8是Freundlich吸附等温模型；
图9是准一级动力学方程；
图10是准二级动力学方程。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
实施例1：金孢菌C200的分离、筛选与鉴定
A、分别从云南省玉溪市易门县、昆明市石林县、曲靖的花山采集得到灰褐牛肝菌（ Boletus griseus），选取发育完全的灰褐牛肝菌子实体，用流水冲洗掉表面泥土；
B、于超净工作台中依次用75%的酒精和含5%有效氯的次氯酸钠溶液对灰褐牛肝菌子实体表面进行擦拭消毒，之后用无菌水冲洗3遍，置于无菌滤纸上晾干。在菌柄根部约1/3处用灭菌手术刀削除表皮及酒精接触的部分，取皮下组织块（0.5cm×0.5cm×0.5cm），接种于PDA平板上，28℃培养，每天观察菌丝的萌发情况，当观察到白色、絮状、平伏的丝状真菌菌落时，挑取该真菌进行分离纯化，获得菌株C200；
C、在PDA培养基中加入CdCl2溶液，1×105Pa灭菌30min后，制得含0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L Cd2+的含镉PDA平板。将分离得到的内生真菌经PDA平板活化3d后，在菌落边缘用直径5mm打孔器打孔，接种至含镉PDA平板上，28℃培养10d，每个处理重复5次；结果见图1，结果显示该菌株对重金属镉有着较强的耐受性，在镉浓度为200mg/L的含镉平板上仍可以萌发形成肉眼可见的菌落，是一株耐镉的内生真菌，之后将该菌种保存于PDA斜面上备用；
D、菌株C200的鉴定
①C200形态学特征：如图2所示，该菌株的菌丝体初期为白色、絮状，平伏，边缘规则，菌丝壁薄，呈透明状；菌落3d后出现黄色孢子层，镜检可见椭圆形的分生孢子，以及顶生、呈球状的组织；经扫描电镜观察，球状组织为直径10mm左右的、壁厚、明显瘤状的厚垣孢子；
分子鉴定：将分离纯化后的菌株送测序公司进行菌种鉴定，通过ITS基因序列鉴定，ITS基因PCR扩增引物为：ITS1（5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），将扩增获得的基因序列与NCBI数据库中的相关菌株序列进行BLAST对比，该株内生真菌属于子囊菌门（ Ascomycota），粪壳菌纲（ Sordariomycetes），肉座菌目（ Hypocreales），肉座菌科（ Hypocreaceae），真菌寄生菌属（ Hypomyces）的金孢菌（ Hypomyces chrysospermus）；
 从来源于不同地区的灰褐牛肝菌子实体中分离获得的菌株经过形态学和分子学鉴定，均为金孢菌（ Hypomyces chrysospermus）。
实施例2：金孢菌C200粉体的制备
1、将保存于PDA斜面上的金孢菌C200接种到马铃薯葡萄糖固体培养基中28℃下活化培养7天；
2、将活化后的金孢菌C200然接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃下3天制得种子液，然后按3%的接种量将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中28℃下扩大培养5天，5000rpm下离心收集菌丝体，然后将菌丝体用去离子水洗涤3次后；冷冻干燥制得。
实施例3：金孢菌C200粉体在吸附水体中镉离子中的应用
1、pH对Cd2+液体处理效果的影响
在浓度20mg/L的含Cd2+溶液50mL中，加入0.05g吸附剂，边振荡边缓慢滴加盐酸或氢氧化钠，分别调节pH至1.5、2、3、4、5、6、7，25℃恒温150r/min振荡12h，吸附后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液消解，测定其镉浓度，结果如图3所示。
水体中不同的pH环境会影响金孢菌C200粉体与镉离子的接触，进而影响金孢菌C200粉体对水体中镉离子的去除效果，由图3可以看出镉去除率随着pH的增大而增大，可能是因为粉体表面的基团被溶液中的H+包围，使粉体表面的基团质子化，降低其对溶液中重金属离子的去除效果，pH在达到6之后去除率逐渐趋于平稳，pH=6时的吸附量为5.71mg/g。
2、粉体用量对Cd2+液体处理效果的影响
在浓度20mg/L的含Cd2+溶液50mL中，边振荡边缓慢滴加盐酸或氢氧化钠，调节pH至6，之后加入金孢菌粉体，使溶液中粉体的浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L，25℃恒温150r/min振荡12h，处理后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液消解，测定其镉浓度，结果如图4所示；
由图4可以看出，在添加量为0.5-2g/L的范围内，去除率随着粉体添加量的增加而增加，当粉体添加量为2g/L时，吸附量为4.51mg/g；这可能是因为粉体的添加量增大使吸附位点也增多，去除率也随之升高。当投加量超过2g/L后，随投加量的增加去除率不再提高，而是趋于平稳。其原因可能是随着粉体剂量的增加，粉体间的团聚作用限制了有效比表面积和吸附位点的增加；另一方面吸附量随着粉体添加量的增大而减小，这可能是因为粉体的吸附位点没有达到饱和造成的。
3、处理时间对去除效果的影响
在浓度20mg/L的含Cd2+溶液50mL中，边振荡边缓慢滴加盐酸或氢氧化钠，调节pH至6，之后加入粉体使粉体浓度达到2g/L，25℃恒温150r/min振荡10、30、60、90、120、180、240、360、480、600、720min，处理后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液消解，测定其镉浓度，结果如图5所示；
由图5可以看出，吸附量随着吸附时间的增大而增加，到600min之后不再明显增加而是逐渐趋于平稳，600min的吸附量为4.52mg/g。
4、镉初始浓度对处理效果的影响
分别在镉浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的含Cd2+溶液50mL中，边振荡边缓慢滴加盐酸或氢氧化钠，调节pH至6，之后加入粉体使粉体浓度达到2g/L，25℃恒温150r/min振荡600min，吸附后的溶液10000r/min离心10min，离心后将上清液消解，测定其镉浓度，结果如图6所示；
由图6可以看出，吸附量随着镉初始浓度的提高而增加，到60mg/L之后不再增加而是逐渐趋于平稳，这可能是因为初始浓度较高时可以提供更大的推动力，从而使镉离子更容易克服固液相之间的传质阻力，表现为较大的单位吸附量，但粉体上吸附位点的数量是一定的，所以吸附量最终趋于平稳，初始浓度60mg/L时粉体吸附量为8.35mg/g。
5、等温吸附研究
根据镉初始浓度对吸附剂吸附效果影响的实验数据，建立Langmuir和Freundlich模型分析其吸附，分析结果如图7和图8；
由图7和图8可以看出，粉体的吸附过程更接近Langmuir模型，说明粉体吸附镉离子以单分子层吸附为主，Langmuir等温线的相关系数R2为0.9912，理论吸附饱和量Qm=9.66mg/g，吸附常数KL=0.0872，代入Langmuir吸附经验式Ce/Qe=Ce/Qm+1/KLQm。
6、吸附动力学研究
根据吸附时间度对吸附剂吸附效果影响的实验数据，建立准一级动力学和准二级动力学方程分析其吸附，分析结果如图9和图10；
由图9和图10可以看出，粉体的吸附过程更符合准二级动力学拟合，说明吸附过程以化学吸附为主，准一级动力学方程采用0-240min的数据进行拟合，相关系数R2为0.984，能够较好的描述金孢菌C200粉体吸附的初始阶段。准二级动力学描述了金孢菌C200粉体吸附全过程的状态，R2=0.9977。因此，吸附过程是由物理吸附与化学吸附共同作用，物理吸附主要作用在吸附的初始阶段，可能发生静电吸附，而化学吸附在全过程中起到了主导作用，可能发生表面络合。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种金孢菌及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (2)

1.一种金孢菌寄生（Hypomyces chrysospermus）C200，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.23900。
2.权利要求1所述的金孢菌寄生C200在去除水体镉离子中的应用。
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