JP2000041684A - 新規なｄ−アミノアシラーゼおよびその製造方法、並びに該ｄ−アミノアシラーゼを利用したｄ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
新規なｄ−アミノアシラーゼおよびその製造方法、並びに該ｄ−アミノアシラーゼを利用したｄ−アミノ酸の製造方法Info
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来の細菌や放射菌以外の微生物を利用し
た、効率的なD-アミノ酸の製造方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】 D-アミノアシラーゼを生産するかびの探
索を行い、ヒポミセス（Hypomyces）属、フザリウム(Fu
sarium)属、オーリクラリア(Auricularia)属、フィシウ
ム(Pythium)属およびメニスポロプシス(Menisporopsis)
属に属する多くのかびが、N-アセチル-D-アミノ酸からD
-アミノ酸を生産する能力を有することを見出した。ま
た、かびからD-アミノアシラーゼを分離し、N-アセチル
-D-アミノ酸に作用させることにより、効率的にD-アミ
ノ酸を製造することが可能であることを見出した。
た、効率的なD-アミノ酸の製造方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】 D-アミノアシラーゼを生産するかびの探
索を行い、ヒポミセス（Hypomyces）属、フザリウム(Fu
sarium)属、オーリクラリア(Auricularia)属、フィシウ
ム(Pythium)属およびメニスポロプシス(Menisporopsis)
属に属する多くのかびが、N-アセチル-D-アミノ酸からD
-アミノ酸を生産する能力を有することを見出した。ま
た、かびからD-アミノアシラーゼを分離し、N-アセチル
-D-アミノ酸に作用させることにより、効率的にD-アミ
ノ酸を製造することが可能であることを見出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、かびにより生産さ
れるD-アミノアシラーゼ、該D-アミノアシラーゼの製造
方法、および該D-アミノアシラーゼを用いたD-アミノ酸
の製造方法に関する。
れるD-アミノアシラーゼ、該D-アミノアシラーゼの製造
方法、および該D-アミノアシラーゼを用いたD-アミノ酸
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素は高い触媒機能をもつだけでなく、
基質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。
酵素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほ
とんど絶対的といえる。近年における研究の精密化に伴
い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体
を扱うことの重要性が増している。これは光学異性体が
生理活性をまったく異にする場合があるためで、たとえ
ば、サリドマイドは、D（R）体には催奇性をもたない
が、L（S）体には強い催奇形成があり、ラセミ体を実用
に供したことが薬害事件を引き起こす原因となった。さ
らに、対掌体の一方が有効な生理活性を示す場合、もう
一方の異性体が単に全く活性を示さないだけでなく、有
効な対掌体に対して競合阻害をもたらす結果、ラセミ体
の生物活性が有効な対掌体に対して1／2以下に激減して
しまうこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をい
かにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要
な課題となっている。この目的に対して、ラセミ体を合
成した上で、それを効果的に光学分割する手法が広く用
いられており、副生成物や多量の廃液を生じない酵素法
による光学分割が注目されている。
基質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。
酵素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほ
とんど絶対的といえる。近年における研究の精密化に伴
い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体
を扱うことの重要性が増している。これは光学異性体が
生理活性をまったく異にする場合があるためで、たとえ
ば、サリドマイドは、D（R）体には催奇性をもたない
が、L（S）体には強い催奇形成があり、ラセミ体を実用
に供したことが薬害事件を引き起こす原因となった。さ
らに、対掌体の一方が有効な生理活性を示す場合、もう
一方の異性体が単に全く活性を示さないだけでなく、有
効な対掌体に対して競合阻害をもたらす結果、ラセミ体
の生物活性が有効な対掌体に対して1／2以下に激減して
しまうこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をい
かにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要
な課題となっている。この目的に対して、ラセミ体を合
成した上で、それを効果的に光学分割する手法が広く用
いられており、副生成物や多量の廃液を生じない酵素法
による光学分割が注目されている。
【０００３】一般にL-アミノ酸は、調味料や食品・飼料
の添加物、医薬用輸液などに広く、かつ多量に用いられ
ておりその利用価値は非常に高い。L-アミノ酸は主に微
生物を用いた直接発酵法により生産されているが、N-ア
シル-DL-アミノ酸をL-アミノアシラーゼによって加水分
解し、L-アミノ酸を生産する光学分割法も知られてお
り、発酵法では製造が困難なL-アミノ酸の工業的生産に
古くから利用されている。このL-アミノアシラーゼは動
物、植物、微生物に広く分布しており、今日までに様々
な生物に由来するL-アミノアシラーゼが精製され、酵素
化学的性質が明らかにされている。また、生体内では多
くのタンパク質のN-末端アミノ酸はN-アセチル化されて
いると考えられている。L-アミノアシラーゼはタンパク
質の分解によって生じたN-アセチル-アミノ酸をアミノ
酸に再生する機能をもつと考えられている。また、L-ア
ミノアシラ−ゼの中でもN-アシル-L-グルタミン酸に作
用するアシラーゼはアルギニンの生合成に関与している
と考えられている（Fruh,H.,Leisinger,T.:J.Gen.,125,
pp1(1981)）。
の添加物、医薬用輸液などに広く、かつ多量に用いられ
ておりその利用価値は非常に高い。L-アミノ酸は主に微
生物を用いた直接発酵法により生産されているが、N-ア
シル-DL-アミノ酸をL-アミノアシラーゼによって加水分
解し、L-アミノ酸を生産する光学分割法も知られてお
り、発酵法では製造が困難なL-アミノ酸の工業的生産に
古くから利用されている。このL-アミノアシラーゼは動
物、植物、微生物に広く分布しており、今日までに様々
な生物に由来するL-アミノアシラーゼが精製され、酵素
化学的性質が明らかにされている。また、生体内では多
くのタンパク質のN-末端アミノ酸はN-アセチル化されて
いると考えられている。L-アミノアシラーゼはタンパク
質の分解によって生じたN-アセチル-アミノ酸をアミノ
酸に再生する機能をもつと考えられている。また、L-ア
ミノアシラ−ゼの中でもN-アシル-L-グルタミン酸に作
用するアシラーゼはアルギニンの生合成に関与している
と考えられている（Fruh,H.,Leisinger,T.:J.Gen.,125,
pp1(1981)）。
【０００４】一方、D-アミノ酸は非タンパク性アミノ酸
であるため長い間興味の対象外であった。天然では、D-
アミノ酸の存在は小さな環状ペプチドまたは細菌細胞壁
のペプチドグリカン、ペプチド系抗生物質に限られてい
た。しかしながら、神経ペプチドの構成成分、歯のエナ
メル質、目の水晶体や脳のタンパク質中に結合型として
存在することが明らかにされ、D-アミノ酸の生理的意義
の解明、酵素法によるD-アミノ酸の合成法などが研究さ
れている。DL-アミノ酸の分割は、現在、物理化学的、
化学的、酵素的方法で行われているが酵素的方法が最も
簡便であり、酵素法の一つにL-アミノアシラーゼを固定
化したバイオリアクターを用いてN-アセチル-DL-メチオ
ニンから、L-メチオニンを連続生産する方法が工業化さ
れている。D-アミノ酸を生産する方法の一つにヒダント
イナーゼを用いる方法がある。この方法はアルデヒド類
似物から安価に合成されるD,L-5位置換ヒダントインを
出発物質として、D-特異的なヒダントイナーゼによるD-
カルバミル誘導体化、それに続くD-アミノ酸カルバミラ
ーゼによる2段階の酵素的方法で行われている。
であるため長い間興味の対象外であった。天然では、D-
アミノ酸の存在は小さな環状ペプチドまたは細菌細胞壁
のペプチドグリカン、ペプチド系抗生物質に限られてい
た。しかしながら、神経ペプチドの構成成分、歯のエナ
メル質、目の水晶体や脳のタンパク質中に結合型として
存在することが明らかにされ、D-アミノ酸の生理的意義
の解明、酵素法によるD-アミノ酸の合成法などが研究さ
れている。DL-アミノ酸の分割は、現在、物理化学的、
化学的、酵素的方法で行われているが酵素的方法が最も
簡便であり、酵素法の一つにL-アミノアシラーゼを固定
化したバイオリアクターを用いてN-アセチル-DL-メチオ
ニンから、L-メチオニンを連続生産する方法が工業化さ
れている。D-アミノ酸を生産する方法の一つにヒダント
イナーゼを用いる方法がある。この方法はアルデヒド類
似物から安価に合成されるD,L-5位置換ヒダントインを
出発物質として、D-特異的なヒダントイナーゼによるD-
カルバミル誘導体化、それに続くD-アミノ酸カルバミラ
ーゼによる2段階の酵素的方法で行われている。
【０００５】また、この方法とは別にD-アミノアシラー
ゼを用いて、このN-アセチル-DL-アミノ酸を加水分解
し、D-アミノ酸を生産する方法も知られている（Sugie,
M.andSuzuki,H.:Argric.Biol.Chem.,44,pplO89(1980)、
Tsai,Y.C.,Lin,C.S.,Tseng,T.H.,Lee,H.and Wang,Y.J.E
nzyme Microb.Technol.,14,pp384(1992)）。
ゼを用いて、このN-アセチル-DL-アミノ酸を加水分解
し、D-アミノ酸を生産する方法も知られている（Sugie,
M.andSuzuki,H.:Argric.Biol.Chem.,44,pplO89(1980)、
Tsai,Y.C.,Lin,C.S.,Tseng,T.H.,Lee,H.and Wang,Y.J.E
nzyme Microb.Technol.,14,pp384(1992)）。
【０００６】D-アミノアシラーゼは、1952年にkamedaら
が土壌から分離したシュードモナス（Pseudomonas）sp.
KT83に存在することが初めて報告された（Kameda,Y.,To
youra,H.,Kimura,Y.and Yasuda,Y.:Nature,170, pp88
8 (1952)）。この酵素はD-型のフェニルアラニンやチロ
シン、アラニンのN-ベンゾイル誘導体を加水分解した。
その後は、シュードモナス（Pseudomonas）属（ Kubo,
K.,Ishikura,T.and Fukagawa,Y.: J.Antibiot. ,43, pp
550 (1980) 、Kubo,K.,Ishikura,T.and Fukagawa,Y.:J.
Antibiot.,43,pp556(1980)、Kameda,Y.,Hase,T. , Kana
tomo,S.and Kita,Y. : Chem.Pharm.Bull.,26,pp2698(19
78)、Kubo,K.,Ishikura,T.and Fukagawa,Y. : J.Antibi
ot., 43, pp543 (1980)）、ストレプトマイセス（Strep
tomyces）属（ Sugie,M.and Suzuki,H. : Argric.Biol.
Chem. ,42 , ppl07 (1978)、Sugie,M.and Suzuki,H.:Ar
gric.Biol.Chem.,44,pplO89 (1980) ）、アルカリジェ
ネス（Alcaligenes）属（Tsai,Y.C.,Tseng,C.P.,Hsiao,
K.M.and Chen,L.Y., Appl.Environ.Microbiol. ,54, pp
984 (1988)、Yang,Y.B., Hsiao,K.M.,Li,H.,Yano,Y.,Ts
ugita,A.end Tsai,Y.C.:Biosci.Biotech. Biochem.,56,
ppl392 (1992)、Yang,Y.B., Lin,C.S.,Tseng,C.P.,Wan
g,Y.J.and Tsai,Y.C. : Appl.Environ.Microbiol. ,57,
pp2767 (1991)、Tsai,Y.C., Lin,C.S., Tseng,T.H.,Le
e,H.and Wang,Microb.Technol.,14,pp384(1992)、Morig
uchi,M.and Ideta,K.: Appl.Environ.Microbiol. , 54,
pp2767 (1988)、Sakai,K.,Imamura,K.,Sonoda,Y.,Kido,
H.and Moriguchi,M.: FEBS,289,pp44(1991)、Sakai,K.,
Obata,T.,Ideta,K.and Moriguchi,M.:J.Ferment.Bioen
g.,71,pp79(1991)、Sakai,K., Oshima,K.and Moriguch
i,M.: Appl.Environ.Microbiol. 57,pp2540 (1991)、Mo
riguchi,M.,Sakai,K.,Katsuno,Y. , Maki,T.and Wakaya
ma,M. Biosci.Biotech.Biochem.,57, ppll45(1993)）、
Wakayama,M. ,Ashika,T. ,Miyamoto,Y. , Yoshikawa,T.
,Sonoda,Y. , Sakai,K.end Moriguchi,M. : J.Bioche
m.118 pp204 (1995)）、Moriguchi,M. , Sakai,K. , Mi
yamoto,Y.and Wakayama,M. : Biosci.Biotech.Biochem.
,57, ppl149(1993)）由来のD-アミノアシラーゼが報告
されている。
が土壌から分離したシュードモナス（Pseudomonas）sp.
KT83に存在することが初めて報告された（Kameda,Y.,To
youra,H.,Kimura,Y.and Yasuda,Y.:Nature,170, pp88
8 (1952)）。この酵素はD-型のフェニルアラニンやチロ
シン、アラニンのN-ベンゾイル誘導体を加水分解した。
その後は、シュードモナス（Pseudomonas）属（ Kubo,
K.,Ishikura,T.and Fukagawa,Y.: J.Antibiot. ,43, pp
550 (1980) 、Kubo,K.,Ishikura,T.and Fukagawa,Y.:J.
Antibiot.,43,pp556(1980)、Kameda,Y.,Hase,T. , Kana
tomo,S.and Kita,Y. : Chem.Pharm.Bull.,26,pp2698(19
78)、Kubo,K.,Ishikura,T.and Fukagawa,Y. : J.Antibi
ot., 43, pp543 (1980)）、ストレプトマイセス（Strep
tomyces）属（ Sugie,M.and Suzuki,H. : Argric.Biol.
Chem. ,42 , ppl07 (1978)、Sugie,M.and Suzuki,H.:Ar
gric.Biol.Chem.,44,pplO89 (1980) ）、アルカリジェ
ネス（Alcaligenes）属（Tsai,Y.C.,Tseng,C.P.,Hsiao,
K.M.and Chen,L.Y., Appl.Environ.Microbiol. ,54, pp
984 (1988)、Yang,Y.B., Hsiao,K.M.,Li,H.,Yano,Y.,Ts
ugita,A.end Tsai,Y.C.:Biosci.Biotech. Biochem.,56,
ppl392 (1992)、Yang,Y.B., Lin,C.S.,Tseng,C.P.,Wan
g,Y.J.and Tsai,Y.C. : Appl.Environ.Microbiol. ,57,
pp2767 (1991)、Tsai,Y.C., Lin,C.S., Tseng,T.H.,Le
e,H.and Wang,Microb.Technol.,14,pp384(1992)、Morig
uchi,M.and Ideta,K.: Appl.Environ.Microbiol. , 54,
pp2767 (1988)、Sakai,K.,Imamura,K.,Sonoda,Y.,Kido,
H.and Moriguchi,M.: FEBS,289,pp44(1991)、Sakai,K.,
Obata,T.,Ideta,K.and Moriguchi,M.:J.Ferment.Bioen
g.,71,pp79(1991)、Sakai,K., Oshima,K.and Moriguch
i,M.: Appl.Environ.Microbiol. 57,pp2540 (1991)、Mo
riguchi,M.,Sakai,K.,Katsuno,Y. , Maki,T.and Wakaya
ma,M. Biosci.Biotech.Biochem.,57, ppll45(1993)）、
Wakayama,M. ,Ashika,T. ,Miyamoto,Y. , Yoshikawa,T.
,Sonoda,Y. , Sakai,K.end Moriguchi,M. : J.Bioche
m.118 pp204 (1995)）、Moriguchi,M. , Sakai,K. , Mi
yamoto,Y.and Wakayama,M. : Biosci.Biotech.Biochem.
,57, ppl149(1993)）由来のD-アミノアシラーゼが報告
されている。
【０００７】また、TsaiらやMoriguchiらは、アルカリ
ジェネス（Alcaligenes）属とシュードモナス（Pseudom
onas）属の細菌由来のD-アミノアシラーゼの性質を明ら
かにし、さらに酵素タンパクのアミノ酸配列や遺伝子の
配列も明らかにしている。Moriguchiらは、アルカリジ
ェネス （Alcaligenes）属とシュードモナス（Pseudomo
nas）属の細菌が、誘導物質をかえることによって三種
のD-アミノアシラーゼ類を見いだしている（Wakayama,
M.,Katsuno,Y.,Hayashi,S.,Miyamoto,Y.,Sakai,K.and M
origuchi,M. : Biosci.Biotech.Biochem. , 59,pp2115
(1995)）。
ジェネス（Alcaligenes）属とシュードモナス（Pseudom
onas）属の細菌由来のD-アミノアシラーゼの性質を明ら
かにし、さらに酵素タンパクのアミノ酸配列や遺伝子の
配列も明らかにしている。Moriguchiらは、アルカリジ
ェネス （Alcaligenes）属とシュードモナス（Pseudomo
nas）属の細菌が、誘導物質をかえることによって三種
のD-アミノアシラーゼ類を見いだしている（Wakayama,
M.,Katsuno,Y.,Hayashi,S.,Miyamoto,Y.,Sakai,K.and M
origuchi,M. : Biosci.Biotech.Biochem. , 59,pp2115
(1995)）。
【０００８】さらに、Moriguchiらはアルカリジェネス
（Alcaligenes）属のこれらのD-アミノアシラ−ゼ類の
遺伝子配列を決定し、バシルス・ステレオサーモフィラ
ス（Bacillus stereothermophilus）や人、ブタに由来
するL-アミノアシラーゼと比較している。その結果、こ
れらのD-アミノアシラーゼ類はL-アミノアシラーゼとは
類似性が低いことを報告している（Wakayama,M.,Katsun
o,Y.,Hayashi,S.,Miyamoto,Y.,Sakai,K.and Moriguchi,
M.:Biosci.Biotech.Biochem.,59,pp2115(1995)）。
（Alcaligenes）属のこれらのD-アミノアシラ−ゼ類の
遺伝子配列を決定し、バシルス・ステレオサーモフィラ
ス（Bacillus stereothermophilus）や人、ブタに由来
するL-アミノアシラーゼと比較している。その結果、こ
れらのD-アミノアシラーゼ類はL-アミノアシラーゼとは
類似性が低いことを報告している（Wakayama,M.,Katsun
o,Y.,Hayashi,S.,Miyamoto,Y.,Sakai,K.and Moriguchi,
M.:Biosci.Biotech.Biochem.,59,pp2115(1995)）。
【０００９】一方、放線菌ではSugieら（Sugie,M.and S
uzuki,H.:Argric.Biol.Chem.,42,pplO7(1978)、Sugie,
M.and Suzuki,H.:Argric.Biol.Chem.,44,pplO89(198
0)）がストレプトマイセス（Streptomyces）属にD-アミ
ノアシラーゼを見いだし報告しているが、酵素は未精製
でありその性質は解明されていない。
uzuki,H.:Argric.Biol.Chem.,42,pplO7(1978)、Sugie,
M.and Suzuki,H.:Argric.Biol.Chem.,44,pplO89(198
0)）がストレプトマイセス（Streptomyces）属にD-アミ
ノアシラーゼを見いだし報告しているが、酵素は未精製
でありその性質は解明されていない。
【００１０】このように細菌については、複数のD-アミ
ノアシラーゼが単離され、現在、これらを利用したD-ア
ミノ酸の製造が試みられている。しかしながら、従来の
細菌を利用したD-アミノ酸の製造には、以下のような問
題点があった。
ノアシラーゼが単離され、現在、これらを利用したD-ア
ミノ酸の製造が試みられている。しかしながら、従来の
細菌を利用したD-アミノ酸の製造には、以下のような問
題点があった。
【００１１】従来の細菌のD-アミノアシラーゼの多くが
誘導酵素であり、その製造には通常N-アセチル-DL-アミ
ノ酸を必要としていたため、D-アミノアシラーゼの製造
に用いる細菌の培養液中には未反応のN-アセチル-D-ア
ミノ酸および分解を受けたD-アミノ酸が含まれていた。
このため、誘導源として用いたN-アセチル-D-アミノ酸
以外の基質に対してこれら細菌が生産するD-アミノアシ
ラーゼを作用させる場合には、培養液から培養菌体をい
ったん除菌する必要があった。また、誘導源として用い
たN-アセチル-D-アミノ酸と同じ基質に対して作用させ
る場合であっても、生成したD-アミノ酸を精製する際に
は、同様の除菌処理が必要であった。これら菌体培養後
の集菌作業においては、通常、ウェストファリアー、シ
ャープレスなどの連続遠心分離機が用いられていた。し
かしながら、遠心分離においては、培養液量の増大に伴
って、作業時間が長大になり、作業過程においてD-アミ
ノアシラーゼ活性の失活を招くことがある等の問題点が
あった。また、細菌や放線菌由来の菌体は反応経過とと
もに溶菌するため、遠心分離自体が困難であるという問
題点もあった。このため、従来の細菌のD-アミノアシラ
ーゼを利用した場合には、効率的なD-アミノ酸の製造が
困難な場合があった。
誘導酵素であり、その製造には通常N-アセチル-DL-アミ
ノ酸を必要としていたため、D-アミノアシラーゼの製造
に用いる細菌の培養液中には未反応のN-アセチル-D-ア
ミノ酸および分解を受けたD-アミノ酸が含まれていた。
このため、誘導源として用いたN-アセチル-D-アミノ酸
以外の基質に対してこれら細菌が生産するD-アミノアシ
ラーゼを作用させる場合には、培養液から培養菌体をい
ったん除菌する必要があった。また、誘導源として用い
たN-アセチル-D-アミノ酸と同じ基質に対して作用させ
る場合であっても、生成したD-アミノ酸を精製する際に
は、同様の除菌処理が必要であった。これら菌体培養後
の集菌作業においては、通常、ウェストファリアー、シ
ャープレスなどの連続遠心分離機が用いられていた。し
かしながら、遠心分離においては、培養液量の増大に伴
って、作業時間が長大になり、作業過程においてD-アミ
ノアシラーゼ活性の失活を招くことがある等の問題点が
あった。また、細菌や放線菌由来の菌体は反応経過とと
もに溶菌するため、遠心分離自体が困難であるという問
題点もあった。このため、従来の細菌のD-アミノアシラ
ーゼを利用した場合には、効率的なD-アミノ酸の製造が
困難な場合があった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の細菌
や放射菌以外の微生物を利用した、効率的なD-アミノ酸
の製造方法を提供することを課題とする。
や放射菌以外の微生物を利用した、効率的なD-アミノ酸
の製造方法を提供することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、真核細胞であり、動植物と共通の細
胞構造（真核性）と多くの細胞の化学属性および機能を
持っているかびが、細胞が大きくかつ形状が糸状であ
るという特性を有するため、液体培養をした場合に培養
後の菌体を採取し易く、ろ過で分離可能である、高い
炭素／窒素比の原料で、より早く生育でき、炭水化物の
利用効率が高いため、酵素当たりの醗酵原料が安価にな
る、固体培養法で培養できるため、液体培養法に比べ
て設備投資がはるかに少なく、また通気も自然状態で行
われ、高濃度の酵素抽出液を得ることができ、酵素回収
に要する有機溶媒も少なく済む等、経済的に培養を行う
ことができる、培地の活性水分が低く保たれている固
定培養において、良く生育できるため、活性水分が少な
いと生育し難い雑菌（細菌）の汚染が起こりにくい、
でんぷん分解能、セルロース分解能、たんぱく分解能に
優れていることが多いため、培養原料として、安価なキ
ャサバ等のでんぷん資源、ふすま、米、米糠、麦類、大
豆、セルロース資源などを用いることができる、という
多くの利点を有することに着目し、かびを利用したD-ア
ミノ酸の製造を試みた。
を解決するために、真核細胞であり、動植物と共通の細
胞構造（真核性）と多くの細胞の化学属性および機能を
持っているかびが、細胞が大きくかつ形状が糸状であ
るという特性を有するため、液体培養をした場合に培養
後の菌体を採取し易く、ろ過で分離可能である、高い
炭素／窒素比の原料で、より早く生育でき、炭水化物の
利用効率が高いため、酵素当たりの醗酵原料が安価にな
る、固体培養法で培養できるため、液体培養法に比べ
て設備投資がはるかに少なく、また通気も自然状態で行
われ、高濃度の酵素抽出液を得ることができ、酵素回収
に要する有機溶媒も少なく済む等、経済的に培養を行う
ことができる、培地の活性水分が低く保たれている固
定培養において、良く生育できるため、活性水分が少な
いと生育し難い雑菌（細菌）の汚染が起こりにくい、
でんぷん分解能、セルロース分解能、たんぱく分解能に
優れていることが多いため、培養原料として、安価なキ
ャサバ等のでんぷん資源、ふすま、米、米糠、麦類、大
豆、セルロース資源などを用いることができる、という
多くの利点を有することに着目し、かびを利用したD-ア
ミノ酸の製造を試みた。
【００１４】これまでにD-アミノアシラーゼを生産する
かびは報告されていないため、本発明者らは、まず、D-
アミノアシラーゼを生産するかびの探索を行い、ヒポミ
セス（Hypomyces）属、フザリウム(Fusarium)属、オー
リクラリア(Auricularia)属、フィシウム(Pythium)属お
よびメニスポロプシス(Menisporopsis)属に属する多く
のかびが、N-アセチル-D-アミノ酸からD-アミノ酸を生
産する能力、即ち、D-アミノアシラーゼ活性を有するこ
とを見出した。
かびは報告されていないため、本発明者らは、まず、D-
アミノアシラーゼを生産するかびの探索を行い、ヒポミ
セス（Hypomyces）属、フザリウム(Fusarium)属、オー
リクラリア(Auricularia)属、フィシウム(Pythium)属お
よびメニスポロプシス(Menisporopsis)属に属する多く
のかびが、N-アセチル-D-アミノ酸からD-アミノ酸を生
産する能力、即ち、D-アミノアシラーゼ活性を有するこ
とを見出した。
【００１５】次いで、本発明者らは、硫安塩析や種々の
クロマトグラフィーを行うことにより、D-アミノアシラ
ーゼ活性が検出されたかびから、D-アミノアシラーゼを
分離し、精製することに成功した。さらに、本発明者ら
は、精製したD-アミノアシラーゼにつき、その基質特異
性や温度安定性などの種々の理化学的性質の検出を行
い、かび由来のD-アミノアシラーゼを適当な条件下でN-
アセチル-D-アミノ酸に作用させることにより、効率的
にD-アミノ酸を製造することが可能であることを見出し
た。
クロマトグラフィーを行うことにより、D-アミノアシラ
ーゼ活性が検出されたかびから、D-アミノアシラーゼを
分離し、精製することに成功した。さらに、本発明者ら
は、精製したD-アミノアシラーゼにつき、その基質特異
性や温度安定性などの種々の理化学的性質の検出を行
い、かび由来のD-アミノアシラーゼを適当な条件下でN-
アセチル-D-アミノ酸に作用させることにより、効率的
にD-アミノ酸を製造することが可能であることを見出し
た。
【００１６】即ち、本発明者らは、これまで細菌や放線
菌という原核生物しか見出されていなかったD-アミノア
シラーゼを、真核生物であるかびにおいて初めて見出
し、さらに、かびの産生するD-アミノアシラーゼを利用
してD-アミノ酸を製造することが可能であることを初め
て見出した。
菌という原核生物しか見出されていなかったD-アミノア
シラーゼを、真核生物であるかびにおいて初めて見出
し、さらに、かびの産生するD-アミノアシラーゼを利用
してD-アミノ酸を製造することが可能であることを初め
て見出した。
【００１７】従って、本発明は、かびの産生するD-アミ
ノアシラーゼ、該D-アミノアシラーゼの製造方法、およ
び該D-アミノアシラーゼを利用したD-アミノ酸の製造方
法に関し、より具体的には、（１） かび由来のD-アミ
ノアシラーゼ、（２） かびがヒポミセス（Hypomyce
s）、フザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricula
ria)、フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属からなる群より選択される属に属する、
（１）に記載のD-アミノアシラーゼ、（３） ヒポミセ
ス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセス・アウラ
ンチアス(Hypomyces aurantius)種、ヒポミセス・ブル
ーメアナス(Hypomyces broomeanus)種、ヒポミセス・ク
リソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)種、ヒポミ
セス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種、ヒポミセス・
セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)種、ヒポミセ
ス・スビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)種、ま
たはヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）種であり、フザリウム(Fusarium)属に属するかびが
フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種であり、オー
リクラリア(Auricularia)属に属するかびがオーリクラ
リア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auriculajud
ae)種であり、フィシウム(Pythium)属に属するかびがフ
ィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatu
m)種であり、メニスポロプシス(Menisporopsis)属に属
するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランディア(Men
isporopsis novaezelandiae)種である、（２）に記載の
D-アミノアシラーゼ、（４） ヒポミセス・アウランチ
アス(Hypomyces aurantius)種に属するかびがヒポミセ
ス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)IFO6847株
であり、ヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broom
eanus)種に属するかびがヒポミセス・ブルーメアナス(H
ypomyces broomeanus)IFO9164株であり、ヒポミセス・
ロセラス(Hypomyces rosellus)種に属するかびがヒポミ
セス・ロセラス(Hypomyces rosellus)IFO6911株、ヒポ
ミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)
種に属するかびがヒポミセス・クリソスペルムス(Hypom
yces chrysospermus)IFO6817株であり、ヒポミセス・セ
プルクラリス(Hypomyces sepulcralis)種に属するかび
がヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcrali
s)IFO9102株であり、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hy
pomyces subiculosus)種に属するかびがヒポミセス・ス
ビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)IFO6892株であ
り、ヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）種に属するかびがヒポミセス ミコフィラス（Hypomy
ces mycophilus）ATCC76474株またはIFO 6785株であ
り、フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種に属する
かびがフザリウム・ソラニ(Fusariumsolani) IFO 9974
株またはIFO 9975株であり、オーリクラリア・オーリ
キュラジュダエ(Auricularia auriculajudae)種に属す
るかびがオーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auric
ularia auriculajudae)IFO5949株であり、フィシウム・
アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatum)種に属す
るかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphan
idermaatum)IFO7030株であり、メニスポロプシス・ノバ
エゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種に属
するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランディア(Men
isporopsis novaezelandiae)IFO9179株である、（３）
に記載のD-アミノアシラーゼ、（５） 下記の(a) から
(f)の理化学的性質を有する、かび由来のD-アミノアシ
ラーゼ、 (a) 作用：N-アセチル-D-アミノ酸に作用して、D-アミ
ノ酸を生じる。
ノアシラーゼ、該D-アミノアシラーゼの製造方法、およ
び該D-アミノアシラーゼを利用したD-アミノ酸の製造方
法に関し、より具体的には、（１） かび由来のD-アミ
ノアシラーゼ、（２） かびがヒポミセス（Hypomyce
s）、フザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricula
ria)、フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属からなる群より選択される属に属する、
（１）に記載のD-アミノアシラーゼ、（３） ヒポミセ
ス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセス・アウラ
ンチアス(Hypomyces aurantius)種、ヒポミセス・ブル
ーメアナス(Hypomyces broomeanus)種、ヒポミセス・ク
リソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)種、ヒポミ
セス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種、ヒポミセス・
セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)種、ヒポミセ
ス・スビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)種、ま
たはヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）種であり、フザリウム(Fusarium)属に属するかびが
フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種であり、オー
リクラリア(Auricularia)属に属するかびがオーリクラ
リア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auriculajud
ae)種であり、フィシウム(Pythium)属に属するかびがフ
ィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatu
m)種であり、メニスポロプシス(Menisporopsis)属に属
するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランディア(Men
isporopsis novaezelandiae)種である、（２）に記載の
D-アミノアシラーゼ、（４） ヒポミセス・アウランチ
アス(Hypomyces aurantius)種に属するかびがヒポミセ
ス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)IFO6847株
であり、ヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broom
eanus)種に属するかびがヒポミセス・ブルーメアナス(H
ypomyces broomeanus)IFO9164株であり、ヒポミセス・
ロセラス(Hypomyces rosellus)種に属するかびがヒポミ
セス・ロセラス(Hypomyces rosellus)IFO6911株、ヒポ
ミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)
種に属するかびがヒポミセス・クリソスペルムス(Hypom
yces chrysospermus)IFO6817株であり、ヒポミセス・セ
プルクラリス(Hypomyces sepulcralis)種に属するかび
がヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcrali
s)IFO9102株であり、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hy
pomyces subiculosus)種に属するかびがヒポミセス・ス
ビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)IFO6892株であ
り、ヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）種に属するかびがヒポミセス ミコフィラス（Hypomy
ces mycophilus）ATCC76474株またはIFO 6785株であ
り、フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種に属する
かびがフザリウム・ソラニ(Fusariumsolani) IFO 9974
株またはIFO 9975株であり、オーリクラリア・オーリ
キュラジュダエ(Auricularia auriculajudae)種に属す
るかびがオーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auric
ularia auriculajudae)IFO5949株であり、フィシウム・
アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatum)種に属す
るかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphan
idermaatum)IFO7030株であり、メニスポロプシス・ノバ
エゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種に属
するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランディア(Men
isporopsis novaezelandiae)IFO9179株である、（３）
に記載のD-アミノアシラーゼ、（５） 下記の(a) から
(f)の理化学的性質を有する、かび由来のD-アミノアシ
ラーゼ、 (a) 作用：N-アセチル-D-アミノ酸に作用して、D-アミ
ノ酸を生じる。
【００１８】(b) 分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル
電気泳動における分子量が約64000Daであり、Superdex2
00 Hi-Load 6/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約56000Da
を示す。
電気泳動における分子量が約64000Daであり、Superdex2
00 Hi-Load 6/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約56000Da
を示す。
【００１９】(c) 基質特異性：N-アセチル-D-トリプト
ファン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-バリン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチ
オニンに作用し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-ア
セチル-L-フェニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-
アセチル-L-ロイシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用
しない。
ファン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-バリン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチ
オニンに作用し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-ア
セチル-L-フェニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-
アセチル-L-ロイシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用
しない。
【００２０】(d) 温度安定性：pH 9.5で30分間熱処理し
た場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
た場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
【００２１】(e) 至適温度：pH 7.5で反応させる場合、
温度約45℃において作用が至適である。
温度約45℃において作用が至適である。
【００２２】(f) 安定化剤：還元剤によって、その活性
が安定に保持され、さらにICH3CONH2で活性化される。
（６） ヒポミセス（Hypomyces）属に属するかびに由
来する（５）のD-アミノアシラーゼ、（７） ヒポミセ
ス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセス・ミコフ
ィラス（Hypomyces mycophilus）種である（６）記載の
D-アミノアシラーゼ、（８） ヒポミセス・ミコフィラ
ス（Hypomyces mycophilus）種に属するかびがヒポミセ
ス ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株
またはIFO 6785株である（７）記載のD-アミノアシラー
ゼ、（９） 配列番号：１から５に記載のアミノ酸配列
を含む、（５）から（８）のいずれかに記載のD-アミノ
アシラーゼ、（１０） （５）から（９）のいずれか記
載のD-アミノアシラーゼをコードするDNA、（１１） D
-アミノアシラーゼ生産能を有するかびを、下記式（I）
が安定に保持され、さらにICH3CONH2で活性化される。
（６） ヒポミセス（Hypomyces）属に属するかびに由
来する（５）のD-アミノアシラーゼ、（７） ヒポミセ
ス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセス・ミコフ
ィラス（Hypomyces mycophilus）種である（６）記載の
D-アミノアシラーゼ、（８） ヒポミセス・ミコフィラ
ス（Hypomyces mycophilus）種に属するかびがヒポミセ
ス ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株
またはIFO 6785株である（７）記載のD-アミノアシラー
ゼ、（９） 配列番号：１から５に記載のアミノ酸配列
を含む、（５）から（８）のいずれかに記載のD-アミノ
アシラーゼ、（１０） （５）から（９）のいずれか記
載のD-アミノアシラーゼをコードするDNA、（１１） D
-アミノアシラーゼ生産能を有するかびを、下記式（I）
【００２３】
【化２】 （式中、R1、R2は、同一または異なっていてもよい、水
素原子または置換基を有していてもよい炭化水素基を示
す。ただし、R2は水素原子ではない。また、XはH、NH
4、金属原子）で表されるN-アシル-DL-アミノ酸または
その塩に作用させることを特徴とする、D-アミノ酸の製
造方法、（１２） かび由来のD-アミノアシラーゼを、
上記式（I）で表されるN-アシル-DL-アミノ酸およびそ
の塩に作用させることを特徴とする、D-アミノ酸の製造
方法、（１３） かびがヒポミセス（Hypomyces）、フ
ザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricularia)、
フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属からなる群より選択される属に属する、（１１）ま
たは（１２）に記載のD-アミノ酸の製造方法、（１４）
ヒポミセス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセ
ス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種、ヒポミ
セス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種、ヒポ
ミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)
種、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種、ヒ
ポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)
種、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subicul
osus)種、またはヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces
mycophilus）種であり、フザリウム(Fusarium)属に属
するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種で
あり、オーリクラリア(Auricularia)属に属するかびが
オーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia a
uriculajudae)種であり、フィシウム(Pythium)属に属す
るかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphan
idermaatum)種であり、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属に属するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランデ
ィア(Menisporopsis novaezelandiae)種である、（１
３）に記載のD-アミノ酸の製造方法、（１５） ヒポミ
セス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種に属す
るかびがヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces aura
ntius)IFO6847株であり、ヒポミセス・ブルーメアナス
(Hypomyces broomeanus)種に属するかびがヒポミセス・
ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)IFO9164株であ
り、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種に属
するかびがヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)
IFO6911株、ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces
chrysospermus)種に属するかびがヒポミセス・クリソス
ペルムス(Hypomyces chrysospermus)IFO6817株であり、
ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)
種に属するかびがヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyc
es sepulcralis)IFO9102株であり、ヒポミセス・スビキ
ュロスアス(Hypomyces subiculosus)種に属するかびが
ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subiculosu
s)IFO6892株であり、ヒポミセス・ミコフィラス（Hypom
yces mycophilus）種に属するかびがヒポミセス ミコフ
ィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはIFO
6785株であり、フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)
種に属するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium solan
i) IFO 9974 株またはIFO 9975株であり、オーリクラ
リア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auriculajud
ae)種に属するかびがオーリクラリア・オーリキュラジ
ュダエ(Auricularia auriculajudae)IFO5949株であり、
フィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaat
um)種に属するかびがフィシウム・アハニデルマタム(Py
thium aphanidermaatum)IFO7030株であり、メニスポロ
プシス・ノバエゼランディア(Menisporopsis novaezela
ndiae)種に属するかびがメニスポロプシス・ノバエゼラ
ンディア(Menisporopsis novaezelandiae)IFO9179株で
ある、（１４）記載のD-アミノ酸の製造方法、（１６）
D-アミノアシラーゼが下記の(a) から(f)の理化学的
性質を有する、（１１）または（１２）に記載のD-アミ
ノ酸の製造方法、 (a) 作用：N-アセチル-D-アミノ酸に作用して、D-アミ
ノ酸を生じる。
素原子または置換基を有していてもよい炭化水素基を示
す。ただし、R2は水素原子ではない。また、XはH、NH
4、金属原子）で表されるN-アシル-DL-アミノ酸または
その塩に作用させることを特徴とする、D-アミノ酸の製
造方法、（１２） かび由来のD-アミノアシラーゼを、
上記式（I）で表されるN-アシル-DL-アミノ酸およびそ
の塩に作用させることを特徴とする、D-アミノ酸の製造
方法、（１３） かびがヒポミセス（Hypomyces）、フ
ザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricularia)、
フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属からなる群より選択される属に属する、（１１）ま
たは（１２）に記載のD-アミノ酸の製造方法、（１４）
ヒポミセス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセ
ス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種、ヒポミ
セス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種、ヒポ
ミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)
種、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種、ヒ
ポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)
種、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subicul
osus)種、またはヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces
mycophilus）種であり、フザリウム(Fusarium)属に属
するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種で
あり、オーリクラリア(Auricularia)属に属するかびが
オーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia a
uriculajudae)種であり、フィシウム(Pythium)属に属す
るかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphan
idermaatum)種であり、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属に属するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランデ
ィア(Menisporopsis novaezelandiae)種である、（１
３）に記載のD-アミノ酸の製造方法、（１５） ヒポミ
セス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種に属す
るかびがヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces aura
ntius)IFO6847株であり、ヒポミセス・ブルーメアナス
(Hypomyces broomeanus)種に属するかびがヒポミセス・
ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)IFO9164株であ
り、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種に属
するかびがヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)
IFO6911株、ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces
chrysospermus)種に属するかびがヒポミセス・クリソス
ペルムス(Hypomyces chrysospermus)IFO6817株であり、
ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)
種に属するかびがヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyc
es sepulcralis)IFO9102株であり、ヒポミセス・スビキ
ュロスアス(Hypomyces subiculosus)種に属するかびが
ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subiculosu
s)IFO6892株であり、ヒポミセス・ミコフィラス（Hypom
yces mycophilus）種に属するかびがヒポミセス ミコフ
ィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはIFO
6785株であり、フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)
種に属するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium solan
i) IFO 9974 株またはIFO 9975株であり、オーリクラ
リア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auriculajud
ae)種に属するかびがオーリクラリア・オーリキュラジ
ュダエ(Auricularia auriculajudae)IFO5949株であり、
フィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaat
um)種に属するかびがフィシウム・アハニデルマタム(Py
thium aphanidermaatum)IFO7030株であり、メニスポロ
プシス・ノバエゼランディア(Menisporopsis novaezela
ndiae)種に属するかびがメニスポロプシス・ノバエゼラ
ンディア(Menisporopsis novaezelandiae)IFO9179株で
ある、（１４）記載のD-アミノ酸の製造方法、（１６）
D-アミノアシラーゼが下記の(a) から(f)の理化学的
性質を有する、（１１）または（１２）に記載のD-アミ
ノ酸の製造方法、 (a) 作用：N-アセチル-D-アミノ酸に作用して、D-アミ
ノ酸を生じる。
【００２４】(b) 分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル
電気泳動における分子量が約64000Daであり、Superdex2
00 Hi-Load 6/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約56000Da
を示す。
電気泳動における分子量が約64000Daであり、Superdex2
00 Hi-Load 6/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約56000Da
を示す。
【００２５】(c) 基質特異性：N-アセチル-D-トリプト
ファン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-バリン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチ
オニンに作用し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-ア
セチル-L-フェニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-
アセチル-L-ロイシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用
しない。
ファン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-バリン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチ
オニンに作用し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-ア
セチル-L-フェニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-
アセチル-L-ロイシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用
しない。
【００２６】(d) 温度安定性：pH 9.5で30分間熱処理し
た場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
た場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
【００２７】(e) 至適温度：pH 7.5で反応させる場合、
温度約45℃において作用が至適である。
温度約45℃において作用が至適である。
【００２８】(f) 安定化剤：還元剤によって、その活性
が安定に保持され、さらにICH3CONH2で活性化される。
（１７） D-アミノアシラーゼがヒポミセス（Hypomyce
s）属に属するかびに由来する、（１６）記載のD-アミ
ノ酸の製造方法、（１８） ヒポミセス（Hypomyces）
属に属するかびがヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyce
s mycophilus）種である、（１７）記載のD-アミノ酸の
製造方法、（１９） ヒポミセス・ミコフィラス（Hypo
myces mycophilus）種に属するかびがヒポミセス ミコ
フィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはI
FO 6785株である、（１８）記載のD-アミノ酸の製造方
法、（２０） D-アミノアシラーゼが配列番号：１から
５に記載のアミノ酸配列を含む、（１６）から（１９）
のいずれかに記載のD-アミノ酸の製造方法、（２１）
上記式（I）においてR1、R2が、同一または異なってい
てもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、
シクロアルキル基、アリル基、もしくはアラルキル基ま
たはそれらの誘導体である、（１１）から（２０）のい
ずれかに記載のD-アミノ酸の製造方法、（２２） R2が
メチル基、クロロメチル基、フェニル基またはアミノメ
チル基であり、R1がインドリル基（N-アシル-DL-トリプ
トファン）、ベンジル基（N-アシル-DL-フェニルアラニ
ン）、チオメチルエチル基（N-アシル-DL-メチオニ
ン）、イソプロピル基（N-アシル-DL-バリン）、または
2-メチル-プロピル基（N-アシル-DL-ロイシン）であ
る、（２１）に記載のD-アミノ酸の製造方法、（２３）
かびを培養することを特徴とする、D-アミノアシラー
ゼの製造方法、（２４） かびがヒポミセス（Hypomyce
s）、フザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricula
ria)、フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属からなる群より選択される属に属する、（２
３）記載のD-アミノアシラーゼの製造方法、（２５）
ヒポミセス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセス
・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種、ヒポミセ
ス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種、ヒポミ
セス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)
種、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種、ヒ
ポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)
種、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subicul
osus)種、またはヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces
mycophilus）種であり、フザリウム(Fusarium)属に属
するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種で
あり、オーリクラリア(Auricularia)属に属するかびが
オーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia a
uriculajudae)種であり、フィシウム(Pythium)属に属す
るかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphan
idermaatum)種であり、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属に属するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランデ
ィア(Menisporopsis novaezelandiae)種である、（２
４）記載のD-アミノアシラーゼの製造方法、（２６）
ヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種
に属するかびがヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces
aurantius)IFO6847株であり、ヒポミセス・ブルーメ
アナス(Hypomyces broomeanus)種に属するかびがヒポミ
セス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)IFO9164
株であり、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)
種に属するかびがヒポミセス・ロセラス(Hypomyces ros
ellus)IFO6911株、ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypo
myces chrysospermus)種に属するかびがヒポミセス・ク
リソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)IFO6817株で
あり、ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcr
alis)種に属するかびがヒポミセス・セプルクラリス(Hy
pomyces sepulcralis)IFO9102株であり、ヒポミセス・
スビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)種に属する
かびがヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subic
ulosus)IFO6892株であり、ヒポミセス・ミコフィラス
（Hypomyces mycophilus）種に属するかびがヒポミセス
ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株ま
たはIFO 6785株であり、フザリウム・ソラニ(Fusarium
solani)種に属するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium
solani) IFO 9974 株またはIFO 9975株であり、オー
リクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auric
ulajudae)種に属するかびがオーリクラリア・オーリキ
ュラジュダエ(Auricularia auriculajudae)IFO5949株で
あり、フィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphanid
ermaatum)種に属するかびがフィシウム・アハニデルマ
タム(Pythium aphanidermaatum)IFO7030株であり、メニ
スポロプシス・ノバエゼランディア(Menisporopsis nov
aezelandiae)種に属するかびがメニスポロプシス・ノバ
エゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)IFO917
9株である、（２５）記載のD-アミノアシラーゼの製造
方法、に関する。
が安定に保持され、さらにICH3CONH2で活性化される。
（１７） D-アミノアシラーゼがヒポミセス（Hypomyce
s）属に属するかびに由来する、（１６）記載のD-アミ
ノ酸の製造方法、（１８） ヒポミセス（Hypomyces）
属に属するかびがヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyce
s mycophilus）種である、（１７）記載のD-アミノ酸の
製造方法、（１９） ヒポミセス・ミコフィラス（Hypo
myces mycophilus）種に属するかびがヒポミセス ミコ
フィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはI
FO 6785株である、（１８）記載のD-アミノ酸の製造方
法、（２０） D-アミノアシラーゼが配列番号：１から
５に記載のアミノ酸配列を含む、（１６）から（１９）
のいずれかに記載のD-アミノ酸の製造方法、（２１）
上記式（I）においてR1、R2が、同一または異なってい
てもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、
シクロアルキル基、アリル基、もしくはアラルキル基ま
たはそれらの誘導体である、（１１）から（２０）のい
ずれかに記載のD-アミノ酸の製造方法、（２２） R2が
メチル基、クロロメチル基、フェニル基またはアミノメ
チル基であり、R1がインドリル基（N-アシル-DL-トリプ
トファン）、ベンジル基（N-アシル-DL-フェニルアラニ
ン）、チオメチルエチル基（N-アシル-DL-メチオニ
ン）、イソプロピル基（N-アシル-DL-バリン）、または
2-メチル-プロピル基（N-アシル-DL-ロイシン）であ
る、（２１）に記載のD-アミノ酸の製造方法、（２３）
かびを培養することを特徴とする、D-アミノアシラー
ゼの製造方法、（２４） かびがヒポミセス（Hypomyce
s）、フザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricula
ria)、フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属からなる群より選択される属に属する、（２
３）記載のD-アミノアシラーゼの製造方法、（２５）
ヒポミセス（Hypomyces）属に属するかびがヒポミセス
・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種、ヒポミセ
ス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種、ヒポミ
セス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)
種、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)種、ヒ
ポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)
種、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subicul
osus)種、またはヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces
mycophilus）種であり、フザリウム(Fusarium)属に属
するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種で
あり、オーリクラリア(Auricularia)属に属するかびが
オーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia a
uriculajudae)種であり、フィシウム(Pythium)属に属す
るかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphan
idermaatum)種であり、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属に属するかびがメニスポロプシス・ノバエゼランデ
ィア(Menisporopsis novaezelandiae)種である、（２
４）記載のD-アミノアシラーゼの製造方法、（２６）
ヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces aurantius)種
に属するかびがヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces
aurantius)IFO6847株であり、ヒポミセス・ブルーメ
アナス(Hypomyces broomeanus)種に属するかびがヒポミ
セス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)IFO9164
株であり、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rosellus)
種に属するかびがヒポミセス・ロセラス(Hypomyces ros
ellus)IFO6911株、ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypo
myces chrysospermus)種に属するかびがヒポミセス・ク
リソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)IFO6817株で
あり、ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcr
alis)種に属するかびがヒポミセス・セプルクラリス(Hy
pomyces sepulcralis)IFO9102株であり、ヒポミセス・
スビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)種に属する
かびがヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subic
ulosus)IFO6892株であり、ヒポミセス・ミコフィラス
（Hypomyces mycophilus）種に属するかびがヒポミセス
ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株ま
たはIFO 6785株であり、フザリウム・ソラニ(Fusarium
solani)種に属するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium
solani) IFO 9974 株またはIFO 9975株であり、オー
リクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auric
ulajudae)種に属するかびがオーリクラリア・オーリキ
ュラジュダエ(Auricularia auriculajudae)IFO5949株で
あり、フィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphanid
ermaatum)種に属するかびがフィシウム・アハニデルマ
タム(Pythium aphanidermaatum)IFO7030株であり、メニ
スポロプシス・ノバエゼランディア(Menisporopsis nov
aezelandiae)種に属するかびがメニスポロプシス・ノバ
エゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)IFO917
9株である、（２５）記載のD-アミノアシラーゼの製造
方法、に関する。
【００２９】なお、本発明において、「D-アミノアシラ
ーゼ」とは、N-アシル-D-アミノ酸に作用して、有機酸
およびD-アミノ酸の生成を触媒する酵素をさす。
ーゼ」とは、N-アシル-D-アミノ酸に作用して、有機酸
およびD-アミノ酸の生成を触媒する酵素をさす。
【００３０】
【発明の実施の形態】本発明のかび由来のD-アミノアシ
ラーゼは、かびの培養によりかびに生産させて調製する
ことができる。D-アミノアシラーゼの調製に用いられる
かびとしては、D-アミノアシラーゼ産生能を有すれば特
に制限はない。D-アミノアシラーゼ産生能を有するかび
としては、例えば、ヒポミセス（Hypomyces）属、フザ
リウム(Fusarium)属、オーリクラリア(Auricularia)
属、フィシウム(Pythium)属、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属に属するかびが挙げられるが、これらに制限
されない。
ラーゼは、かびの培養によりかびに生産させて調製する
ことができる。D-アミノアシラーゼの調製に用いられる
かびとしては、D-アミノアシラーゼ産生能を有すれば特
に制限はない。D-アミノアシラーゼ産生能を有するかび
としては、例えば、ヒポミセス（Hypomyces）属、フザ
リウム(Fusarium)属、オーリクラリア(Auricularia)
属、フィシウム(Pythium)属、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属に属するかびが挙げられるが、これらに制限
されない。
【００３１】ヒポミセス（Hypomyces）属に属するかび
としては、例えば、ヒポミセス・アウランチアス(Hypom
yces aurantius)種、ヒポミセス・ブルーメアナス(Hyp
omyces broomeanus)種、ヒポミセス・クリソスペルムス
(Hypomyces chrysospermus)種、ヒポミセス・ロセラス
(Hypomyces rosellus)種、ヒポミセス・セプルクラリス
(Hypomyces sepulcralis)種、ヒポミセス・スビキュロ
スアス(Hypomyces subiculosus)種、またはヒポミセス
・ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）種のかびが、
また、フザリウム(Fusarium)属に属するかびとしてはフ
ザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種のかびが、オー
リクラリア(Auricularia)属に属するかびとしてはオー
リクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auric
ulajudae)種のかびが、フィシウム(Pythium)属に属する
かびとしてはフィシウム・アハニデルマタム(Pythium a
phanidermaatum)種のかびが、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属に属するかびとしてはメニスポロプシス・ノ
バエゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種の
かびが、それぞれD-アミノアシラーゼの調製に適用しう
るが、これら種に制限されない。
としては、例えば、ヒポミセス・アウランチアス(Hypom
yces aurantius)種、ヒポミセス・ブルーメアナス(Hyp
omyces broomeanus)種、ヒポミセス・クリソスペルムス
(Hypomyces chrysospermus)種、ヒポミセス・ロセラス
(Hypomyces rosellus)種、ヒポミセス・セプルクラリス
(Hypomyces sepulcralis)種、ヒポミセス・スビキュロ
スアス(Hypomyces subiculosus)種、またはヒポミセス
・ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）種のかびが、
また、フザリウム(Fusarium)属に属するかびとしてはフ
ザリウム・ソラニ(Fusarium solani)種のかびが、オー
リクラリア(Auricularia)属に属するかびとしてはオー
リクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auric
ulajudae)種のかびが、フィシウム(Pythium)属に属する
かびとしてはフィシウム・アハニデルマタム(Pythium a
phanidermaatum)種のかびが、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属に属するかびとしてはメニスポロプシス・ノ
バエゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種の
かびが、それぞれD-アミノアシラーゼの調製に適用しう
るが、これら種に制限されない。
【００３２】さらに、ヒポミセス・アウランチアス(Hyp
omyces aurantius)種のかびとしてはヒポミセス・アウ
ランチアス(Hypomyces aurantius)IFO6847株が、ヒポ
ミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種のか
びとしてはヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces bro
omeanus)IFO9164株が、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyce
s rosellus)種のかびとしてはヒポミセス・ロセラス(Hy
pomyces rosellus)IFO6911株が、ヒポミセス・クリソス
ペルムス(Hypomyces chrysospermus)種のかびとしては
ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysosperm
us)IFO6817株が、ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyc
es sepulcralis)種のかびとしてはヒポミセス・セプル
クラリス(Hypomyces sepulcralis)IFO9102株が、ヒポミ
セス・スビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)種の
かびとしてはヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces
subiculosus)IFO6892株が、ヒポミセス・ミコフィラス
（Hypomyces mycophilus）種のかびとしてはヒポミセス
ミコフィラス（Hypomycesmycophilus）ATCC76474株ま
たはIFO 6785株が、フザリウム・ソラニ(Fusariumsolan
i)種のかびとしてはフザリウム・ソラニ(Fusarium sola
ni) IFO 9974 株またはIFO 9975株が、オーリクラリ
ア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auriculajuda
e)種のかびとしてはオーリクラリア・オーリキュラジュ
ダエ(Auricularia auriculajudae)IFO5949株が、フィシ
ウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatum)種
のかびとしてはフィシウム・アハニデルマタム(Pythium
aphanidermaatum)IFO7030株が、メニスポロプシス・ノ
バエゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種の
かびとしてはメニスポロプシス・ノバエゼランディア(M
enisporopsis novaezelandiae)IFO9179株が、それぞれD
-アミノアシラーゼの調製に適用しうるが、これらの株
に制限されない。
omyces aurantius)種のかびとしてはヒポミセス・アウ
ランチアス(Hypomyces aurantius)IFO6847株が、ヒポ
ミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種のか
びとしてはヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces bro
omeanus)IFO9164株が、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyce
s rosellus)種のかびとしてはヒポミセス・ロセラス(Hy
pomyces rosellus)IFO6911株が、ヒポミセス・クリソス
ペルムス(Hypomyces chrysospermus)種のかびとしては
ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysosperm
us)IFO6817株が、ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyc
es sepulcralis)種のかびとしてはヒポミセス・セプル
クラリス(Hypomyces sepulcralis)IFO9102株が、ヒポミ
セス・スビキュロスアス(Hypomyces subiculosus)種の
かびとしてはヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces
subiculosus)IFO6892株が、ヒポミセス・ミコフィラス
（Hypomyces mycophilus）種のかびとしてはヒポミセス
ミコフィラス（Hypomycesmycophilus）ATCC76474株ま
たはIFO 6785株が、フザリウム・ソラニ(Fusariumsolan
i)種のかびとしてはフザリウム・ソラニ(Fusarium sola
ni) IFO 9974 株またはIFO 9975株が、オーリクラリ
ア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auriculajuda
e)種のかびとしてはオーリクラリア・オーリキュラジュ
ダエ(Auricularia auriculajudae)IFO5949株が、フィシ
ウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatum)種
のかびとしてはフィシウム・アハニデルマタム(Pythium
aphanidermaatum)IFO7030株が、メニスポロプシス・ノ
バエゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種の
かびとしてはメニスポロプシス・ノバエゼランディア(M
enisporopsis novaezelandiae)IFO9179株が、それぞれD
-アミノアシラーゼの調製に適用しうるが、これらの株
に制限されない。
【００３３】D-アミノアシラーゼ産生能を有する菌体は
醗酵学の分野で公知の情報に従って培養することができ
る。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他
の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天
然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固
体培地を使用することができる。具体的には、炭素源と
して、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラク
トース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖
類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロー
ル、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢
酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸
類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、
グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的
な炭素源より使用するかびの資化性を考慮して、適宜一
種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミ
ルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステ
ィープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解
物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機
窒素化合物より使用かびの資化性を考慮して、適宜一種
または二種以上選択して使用する。
醗酵学の分野で公知の情報に従って培養することができ
る。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他
の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天
然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固
体培地を使用することができる。具体的には、炭素源と
して、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラク
トース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖
類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロー
ル、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢
酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸
類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、
グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的
な炭素源より使用するかびの資化性を考慮して、適宜一
種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミ
ルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステ
ィープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解
物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機
窒素化合物より使用かびの資化性を考慮して、適宜一種
または二種以上選択して使用する。
【００３４】また、かびにD-アミノアシラーゼを効率的
に生産させるために、誘導物質として、N-アセチル-DL-
アミノ酸を、使用するかびに応じて使用することができ
る。
に生産させるために、誘導物質として、N-アセチル-DL-
アミノ酸を、使用するかびに応じて使用することができ
る。
【００３５】さらに、無機塩として微量のマグネシウ
ム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、
銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等よ
り適宜一種または二種以上を選択して使用することがで
きる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコ
ンなどの消泡剤を添加してもよい。
ム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、
銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等よ
り適宜一種または二種以上を選択して使用することがで
きる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコ
ンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００３６】培養は前記培地成分を含有する液体培地中
で振とう培養、通気撹拌培養、連続培養、流加培養など
の通常の培養方法を用いて行うことができる。
で振とう培養、通気撹拌培養、連続培養、流加培養など
の通常の培養方法を用いて行うことができる。
【００３７】培養条件は、培養の種類、培養方法により
適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、D-アミノアシラ
ーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。通常
は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調
節し、15から50℃、好ましくは25から35℃の温度条件下
で培養することが望ましい。培養時間は、十分量のD-ア
ミノアシラーゼ活性を有する菌体が得られれば特に問題
はなく、通常は1日から14日、このましくは1日から3日
培養する。培養物中に生産蓄積されたD-アミノアシラー
ゼは、次のような方法で採取、分取することができる。
適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、D-アミノアシラ
ーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。通常
は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調
節し、15から50℃、好ましくは25から35℃の温度条件下
で培養することが望ましい。培養時間は、十分量のD-ア
ミノアシラーゼ活性を有する菌体が得られれば特に問題
はなく、通常は1日から14日、このましくは1日から3日
培養する。培養物中に生産蓄積されたD-アミノアシラー
ゼは、次のような方法で採取、分取することができる。
【００３８】D-アミノアシラーゼが菌体内に蓄積される
場合には、培養終了後、菌体をろ過、遠心分離等の方法
で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例え
ば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処
理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチームなど
の細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理もしくは界
面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組
み合わせて行うことにより菌体を破砕し、D-アミノアシ
ラーゼを抽出することができる。こうして得られた粗D-
アミノアシラーゼは、塩析、有機溶媒などによる分別沈
殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、
中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、nati
ve-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単
独もしくは組み合わせて用いることにより精製すること
ができる。
場合には、培養終了後、菌体をろ過、遠心分離等の方法
で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例え
ば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処
理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチームなど
の細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理もしくは界
面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組
み合わせて行うことにより菌体を破砕し、D-アミノアシ
ラーゼを抽出することができる。こうして得られた粗D-
アミノアシラーゼは、塩析、有機溶媒などによる分別沈
殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、
中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、nati
ve-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単
独もしくは組み合わせて用いることにより精製すること
ができる。
【００３９】具体的には、例えば、ろ過で集めた菌体を
凍結融解し、Dyno Millを用いて磨砕処理し、D-アミノ
アシラーゼ抽出液を得て、その後、硫安を用いた塩析処
理、DEAE-Sepharose FF イオン交換クロマトグラフィ
ー、Phenyl-Sepharose FF 疎水クロマトグラフィー、Su
perdex200 ゲルろ過クロマトグラフィー、Mono Q イオ
ン交換クロマトグラフィーを行い、SDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動的に単一のバンドに精製することがで
きる。
凍結融解し、Dyno Millを用いて磨砕処理し、D-アミノ
アシラーゼ抽出液を得て、その後、硫安を用いた塩析処
理、DEAE-Sepharose FF イオン交換クロマトグラフィ
ー、Phenyl-Sepharose FF 疎水クロマトグラフィー、Su
perdex200 ゲルろ過クロマトグラフィー、Mono Q イオ
ン交換クロマトグラフィーを行い、SDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動的に単一のバンドに精製することがで
きる。
【００４０】このようにして実施例５においてかびから
精製されたD-アミノアシラーゼは、下記の(a) から(f)
の理化学的性質を有していた。
精製されたD-アミノアシラーゼは、下記の(a) から(f)
の理化学的性質を有していた。
【００４１】(a) 作用：N-アセチル-D-アミノ酸に作用
して、D-アミノ酸を生じる。
して、D-アミノ酸を生じる。
【００４２】(b) 分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル
電気泳動における分子量が約64000Daであり、Superdex2
00 Hi-Load 6/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約56000Da
を示す。
電気泳動における分子量が約64000Daであり、Superdex2
00 Hi-Load 6/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約56000Da
を示す。
【００４３】(c) 基質特異性：N-アセチル-D-トリプト
ファン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-バリン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチ
オニンに作用し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-ア
セチル-L-フェニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-
アセチル-L-ロイシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用
しない。
ファン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-バリン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチ
オニンに作用し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-ア
セチル-L-フェニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-
アセチル-L-ロイシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用
しない。
【００４４】(d) 温度安定性：pH 9.5で30分間熱処理し
た場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
た場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
【００４５】(e) 至適温度：pH 7.5で反応させる場合、
温度約45℃において作用が至適である。
温度約45℃において作用が至適である。
【００４６】(f) 安定化剤：還元剤によって、その活性
が安定に保持され、さらにICH3CONH2で活性化される。
が安定に保持され、さらにICH3CONH2で活性化される。
【００４７】従って、本発明のD-アミノアシラーゼに
は、このような理化学的性質を有するかび由来のD-アミ
ノアシラーゼが含まれる。このような理化学的性質を有
するD-アミノアシラーゼは、好ましくはヒポミセス（Hy
pomyces）属に属するかびに由来し、さらに好ましくは
ヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）種
のかびに由来し、さらに好ましくはヒポミセス ミコフ
ィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはIFO
6785株のかびに由来する。また、配列番号：１から５
に記載のアミノ酸配列を含有しうる。
は、このような理化学的性質を有するかび由来のD-アミ
ノアシラーゼが含まれる。このような理化学的性質を有
するD-アミノアシラーゼは、好ましくはヒポミセス（Hy
pomyces）属に属するかびに由来し、さらに好ましくは
ヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）種
のかびに由来し、さらに好ましくはヒポミセス ミコフ
ィラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはIFO
6785株のかびに由来する。また、配列番号：１から５
に記載のアミノ酸配列を含有しうる。
【００４８】本発明のD-アミノアシラーゼは、種々のN-
アシル-D-アミノ酸に作用して、D-アミノ酸を生じる性
質を有するため、本発明のD-アミノアシラーゼを用いて
D-アミノ酸を工業的に有利に製造することが可能であ
る。例えば、本発明のD-アミノアシラーゼをD体とL体の
混合物であるN-アシル-DL-アミノ酸に作用させて、D-ア
ミノ酸を特異的に製造することができる。
アシル-D-アミノ酸に作用して、D-アミノ酸を生じる性
質を有するため、本発明のD-アミノアシラーゼを用いて
D-アミノ酸を工業的に有利に製造することが可能であ
る。例えば、本発明のD-アミノアシラーゼをD体とL体の
混合物であるN-アシル-DL-アミノ酸に作用させて、D-ア
ミノ酸を特異的に製造することができる。
【００４９】適用可能なN-アシル-DL-アミノ酸としては
特に制限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代
表的なN-アシル-DL-アミノ酸は、式（１）
特に制限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代
表的なN-アシル-DL-アミノ酸は、式（１）
【００５０】
【化３】 （式中、R1、R2は、同一または異なる、アルキル基、ア
ルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリル
基、またはアラルキル基を示し、これらの基はさらに置
換基を有していてもよい）で表すことができる。好まし
いR2にはメチル基、クロロメチル基、フェニル基、アミ
ノメチル基が挙げられ、また好ましいR1にはインドリル
基（N-アシル-DL-トリプトファン）、ベンジル基（N-ア
シル-DL-フェニルアラニン）、チオメチルエチル基（N-
アシル-DL-メチオニン）、イソプロピル基（N-アシル-D
L-バリン）、2-メチル-プロピル基（N-アシル-DL-ロイ
シン）が挙げられる。さらに、好ましいN-アシル-DL-ア
ミノ酸としてはN-アセチル-DL-アミノ酸が挙げられ、例
えば、N-アセチル-DL-メチオニン、N-アセチル-DL-バリ
ン、N-アセチル-DL-トリプトファン、N-アセチル-DL-ア
スパラギン、N-アセチル-DL-フェニルアラニン、N-アセ
チル-DL-アラニン、N-アセチル-DL-ロイシンが例示され
る。
ルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリル
基、またはアラルキル基を示し、これらの基はさらに置
換基を有していてもよい）で表すことができる。好まし
いR2にはメチル基、クロロメチル基、フェニル基、アミ
ノメチル基が挙げられ、また好ましいR1にはインドリル
基（N-アシル-DL-トリプトファン）、ベンジル基（N-ア
シル-DL-フェニルアラニン）、チオメチルエチル基（N-
アシル-DL-メチオニン）、イソプロピル基（N-アシル-D
L-バリン）、2-メチル-プロピル基（N-アシル-DL-ロイ
シン）が挙げられる。さらに、好ましいN-アシル-DL-ア
ミノ酸としてはN-アセチル-DL-アミノ酸が挙げられ、例
えば、N-アセチル-DL-メチオニン、N-アセチル-DL-バリ
ン、N-アセチル-DL-トリプトファン、N-アセチル-DL-ア
スパラギン、N-アセチル-DL-フェニルアラニン、N-アセ
チル-DL-アラニン、N-アセチル-DL-ロイシンが例示され
る。
【００５１】本発明においてD-アミノ酸の製造に用いら
れるD-アミノアシラーゼとしては、精製酵素の他、部分
精製酵素も含まれる。またD-アミノアシラーゼをコード
するDNAを単離し、これを適当な宿主細胞に導入し発現
させて得た酵素（組み換えタンパク質）を用いてもよ
い。D-アミノアシラーゼをコードするDNAは、例えば、
精製酵素を得て、その部分アミノ酸配列を決定し、決定
したアミノ酸配列を基に適当なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを設計し、設計に基づいて調製したプライマーを
利用して精製酵素の由来するかびから調製したmRMA、cD
NAもしくはゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を
行うことにより、単離することが可能である。
れるD-アミノアシラーゼとしては、精製酵素の他、部分
精製酵素も含まれる。またD-アミノアシラーゼをコード
するDNAを単離し、これを適当な宿主細胞に導入し発現
させて得た酵素（組み換えタンパク質）を用いてもよ
い。D-アミノアシラーゼをコードするDNAは、例えば、
精製酵素を得て、その部分アミノ酸配列を決定し、決定
したアミノ酸配列を基に適当なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを設計し、設計に基づいて調製したプライマーを
利用して精製酵素の由来するかびから調製したmRMA、cD
NAもしくはゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を
行うことにより、単離することが可能である。
【００５２】また、本発明においては、これら酵素を用
いるだけでなく、D-アミノアシラーゼ産生能を有する菌
体自体を用いることも可能である。即ち、D-アミノアシ
ラーゼ産生能を有するかびを直接N-アセチル-DL-アミノ
酸に作用させて、D-アミノ酸を製造することも可能であ
る。
いるだけでなく、D-アミノアシラーゼ産生能を有する菌
体自体を用いることも可能である。即ち、D-アミノアシ
ラーゼ産生能を有するかびを直接N-アセチル-DL-アミノ
酸に作用させて、D-アミノ酸を製造することも可能であ
る。
【００５３】D-アミノアシラーゼ、またはD-アミノアシ
ラーゼ産生能を有するかびをN-アシル-D-アミノ酸に作
用させる際には、D-アミノアシラーゼの活性や安定性、
D-アミノアシラーゼ産生能を有するかびの反応性にとっ
て好ましい条件を選択する。D-アミノアシラーゼには金
属イオン、例えば、Co2+、Ca2+などで活性化されるもの
があるため、これら2価金属を反応液に添加することも
できる。また、2価金属により阻害を受ける場合にはEDT
Aなどのキレート剤を添加できる。反応の基質であるN-
アセチル-DL-アミノ酸の濃度に特に制限はないが、通常
0.1〜30%程度の濃度が用いられる。使用するD-アミノア
シラーゼの量は大量に使用すれば反応が速く進む場合が
多いが、通常は1U〜1000U/ml程度用いられる。反応温度
はD-アミノアシラーゼがその活性を発現できる温度に維
持することが好ましく、特に30から50℃に維持すること
が好ましい。また反応pHも、D-アミノアシラーゼがその
活性を発現できるpHに維持することが好ましくpH4〜10
で行われる。また、撹拌下、あるいは静置下で行うこと
ができる。
ラーゼ産生能を有するかびをN-アシル-D-アミノ酸に作
用させる際には、D-アミノアシラーゼの活性や安定性、
D-アミノアシラーゼ産生能を有するかびの反応性にとっ
て好ましい条件を選択する。D-アミノアシラーゼには金
属イオン、例えば、Co2+、Ca2+などで活性化されるもの
があるため、これら2価金属を反応液に添加することも
できる。また、2価金属により阻害を受ける場合にはEDT
Aなどのキレート剤を添加できる。反応の基質であるN-
アセチル-DL-アミノ酸の濃度に特に制限はないが、通常
0.1〜30%程度の濃度が用いられる。使用するD-アミノア
シラーゼの量は大量に使用すれば反応が速く進む場合が
多いが、通常は1U〜1000U/ml程度用いられる。反応温度
はD-アミノアシラーゼがその活性を発現できる温度に維
持することが好ましく、特に30から50℃に維持すること
が好ましい。また反応pHも、D-アミノアシラーゼがその
活性を発現できるpHに維持することが好ましくpH4〜10
で行われる。また、撹拌下、あるいは静置下で行うこと
ができる。
【００５４】酵素あるいはかびは固定化した方が安定す
る場合が多い。固定化する方法としては、ポリアクリル
アミドゲル法、含硫多糖ゲル法（カラギーナンゲル
法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知の方法
を用いることができる。反応時間はD-アミノアシラーゼ
の量と基質量で決まるが、通常は10〜100時間で終了す
る場合が多い。
る場合が多い。固定化する方法としては、ポリアクリル
アミドゲル法、含硫多糖ゲル法（カラギーナンゲル
法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知の方法
を用いることができる。反応時間はD-アミノアシラーゼ
の量と基質量で決まるが、通常は10〜100時間で終了す
る場合が多い。
【００５５】反応液から反応により生じたD-アミノ酸の
回収は、例えば、濃縮、等電点沈殿などによる直接結晶
法やイオン交換樹脂処理、膜分離などの公知の方法によ
り行うことができる。例えば N-アセチル-DL-トリプト
ファンを基質にして D-トリプトファンを生成した場
合、反応液からD-トリプトファンを採取するには、反応
液を強酸性陽イオン交換樹脂に通し、 D-トリプトファ
ンを吸着させ、該樹脂を水洗後、0.5Ｎアンモニア水で
溶出させる。溶出液を濃縮して得た粗D-トリプトファン
結晶粉末を少量の50％熱エタノール水に溶解し、活性炭
処理して脱色し、冷却後、精D-トリプトファンの結晶を
得ることができる。また、D-バリンの場合には、反応終
了後、遠心分離して除菌などした後に6規定塩酸でpH1と
する。次いで、析出したN-アセチル-L-バリンを遠心分
離で除去し、上清を活性炭処理した後、再びpHを7.0と
しH+型強酸性陽イオン交換体（アンバーライトIR-120
B）に加え、5％アンモニア水溶液で脱着する。さらに、
脱着物を80℃で減圧乾燥することで得ることができる。
回収は、例えば、濃縮、等電点沈殿などによる直接結晶
法やイオン交換樹脂処理、膜分離などの公知の方法によ
り行うことができる。例えば N-アセチル-DL-トリプト
ファンを基質にして D-トリプトファンを生成した場
合、反応液からD-トリプトファンを採取するには、反応
液を強酸性陽イオン交換樹脂に通し、 D-トリプトファ
ンを吸着させ、該樹脂を水洗後、0.5Ｎアンモニア水で
溶出させる。溶出液を濃縮して得た粗D-トリプトファン
結晶粉末を少量の50％熱エタノール水に溶解し、活性炭
処理して脱色し、冷却後、精D-トリプトファンの結晶を
得ることができる。また、D-バリンの場合には、反応終
了後、遠心分離して除菌などした後に6規定塩酸でpH1と
する。次いで、析出したN-アセチル-L-バリンを遠心分
離で除去し、上清を活性炭処理した後、再びpHを7.0と
しH+型強酸性陽イオン交換体（アンバーライトIR-120
B）に加え、5％アンモニア水溶液で脱着する。さらに、
脱着物を80℃で減圧乾燥することで得ることができる。
【００５６】
【実施例】以下に、本発明を実施例をあげて説明する
が、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。
が、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。
【００５７】[実施例１]ヒポミセス・アウランチアス(H
ypomyces aurantius)IFO6847、ヒポミセス・ブルーメ
アナス(Hypomyces broomeanus)IFO9164、ヒポミセス・
ロセラス(Hypomyces rosellus)IFO6911、ヒポミセス・
クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)IFO6817、
ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)I
FO9102、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces sub
iculosus)IFO6892、ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyc
es mycophilus）ATCC76474、IFO 6785、フザリウム・ソ
ラニ(Fusarium solani) IFO 9974 、 IFO 9975をＹＭ
培地（酵母エキス0.3％、麦芽エキス0.3％、ペプトン0.
5％、グルコース2.0％、pH6.0）25ml（500ml容坂口フラ
スコ）に一白金耳を植菌して24℃で3日間振とう培養を
行った。培養終了後、培養液5mlを冷却遠心分離機で遠
心分離を行い、菌体を集めた。菌体に5mlの生理食塩水
を加え、洗浄した後に再度、遠心分離で菌体を集めた。
集めた菌体に反応液（N−アセチル−D−アミノ酸0.1
％、トリス塩酸緩衝液pH7.5）を加え、5ml容の試験管で
30℃で24時間、振とうさせた。
ypomyces aurantius)IFO6847、ヒポミセス・ブルーメ
アナス(Hypomyces broomeanus)IFO9164、ヒポミセス・
ロセラス(Hypomyces rosellus)IFO6911、ヒポミセス・
クリソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)IFO6817、
ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)I
FO9102、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces sub
iculosus)IFO6892、ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyc
es mycophilus）ATCC76474、IFO 6785、フザリウム・ソ
ラニ(Fusarium solani) IFO 9974 、 IFO 9975をＹＭ
培地（酵母エキス0.3％、麦芽エキス0.3％、ペプトン0.
5％、グルコース2.0％、pH6.0）25ml（500ml容坂口フラ
スコ）に一白金耳を植菌して24℃で3日間振とう培養を
行った。培養終了後、培養液5mlを冷却遠心分離機で遠
心分離を行い、菌体を集めた。菌体に5mlの生理食塩水
を加え、洗浄した後に再度、遠心分離で菌体を集めた。
集めた菌体に反応液（N−アセチル−D−アミノ酸0.1
％、トリス塩酸緩衝液pH7.5）を加え、5ml容の試験管で
30℃で24時間、振とうさせた。
【００５８】生成したD−アミノ酸は高速液体クロマト
グラフィ法（カラム：CROWNPAK CR（ダイセル化学工業
製）、カラム温度：26℃、バリンのみ氷温、移動相：HC
lO4水溶液pH2.0、流速：1ml／分、検出：200nm）で定量
した。定量した結果を表1に示す。
グラフィ法（カラム：CROWNPAK CR（ダイセル化学工業
製）、カラム温度：26℃、バリンのみ氷温、移動相：HC
lO4水溶液pH2.0、流速：1ml／分、検出：200nm）で定量
した。定量した結果を表1に示す。
【００５９】
【表１】 ヒポミセス・アウランチアス（Hypomyces aurantius）
IFO6847、ヒポミセス・ブルーメアナス（Hypomyces bro
omeanus）IFO9164はN−アセチル−D−トリプトファン、
N−アセチル−D−メチオニン、 N−アセチル−D−フェ
ニルアラニン、 N−アセチル−D−バリンからそれぞれD
−トリプトファン、 D−メチオニン、D−フェニルアラ
ニン、 D−バリンを生成し、ヒポミセス・クリソスペル
ムス（Hypomyces chrysospermus）IFO6817、ヒポミセス
・ロセラス（Hypomyces rosellus）IFO6911、ヒポミセ
ス・セプルクラリス（Hypomyces sepulcralis）IFO910
2、ヒポミセス・スビキュロスアス（Hypomyces subicul
osus）IFO6892、ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces
mycophilus）ATCC76474、IFO 6785はN−アセチル−D−
トリプトファン、 N−アセチル−D−メチオニン、 N−
アセチル−D−フェニルアラニン、 N−アセチル−D−バ
リン、 N−アセチル−D−ロイシンからそれぞれD−トリ
プトファン、 D−メチオニン、 D−フェニルアラニン、
D−バリン、 D−ロイシンを生成し、フザリウム・ソラ
ニ（Fusarium solani） IFO 9974は N−アセチル−D−
メチオニン、 N−アセチル−D−フェニルアラニン、 N
−アセチル−D−バリン、 N−アセチル−D−ロイシンか
らそれぞれD−メチオニン、D−フェニルアラニン、 D−
バリン、 D−ロイシンを生成し、、フザリウム・ソラニ
（Fusarium solani）IFO 9975はN−アセチル−D−トリ
プトファン、 N−アセチル−D−メチオニン、 N−アセ
チル−D−フェニルアラニン、 N−アセチル−D−ロイシ
ンからそれぞれD−トリプトファン、 D−メチオニン、
D−フェニルアラニン、 D−ロイシンを生成し、全ての
菌株にD−アミノアシラーゼ生産能が確認された。
IFO6847、ヒポミセス・ブルーメアナス（Hypomyces bro
omeanus）IFO9164はN−アセチル−D−トリプトファン、
N−アセチル−D−メチオニン、 N−アセチル−D−フェ
ニルアラニン、 N−アセチル−D−バリンからそれぞれD
−トリプトファン、 D−メチオニン、D−フェニルアラ
ニン、 D−バリンを生成し、ヒポミセス・クリソスペル
ムス（Hypomyces chrysospermus）IFO6817、ヒポミセス
・ロセラス（Hypomyces rosellus）IFO6911、ヒポミセ
ス・セプルクラリス（Hypomyces sepulcralis）IFO910
2、ヒポミセス・スビキュロスアス（Hypomyces subicul
osus）IFO6892、ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces
mycophilus）ATCC76474、IFO 6785はN−アセチル−D−
トリプトファン、 N−アセチル−D−メチオニン、 N−
アセチル−D−フェニルアラニン、 N−アセチル−D−バ
リン、 N−アセチル−D−ロイシンからそれぞれD−トリ
プトファン、 D−メチオニン、 D−フェニルアラニン、
D−バリン、 D−ロイシンを生成し、フザリウム・ソラ
ニ（Fusarium solani） IFO 9974は N−アセチル−D−
メチオニン、 N−アセチル−D−フェニルアラニン、 N
−アセチル−D−バリン、 N−アセチル−D−ロイシンか
らそれぞれD−メチオニン、D−フェニルアラニン、 D−
バリン、 D−ロイシンを生成し、、フザリウム・ソラニ
（Fusarium solani）IFO 9975はN−アセチル−D−トリ
プトファン、 N−アセチル−D−メチオニン、 N−アセ
チル−D−フェニルアラニン、 N−アセチル−D−ロイシ
ンからそれぞれD−トリプトファン、 D−メチオニン、
D−フェニルアラニン、 D−ロイシンを生成し、全ての
菌株にD−アミノアシラーゼ生産能が確認された。
【００６０】[実施例２]ヒポミセス・ロセラス（Hypomy
ces rosellus）IFO6911、ヒポミセス・セプルクラリス
（Hypomyces sepulcralis）IFO9102、ヒポミセス ミコ
フィラス（Hypomyces mycophilus） IFO 6785をYM培地
（酵母エキス0.3％、麦芽エキス0.3％、ペプトン0.5
％、グルコース2.0％、pH6.0）25ml（500ml容坂口フラ
スコ）に一白金耳を植菌して24℃で3日間振とう培養を
行った。培養終了後、培養液5mlを冷却遠心分離機で遠
心分離を行い、菌体を集めた。菌体に5mlの生理食塩水
を加え、洗浄した後に再度、遠心分離で菌体を集めた。
集めた菌体に反応液（N−アセチル−DL−アミノ酸0.1
％、トリス塩酸緩衝液pH7.5）を加え、5ml容の試験管で
30℃で24時間、振とうさせた。生成したD−アミノ酸は
高速液体クロマトグラフィ法（カラム：CROWNPAK CR
（ダイセル化学工業製）、カラム温度：26℃、移動相：
HClO4水溶液pH2.0、流速：1ml／分、検出：200nm）で定
量及び光学純度を測定した。定量した結果を表2に示
す。
ces rosellus）IFO6911、ヒポミセス・セプルクラリス
（Hypomyces sepulcralis）IFO9102、ヒポミセス ミコ
フィラス（Hypomyces mycophilus） IFO 6785をYM培地
（酵母エキス0.3％、麦芽エキス0.3％、ペプトン0.5
％、グルコース2.0％、pH6.0）25ml（500ml容坂口フラ
スコ）に一白金耳を植菌して24℃で3日間振とう培養を
行った。培養終了後、培養液5mlを冷却遠心分離機で遠
心分離を行い、菌体を集めた。菌体に5mlの生理食塩水
を加え、洗浄した後に再度、遠心分離で菌体を集めた。
集めた菌体に反応液（N−アセチル−DL−アミノ酸0.1
％、トリス塩酸緩衝液pH7.5）を加え、5ml容の試験管で
30℃で24時間、振とうさせた。生成したD−アミノ酸は
高速液体クロマトグラフィ法（カラム：CROWNPAK CR
（ダイセル化学工業製）、カラム温度：26℃、移動相：
HClO4水溶液pH2.0、流速：1ml／分、検出：200nm）で定
量及び光学純度を測定した。定量した結果を表2に示
す。
【００６１】
【表２】 全ての株がDL体から高い光学純度のD体を生産すること
が確認出来た。
が確認出来た。
【００６２】[実施例３]オーリクラリア・オーリキュラ
ジュダエ（Auricularia auricula judae ）IFO 594
9、フィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphaniderm
aatum)IFO7030、メニスポロプシス・ノバエゼランディ
ア(Menisporopsis novaezelandiae)IFO9179を500ml容三
角フラスコに100mlの下記の培地（IFO 5949：Czapek do
gs培地、IFO 7030： YM１培地、IFO 9179：POTATO DEX
TROSE BROTH）を分注・滅菌した後、植菌した。24℃、
210rpmで7日間振とう培養を行った後、遠心分離（himac
SCR20B HITACHI、RPR10-2ローター、8,000rpm(12,500
×g)× 20min）を行い、沈降した菌体を50mMリン酸バッ
ファー(pH7.0）で洗浄し、水気を切ってから凍結保存し
た。
ジュダエ（Auricularia auricula judae ）IFO 594
9、フィシウム・アハニデルマタム(Pythium aphaniderm
aatum)IFO7030、メニスポロプシス・ノバエゼランディ
ア(Menisporopsis novaezelandiae)IFO9179を500ml容三
角フラスコに100mlの下記の培地（IFO 5949：Czapek do
gs培地、IFO 7030： YM１培地、IFO 9179：POTATO DEX
TROSE BROTH）を分注・滅菌した後、植菌した。24℃、
210rpmで7日間振とう培養を行った後、遠心分離（himac
SCR20B HITACHI、RPR10-2ローター、8,000rpm(12,500
×g)× 20min）を行い、沈降した菌体を50mMリン酸バッ
ファー(pH7.0）で洗浄し、水気を切ってから凍結保存し
た。
【００６３】なお、POTATO DEXTROSE BROTH（DIFCO社）
は、乾燥培地粉末（Potato，infusion fromとBacto Dex
troseを10:1で混合したもの）24gに水1lの割合で溶かし
た液に、N-アセチル-DL-メチオニン（N-Ac-DL-Met）を
0.1%になるよう加え、pH5.1に調整したものである。ま
た、Czapek dogs培地は、NaNO3を0.3％、K2HPO4を0.1
％、MgSO4・7H2Oを0.05％、KClを0.05％、FeSO4・7H2O
を0.001％、ショ糖を3.0％、酵母抽出物（Yeast extrac
t）を0.2％、ポリペプトンを0.2％、N-Ac-DL-Metを0.1
％の組成（％はすべて体積当たりの重量(W/V)である）
で含み、pH7.3に調整したものである。また、YM1培地
（Yeast extract malt extract pepton glucosemedium)
は、ポリペプトンを0.5％、酵母抽出物を0.3％、麦芽抽
出物を0.3％、ブドウ糖を0.2％、N-Ac-DL-Metを0.1％の
組成（％はすべて体積当たりの重量(W/V)である）で含
み、pH5.5〜6.0に調整したものである。
は、乾燥培地粉末（Potato，infusion fromとBacto Dex
troseを10:1で混合したもの）24gに水1lの割合で溶かし
た液に、N-アセチル-DL-メチオニン（N-Ac-DL-Met）を
0.1%になるよう加え、pH5.1に調整したものである。ま
た、Czapek dogs培地は、NaNO3を0.3％、K2HPO4を0.1
％、MgSO4・7H2Oを0.05％、KClを0.05％、FeSO4・7H2O
を0.001％、ショ糖を3.0％、酵母抽出物（Yeast extrac
t）を0.2％、ポリペプトンを0.2％、N-Ac-DL-Metを0.1
％の組成（％はすべて体積当たりの重量(W/V)である）
で含み、pH7.3に調整したものである。また、YM1培地
（Yeast extract malt extract pepton glucosemedium)
は、ポリペプトンを0.5％、酵母抽出物を0.3％、麦芽抽
出物を0.3％、ブドウ糖を0.2％、N-Ac-DL-Metを0.1％の
組成（％はすべて体積当たりの重量(W/V)である）で含
み、pH5.5〜6.0に調整したものである。
【００６４】菌体の破砕は凍結保存してある菌体1gに50
mMリン酸バッファー(pH7.0)を加えて6mlの懸濁液とする
要領で、必要量の懸濁液を作製し、破砕器付属の2.0ml
容サンプルバイアルにガラスビーズ（Φ0.2-0.5mm）1.5
gと懸濁液1.5mlとを入れ、 MINI−BEADBEATERTM(BIOSPE
C PRODUCTS)を用いて、2,500rpm×150秒の破砕を3.5分
の氷冷期間をはさんで合計8回行った。得られた菌体破
砕液は遠心分離（himacSCR20B HITACHI、RPR20-2ロー
ター、17,500rpm(38,000×g)×30分、4℃）し、その上
清をとって粗酵素液とした。反応液 (N-Ac-D-アミノ酸
20mM,CoCl2 1mM,50mMリン酸バッファー、pH7.0)中の基
質をかえて反応させ、各基質に対する活性を測定した。
使用した基質はN-アセチル-D体のアミノ酸7種類（Met、
Ala、Asn、Leu、Phe、Trp、Val）である。結果を表3に
示す。
mMリン酸バッファー(pH7.0)を加えて6mlの懸濁液とする
要領で、必要量の懸濁液を作製し、破砕器付属の2.0ml
容サンプルバイアルにガラスビーズ（Φ0.2-0.5mm）1.5
gと懸濁液1.5mlとを入れ、 MINI−BEADBEATERTM(BIOSPE
C PRODUCTS)を用いて、2,500rpm×150秒の破砕を3.5分
の氷冷期間をはさんで合計8回行った。得られた菌体破
砕液は遠心分離（himacSCR20B HITACHI、RPR20-2ロー
ター、17,500rpm(38,000×g)×30分、4℃）し、その上
清をとって粗酵素液とした。反応液 (N-Ac-D-アミノ酸
20mM,CoCl2 1mM,50mMリン酸バッファー、pH7.0)中の基
質をかえて反応させ、各基質に対する活性を測定した。
使用した基質はN-アセチル-D体のアミノ酸7種類（Met、
Ala、Asn、Leu、Phe、Trp、Val）である。結果を表3に
示す。
【００６５】
【表３】 N-アセチル-D体から生成されたそれぞれ対応するD−ア
ミノ酸量（mM）を示した。いずれの株もN−アセチル−D
−アミノ酸からD−アミノ酸を生成し、D−アミノアシラ
ーゼ活性が見出された。
ミノ酸量（mM）を示した。いずれの株もN−アセチル−D
−アミノ酸からD−アミノ酸を生成し、D−アミノアシラ
ーゼ活性が見出された。
【００６６】[実施例４] （１）菌株およびフラスコ培養方法 ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）IFO
6785株は、50mlのYM培地（0.3％ 酵母エキス（極東製
薬工業株式会社製）、0.3％ 麦芽エキス（極東製薬工業
株式会社製）、0.5％ ポリペプトン（日本製薬株式会社
製）、2.0％ グルコース（和光純薬株式会社製）、pH
6.0）を500ml容量のバッフル付き三角フラスコに分注
し、オートクレーブで滅菌後、D-アミノアシラーゼ生産
培地として使用した。培養は、プレート（YM寒天培地
（0.3％ 酵母エキス、0.3％ 麦芽エキス、0.5％ ポリペ
プトン、2.0％ グルコース（和光純薬株式会社製）、1.
5％ 寒天（和光純薬株式会社製）、pH 6.0）に平面培養
した菌体から、滅菌サージカルナイフで5ml画程度に切
り出したものを植菌し、回転振とう培養器で、25℃、14
5rpm.、96時間培養した。培養後、12000rpm（12000 x
g）で5分間、4℃、遠心分離（株式会社トミー精工製、M
RX-150、TMA-3ローター）を行い、集菌した。集菌体を
生理食塩水で洗浄した後、再び同ローターにより12000r
pm（12000 x g）で5分間、遠心分離を行い、使用する菌
体を得た。 （２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法 上記の方法で得た菌体を、Mini Bead Beater 8（BIOSPE
C PRODUCTS）で、0.01% 2-ME（β-mercaptoethanol）、
1mM PMSF（Phenyl methyl sulfonyl fruolide）を含む5
0mM Tris・Cl（pH 7.5）緩衝液中で、5分間ずつ2度、磨
砕処理した。磨砕処理後、15000rpm（18000 x g）で5分
間、遠心分離（株式会社トミー精工製、MRX-150、TMA-2
ローター）を行い、上清を得た。これをD-アミノアシラ
ーゼの粗酵素液とした。
6785株は、50mlのYM培地（0.3％ 酵母エキス（極東製
薬工業株式会社製）、0.3％ 麦芽エキス（極東製薬工業
株式会社製）、0.5％ ポリペプトン（日本製薬株式会社
製）、2.0％ グルコース（和光純薬株式会社製）、pH
6.0）を500ml容量のバッフル付き三角フラスコに分注
し、オートクレーブで滅菌後、D-アミノアシラーゼ生産
培地として使用した。培養は、プレート（YM寒天培地
（0.3％ 酵母エキス、0.3％ 麦芽エキス、0.5％ ポリペ
プトン、2.0％ グルコース（和光純薬株式会社製）、1.
5％ 寒天（和光純薬株式会社製）、pH 6.0）に平面培養
した菌体から、滅菌サージカルナイフで5ml画程度に切
り出したものを植菌し、回転振とう培養器で、25℃、14
5rpm.、96時間培養した。培養後、12000rpm（12000 x
g）で5分間、4℃、遠心分離（株式会社トミー精工製、M
RX-150、TMA-3ローター）を行い、集菌した。集菌体を
生理食塩水で洗浄した後、再び同ローターにより12000r
pm（12000 x g）で5分間、遠心分離を行い、使用する菌
体を得た。 （２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法 上記の方法で得た菌体を、Mini Bead Beater 8（BIOSPE
C PRODUCTS）で、0.01% 2-ME（β-mercaptoethanol）、
1mM PMSF（Phenyl methyl sulfonyl fruolide）を含む5
0mM Tris・Cl（pH 7.5）緩衝液中で、5分間ずつ2度、磨
砕処理した。磨砕処理後、15000rpm（18000 x g）で5分
間、遠心分離（株式会社トミー精工製、MRX-150、TMA-2
ローター）を行い、上清を得た。これをD-アミノアシラ
ーゼの粗酵素液とした。
【００６７】酵素反応は、20mMのN-アセチル-D-トリプ
トファン（シグマ社製）、50mMのTris・Cl（pH 7.5）緩
衝液、任意量の酵素を含む全量1.0mlの反応系で、30
℃、10分でおこない、TsaiらによるTCA反応停止液（110
mM トリクロロ酢酸と220mM 酢酸ナトリウム、330mM 酢
酸からなる）を0.5ml添加することで反応を停止させ
た。
トファン（シグマ社製）、50mMのTris・Cl（pH 7.5）緩
衝液、任意量の酵素を含む全量1.0mlの反応系で、30
℃、10分でおこない、TsaiらによるTCA反応停止液（110
mM トリクロロ酢酸と220mM 酢酸ナトリウム、330mM 酢
酸からなる）を0.5ml添加することで反応を停止させ
た。
【００６８】酵素活性の測定は、生成したアミノ酸の量
をTNBS法、HPLC法によって測定することによっておこな
った。TNBS法による場合は、0.5mlのアミノ酸を含むサ
ンプルに0.5mlの100mM Na2B4O7を加え、これに、20μl
の110mM TNBS（Trinitrobenzenesulfonic acid）溶液を
加え、素早く撹拌した。5分後に、1.5mMのNa2SO3を含む
100mM NaHPO4を2ml加え、呈色反応を停止させ。420nmに
おける吸光度を測定した。HPLC法による場合は、アミノ
酸を含むサンプルをODSカラムを用いた高速液体クロマ
トグラフィー（カラム：Wakosil II 5C18（φ4.6x250m
m）（和光純薬株式会社製）、溶離液：CH3CN/50mM KH2P
O4・H3PO4（pH2.5）=2:8、検出A280nm、流速1.0ml/min）
によって、定量をおこなった。保持時間は、D-トリプト
ファンが3.5分、N-アセチル-D-トリプトファンが9.8分
であった。なお、D-トリプトファンをスタンダードとし
て定量し、30℃において1分間に1μmolのD-トリプトフ
ァンを生成する酵素量を1単位（unitもしくはU）とし
た。
をTNBS法、HPLC法によって測定することによっておこな
った。TNBS法による場合は、0.5mlのアミノ酸を含むサ
ンプルに0.5mlの100mM Na2B4O7を加え、これに、20μl
の110mM TNBS（Trinitrobenzenesulfonic acid）溶液を
加え、素早く撹拌した。5分後に、1.5mMのNa2SO3を含む
100mM NaHPO4を2ml加え、呈色反応を停止させ。420nmに
おける吸光度を測定した。HPLC法による場合は、アミノ
酸を含むサンプルをODSカラムを用いた高速液体クロマ
トグラフィー（カラム：Wakosil II 5C18（φ4.6x250m
m）（和光純薬株式会社製）、溶離液：CH3CN/50mM KH2P
O4・H3PO4（pH2.5）=2:8、検出A280nm、流速1.0ml/min）
によって、定量をおこなった。保持時間は、D-トリプト
ファンが3.5分、N-アセチル-D-トリプトファンが9.8分
であった。なお、D-トリプトファンをスタンダードとし
て定量し、30℃において1分間に1μmolのD-トリプトフ
ァンを生成する酵素量を1単位（unitもしくはU）とし
た。
【００６９】また、タンパク質の定量は、上記の方法
で、IFO（財団法人醗酵研究所）から分与されたヒポミ
セス ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）IFO 6785
株に関して、D-アミノアシラーゼの生産性を評価した。
その結果、ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycop
hilus）IFO 6785株は比較的高いD-アミノアシラーゼ活
性を有していることが示された。
で、IFO（財団法人醗酵研究所）から分与されたヒポミ
セス ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）IFO 6785
株に関して、D-アミノアシラーゼの生産性を評価した。
その結果、ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycop
hilus）IFO 6785株は比較的高いD-アミノアシラーゼ活
性を有していることが示された。
【００７０】[実施例５]ヒポミセス ミコフィラス（Hyp
omyces mycophilus）IFO 6785株のD-アミノアシラーゼ
の精製 １．D-アミノアシラーゼの生産形態 本菌株を、実施例４に記載のYM液体培地（50ml）にD-ア
ミノアシラーゼの誘導物質として、N-アセチル-DL-バリ
ン、N-アセチル-DL-トリプトファン、N-アセチル-DL-メ
チオニン、DL-バリン、DL-トリプトファン、DL-メチオ
ニンをそれぞれ0.1%添加しなかったもの、誘導物質を添
加しなかったものを25℃、145rpm、96時間、バッフル付
き三角フラスコを用いて回転振とう培養した。培養後、
実施例４に記載の方法により、粗酵素液を調製し、酵素
活性をHPLC法により測定した。本菌株の誘導物質による
D-アミノアシラーゼの生産の結果を表４に示す。なお、
表中の「DCW」は乾燥菌体重量を示す。
omyces mycophilus）IFO 6785株のD-アミノアシラーゼ
の精製 １．D-アミノアシラーゼの生産形態 本菌株を、実施例４に記載のYM液体培地（50ml）にD-ア
ミノアシラーゼの誘導物質として、N-アセチル-DL-バリ
ン、N-アセチル-DL-トリプトファン、N-アセチル-DL-メ
チオニン、DL-バリン、DL-トリプトファン、DL-メチオ
ニンをそれぞれ0.1%添加しなかったもの、誘導物質を添
加しなかったものを25℃、145rpm、96時間、バッフル付
き三角フラスコを用いて回転振とう培養した。培養後、
実施例４に記載の方法により、粗酵素液を調製し、酵素
活性をHPLC法により測定した。本菌株の誘導物質による
D-アミノアシラーゼの生産の結果を表４に示す。なお、
表中の「DCW」は乾燥菌体重量を示す。
【００７１】
【表４】 本菌株において、D-アミノアシラーゼは、誘導酵素では
なく構成酵素であることが示された。 ２．ジャーによる培養方法 本菌株を、20Lの液体培地（0.3% 酵母エキス（極東製薬
工業株式会社製）、0.3% 麦芽エキス（極東製薬工業株
式会社製）、1.0% ポリペプトン（和光純薬工業株式会
社製）、2.0% Glucose（和光純薬工業株式会社製）、シ
リコンFS028 0.01％、pH 6.0）を30L容量のジャーファ
ーメンター、25℃、200rpm.、1v.v.m.、無加圧、44時間
培養した。なお、前培養としては、実施例４のフラスコ
培養方法に従い、2サンプル培養したものを用いた。培
養終了後、培養液をすぐ氷水で冷却した後、No.5Aろ紙
（東洋濾紙株式会社製）を用いた吸引ろ過により集菌
し、集菌体を生理食塩水で洗浄した後、再度吸引ろ過に
より集菌した。集菌体は使用時まで、-90℃まで保存し
た。 ３．D-アミノアシラーゼの精製 （１）菌体破砕、除核酸、硫安塩析 凍結菌体は、100g程度をチャック付きビニル袋で二重に
くるみ、アルミバット上で木槌で粉砕した。粉砕菌体は
1μM ロイペプチン、1μM ペプスタチンA、1mMPMSF、0.
01％ 2-MEを含む50mM Tris・Cl（pH 9.0）に加え、菌体
懸濁液を調製しDyno mill type KDL（Wiley A. Bachofe
n, Based, Switzerland）によって、0.2-0.5mm ガラス
ビーズを用い、連続的に磨砕処理をおこなった。
なく構成酵素であることが示された。 ２．ジャーによる培養方法 本菌株を、20Lの液体培地（0.3% 酵母エキス（極東製薬
工業株式会社製）、0.3% 麦芽エキス（極東製薬工業株
式会社製）、1.0% ポリペプトン（和光純薬工業株式会
社製）、2.0% Glucose（和光純薬工業株式会社製）、シ
リコンFS028 0.01％、pH 6.0）を30L容量のジャーファ
ーメンター、25℃、200rpm.、1v.v.m.、無加圧、44時間
培養した。なお、前培養としては、実施例４のフラスコ
培養方法に従い、2サンプル培養したものを用いた。培
養終了後、培養液をすぐ氷水で冷却した後、No.5Aろ紙
（東洋濾紙株式会社製）を用いた吸引ろ過により集菌
し、集菌体を生理食塩水で洗浄した後、再度吸引ろ過に
より集菌した。集菌体は使用時まで、-90℃まで保存し
た。 ３．D-アミノアシラーゼの精製 （１）菌体破砕、除核酸、硫安塩析 凍結菌体は、100g程度をチャック付きビニル袋で二重に
くるみ、アルミバット上で木槌で粉砕した。粉砕菌体は
1μM ロイペプチン、1μM ペプスタチンA、1mMPMSF、0.
01％ 2-MEを含む50mM Tris・Cl（pH 9.0）に加え、菌体
懸濁液を調製しDyno mill type KDL（Wiley A. Bachofe
n, Based, Switzerland）によって、0.2-0.5mm ガラス
ビーズを用い、連続的に磨砕処理をおこなった。
【００７２】粗酵素液を8000rpm（6000 x g）、4℃で30
分間、遠心分離（日立工機製、20PR-52D、RPR-9ロータ
ー）することにより未破砕菌体、細胞のデブリを沈降さ
せた。この上清液に対し、実施例１に記載のタンパク質
濃度測定法に従い、タンパク質濃度を測定した。この結
果、総タンパク質量が61500mgであったので、1/10量の
プロタミン硫酸塩を3％ プロタミン硫酸塩溶液（菌体破
砕時に使用したbuffer）として、低温撹拌下、滴下し添
加し、滴下終了後2時間撹拌した。6000rpm（3000 x
g）、4℃で20分間、遠心分離（日立工機製、20PR-52D、
RPR-9ローター）することによりミクロゾーム、核酸を
沈降させた。
分間、遠心分離（日立工機製、20PR-52D、RPR-9ロータ
ー）することにより未破砕菌体、細胞のデブリを沈降さ
せた。この上清液に対し、実施例１に記載のタンパク質
濃度測定法に従い、タンパク質濃度を測定した。この結
果、総タンパク質量が61500mgであったので、1/10量の
プロタミン硫酸塩を3％ プロタミン硫酸塩溶液（菌体破
砕時に使用したbuffer）として、低温撹拌下、滴下し添
加し、滴下終了後2時間撹拌した。6000rpm（3000 x
g）、4℃で20分間、遠心分離（日立工機製、20PR-52D、
RPR-9ローター）することによりミクロゾーム、核酸を
沈降させた。
【００７３】上清液は、77%飽和濃度の硫酸アンモニウ
ム、0.1mM PMSF、0.1μM ロイペプチン、0.1μM ペプス
タチンA、0.01％ 2-MEを含む50mM Tris・Cl（pH 9.0）17
Lに対し、一晩撹拌下逆透析を行った。これだけではD-
アミノアシラーゼは完全に塩析されないので、低温撹拌
下、直接硫酸アンモニウムを過剰量加え、完全に塩析さ
せた。沈殿を、10000rpm（16000 x g）、4℃で20分間、
遠心分離（株式会社トミー精工製、RS-20BH、BH-9ロー
ター）することにより回収し、回収沈殿を、少量の0.1m
M PMSF、0.1μM ロイペプチン、0.1μM ペプスタチン
A、0.01％ 2-MEを含む10mM Tris・Cl（pH 9.0）に懸濁
し、懸濁液を同緩衝液 10Lに対し、4時間透析を行い、
その後、透析外液を交換し、再度、同緩衝液 10Lに対
し、一晩透析を行った。 （２）DEAE-Sepharose FF 5.0/25 陰イオン交換クロマ
トグラフィー 上記、調製酵素は陰イオン交換クロマトグラフィーによ
って精製できる。すなわち、あらかじめ0.01％ 2-MEを
含む10mM Tris・Cl（pH 9.0）で平衡化させたDEAE-Sepah
rose FF を詰めたXK50カラム（いずれもAmersham Pharm
acia Biotech社製、φ5.0 x 25cm、500ml）に吸着させ
た。同カラムの3倍量の緩衝液で洗浄後、同カラムの7倍
量の緩衝液を用い、緩衝液中のNaCl濃度を0Mから0.5Mま
で直線的にあげていくことで溶出させた。各フラクショ
ンのタンパク質量は280nmの吸光度を測定することで、
概算した（図1）。
ム、0.1mM PMSF、0.1μM ロイペプチン、0.1μM ペプス
タチンA、0.01％ 2-MEを含む50mM Tris・Cl（pH 9.0）17
Lに対し、一晩撹拌下逆透析を行った。これだけではD-
アミノアシラーゼは完全に塩析されないので、低温撹拌
下、直接硫酸アンモニウムを過剰量加え、完全に塩析さ
せた。沈殿を、10000rpm（16000 x g）、4℃で20分間、
遠心分離（株式会社トミー精工製、RS-20BH、BH-9ロー
ター）することにより回収し、回収沈殿を、少量の0.1m
M PMSF、0.1μM ロイペプチン、0.1μM ペプスタチン
A、0.01％ 2-MEを含む10mM Tris・Cl（pH 9.0）に懸濁
し、懸濁液を同緩衝液 10Lに対し、4時間透析を行い、
その後、透析外液を交換し、再度、同緩衝液 10Lに対
し、一晩透析を行った。 （２）DEAE-Sepharose FF 5.0/25 陰イオン交換クロマ
トグラフィー 上記、調製酵素は陰イオン交換クロマトグラフィーによ
って精製できる。すなわち、あらかじめ0.01％ 2-MEを
含む10mM Tris・Cl（pH 9.0）で平衡化させたDEAE-Sepah
rose FF を詰めたXK50カラム（いずれもAmersham Pharm
acia Biotech社製、φ5.0 x 25cm、500ml）に吸着させ
た。同カラムの3倍量の緩衝液で洗浄後、同カラムの7倍
量の緩衝液を用い、緩衝液中のNaCl濃度を0Mから0.5Mま
で直線的にあげていくことで溶出させた。各フラクショ
ンのタンパク質量は280nmの吸光度を測定することで、
概算した（図1）。
【００７４】D-アミノアシラーゼ活性は、20mMのN-アセ
チル-D-トリプトファンを含む50mMのTris・Cl（pH 7.5）
緩衝液中（全量100μl）中で30℃、30分反応させ、そこ
に4mM TNBSを含む100mM Na2B4O7、NaOH溶液を等量加
え、450nmの吸光度を測定することで、遊離D-トリプト
ファンの概算をおこなった。
チル-D-トリプトファンを含む50mMのTris・Cl（pH 7.5）
緩衝液中（全量100μl）中で30℃、30分反応させ、そこ
に4mM TNBSを含む100mM Na2B4O7、NaOH溶液を等量加
え、450nmの吸光度を測定することで、遊離D-トリプト
ファンの概算をおこなった。
【００７５】本発明のD-アミノアシラーゼは、0.20から
0.25MのNaClを含む緩衝液によって溶出された。アシラ
ーゼ活性を有する画分は、UF膜（Amicon製、YM-10 φ76
mm）を用いて5倍濃縮後、70％飽和濃度になるように硫
酸アンモニウムを加え、一晩沈殿を形成させた後、1200
0rpm（18000 x g）、4℃で10分間、遠心分離（日立工機
製、HIMAC CR26H、RR18Aローター）することにより沈殿
を回収した。回収沈殿は、10mlの0.01% 2-ME、0.3M Na2
SO4を含む200mM KPB（pH 8.5）に懸濁し、同緩衝液2Lに
対し一晩透析を行い、その後透析外液を交換し、再度、
同緩衝液 2Lに対し、4時間透析を行った。 （３）Phenyl-Sepharose HP 2.6/10 疎水クロマトグラ
フィー 先で精製された酵素は、さらに疎水クロマトグラフィー
によって精製できる。すなわち、あらかじめ0.01% 2-M
E、0.3M Na2SO4を含む200mM KPB（pH 8.5）で平衡化さ
せたPhenyl-Sepahrose Hi-Load HP2.6/10カラム（Amers
ham Pharmacia Biotech社製、φ2.6 x 10cm、50ml）に
吸着させ、カラムの4倍量の緩衝液で洗浄後、同カラム
の14倍量の緩衝液を用い、緩衝液中のNa2SO4濃度を0.3M
から0Mまで直線的に、下げていくで、すなわち、上記の
緩衝液をA緩衝液、0.01% 2-MEを含む10mM KPB（pH 8.
5）をB緩衝液とし、B緩衝液濃度を0から100%まで直線的
にあげていくことで溶出させた。各フラクションのタン
パク質量は280nmの吸光度を測定することで、概算し
た。D-アミノアシラーゼ活性は、先にしめした実施例と
同様におこなった（図2）。
0.25MのNaClを含む緩衝液によって溶出された。アシラ
ーゼ活性を有する画分は、UF膜（Amicon製、YM-10 φ76
mm）を用いて5倍濃縮後、70％飽和濃度になるように硫
酸アンモニウムを加え、一晩沈殿を形成させた後、1200
0rpm（18000 x g）、4℃で10分間、遠心分離（日立工機
製、HIMAC CR26H、RR18Aローター）することにより沈殿
を回収した。回収沈殿は、10mlの0.01% 2-ME、0.3M Na2
SO4を含む200mM KPB（pH 8.5）に懸濁し、同緩衝液2Lに
対し一晩透析を行い、その後透析外液を交換し、再度、
同緩衝液 2Lに対し、4時間透析を行った。 （３）Phenyl-Sepharose HP 2.6/10 疎水クロマトグラ
フィー 先で精製された酵素は、さらに疎水クロマトグラフィー
によって精製できる。すなわち、あらかじめ0.01% 2-M
E、0.3M Na2SO4を含む200mM KPB（pH 8.5）で平衡化さ
せたPhenyl-Sepahrose Hi-Load HP2.6/10カラム（Amers
ham Pharmacia Biotech社製、φ2.6 x 10cm、50ml）に
吸着させ、カラムの4倍量の緩衝液で洗浄後、同カラム
の14倍量の緩衝液を用い、緩衝液中のNa2SO4濃度を0.3M
から0Mまで直線的に、下げていくで、すなわち、上記の
緩衝液をA緩衝液、0.01% 2-MEを含む10mM KPB（pH 8.
5）をB緩衝液とし、B緩衝液濃度を0から100%まで直線的
にあげていくことで溶出させた。各フラクションのタン
パク質量は280nmの吸光度を測定することで、概算し
た。D-アミノアシラーゼ活性は、先にしめした実施例と
同様におこなった（図2）。
【００７６】アシラーゼ活性を有する画分は、70％飽和
濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、2時間ゆる
やかに撹拌し、沈殿を形成させた後、12000rpm（18000
x g）、4℃で10分間、遠心分離（日立工機製、HIMAC CR
26H、RR18Aローター）することにより沈殿を回収した。
回収沈殿は、およそ3mlの0.01% 2-ME、0.3M NaClを含む
10mM Tris・Cl（pH 9.5）に溶解させた。 （４）Superdex 200 Hi-Load 1.6/60 ゲルろ過クロマト
グラフィー 先で精製された酵素は、さらにゲルろ過クロマトグラフ
ィーによって精製できる。すなわち、あらかじめ0.01%
2-ME、0.3M NaClを含む10mM Tris・Cl（pH 9.5）の緩衝
液で平衡化させたSuperdex200 Hi-Load 1.6/60カラム
（Amersham Pharmacia Biotech社製、φ1.6 x 60cm、12
0ml）に供し、240mlの同緩衝液を流速1ml/minで溶出さ
せた。各フラクションのタンパク質量は280nmの吸光度
を測定することで、概算した。D-アミノアシラーゼ活性
は、先に示した実施例と同様におこなった（図3）。
濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、2時間ゆる
やかに撹拌し、沈殿を形成させた後、12000rpm（18000
x g）、4℃で10分間、遠心分離（日立工機製、HIMAC CR
26H、RR18Aローター）することにより沈殿を回収した。
回収沈殿は、およそ3mlの0.01% 2-ME、0.3M NaClを含む
10mM Tris・Cl（pH 9.5）に溶解させた。 （４）Superdex 200 Hi-Load 1.6/60 ゲルろ過クロマト
グラフィー 先で精製された酵素は、さらにゲルろ過クロマトグラフ
ィーによって精製できる。すなわち、あらかじめ0.01%
2-ME、0.3M NaClを含む10mM Tris・Cl（pH 9.5）の緩衝
液で平衡化させたSuperdex200 Hi-Load 1.6/60カラム
（Amersham Pharmacia Biotech社製、φ1.6 x 60cm、12
0ml）に供し、240mlの同緩衝液を流速1ml/minで溶出さ
せた。各フラクションのタンパク質量は280nmの吸光度
を測定することで、概算した。D-アミノアシラーゼ活性
は、先に示した実施例と同様におこなった（図3）。
【００７７】D-アミノアシラーゼ活性を有する画分は、
UF膜（Amicon製、YM-10、φ43mm）を用いて濃縮後、0.0
1% 2-MEを含む10mM Tris・Cl（pH 9.5）で希釈し、再度
濃縮した。同様の操作を2度おこない、サンプルの脱塩
をおこなった。 （５）MonoQ HR 5/5 陰イオン交換クロマトグラフィー 先で精製された酵素は、さらに陰イオン交換クロマトグ
ラフィーによって精製できる。すなわち、あらかじめ0.
01％ 2-MEを含む10mM Tris・Cl（pH 9.0）で平衡化させ
たMono Q HR 5/5カラム（Amersham Pharmacia Biotech
社製、φ0.5 x 5cm、1.0ml）に吸着させた。同カラムの
3倍量の緩衝液で洗浄後、同カラムの21倍量の緩衝液を
用い、緩衝液中のNaCl濃度を0Mから0.6Mまで直線的にあ
げていくことで溶出させた。各フラクションのタンパク
質量は280nmの吸光度を測定することで、概算した。
UF膜（Amicon製、YM-10、φ43mm）を用いて濃縮後、0.0
1% 2-MEを含む10mM Tris・Cl（pH 9.5）で希釈し、再度
濃縮した。同様の操作を2度おこない、サンプルの脱塩
をおこなった。 （５）MonoQ HR 5/5 陰イオン交換クロマトグラフィー 先で精製された酵素は、さらに陰イオン交換クロマトグ
ラフィーによって精製できる。すなわち、あらかじめ0.
01％ 2-MEを含む10mM Tris・Cl（pH 9.0）で平衡化させ
たMono Q HR 5/5カラム（Amersham Pharmacia Biotech
社製、φ0.5 x 5cm、1.0ml）に吸着させた。同カラムの
3倍量の緩衝液で洗浄後、同カラムの21倍量の緩衝液を
用い、緩衝液中のNaCl濃度を0Mから0.6Mまで直線的にあ
げていくことで溶出させた。各フラクションのタンパク
質量は280nmの吸光度を測定することで、概算した。
【００７８】D-アミノアシラーゼ活性は、20mMのN-アセ
チル-D-トリプトファンを含む50mMのTris・Cl（pH 7.5）
緩衝液中（全量100μl）中で30℃、30分反応させ、そこ
に4mM TNBSを含む100mM Na2B4O7、NaOH溶液を等量加
え、450nmの吸光度を測定することで、遊離D-トリプト
ファンの概算をおこなった。D-アミノアシラーゼ活性を
有する画分の一部をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（SDS-PAGE）に供した。 （６）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 Laemmli法（Laemmli, U.K. : Nature, 227 , pp680）に
従い、Phast-System（Amersham Pharmacia Biotech社
製）を用いて、電気泳動をおこなった。ゲルは、Phast
gel Homo 12.5（Amersham Pharmacia Biotech社製）を
用いた。試料は、酵素液と同量の試料処理液（4% SDS
（sodium dodecyl sulfate）、20% グリセロール、10%
2-ME、0.005% BPB（Bromo phenol Blue）を含む125mM T
ris・Cl（pH 6.8）緩衝液）を混合し、ブロックヒーター
を用い、100℃で約5分間加熱し、室温まで冷却したもの
2μlを電気泳動に供した。検出はCBB-Rを用いた染色法
によった。この結果、目的のD-アミノアシラーゼと考え
られるバンドが唯一検出された。
チル-D-トリプトファンを含む50mMのTris・Cl（pH 7.5）
緩衝液中（全量100μl）中で30℃、30分反応させ、そこ
に4mM TNBSを含む100mM Na2B4O7、NaOH溶液を等量加
え、450nmの吸光度を測定することで、遊離D-トリプト
ファンの概算をおこなった。D-アミノアシラーゼ活性を
有する画分の一部をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（SDS-PAGE）に供した。 （６）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 Laemmli法（Laemmli, U.K. : Nature, 227 , pp680）に
従い、Phast-System（Amersham Pharmacia Biotech社
製）を用いて、電気泳動をおこなった。ゲルは、Phast
gel Homo 12.5（Amersham Pharmacia Biotech社製）を
用いた。試料は、酵素液と同量の試料処理液（4% SDS
（sodium dodecyl sulfate）、20% グリセロール、10%
2-ME、0.005% BPB（Bromo phenol Blue）を含む125mM T
ris・Cl（pH 6.8）緩衝液）を混合し、ブロックヒーター
を用い、100℃で約5分間加熱し、室温まで冷却したもの
2μlを電気泳動に供した。検出はCBB-Rを用いた染色法
によった。この結果、目的のD-アミノアシラーゼと考え
られるバンドが唯一検出された。
【００７９】[実施例６] ヒポミセス ミコフィラス（H
ypomyces mycophilus）IFO 6785株由来のD-アミノアシ
ラーゼの性質 1.分子量の測定 本酵素の分子量の測定は、（１）ゲルろ過法と（２）SD
S-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）によ
った。 （１）ゲルろ過法 実施例２ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophi
lus）IFO 6785株由来のD-アミノアシラーゼの精製、3.D
-アミノアシラーゼの精製、（４）Superdex 200 Hi-Loa
d 1.6/60 ゲルろ過クロマトグラフィーに記載の方法と
同様におこなった。分子量マーカーには、MW-Marker pr
oteins（HPLC）（オリエンタル酵母社製）：グルタメー
トデヒドロゲナーゼ（290,000）、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼ（142,000）、エノラーゼ（67,000）、ミオキ
ナーゼ（32,000）、チトクロームC（12,400）を用い
た。この結果、本酵素の分子量は、約56,000であること
が示唆された（図4）。 （２）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 実施例２ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophi
lus）IFO 6785株由来のD-アミノアシラーゼの精製、3.D
-アミノアシラーゼの精製、（６）SDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法に記載の方法と同様におこなった。
分子量マーカーには、Electrophoresis Caribration Ki
t（Amersham Pharmacia Biotech社製）：ホスホリラー
ゼb（94,000）、ウシ血清アルブミン（67,000）、オバ
ルブミン（43,000）、カルボニックアンヒドラーゼ（3
0,000）、ダイズトリプシンインヒビター（20,100）、
α-ラクトアルブミン（14,400）を用いた。この結果、
本酵素の分子量は、約64,000であることが示唆された
（図5）。 2.基質特異性 本酵素の基質特異性は、N-アセチル-D-メチオニンに対
する酵素活性を100％として比較した。比較した基質はN
-クロロアセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-D-
バリン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-トリプトファン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチ
ル-L-バリン、N-アセチル-L-フェニルアラニン、N-アセ
チル-L-トリプトファン、N-アセチル-L-ロイシンを用い
た。酵素活性は、1μlの酵素液と20mMの各基質を含む50
mM Tris・Cl（pH 7.5）緩衝液（全量1.0ml）中で、30
℃、20分間で反応させ、TsaiらによるTCA 反応停止液
（110mMトリクロロ酢酸と220mM 酢酸ナトリウム、330mM
酢酸からなる）を0.5ml添加することで反応を停止させ
た。定量は、実施例４（２）D-アミノアシラーゼの活性
測定方法に記載のTNBS法によっておこなった。結果を表
５にしめす。
ypomyces mycophilus）IFO 6785株由来のD-アミノアシ
ラーゼの性質 1.分子量の測定 本酵素の分子量の測定は、（１）ゲルろ過法と（２）SD
S-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）によ
った。 （１）ゲルろ過法 実施例２ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophi
lus）IFO 6785株由来のD-アミノアシラーゼの精製、3.D
-アミノアシラーゼの精製、（４）Superdex 200 Hi-Loa
d 1.6/60 ゲルろ過クロマトグラフィーに記載の方法と
同様におこなった。分子量マーカーには、MW-Marker pr
oteins（HPLC）（オリエンタル酵母社製）：グルタメー
トデヒドロゲナーゼ（290,000）、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼ（142,000）、エノラーゼ（67,000）、ミオキ
ナーゼ（32,000）、チトクロームC（12,400）を用い
た。この結果、本酵素の分子量は、約56,000であること
が示唆された（図4）。 （２）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 実施例２ヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophi
lus）IFO 6785株由来のD-アミノアシラーゼの精製、3.D
-アミノアシラーゼの精製、（６）SDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法に記載の方法と同様におこなった。
分子量マーカーには、Electrophoresis Caribration Ki
t（Amersham Pharmacia Biotech社製）：ホスホリラー
ゼb（94,000）、ウシ血清アルブミン（67,000）、オバ
ルブミン（43,000）、カルボニックアンヒドラーゼ（3
0,000）、ダイズトリプシンインヒビター（20,100）、
α-ラクトアルブミン（14,400）を用いた。この結果、
本酵素の分子量は、約64,000であることが示唆された
（図5）。 2.基質特異性 本酵素の基質特異性は、N-アセチル-D-メチオニンに対
する酵素活性を100％として比較した。比較した基質はN
-クロロアセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-D-
バリン、N-アセチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-
D-トリプトファン、N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチ
ル-L-バリン、N-アセチル-L-フェニルアラニン、N-アセ
チル-L-トリプトファン、N-アセチル-L-ロイシンを用い
た。酵素活性は、1μlの酵素液と20mMの各基質を含む50
mM Tris・Cl（pH 7.5）緩衝液（全量1.0ml）中で、30
℃、20分間で反応させ、TsaiらによるTCA 反応停止液
（110mMトリクロロ酢酸と220mM 酢酸ナトリウム、330mM
酢酸からなる）を0.5ml添加することで反応を停止させ
た。定量は、実施例４（２）D-アミノアシラーゼの活性
測定方法に記載のTNBS法によっておこなった。結果を表
５にしめす。
【００８０】
【表５】 本酵素は、特にN-アセチル-D-フェニルアラニン、N-ク
ロロアセチル-D-フェニルアラニンに作用し、N-アセチ
ル-D-トリプトファン、N-アセチル-D-メチオニン、N-ア
セチル-D-ロイシンによく作用し、N-アセチル-D-バリン
に作用することが、また、N-アセチル-L-フェニルアラ
ニン、N-アセチル-L-トリプトファン、N-アセチル-L-メ
チオニン、N-アセチル-L-バリン、N-アセチル-L-ロイシ
ンには作用しないことが示唆された。 3.反応至適pH 実施例１（２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法に記
載の方法において、反応系のpHを4.0から11.0に換え
て、30℃で5分間反応することによった。なお、定量はH
PLC法によった。緩衝液としては、pH 4.0から6.0まで
は、50mMのAcONa・AcOH緩衝液、pH 5.5から8.0までは、5
0mMのK2HPO4・KH2PO4緩衝液、pH 7.0から9.0までは50mM
のTris・Cl緩衝液、pH 8.0から11.0までは、50mMのグリ
シン・NaOH緩衝液を用いた。結果を図6に示す。この結
果、本酵素の至適pHは7.5から8.0にあり、pH6.5から9.0
の範囲で、その80％以上の活性を示すことが示唆され
た。 4.反応至適温度 実施例１（２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法に記
載の方法において、反応系の温度を20℃から55℃に換え
て、5分間反応することによった。なお、定量はHPLC法
によった。また、緩衝液としては、温度によるpH変化を
押さえるために、50mMのK2HPO4・KH2PO4緩衝液（pH 7.
5）を用いた。結果を図7に示す。この結果、本酵素の反
応至適温度は45℃付近にあることが示唆された。 5.pH安定性 酵素液を各pHの緩衝液で50倍希釈し、30℃、30分間保っ
たあと氷冷し、十分に冷却した後、実施例１（２）D-ア
ミノアシラーゼの活性測定方法に記載の方法に従って、
残存酵素活性を測定した。なお、定量はHPLC法によっ
た。緩衝液としては、緩衝液成分の影響をなくすため
に、0.01% 2-ME を含むBritton and Robinson 緩衝液
（蛋白質・酵素の基礎実験法 改定第2版 堀尾武一編 19
94) を用い、pH5.0から11.0まで0.5きざみに調製した。
結果を図8に示す。この結果、本酵素は、pH 9.5でもっ
とも安定であり、pH 7.5から10.5の範囲で、その80％以
上の活性が保持されることが判明した。 6.温度安定性 酵素液を、緩衝液で希釈、分注し、15から60℃の各温度
で30分間保ったあと氷冷し、十分に冷却した後、実施例
１（２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法に記載の方
法に従って、残存酵素活性を測定した。なお、定量はHP
LC法によった。緩衝液としては、0.01% 2-MEを含むBrit
ton and Robinson 緩衝液（pH 9.5）を用いた。希釈酵
素液は、無処理（4℃）、15から65℃まで5℃きざみに処
理した。結果を図9に示す。この結果、本酵素は、40℃
から45℃の加温で、その酵素活性が活性化され、また50
℃以上で急激に失活することが示唆された。また、40℃
での活性化は、30分間の加温がもっとも有効であり、そ
れ以上、それ以下でも、その効果は弱められること、そ
の後4℃で保存しても、約3日間有効であることが示唆さ
れた。 7.各種金属塩および各種試薬の影響 酵素液を、1mMDTTを含むBritton and Robinson(pH9.5)
緩衝液中で希釈し、40℃、30分間の加温で活性化した
後、各種金属塩および各種試薬を含むBritton and Robi
nson（pH 9.5）緩衝液で希釈し、40℃、30分間保ったあ
と氷冷し、十分に冷却した後、実施例4（2）D-アミノア
シラーゼの活性測定方法に記載の方法に従って、残存酵
素活性を測定した。なお、定量はHPLC法によった。結果
を表6、7に示す。
ロロアセチル-D-フェニルアラニンに作用し、N-アセチ
ル-D-トリプトファン、N-アセチル-D-メチオニン、N-ア
セチル-D-ロイシンによく作用し、N-アセチル-D-バリン
に作用することが、また、N-アセチル-L-フェニルアラ
ニン、N-アセチル-L-トリプトファン、N-アセチル-L-メ
チオニン、N-アセチル-L-バリン、N-アセチル-L-ロイシ
ンには作用しないことが示唆された。 3.反応至適pH 実施例１（２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法に記
載の方法において、反応系のpHを4.0から11.0に換え
て、30℃で5分間反応することによった。なお、定量はH
PLC法によった。緩衝液としては、pH 4.0から6.0まで
は、50mMのAcONa・AcOH緩衝液、pH 5.5から8.0までは、5
0mMのK2HPO4・KH2PO4緩衝液、pH 7.0から9.0までは50mM
のTris・Cl緩衝液、pH 8.0から11.0までは、50mMのグリ
シン・NaOH緩衝液を用いた。結果を図6に示す。この結
果、本酵素の至適pHは7.5から8.0にあり、pH6.5から9.0
の範囲で、その80％以上の活性を示すことが示唆され
た。 4.反応至適温度 実施例１（２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法に記
載の方法において、反応系の温度を20℃から55℃に換え
て、5分間反応することによった。なお、定量はHPLC法
によった。また、緩衝液としては、温度によるpH変化を
押さえるために、50mMのK2HPO4・KH2PO4緩衝液（pH 7.
5）を用いた。結果を図7に示す。この結果、本酵素の反
応至適温度は45℃付近にあることが示唆された。 5.pH安定性 酵素液を各pHの緩衝液で50倍希釈し、30℃、30分間保っ
たあと氷冷し、十分に冷却した後、実施例１（２）D-ア
ミノアシラーゼの活性測定方法に記載の方法に従って、
残存酵素活性を測定した。なお、定量はHPLC法によっ
た。緩衝液としては、緩衝液成分の影響をなくすため
に、0.01% 2-ME を含むBritton and Robinson 緩衝液
（蛋白質・酵素の基礎実験法 改定第2版 堀尾武一編 19
94) を用い、pH5.0から11.0まで0.5きざみに調製した。
結果を図8に示す。この結果、本酵素は、pH 9.5でもっ
とも安定であり、pH 7.5から10.5の範囲で、その80％以
上の活性が保持されることが判明した。 6.温度安定性 酵素液を、緩衝液で希釈、分注し、15から60℃の各温度
で30分間保ったあと氷冷し、十分に冷却した後、実施例
１（２）D-アミノアシラーゼの活性測定方法に記載の方
法に従って、残存酵素活性を測定した。なお、定量はHP
LC法によった。緩衝液としては、0.01% 2-MEを含むBrit
ton and Robinson 緩衝液（pH 9.5）を用いた。希釈酵
素液は、無処理（4℃）、15から65℃まで5℃きざみに処
理した。結果を図9に示す。この結果、本酵素は、40℃
から45℃の加温で、その酵素活性が活性化され、また50
℃以上で急激に失活することが示唆された。また、40℃
での活性化は、30分間の加温がもっとも有効であり、そ
れ以上、それ以下でも、その効果は弱められること、そ
の後4℃で保存しても、約3日間有効であることが示唆さ
れた。 7.各種金属塩および各種試薬の影響 酵素液を、1mMDTTを含むBritton and Robinson(pH9.5)
緩衝液中で希釈し、40℃、30分間の加温で活性化した
後、各種金属塩および各種試薬を含むBritton and Robi
nson（pH 9.5）緩衝液で希釈し、40℃、30分間保ったあ
と氷冷し、十分に冷却した後、実施例4（2）D-アミノア
シラーゼの活性測定方法に記載の方法に従って、残存酵
素活性を測定した。なお、定量はHPLC法によった。結果
を表6、7に示す。
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】 この結果、本酵素は、Co2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+などの金
属により、失活するが、EDTAによっては阻害されず、ま
たICH2CONH2によって活性化されるなどの従来の知見に
はない性質を示した。 8.内部配列の決定 1nmolの精製D-アミノアシラーゼを含む酵素溶液を、限
外ろ過で濃縮し、50μlまで濃縮後、150μlの8M ureaを
含む50mM Tris・Cl（pH 9.0）緩衝液を加えた。酵素溶液
は、そのまま37℃、1時間保ったのち、50mM Tris・Cl（p
H 9.0）緩衝液を200μl加え、Lysyl endo peptidase を
5pmol量加え、30℃で一晩消化した。消化サンプルは、O
DSカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（カラ
ム：TSK gel ODS-120T（φ4.6x250mm）（東ソー製）、
溶離液：bufferA 0.1% TFA、バッファーB 0.095% TFAを
含む80％ CH3CN、検出214nm、流速 1.0ml/min、プログ
ラムドグラジエント溶出）によって、分離溶出させ、回
収した。分取サンプルは、遠心エヴァポレーター（UNIS
CIENCE製、UNIVAP）により濃縮した後、プロテインシー
ケンサー（A477、Applied Biosystems社製）により配列
を決定した。決定した部分アミノ酸配列を配列番号：１
から５に示す。
属により、失活するが、EDTAによっては阻害されず、ま
たICH2CONH2によって活性化されるなどの従来の知見に
はない性質を示した。 8.内部配列の決定 1nmolの精製D-アミノアシラーゼを含む酵素溶液を、限
外ろ過で濃縮し、50μlまで濃縮後、150μlの8M ureaを
含む50mM Tris・Cl（pH 9.0）緩衝液を加えた。酵素溶液
は、そのまま37℃、1時間保ったのち、50mM Tris・Cl（p
H 9.0）緩衝液を200μl加え、Lysyl endo peptidase を
5pmol量加え、30℃で一晩消化した。消化サンプルは、O
DSカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（カラ
ム：TSK gel ODS-120T（φ4.6x250mm）（東ソー製）、
溶離液：bufferA 0.1% TFA、バッファーB 0.095% TFAを
含む80％ CH3CN、検出214nm、流速 1.0ml/min、プログ
ラムドグラジエント溶出）によって、分離溶出させ、回
収した。分取サンプルは、遠心エヴァポレーター（UNIS
CIENCE製、UNIVAP）により濃縮した後、プロテインシー
ケンサー（A477、Applied Biosystems社製）により配列
を決定した。決定した部分アミノ酸配列を配列番号：１
から５に示す。
【００８３】
【配列表】 <110> DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES,LTD. <120> D-aminoacylases, method for producing them, and their use for prod ucing D-amino acids <130> D1-004 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> RPT <213> Hypomyces mycophilus <220> <223> Strain name:IFO6785 Protein fragment type:internal <400> 1 Gly Phe Ile Leu Ser Pro Gly Phe Ile Asp Met His Ala His Ser Asp 1 5 10 15 Leu Tyr Leu Leu Ser His Pro Thr His 20 25 <210> 2 <211> 20 <212> RPT <213> Hypomyces mycophilus <220> <223> Strain name:IFO6785 Protein fragment type:internal <400> 2 Val Leu Ala Asp Glu Tyr Pro Gln Ala Phe Tyr Ala Pro His Ala Tyr 1 5 10 15 Ser Arg Gly Phe 20 <210> 3 <211> 18 <212> RPT <213> Hypomyces mycophilus <220> <223> Strain name:IFO6785 Protein fragment type:internal <400> 3 Thr Ala Thr Asn Val Ala Met Leu Val Pro Gln Gly Asn Leu Arg Leu 1 5 10 15 Leu Ala <210> 4 <211> 18 <212> RPT <213> Hypomyces mycophilus <220> <223> Strain name:IFO6785 Protein fragment type:internal <400> 4 Ile Gly Glu Pro Gly Ser Ile Ser His Asp Ser Ala Arg Arg Val Asp 1 5 10 15 Ala Lys <210> 5 <211> 20 <212> RPT <213> Hypomyces mycophilus <220> <223> Strain name:IFO6785 Protein fragment type:internal <400> 5 Ser Tyr Thr Gly Arg Phe Val Gly Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Arg 1 5 10 15 Leu Pro Ile Glu 20
【図1】DEAE-Sepharose FF 5.0/25 陰イオン交換クロマ
トグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの精製
を示す。
トグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの精製
を示す。
【図2】Phenyl-Sepharose Hi-Load HP 2.6/10疎水クロ
マトグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの精
製を示す。
マトグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの精
製を示す。
【図3】Superdex 200 Hi-Load 1.6/60 ゲルろ過クロマ
トグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの精製
を示す。
トグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの精製
を示す。
【図4】Superdex 200 Hi-Load 1.6/60 ゲルろ過クロマ
トグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの分子
量の測定結果を示す。
トグラフィーによる本発明のD-アミノアシラーゼの分子
量の測定結果を示す。
【図5】SDS-PAGE法による本発明のD-アミノアシラーゼ
の電気泳動像を示す写真である。
の電気泳動像を示す写真である。
【図6】本発明のD-アミノアシラーゼの反応至適pH検討
結果を示す。図中にも示したが、黒菱形はAcoNa/AcoHを
緩衝液として用いたものであり、黒四角は、KH2PO4/KH2
PO4を緩衝液として用いたものであり、黒三角は、Tris・
Clを緩衝液として用いたものであり、黒丸はグリシン・N
aOHを緩衝液として用いたものである。
結果を示す。図中にも示したが、黒菱形はAcoNa/AcoHを
緩衝液として用いたものであり、黒四角は、KH2PO4/KH2
PO4を緩衝液として用いたものであり、黒三角は、Tris・
Clを緩衝液として用いたものであり、黒丸はグリシン・N
aOHを緩衝液として用いたものである。
【図7】本発明のD-アミノアシラーゼの反応至適温度の
検討結果を示す。
検討結果を示す。
【図8】本発明のD-アミノアシラーゼのpH安定性の検討
結果を示す。
結果を示す。
【図9】本発明のD-アミノアシラーゼの温度安定性の検
討結果を示す。
討結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｐ 13/20 13/22 13/22 Ａ Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:77） (72)発明者 徳山 真治 静岡県静岡市子鹿３丁目６−20 合同宿舎 子鹿住宅５−16 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA11 CA04 DA06 HA01 4B050 CC01 DD03 4B064 AE02 AG01 CA05 DA01 DA10 DA16
Claims (26)
- 【請求項１】 かび由来のD-アミノアシラーゼ。
- 【請求項２】 かびがヒポミセス（Hypomyces）、フザ
リウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricularia)、フ
ィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisporopsis)
属からなる群より選択される属に属する、請求項１に記
載のD-アミノアシラーゼ。 - 【請求項３】 ヒポミセス（Hypomyces）属に属するか
びがヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces aurantiu
s)種、ヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broomea
nus)種、ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chr
ysospermus)種、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces rose
llus)種、ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces sepu
lcralis)種、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces
subiculosus)種、またはヒポミセス・ミコフィラス（H
ypomyces mycophilus）種であり、フザリウム(Fusariu
m)属に属するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium sola
ni)種であり、オーリクラリア(Auricularia)属に属する
かびがオーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auricul
aria auriculajudae)種であり、フィシウム(Pythium)属
に属するかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythium
aphanidermaatum)種であり、メニスポロプシス(Menisp
oropsis)属に属するかびがメニスポロプシス・ノバエゼ
ランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種である、
請求項２に記載のD-アミノアシラーゼ。 - 【請求項４】 ヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces
aurantius)種に属するかびがヒポミセス・アウランチ
アス(Hypomyces aurantius)IFO6847株であり、ヒポミ
セス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種に属す
るかびがヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broom
eanus)IFO9164株であり、ヒポミセス・ロセラス(Hypomy
ces rosellus)種に属するかびがヒポミセス・ロセラス
(Hypomyces rosellus)IFO6911株、ヒポミセス・クリソ
スペルムス(Hypomyces chrysospermus)種に属するかび
がヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysospe
rmus)IFO6817株であり、ヒポミセス・セプルクラリス(H
ypomyces sepulcralis)種に属するかびがヒポミセス・
セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)IFO9102株であ
り、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subicul
osus)種に属するかびがヒポミセス・スビキュロスアス
(Hypomyces subiculosus)IFO6892株であり、ヒポミセス
・ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）種に属するか
びがヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）ATCC76474株またはIFO 6785株であり、フザリウム・
ソラニ(Fusarium solani)種に属するかびがフザリウム
・ソラニ(Fusarium solani) IFO 9974 株またはIFO 9
975株であり、オーリクラリア・オーリキュラジュダエ
(Auricularia auriculajudae)種に属するかびがオーリ
クラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auricul
ajudae)IFO5949株であり、フィシウム・アハニデルマタ
ム(Pythium aphanidermaatum)種に属するかびがフィシ
ウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatum)IFO
7030株であり、メニスポロプシス・ノバエゼランディア
(Menisporopsis novaezelandiae)種に属するかびがメニ
スポロプシス・ノバエゼランディア(Menisporopsis nov
aezelandiae)IFO9179株である、請求項３に記載のD-ア
ミノアシラーゼ。 - 【請求項５】 下記の(a) から(f)の理化学的性質を有
する、かび由来のD-アミノアシラーゼ。 (a) 作用：N-アセチル-D-アミノ酸に作用して、D-アミ
ノ酸を生じる。 (b) 分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
ける分子量が約64000Daであり、Superdex200 Hi-Load 6
/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）ゲルろ過クロ
マトグラフィーによる分子量が約56000Daを示す。 (c) 基質特異性：N-アセチル-D-トリプトファン、N-ア
セチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-D-バリン、N-
アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチオニンに作用
し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-アセチル-L-フェ
ニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-アセチル-L-ロ
イシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用しない。 (d) 温度安定性：pH 9.5で30分間熱処理した場合、45℃
では安定であり、60℃以上では失活する。 (e) 至適温度：pH 7.5で反応させる場合、温度約45℃に
おいて作用が至適である。 (f) 安定化剤：還元剤によって、その活性が安定に保持
され、さらにICH3CONH2で活性化される。 - 【請求項６】 ヒポミセス（Hypomyces）属に属するか
びに由来する請求項５のD-アミノアシラーゼ。 - 【請求項７】 ヒポミセス（Hypomyces）属に属するか
びがヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）種である請求項６記載のD-アミノアシラーゼ。 - 【請求項８】 ヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces
mycophilus）種に属するかびがヒポミセス ミコフィラ
ス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはIFO 678
5株である請求項７記載のD-アミノアシラーゼ。 - 【請求項９】 配列番号：１から５に記載のアミノ酸配
列を含む、請求項５から８のいずれかに記載のD-アミノ
アシラーゼ。 - 【請求項１０】 請求項５から９のいずれか記載のD-ア
ミノアシラーゼをコードするDNA。 - 【請求項１１】 D-アミノアシラーゼ生産能を有するか
びを、下記式（I） 【化１】 （式中、R1、R2は、同一または異なっていてもよい、水
素原子または置換基を有していてもよい炭化水素基を示
す。ただし、R2は水素原子ではない。また、XはH、NH
4、金属原子）で表されるN-アシル-DL-アミノ酸または
その塩に作用させることを特徴とする、D-アミノ酸の製
造方法。 - 【請求項１２】 かび由来のD-アミノアシラーゼを、上
記式（I）で表されるN-アシル-DL-アミノ酸およびその
塩に作用させることを特徴とする、D-アミノ酸の製造方
法。 - 【請求項１３】 かびがヒポミセス（Hypomyces）、フ
ザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricularia)、
フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属からなる群より選択される属に属する、請求項１１
または１２に記載のD-アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１４】 ヒポミセス（Hypomyces）属に属する
かびがヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces aurant
ius)種、ヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broom
eanus)種、ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces c
hrysospermus)種、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces ro
sellus)種、ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces se
pulcralis)種、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyc
es subiculosus)種、またはヒポミセス・ミコフィラス
（Hypomyces mycophilus）種であり、フザリウム(Fusar
ium)属に属するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium so
lani)種であり、オーリクラリア(Auricularia)属に属す
るかびがオーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auric
ularia auriculajudae)種であり、フィシウム(Pythium)
属に属するかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythi
um aphanidermaatum)種であり、メニスポロプシス(Meni
sporopsis)属に属するかびがメニスポロプシス・ノバエ
ゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種であ
る、請求項１３に記載のD-アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１５】 ヒポミセス・アウランチアス(Hypomyc
es aurantius)種に属するかびがヒポミセス・アウラン
チアス(Hypomyces aurantius)IFO6847株であり、ヒポ
ミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種に属
するかびがヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces bro
omeanus)IFO9164株であり、ヒポミセス・ロセラス(Hypo
myces rosellus)種に属するかびがヒポミセス・ロセラ
ス(Hypomyces rosellus)IFO6911株、ヒポミセス・クリ
ソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)種に属するか
びがヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysos
permus)IFO6817株であり、ヒポミセス・セプルクラリス
(Hypomyces sepulcralis)種に属するかびがヒポミセス
・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)IFO9102株で
あり、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subic
ulosus)種に属するかびがヒポミセス・スビキュロスア
ス(Hypomyces subiculosus)IFO6892株であり、ヒポミセ
ス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）種に属する
かびがヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）ATCC76474株またはIFO 6785株であり、フザリウム・
ソラニ(Fusarium solani)種に属するかびがフザリウム
・ソラニ(Fusarium solani) IFO 9974 株またはIFO 9
975株であり、オーリクラリア・オーリキュラジュダエ
(Auricularia auriculajudae)種に属するかびがオーリ
クラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auricul
ajudae)IFO5949株であり、フィシウム・アハニデルマタ
ム(Pythium aphanidermaatum)種に属するかびがフィシ
ウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatum)IFO
7030株であり、メニスポロプシス・ノバエゼランディア
(Menisporopsis novaezelandiae)種に属するかびがメニ
スポロプシス・ノバエゼランディア(Menisporopsis nov
aezelandiae)IFO9179株である、請求項１４記載のD-ア
ミノ酸の製造方法。 - 【請求項１６】 D-アミノアシラーゼが下記の(a) から
(f)の理化学的性質を有する、請求項１１または１２に
記載のD-アミノ酸の製造方法。 (a) 作用：N-アセチル-D-アミノ酸に作用して、D-アミ
ノ酸を生じる。 (b) 分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
ける分子量が約64000Daであり、Superdex200 Hi-Load 6
/16（Amersham Pharmacia Biotech社製）ゲルろ過クロ
マトグラフィーによる分子量が約56000Daを示す。 (c) 基質特異性：N-アセチル-D-トリプトファン、N-ア
セチル-D-フェニルアラニン、N-アセチル-D-バリン、N-
アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-メチオニンに作用
し、N-アセチル-L-トリプトファン、N-アセチル-L-フェ
ニルアラニン、N-アセチル-L-バリン、N-アセチル-L-ロ
イシン、N-アセチル-L-メチオニンに作用しない。 (d) 温度安定性：pH 9.5で30分間熱処理した場合、45℃
では安定であり、60℃以上では失活する。 (e) 至適温度：pH 7.5で反応させる場合、温度約45℃に
おいて作用が至適である。 (f) 安定化剤：還元剤によって、その活性が安定に保持
され、さらにICH3CONH2で活性化される。 - 【請求項１７】 D-アミノアシラーゼがヒポミセス（Hy
pomyces）属に属するかびに由来する、請求項１６記載
のD-アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１８】 ヒポミセス（Hypomyces）属に属する
かびがヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyces mycophil
us）種である、請求項１７記載のD-アミノ酸の製造方
法。 - 【請求項１９】 ヒポミセス・ミコフィラス（Hypomyce
s mycophilus）種に属するかびがヒポミセス ミコフィ
ラス（Hypomyces mycophilus）ATCC76474株またはIFO 6
785株である、請求項１８記載のD-アミノ酸の製造方
法。 - 【請求項２０】 D-アミノアシラーゼが配列番号：１か
ら５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１６から１９
のいずれかに記載のD-アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２１】 上記式（I）においてR1、R2が、同一
または異なっていてもよい、アルキル基、アルケニル
基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリル基、もし
くはアラルキル基またはそれらの誘導体である、請求項
１１から２０のいずれかに記載のD-アミノ酸の製造方
法。 - 【請求項２２】 R2がメチル基、クロロメチル基、フェ
ニル基またはアミノメチル基であり、R1がインドリル基
（N-アシル-DL-トリプトファン）、ベンジル基（N-アシ
ル-DL-フェニルアラニン）、チオメチルエチル基（N-ア
シル-DL-メチオニン）、イソプロピル基（N-アシル-DL-
バリン）、または2-メチル-プロピル基（N-アシル-DL-
ロイシン）である、請求項２１に記載のD-アミノ酸の製
造方法。 - 【請求項２３】 かびを培養することを特徴とする、D-
アミノアシラーゼの製造方法。 - 【請求項２４】 かびがヒポミセス（Hypomyces）、フ
ザリウム(Fusarium)、オーリクラリア(Auricularia)、
フィシウム(Pythium)、メニスポロプシス(Menisporopsi
s)属からなる群より選択される属に属する、請求項２３
記載のD-アミノアシラーゼの製造方法。 - 【請求項２５】 ヒポミセス（Hypomyces）属に属する
かびがヒポミセス・アウランチアス(Hypomyces aurant
ius)種、ヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broom
eanus)種、ヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces c
hrysospermus)種、ヒポミセス・ロセラス(Hypomyces ro
sellus)種、ヒポミセス・セプルクラリス(Hypomyces se
pulcralis)種、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyc
es subiculosus)種、またはヒポミセス・ミコフィラス
（Hypomyces mycophilus）種であり、フザリウム(Fusar
ium)属に属するかびがフザリウム・ソラニ(Fusarium so
lani)種であり、オーリクラリア(Auricularia)属に属す
るかびがオーリクラリア・オーリキュラジュダエ(Auric
ularia auriculajudae)種であり、フィシウム(Pythium)
属に属するかびがフィシウム・アハニデルマタム(Pythi
um aphanidermaatum)種であり、メニスポロプシス(Meni
sporopsis)属に属するかびがメニスポロプシス・ノバエ
ゼランディア(Menisporopsis novaezelandiae)種であ
る、請求項２４記載のD-アミノアシラーゼの製造方法。 - 【請求項２６】 ヒポミセス・アウランチアス(Hypomyc
es aurantius)種に属するかびがヒポミセス・アウラン
チアス(Hypomyces aurantius)IFO6847株であり、ヒポ
ミセス・ブルーメアナス(Hypomyces broomeanus)種に属
するかびがヒポミセス・ブルーメアナス(Hypomyces bro
omeanus)IFO9164株であり、ヒポミセス・ロセラス(Hypo
myces rosellus)種に属するかびがヒポミセス・ロセラ
ス(Hypomyces rosellus)IFO6911株、ヒポミセス・クリ
ソスペルムス(Hypomyces chrysospermus)種に属するか
びがヒポミセス・クリソスペルムス(Hypomyces chrysos
permus)IFO6817株であり、ヒポミセス・セプルクラリス
(Hypomyces sepulcralis)種に属するかびがヒポミセス
・セプルクラリス(Hypomyces sepulcralis)IFO9102株で
あり、ヒポミセス・スビキュロスアス(Hypomyces subic
ulosus)種に属するかびがヒポミセス・スビキュロスア
ス(Hypomyces subiculosus)IFO6892株であり、ヒポミセ
ス・ミコフィラス（Hypomyces mycophilus）種に属する
かびがヒポミセス ミコフィラス（Hypomyces mycophilu
s）ATCC76474株またはIFO 6785株であり、フザリウム・
ソラニ(Fusarium solani)種に属するかびがフザリウム
・ソラニ(Fusarium solani) IFO 9974 株またはIFO 9
975株であり、オーリクラリア・オーリキュラジュダエ
(Auricularia auriculajudae)種に属するかびがオーリ
クラリア・オーリキュラジュダエ(Auricularia auricul
ajudae)IFO5949株であり、フィシウム・アハニデルマタ
ム(Pythium aphanidermaatum)種に属するかびがフィシ
ウム・アハニデルマタム(Pythium aphanidermaatum)IFO
7030株であり、メニスポロプシス・ノバエゼランディア
(Menisporopsis novaezelandiae)種に属するかびがメニ
スポロプシス・ノバエゼランディア(Menisporopsis nov
aezelandiae)IFO9179株である、請求項２５記載のD-ア
ミノアシラーゼの製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10228636A JP2000041684A (ja) | 1998-07-29 | 1998-07-29 | 新規なｄ−アミノアシラーゼおよびその製造方法、並びに該ｄ−アミノアシラーゼを利用したｄ−アミノ酸の製造方法 |
| US09/361,901 US6514742B1 (en) | 1998-07-29 | 1999-07-27 | D-aminoacylases, method for producing the same, and method for producing D-amino acids using the same |
| DE69922301T DE69922301T2 (de) | 1998-07-29 | 1999-07-29 | D-aminoacylasen aus Pilzen und Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren |
| EP99114877A EP0976828B1 (en) | 1998-07-29 | 1999-07-29 | Fungal D-aminoacylases and method for producing D-amino acids |
| US10/242,378 US6905861B2 (en) | 1998-07-29 | 2002-09-10 | D-aminoacylases, method for producing the same, and method for producing D-amino acids using the same |
| US10/348,455 US20030170869A1 (en) | 1998-07-29 | 2003-01-17 | D-aminoacylases, method for producing the same, and method for producing D-amino acids using the same |
Applications Claiming Priority (1)
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