DE69922301T2

DE69922301T2 - D-aminoacylasen aus Pilzen und Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren

Info

Publication number: DE69922301T2
Application number: DE69922301T
Authority: DE
Inventors: Kazuya Tsukuba-shi Mitsuhashi; Hiroaki Tsukuba-shi Yamamoto; Akinobu Tsukuba-shi Matsuyama; Shinji Shizuoka-shi Tokuyama
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: DE69922301D1; US6514742B1; EP0976828A1; EP0976828B1; US20030170869A1; US6905861B2; JP2000041684A; US20030113893A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine D-Aminoacylase, die von Pilzen produziert wird, ein Verfahren zur Herstellung dieser D-Aminoacylase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, wobei diese D-Aminoacylase verwendet wird.
Enzyme besitzen ausgezeichnete katalytische Funktionen mit Substratspezifität, Reaktionsspezifität und Stereospezifität. Stereospezifität liegt bei Enzymen von einigen Ausnahmen abgesehen nahezu uneingeschränkt vor.
Kürzlich durchgeführte exakte Forschung hat die Bedeutung der Verwendung von optisch aktiven Substanzen in Arzneimitteln, Pestiziden, Speisen und Parfüms verstärkt. Optische Isomere besitzen manchmal ziemlich voneinander verschiedene biologische Aktivität. Die D(R)-Form von Thalidomid hat keine teratogene Aktivität, seine L(S)-Form zeigt jedoch starke Teratogenizität. Die praktische Verwendung von Thalidomid-Racemat verursachte Arzneimittel-Schädigungs-Vorfälle. Wenn ein Enantiomer eine wirkungsvolle biologische Aktivität zeigt, kann das andere Enantiomer manchmal keine Aktivität besitzen, im Gegenteil, es kann die Aktivität des wirkungsvollen Enantiomers hemmen. In einigen Fällen wird die Aktivität des Racemats auf die Hälfte oder weniger der Aktivität des wirkungsvollen Enantiomers reduziert. Demgemäß ist es von industrieller Bedeutung optisch reine Enantiomere zu erhalten (zu synthetisieren oder optisch aufzulösen). Für diesen Zweck sind Verfahren zur wirkungsvollen Auflösung synthetischer Racemate weitläufig verwendet worden. Die enzymatische optische Auflösung hat die Aufmerksamkeit auf sich gezogen, weil sie keine Nebenprodukte und großen Mengen an flüssigem Abfall produziert.
Im Allgemeinen werden L-Aminosäuren weitläufig und in hohem Maße für Gewürze, Lebensmittel und Speisezusätze und Infusionen verwendet und es besteht deshalb eine sehr hohe Nachfrage. L-Aminosäuren sind hauptsächlich mit Hilfe von direkter Fermentation hergestellt worden, wobei Mikroorganismen verwendet wurden. Die optische Auflösung ist auch ein bekanntes Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Hydrolyse von N-Acyl-DL-Aminosäuren, wobei L-Aminoacylasen verwendet werden. Es ist verwendet worden, um L-Aminosäuren industriell herzustellen, die mit Hilfe von Fermentation schwierig herzustellen sind. L-Aminoacylasen werden in Säugern, Pflanzen und Mikroorganismen weitläufig gefunden. Sie wurden von verschiedenen Organismen aufgereinigt und ihre Eigenschaften sind aufgeklärt worden. Man geht davon aus, dass N-terminale Aminosäuren von zahlreichen Proteinen in vivo N-acetyliert sind. L-Aminoacylasen regenerieren vermutlich N-Acetyl-Aminosäuren, die durch Abbau von Proteinen zu Aminosäuren entstanden sind. Unter den L-Aminoacylasen ist die Acylase, die auf N-Acyl-L-Glutaminsäure wirkt, wie berichtet wurde, bei der Arginin-Biosynthese beteiligt (Fruth, H., Leisinger, T.: J. Gen. Microb. 125, Sl (1981)).
Im Gegensatz dazu sind D-Aminosäuren für eine lange Zeit kein Gegenstand des Interesses gewesen, da es sich um nicht-Protein-Aminosäuren handelt. D-Aminosäuren waren dafür bekannt, dass sie in kleinen zyklischen Peptiden, Peptidoglycan bakterieller Zellwände und in Peptid-Antibiotika vorkommen. Es wurde jedoch gezeigt, dass D-Aminosäuren Bestandteile von Neuropeptiden sind und dass sie als Bindungsformen in Zahnschmelz, den Linsen und cerebralen Proteinen vorkommen, was in der Erforschung der physiologischen Bedeutung und der enzymatischen Synthese von D-Aminosäuren resultierte.
Gegenwärtig sind DL-Aminosäuren mit Hilfe von physicochemischen, chemischen und enzymatischen Verfahren optisch aufgelöst worden. Die enzymatischen Verfahren sind die dienlichsten und industriell anwendbar für zum Beispiel die fortlaufende Herstellung von L-Methionin aus N-Acetyl-DL-Methionin, wobei ein Bioreaktor mit immobilisierter L-Aminoacylase verwendet wird. D-Aminosäuren können auch unter Verwendung von Hydantoinase hergestellt werden. Das Verfahren besteht aus enzymatischen Zweischritt-Reaktionen. Die erste Reaktion verwendet D-spezifische Hydantoinase, um D, L-5-substituiertes Hydantoin, das mit niedrigen Kosten aus Aldehyd-Analogen synthetisiert wurde, in ein D-Carbamyl-Derivat umzuwandeln. Die zweite Reaktion verwendet D-Aminosäure-Carbamylase.
Ein anderes Verfahren umfasst die Hydrolyse von N-Acetyl-DL-Aminosäuren mit D-Aminoacylase, wobei D-Aminosäuren hergestellt werden (Sugie, M., Lin, C. S., Tseng, T. H., Lee, H. and Wang, Y. J.: J. Enzyme Microb. Technol. 14, 5. 384 (1992)).
Als erstes wurde berichtet, dass D-Aminoacylase in Pseudomonas sp. KT83 gefunden wird, der 1952 von Kameda et. al aus dem Erdreich isoliert wurde (Kameda, Y., Toyoura, H., Kimura, Y. and Yasuda, Y.: Nature 170, S. 888 (1952)). Dieses Enzym hydrolysierte N-Benzoyl-Derivate von D-Phenylalanin, D-Tyrosin und D-Alanin. Danach wurden D-Aminoacylasen aus Mikroorganismen erhalten, die zu der Gattung Pseudomonas gehören (Kubo, K., Ishikura, T. and Fukagawa, Y.: J. Antibiot. 43, S. 550 (1980), Kubo, K., Ishikura, T. and Fukagawa, Y.: J. Antibiot. 43, S. 556 (1980), Kameda, Y., Hase, T., Kanatomo, S. and Kita, Y.: Chem. Pharm. Bull. 26, S. 2698 (1978), Kubo, K., Ishikura, T. and Fukagawa, Y.: J. Antibiot. 43, S. 543 (1980)), der Gattung Streptomyces (Sugie, M. and Suzuki, H.: Argric. Biol. Chem. 44, S. 1089 (1980)) und der Gattung Alcaligenes (Tsai, Y. C., Tseng, C. P., Hsiao, K. M. and Chen, L. Y.: Appl. Environ. Microbiol. 54, S. 984 (1988), Yang, Y. B., Hsiao, K. M., Li, H., Yano, Y., Tsugita, A. and Tsai, Y. C.: Biosci. Biotech. Biochem. 56, S. 1392 (1992), Yang, Y. B., Lin, C. S., Tseng, C. P., Wang, Y. J. and Tsai, Y. C.: Appl. Environ. Microbiol. 57, S. 2767 (1991), Tsai, Y. C., Lin, C. S., Tseng, T. H., Lee, H. and Wang: Microb. Technol. 14, S. 384 (1992), Moriguchi, M. and Ideta, K.: Appl. Environ. Microbiol. 54, S. 2767 (1988), Sakai, K., Imamura, K., Sonoda, Y., Kido, H. and Moriguchi, M.: FEBS, 289, S. 44 (1991), Sakai, K., Obata, T., Ideta, K. and Moriguchi, M.: J. Ferment. Bioeng. 71, S. 79 (1991), Sakai, K., Oshima, K. and Moriguchi, M.: Appl. Environ. Microbiol. 57, S. 2540 (1991), Moriguchie, M., Sakai, K., Katsuno, Y., Maki, T. and Wakayama, M.: Biosci. Biotech. Biochem., 57, S. 1145 (1993), Kayama, M., Ashika, T., Miyamoto, Y., Yoshikawa, T., Sonoda, Y., Sakai, K. and Moriguchi, M.: J. Biochem. 118, S. 204 (1995), Moriguchi, M., Sakai, K., Miyamoto, Y. and Wakayama, M.: Biosci. Biotech. Biochem., 57, S. 1149 (1993)).
Tsai et al. und Moriguchi et al. klärten auch die Eigenschaften von D-Aminoacylase auf, die von Mikroorganismen abstammt, die zu der Gattung Alcaligenes und Pseudomonas gehören und die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen dieser Enzyme. Moriguchi et al. fanden heraus, dass Mikroorganismen, die zu der Gattung Alcaligenes und Pseudomonas gehören, drei Arten von D-Aminoacylasen produzierten, wobei verschiedene Induktoren verwendet wurden (Wakayama, M., Katsumo, Y., Hayashi, S., Miyamoto, Y., Sakai, K. and Moriguchi, M.: Biosci. Biotech. Biochem. 59, S. 2115 (1995)).
Darüber hinaus bestimmten Moriguchi et al. die Nucleotidsequenzen dieser D-Aminoacylase, die von einem Mikroorganismus abstammen, der zu der Gattung Alcaligenes gehört und verglichen diese mit L-Aminoacylasen, die von Bacillus stereothermophilus, Mensch und Schwein abstammen. Das Ergebnis zeigte, dass diese D-Aminoacylasen eine geringe Homologie mit L-Aminoacylasen aufweisen (Wakayama, M., Katsuno, Y., Hayashi, S., Miyamoto, Y., Sakai, K. and Moriguchi, M.: Biosci. Biotech. Biochem., 59 S. 2115 (1995)).
Sugie et al. berichteten D-Aminoacylase von einem Mikroorganismus, der zu der Gattung Streptomyces von Actinomyceten gehört (Sugie, M. and Suzuki, H.: Argric Biol. Chem. 42, S. 107 (1978), Sugie, M. and Suzuki, H.: Argric. Biol. Chem. 44, S. 1089 (1980)). Das Enzym wurde bis jetzt jedoch noch nicht aufgereinigt und seine Eigenschaften bleiben unbekannt.
Wie vorstehend beschrieben sind zahlreiche D-Aminoacylasen aus Bakterien isoliert worden und sind verwendet worden, um D-Aminosäuren herzustellen. Die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, wobei Bakterien verwendet werden, besitzen die nachfolgenden Probleme.
Die meisten der herkömmlichen D-Aminoacylasen sind induzierbare Enzyme und im Allgemeinen ist N-Acetyl-DL-Aminosäure für deren Herstellung erforderlich. Das Kulturmedium des Bakteriums, das für die Herstellung von D-Aminoacylase verwendet wurde, enthält die nicht umgesetzte N-Acetyl-D-Aminosäure sowie das Degradationsprodukt der D-Aminosäure. Um D-Aminoacylase, die von diesen Bakterien hergestellt wurde, mit einem anderen Substrat als N-Acetyl-D-Aminosäure, die als der Enzym-Induktor verwendet wurde, umzusetzen, war es notwendig die gezüchteten Bakterien aus dem Wachstumsmedium zu isolieren. Sogar wenn das Enzym mit N-Acetyl-D-Aminosäure als Substrat reagiert, müssen die Bakterien entfernt werden, um die hergestellte D-Aminosäure aufzureinigen. Im Allgemeinen wurden eine kontinuierliche Zentrifuge wie eine Westfalia-Zentrifuge und eine Sharples-Zentrifuge verwendet, um die gezüchteten Bakterien zu entfernen. Ein Problem der Zentrifugation ist, dass es längere Zeit dauert ein großes Volumen Kulturmedium zu zentrifugieren, was häufig die Inaktivierung von D-Aminoacylase während der Zentrifugation verursacht. Darüber hinaus lysieren die Bakterien und Actinomyceten, während die Umsetzung fortdauert und sind somit schwierig durch Zentrifugation abzutrennen. Wie vorstehend beschrieben werden D-Aminosäuren mit Hilfe herkömmlicher bakterieller D-Aminoacylase nicht immer wirkungsvoll produziert.
Somit ist das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung obliegt, Mittel und Verfahren bereitzustellen, um D-Aminosäuren wirkungsvoll und ökonomisch herzustellen. Die Lösung des technischen Problems wird durch Bereitstellung der Ausführungsformen erhalten, die in den Ansprüchen charakterisiert sind.
Um die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen, wurde versucht D-Aminosäuren herzustellen, wobei Pilze verwendet wurden, was eukaryontische Zellen sind, die mit Tieren und Pflanzen eine gemeinsame Zellstruktur und viele chemische Eigenschaften und Funktionen teilen (eukaryontische Merkmale). Pilze sind im Nachfolgenden von Vorteil: (1) Pilzzellen sind groß und faserartig und können somit leicht durch Filtration aus der flüssigen Kultur gesammelt werden; (2) Pilze verwenden wirkungsvoll Kohlenhydrate und sind in der Lage bei einem hohen Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis schneller als gewöhnlich zu wachsen, was die Kosten für Fermentations-Materialien pro Einheit Enzym reduziert; (3) Pilze können ökonomisch in einer festen Kultur gezüchtet werden (d. h. ohne eine Flüssigkultur), da sie unter natürlichen Sauerstoff-Bedingungen wachsen; das überträgt sich in geringere Investition in die Apparatur, Enzym-Produktion in hoher Konzentration und weniger organische Lösungsmittel, um die Enzyme zu extrahieren; (4) Pilze sind in der Lage in der festen Kultur mit einem niedrigen aktiven Wasserspiegel gut zu wachsen, was die Kontamination mit Bakterien verhindern kann, die in einem niedrigen aktiven Wasserspiegel schlecht wachsen; und (5) die meisten Pilze verwenden wirkungsvoll Stärke, Cellulose und Proteine, einschließlich kostengünstige Nährstoffquellen wie den Maniuk (Cassava) als eine Stärkequelle, Weizenflocken, Reis, Reisflocken, Gerste, Weizen, Sojabohne und Cellulose-Quellen.
Bisher wurde kein Pilz berichtet, der D-Aminoacylase produziert.
D-Aminoacylase-produzierende Pilze wurden durchmustert, und es wurde gefunden, dass zahlreiche Pilze, die zu der Gattung Hypomyces, Fusarium, Auricularia, Pythium und Menisporopsis gehören, D-Aminosäure aus N-Acetyl-D-Aminosäure herstellen können. Diese Pilze besitzen somit D-Aminoacylase-Aktivität.
Es konnte somit gelingen D-Aminoacylasen aus Pilzen mit D-Aminoacylase-Aktivität zu isolieren und aufzureinigen, indem ein Aussalzen mit Ammoniumsulfat und verschiedenen Chromatographie-Schritten durchgeführt wurde. Darüber hinaus studierten die Erfinder verschiedene physikochemische Eigenschaften der gereinigten D-Aminoacylasen, wie deren Substratspezifität und Thermostabilität, was versicherte, dass D-Aminosäure durch Umsetzung von N-Acetyl-D-Aminosäure mit der Pilz-D-Aminoacylase unter den geeigneten Bedingungen wirkungsvoll hergestellt werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist die erste, die D-Aminoacylase in Eukaryonten, Pilzen, beschreibt. Das Enzym wurde ausschließlich in Prokaryonten, Bakterien und Actinomyceten gefunden. Die Pilz-D-Aminoacylase kann verwendet werden, um D-Aminosäuren herzustellen. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine D-Aminoacylase, die von Pilzen produziert wird, ein Verfahren zur Herstellung dieser D-Aminoacylase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, wobei diese D-Aminoacylase verwendet wird. Mehr spezifisch beschreibt die vorliegende Erfindung eine D-Aminoacylase, die von einem Pilz abstammt. In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Pilz-D- Aminoacylase bereit, die die nachstehenden physikochemischen Eigenschaften (a) bis (f) hat;

(a) Funktion: das Enzym wirkt auf N-Acetyl-D-Aminosäuren, wobei die entsprechenden D-Aminosäuren produziert werden;
(b) Molekulargewicht: das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms wird mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf etwa 64 000 Daltons und mit der Gelfiltrations-Chromatographie über Superdex^TM 200 Hi-Load^TM 6/16 (Amersham Pharmacia Biotech) auf etwa 56 000 Daltons geschätzt;
(c) Substratspezifität: das Enzym wirkt auf N-Acetyl-D-Tryptophan, N-Acetyl-D-Phenylalanin, N-Acetyl-D-Valin, N-Acetyl-D-Leucin und N-Acetyl-D-Methionin, aber nicht auf N-Acetyl-L-Tryptophan, N-Acetyl-L-Phenylalanin, N-Acetyl-Valin, N-Acetyl-L-Leucin oder N-Acetyl-L-Methionin;
(d) Hitzestabilität: beim Erhitzen bei pH 9,5 für 30 Minuten ist das Enzym bei 45°C stabil, wird aber bei mehr als 60°C inaktiviert;
(e) Optimale Temperatur für die Aktivität: für die Reaktion bei pH 7,5 ist die Enzymaktivität bei etwa 45°C optimal; und
(f) Stabilisator: die Enzymaktivität wird durch Reduktionsmittel stabilisiert, und durch ICH₂CONH₂ weiter aktiviert.

Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine DNA, die die vorstehend beschriebene D-Aminoacylase codiert.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, wobei das Verfahren das Umsetzen der Pilz-D-Aminoacylase oder des Pilzes, der diese D-Aminoacylase produziert, mit N-Acyl-DL-Aminosäure oder ihrem Salz, der Formel (I) umfasst:
(I)
wobei die Reste R₁ und R₂ gleich oder verschieden sein können und jeder Rest ein Wasserstoffatom oder ein substituierter und unsubstituierter Kohlenwasserstoffrest ist, mit der Maßgabe, dass der Rest R₂ kein Wasserstoffatom ist, und X ein Wasserstoffatom, eine NH₄-Gruppe oder ein Metall-Ion ist.
Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminoacylase bereit, wobei dieses Verfahren das Züchten eines Pilzes umfasst.
Die Figuren zeigen:
1 zeigt die Aufreinigung der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase durch DEAE-Sepharose^TM FF 5,0/25 Anionenaustausch-Chromatographie.
2 zeigt die Aufreinigung der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase durch Phenyl-Sepharose^TM Hi-Load^TM HP 2,6/10 hydrophobe Chromatographie.
3 zeigt die Aufreinigung der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase durch Superdex^TM 200 Hi-Load^TM 1,6/60 Gelfiltrations-Chromatographie.
4 zeigt das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase, gemessen durch Superdex^TM 200 Hi-Load^TM 1,6/60 Gelfiltrations-Chromatographie.
5 zeigt das Elektrophoretogramm der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase durch SDS-PAGE.
6 zeigt den optimalen pH-Wert für die Reaktivität der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase. Die schwarze Raute zeigt die Enzymaktivität in AcONa × AcOH an; das schwarze Quadrat die Aktivität in K₂HPO₄ × KH₂PO₄; das schwarze Dreieck die Aktivität in Tris-HCl; und der schwarze Kreis die Aktivität in Glycin × NaOH.
7 zeigt die optimale Temperatur für die Reaktivität der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase.
8 zeigt die pH-Stabilität der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase.
9 zeigt die Hitzestabilität der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase.
"D-Aminoacylase", wie hierin verwendet, bedeutet ein Enzym, das mit einer N-Acyl-D-Aminosäure reagiert, um die Herstellung einer organischen Säure und einer D-Aminosäure zu katalysieren. Die erfindungsgemäße Pilz-D-Aminoacylase kann durch Züchten von Pilzen hergestellt werden, denen erlaubt wird, diese zu produzieren. D-Aminoacylase-produzierende Pilze, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie in der Lage sind D-Aminoacylase zu produzieren. Pilze, die in der Lage sind D-Aminoacylase zu produzieren, beinhalten diejenigen, die zu der Gattung Hypomyces, Fusarium, Auricularia, Pythium und Menisporopsis gehören, sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
Beispiele für Pilze, die zu der Gattung Hypomyces gehören, beinhalten die Arten Hypomyces aurantius, Hypomyces broomeanus, Hypomyces chrysospermus, Hypomyces rosellus, Hypomyces sepulcralis, Hypomyces subicolosus und Hypomyces mycophilus. Die Pilze, die zu der Gattung Fusarium gehören, beinhalten die Art Fusarium solani. Die Pilze, die zu der Gattung Auricular gehören, beinhalten die Art Auricular auriculajudae. Die Pilze, die zu der Gattung Pythium gehören, beinhalten die Art Pythium aphanidermaatum. Die Pilze, die zu der Gattung Menisporopsis gehören, beinhalten die Art Menisporopsis novaezelandiae. Die Pilze, die verwendet werden können, sind jedoch nicht auf diese Arten begrenzt.
Mehr spezifisch kann D-Aminoacylase von Hypomyces aurantius IFO 6847, Hypomyces broomeanus IFO 9164, Hypomyces rosellus IFO 6911, Hypomyces chrysospermus IFO 6817, Hypomyces sepulcralis IFO 9102, Hypomyces subicolosus IFO 6892, Hypmyces mycophilus ATCC 76474 oder IFO 6785, Fusarium solani IFO 9974 oder IFO 9975, Auricularia auriculajudae IFO 5949, Pythium aphanidermaatum IFO 7030, oder Menisporopsis novaezelandiae IFO 9179 abstammen. Die zu verwendenden Pilze sind jedoch nicht auf diese Stämme eingeschränkt.
Die vorstehenden Mikroorganismen mit IFO-Nummern werden in der Liste der Kulturen, 10. Ausgabe (1996) rezitiert, die vom Institute of Fermentation Research, Osaka (IFO) veröffentlicht wurde und sind vom IFO erhältlich. Die vorstehenden Mikroorganismen mit ATCC-Nummern werden im ATCC^TM-Katalog auf CD, Ausgabe 1995 rezitiert, die von der "Amercian Type Culture Collection (ATCC)" bereitgestellt wird, und sind von der ATCC erhältlich.
D-Aminoacylase-produzierende Pilze können unter Verwendung von herkömmlichen Fermentations-Verfahren gezüchtet werden. Es können entweder synthetische oder natürliche Medien verwendet werden, solange sie angemessene Mengen der Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Materialien und andere Nährstoffe enthalten. Das Kulturmedium kann entweder flüssig oder fest sein. Mehr spezifisch, wenn man die geplante Verwendung der Pilze betrachtet, beinhalten Beispiele der Kohlenstoffquellen Zucker wie Glucose, Fructose, Maltose, Galactose, Stärke, Stärke-Hydrolysate, Molassen und Melassen; natürliche Produkte wie Weizen, Hafer und Korn; Alkohole wie Glycerin, Methanol und Ethanol; aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Essigsäure, Glukonsäure, Brenztraubensäure und Citronensäure; Kohlenwasserstoffe wie normales Paraffin und Aminosäuren wie Glycin, Glutamin und Asparagin. In Abhängigkeit von der Assimilationsfähigkeit des verwendeten Pilzes kann eine oder können mehrere der vorstehenden Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele für die Stickstoff-Quellen beinhalten organische Stickstoffenthaltende Verbindungen, wie Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Sojabohnen-Hydrolysat, Milch-Casein, Casaminosäuren, verschiedene Aminosäuren, Korn-Weichen-Flüssigkeit und andere Hydrolysate von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen; und anorganische Stickstoff-enthaltende Verbindungen wie Ammonium, Ammoniumsalze wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Nitrate wie Natriumnitrat und Harnstoff. In Abhängigkeit der Assimilationsfähigkeit des Pilzes kann eine oder können mehrere der vorstehenden Stickstoff-Quellen verwendet werden.
Zur wirkungsvollen Herstellung von D-Aminoacylase durch Pilze, kann, in Abhängigkeit von dem verwendeten Pilz, N-Acetyl-DL-Aminosäure als Enzym-Induktor verwendet werden.
Darüber hinaus kann eine geringe Menge eines oder mehrerer anorganischer Salze verwendet werden. Beispiele dafür beinhalten Phosphatasen; Kohlenwasserstoffe; Nitrate, Acetate oder ähnliche Salze aus Magnesium, Mangan, Kalium, Kalzium, Natrium, Kupfer oder Zink. Antischaummittel wie Gemüseöl, Tenside oder Silikon können dem Kulturmedium hinzugefügt werden.
Das Züchten kann in dem flüssigen Medium durchgeführt werden, das die vorstehend beschriebenen Inhaltsstoffe enthält, wobei die herkömmlichen Züchtungsverfahren verwendet werden, wie Schüttelkultur, belüftete Rührkultur, fortlaufende Kultur oder großtechnische Kultur.
Die Züchtungsbedingungen können in Abhängigkeit von dem Pilzstamm und dem Züchtungsverfahren in angemessener Weise ausgewählt werden und sind nicht in besonderer Weise eingeschränkt, solange der verwendete Pilz proliferieren kann, um D-Aminoacylase zu produzieren. Es wird gewöhnlich bevorzugt den Ausgangs-pH-Wert auf 4 bis 10 einzustellen, vorzugsweise 6 bis 8 und bei einer Temperatur von 15 bis 50°C zu züchten, vorzugsweise 25 bis 35°C. Die Züchtungsdauer wird ebenfalls nicht besonders eingeschränkt, solange ausreichende Mengen von Pilzzellen erhalten werden können, die D-Aminoacylase-Aktivität besitzen. Die Züchtung wird gewöhnlich von 1 bis 14 Tage durchgeführt, vorzugsweise von 1 bis 3 Tage. D-Aminoacylase, die hergestellt und in der Kultur angereichert wurde, kann mit Hilfe der nachfolgenden Verfahren gewonnen und isoliert werden.
Wenn D-Aminoacylase intrazellulär produziert wird, werden die Pilzzellen nach der Züchtung durch Filtrierung oder Zentrifugation gesammelt und mit Puffer, physiologischer Kochsalzlösung etc. gewaschen. Das Enzym kann dann durch Aufbrechen der Pilzzellen extrahiert werden, wobei physikalische Mittel verwendet werden, wie Einfrieren und Auftauen, Ultraschall, Druck, osmotische Behandlung oder Zerreibung; unter Verwendung von biochemischen Mitteln wie Zellwand-Lyse mit Lysozym; oder chemische Mittel unter Verwendung von chemischen Mitteln wie Tensid-Behandlung. Eine dieser Behandlungen kann verwendet werden oder es können mehrere dieser Behandlungen kombiniert werden. Der so erhaltene Rohextrakt von D-Aminoacylase kann mit einem einzigen oder mit kombinierten Fraktionierungsverfahren gereinigt werden, die Folgendes beinhalten; Aussalzen; fraktionierte Fällung mit organischen Lösungsmitteln; verschiedene Chromatographie-Arten wie Aussalzungs-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Farbstoff-Chromatographie, Hydroxyl-Apatit-Chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie; und Elektrophorese, wie isoelektrische Fokussierung und native Elektrophorese. Die vorstehenden Chromatographien können durchgeführt werden, wobei offene Säulen verwendet werden oder mit Hilfe von mittlerem Druck- oder Hochdurchsatz-Flüssig-Chromatographie (HPLC).
Die Pilzzellen, die zum Beispiel durch Filtrierung gesammelt wurden, werden eingefroren und aufgetaut und mit Hilfe eines Dyno Mill zerrieben, um einen D-Aminoacylase-Extrakt zu erhalten. Der Extrakt wird dann schrittweise dem Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Ionenaustausch-Chromatographie über DEAE-Sepharose^TM FF, hydrophobe Chromatographie an Phenyl-Sepharose^TM FF, Sephadex^TM 200 Gelfiltrations-Chromatographie oder Mono Q^TM-Ionenaustausch-Chromatographie unterzogen. Das auf diese Art und Weise gereinigte Enzym kann in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als ein einzelnes Protein nachgewiesen werden.
Die erfindungsgemäße Pilz-D-Aminoacylase hat die nachfolgenden physikochemischen Eigenschaften (a) bis (f):

(a) Funktion: das Enzym wirkt auf N-Acetyl-D-Aminosäuren, wobei die entsprechenden D-Aminosäuren produziert werden;
(b) Molekulargewicht: das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms wird mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf etwa 64 000 Daltons und mit der Gelfiltrations-Chromatographie an Superdex^TM 200 Hi-Load^TM 6/16 (Amersham Pharmacia Biotech) auf etwa 56 000 Daltons geschätzt;
(c) Substratspezifität: das Enzym wirkt auf N-Acetyl-D-Tryptophan, N-Acetyl-D-Phenylalanin, N-Acetyl-D-Valin, N-Acetyl-D-Leucin und N-Acetyl-D-Methionin, aber nicht auf N-Acetyl-L-Tryptophan, N-Acetyl-L-Phenylalanin, N-Acetyl-Valin, N-Acetyl-L-Leucin oder N-Acetyl-L-Methionin;
(d) Hitzestabilität: beim Erhitzen bei pH 9,5 für 30 Minuten ist das Enzym bei 45°C stabil, wird aber bei mehr als 60°C inaktiviert;
(e) Optimale Temperatur für die Aktivität: für die Reaktion bei pH 7,5 ist die Enzymaktivität bei etwa 45°C optimal; und
(f) Stabilisator: die Enzymaktivität wird durch Reduktionsmittel stabilisiert und durch ICH₂CONH₂ weiter aktiviert.

Die erfindungsgemäße D-Aminoacylase, die die vorstehenden Eigenschaften besitzt, stammt vorzugsweise von Pilzen, die zu der Gattung Hypomyces gehören, mehr bevorzugt von der Art Hypomyces mycophilus und noch mehr bevorzugt von dem Stamm Hypomyces mycophilus ATCC 76474 oder IFO 6785. Das Enzym kann die Aminosäuresequenzen enthalten, die in den SEQ ID-Nrn: 1 bis 5 enthalten sind.
Erfindungsgemäße D-Aminoacylase ist in der Lage auf verschiedene N-Acyl-D-Aminosäuren zu wirken, wobei die entsprechenden D-Aminosäuren erhalten werden, was die vorteilhafte industrielle Produktion der D-Aminosäuren ermöglicht, wobei dieses Enzym verwendet wird. D-Aminosäure kann zum Beispiel selektiv hergestellt werden, indem N-Acyl-DL-Aminosäure, ein Gemisch von D- und L-Enantiomeren, mit der erfindungsgemäßen D-Aminoacylase umgesetzt wird.
N-Acyl-DL-Aminosäuren, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, sind nicht besonders eingeschränkt und können aus einer großen Vielzahl von Verbindungen ausgewählt werden. Eine typische N-Acyl-DL-Aminosäure kann durch die Formel (I) repräsentiert werden:
(I)
wobei die Reste R₁ und R₂ gleich oder verschieden sein können und jeder Rest ein Wasserstoffatom oder ein substituierter oder unsubstituierter Kohlenwasserstoffrest ist, mit der Maßgabe, dass der Rest R₂ kein Wasserstoffatom ist; und X ein Wasserstoffatom, eine NH₄-Gruppe oder ein Metall-Ion ist.
Der Kohlenwasserstoffrest, der durch R₁ und R₂ repräsentiert ist, ist vorzugsweise ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Rest, der substituiert sein kann. Mehr spezifisch beinhaltet der Kohlenwasserstoffrest lineare oder verzweigte Alkyl-Reste wie einen Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl-, n-Butyl-, i-Butyl-, sek-Butyl-, t-Butyl-, n-Pentyl-, i-Pentyl-, n-Hexyl- Rest etc.; Alkenyl-Reste wie Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 2-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Hexenyl, 3-Hexenyl, 5-Hexenyl, etc.; Alkynyl-Reste wie Ethinyl, 1-Propinyl, 2-Pentinyl etc.; Aryl-Reste wie Phenyl, Naphthyl etc.; Cycloalkyl-Reste wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl etc. Der Substituent des Kohlenwasserstoffrestes für R₁ und R₂ beinhaltet Halogen; Alkyl, wie vorstehend definiert; Alkenyl, wie vorstehend definiert; Alkinyl, wie vorstehend definiert; Aryl wie vorstehend definiert; heterocyclische Reste wie Piridyl, Indol, Quinolyl etc.; Amino-Hydroxyl; Thio etc. R₁ ist vorzugsweise Indolyl (N-Acyl-DL-Tryptophan), Benzyl (N-Acyl-DL-Phenylalanin), Thiomethylethyl (N-Acyl-DL-Methionin), Isopropyl (N-Acyl-DL-Valin) oder 2-Methylpropyl (N-Acyl-DL-Leucin). R₂ ist vorzugsweise Methyl, Chlormethyl, Phenyl oder Aminomethyl, die mit dem (den) vorstehenden Substituenten substituiert sein können. Das Metall-Ion, das durch X repräsentiert wird, beinhaltet Natrium, Kalium etc. Bevorzugte Beispiele für N-Acyl-DL-Aminosäuren sind N-Acetyl-DL-Aminosäuren wie N-Acetyl-DL-Methionin, N-Acetyl-DL-Valin, N-Acetyl-DL-Tryptophan, N-Acetyl-DL-Asparagin, N-Acetyl-DL-Phenylalanin, N-Acetyl-DL-Alanin und N-Acetyl-DL-Leucin.
N-Acetyl-DL-Aminosäuren können in Form eines Salzes wie als ein Natriumsalz oder ein Kaliumsalz verwendet werden.
D-Aminoacylase, die zur Herstellung der D-Aminosäure in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet ein partiell gereinigtes Enzym sowie das gereinigte Enzym. Die Enzyme beinhalten auch ein rekombinantes Protein, das durch Isolierung einer DNA, die D-Aminoacylase codiert, Einbringen dieser DNA in geeignete Wirtszellen und dem Ermöglichen der Zellen, das Enzym zu exprimieren, erhalten wird. Eine DNA, die D-Aminoacylase codiert, kann zum Beispiel isoliert werden, indem das gereinigte Enzym erhalten wird, dessen Aminosäuresequenz teilweise bestimmt wird, das Entwerfen geeigneter Oligonucleotid-Primer auf der Grundlage dieser bestimmten Aminosäuresequenz und dem Durchführen der Polymerase-Kettenreaktion, wobei die Primer verwendet werden und die mRNA, cDNA oder genomische DNA als Matrize, die aus dem Pilz hergestellt wurden, von dem das gereinigte Enzym abstammt.
Neben diesen Enzymen können die D-Aminoacylase produzierenden Pilzzellen selbst ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und zwar kann D-Aminosäure produziert werden, indem der Pilz, der in der Lage ist, D-Aminoacylase zu produzieren, direkt mit der N-Acetyl-DL-Aminosäure umgesetzt wird. Der Pilz kann in Form des Kulturmediums verwendet werden, die Zellen können durch Zentrifugation oder ähnliches aus dem Kulturmedium abgetrennt werden oder Zellen werden in Puffer, Wasser oder ähnlichem resuspendiert, nachdem sie durch Zentrifugation abgetrennt und gewaschen wurden. Die abgetrennten Zellen können in einem Stadium verwendet werden, wie sie gewonnen wurden, als deren Aufschluss nach Behandlung mit Aceton oder Toluol oder als Lyophilisat.
D-Aminoacylase oder der Pilz, der in der Lage ist dieses Enzym zu produzieren, wird unter Bedingungen mit N-Acyl-D-Aminosäure umgesetzt, die für die Aktivität und Stabilität von D-Aminoacylase und für die Reaktivität des Pilzes geeignet sind. Einige D-Aminoacylasen werden durch Metall-Ionen wie Co²⁺ und Ca²⁺ aktiviert. Wenn solche Enzyme verwendet werden, können die divalenten Metall-Ionen zu der Reaktionslösung zugegeben werden. Falls das Enzym durch divalente Metall-Ionen gehemmt wird, kann ein Chelat-bildendes Mittel wie EDTA zugegeben werden. Obwohl die Konzentration des Substrats, N-Acetyl-DL-Aminosäure, nicht besonders eingeschränkt ist, wird es gewöhnlich in einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew/V verwendet. Die Verwendung einer großen Menge D-Aminoacylase beschleunigt häufig die Umsatzrate und das Enzym wird gewöhnlich in der Menge von etwa 1 bis 1.000 U/ml verwendet. Eine Einheit des Enzyms ist definiert als die Menge des Enzyms, die 1 μmol D-Tryptophan bei 30°C in einer Minute produziert, wenn das Enzym mit N-Acetyl-D-Tryptophan als Substrat versetzt wird. Es wird bevorzugt die Reaktionstemperatur, bei der die D-Aminoacylase-Aktivität vorliegt, bei 30 bis 50°C zu erhalten. Es wird bevorzugt den pH-Wert der Reaktion, bei dem die D-Aminoacylase aktiv ist, beispielsweise zwischen pH 4 bis 10 zu erhalten. Die Umsetzung kann mit oder ohne Rühren durchgeführt werden.
Das Enzym oder der Pilz können häufig durch Immobilisation stabilisiert sein. Er (Es) kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens an einen geeigneten Träger wie Polyacrylamidgel, Schwefel enthaltendes Polysaccharid-Gel (Carragenan-Gel), Alginsäure-Gel oder Agar-Gel immobilisiert sein.
Die hergestellten D-Aminosäuren können mit Hilfe eines bekannten Verfahrens, wie direkte Kristallisation durch Konzentration oder isoelektrische Fällung, Ionenaustausch-Harz-Behandlung, Membran-Filtration oder ähnliches aus dem Reaktionsgemisch gewonnen werden.
D-Tryptophan zum Beispiel, das unter Verwendung von N-Acetyl-DL-Tryptophan als ein Substrat produziert wurde, kann wie folgt aufgereinigt werden. Nach der enzymatischen Reaktion wird das Reaktionsgemisch mit einem starken Säurekationen-Austausch-Harz in Kontakt gebracht, um D-Tryptophan zu absorbieren. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit 0,5 normalem wässrigen Ammoniak eluiert. Nachdem das Eluat auf konzentriert worden war, wird das so erhaltene rohe kristalline Pulver aus D-Tryptophan in einer kleinen Menge 50%igem heißem Ethanol gelöst, mit aktivierter Aktivkohle gebleicht und abgekühlt, wobei gereinigte Kristalle von D-Tryptophan erhalten werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann D-Valin wie folgt aufgereinigt werden. Nach der enzymatischen Reaktion werden die mikrobiellen Zellen durch Zentrifugation oder ähnliches entfernt und der resultierende Überstand wird durch Zugabe von 6 N Hydrochlorsäure auf pH 1 eingestellt. Das ausgefällte N-Acetyl-L-Valin wird durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird mit aktivierter Aktivkohle behandelt, auf pH 7,0 eingestellt, dann auf einen starken Säure-Kationen-Austauscher (Amberlite^TM IR-120B) vom H⁺-Typ gegeben. Die Elution wird mit 5%igem wässrigen Ammoniak durchgeführt und das resultierende Eluat wird bei 80°C unter reduziertem Druck getrocknet, wobei D-Valin produziert wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezug auf die nachfolgenden Beispiele ausführlicher beschrieben, diese sind jedoch nicht so ausgelegt, dass die Erfindung dadurch eingegrenzt wird.
In den nachfolgenden Beispielen bezeichnet "%" als Konzentration Gewicht pro Volumenprozent, falls nicht andersartig spezifiziert.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Polynucleotide, die die erfindungsgemäße D-Aminoacylase codieren. Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann z. B. DNA, cDNA, genomische DNA, RNA oder synthetisch produzierte DNA oder RNA oder ein rekombinant produziertes chimäres Nucleinsäure-Molekül sein, das irgendeines dieser Polynucleotide, entweder alleine oder in Kombination, umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Vektor, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen, die gewöhnlich für gentechnische Manipulation verwendet werden, die ein erfindungsgemäßes Polynucleotid umfassen. Solche Vektoren können weitere Gene umfassen, wie Markergene, die die Selektion dieses Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Wirtszellen, die mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotid oder Vektor gentechnisch manipuliert sind.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das D-Aminoacylase-Aktivität besitzt, das die Züchtung der erfindungsgemäßen Wirtszelle umfasst und die Gewinnung des Polypeptids aus der Kultur, das durch dieses Polynucleotid codiert wird.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Nucleinsäure-Molekül, das spezifisch mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotid hybridisiert.
Beispiel 1
Eine Platinöse von dem Stamm Hypomyces aurantius IFO 6847, dem Stamm Hypomyces broomeanus IFO 9164, dem Stamm Hypomyces rosellus IFO 9611, dem Stamm Hypomyces chrysospermus IFO 6817, dem Stamm Hypmyces sepulcralis IFO 9102, dem Stamm Hypomyces subicolosus IFO 6892, dem Stamm Hypomyces mycophilus ATCC 76474 oder IFO 6785 oder dem Stamm Fusarium solani IFO 9974 oder IFO 9975 wurde in 25 ml YM-Medium (enthaltend 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malz-Extrakt, 0,5% Pepton und 2,0% Glukose, pH 6,0) in einen 500 ml-geschulterten Kolben überimpft. Die Pilze wurden drei Tage bei 24°C durch Schütteln gezüchtet. Nach der Züchtung wurde eine 5 ml-Portion des Kulturmediums in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert, um die Pilzzellen zu sammeln. Die Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen und wiederum durch Zentrifugation gesammelt. Eine Reaktionslösung (enthaltend 0,1% N-Acetyl-D-Aminosäure, wie gezeigt in nachfolgender Tabelle 1 in Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) wurde dann zu den so gesammelten Zellen zugegeben. Das Gemisch wurde in einem 5 ml-Teströhrchen 24 Stunden bei 30 °C durch Schütteln inkubiert.
Die so produzierte D-Aminosäure wurde mit Hochdurchsatz-Flüssig-Chromatographie (Säule, CROWNPAK^TM CR (Daicel Chemical); Säulentemperatur, 26°C; ausschließlich für Valin auf Eis gekühlt; mobile Phase, HClO₄-wässrige Lösung, pH 2,0; Flussrate, 1 ml/min; und Nachweis 200 nm) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Aus Tabelle 1 wird klar, dass die Fähigkeit, D-Aminoacylase herzustellen in allen getesteten Pilzstämmen gefunden wurde.
Beispiel 2
Eine Platinöse des Stammes Hypomyces rosellus IFO 6911, des Stammes Hypomyces sepulcralis IFO 9102 oder des Stammes Hypomyces mycophilus IFO 6785 wurde in 25 ml YM-Medium (enthaltend 0,3% Hefe-Extrakt, 0,3% Malz-Extrakt, 0,5% Pepton und 2,0% Glucose, pH 6,0) in einen 500 ml geschulterten Kolben überimpft. Die Pilze wurden drei Tage bei 24°C durch Schütteln gezüchtet. Nach der Züchtung wurde eine 5 ml-Portion des Kulturmediums in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert, um die Pilzzellen zu sammeln. Die Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen und erneut durch Zentrifugation gesammelt. Eine Reaktionslösung (enthaltend 0,1% N-Acetyl-DL-Aminosäure, gezeigt in nachfolgender Tabelle 2, in Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) wurde zu den so gesammelten Zellen zugegeben. Das Gemisch wurde in einem 5 ml-Teströhrchen 24 Stunden bei 30°C durch Schütteln inkubiert. Die so erhaltene D-Aminosäure wurde durch Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (Säule, CROWNPAK^TM CR (Daicel Chemical) getestet und auf optische Reinheit überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Somit wurde versichert, dass alle getesteten Stämme das D-Enantiomer von hoher optischer Reinheit aus dem entsprechenden DL-Racemat produzierten.
Beispiel 3
Auricularia auriculajudae IFO 5949, Pythium aphanidermaatum IFO 7030, und Menispropsis novaezelandiae IFO 9179 wurden jeweils in sterilisiertes Medium überimpft (jeweils 100 ml) (Czapek Dox Broth für IFO 5949, YM1-Medium für IFO 7030 und POTATO DEXTROSE BROTH für IFO 9179) in 500 ml Erlenmeyer-Kolben. Die Pilze wurden auf einem Rotationsschüttler bei 210 UpM sieben Tage bei 24°C gezüchtet und durch Zentrifugation gesammelt, wobei eine HIMAC SCR 20B HITACHI-Zentrifuge mit einem RPR10-2-Rotor bei 8.000 UpM (12.500 × g) für 20 Minuten verwendet wurde. Die so sedimentierten Zellen wurden mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, dehydriert und im gefrorenen Zustand aufbewahrt.
In diesem Experiment wurde POTATO DEXTROSE BROTH (DIFCO) hergestellt, indem 24 g des getrockneten Medium-Pulvers (ein 10:1-Gemisch der Potato-Infusionsform und Bacto-Dextrose) in 1 Liter Wasser gelöst wurden, dazu Zugabe von N-Acetyl-DL-Methionin (N-Yc-DL-Met) bis auf 0,1% und Einstellen des pH-Werts auf 5,1. Czapek Dox Broth bestand aus 0,3% NaNO₃, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ × 7H₂O, 0,05% KCl, 0,001% FeSO₄ × 7H₂O, 3,0% Saccharose, 0,2% Hefeextrakt, 0,2% Polypepton und 0,1% N-Ac-DL-Met und wurde auf pH 7,3 eingestellt. YMl-Medium (Hefeextrakt-Malzextrakt-Pepton-Glucose-Medium) bestand aus 0,5% Polypepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 0,2% Glucose und 0,1% N-Ac-DL-Met und wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt.
Die gefrorenen Zellen wurden durch Zugabe von 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) zu den Zellen aufgeschlossen, wobei eine Zellsuspension von 1 g Zellen pro 6 ml erhalten wurde, die Suspension (1,5 ml) und Glaskügelchen (0,2 dia. bis 0,5 mm) (1,5 g) wurden in ein 2, 0 ml Probengefäß gegeben, das mit einem Spaltgerät ausgestattet war und unter Verwendung eines Mini-Bead Beater^TM (BIOSPECT PRODUCT) bei 2.500 UpM 150 Sekunden lang aufgeschlossen, gefolgt von 3,5 Minuten-Intervallen kühlen auf Eis (eine Gesamtheit von 8 Zyklen). Die so erhaltenen aufgeschlossenen Zellen wurden unter Verwendung einer HIMAC SCR20B HITACHI-Zentrifuge mit einem RPR20-2-Rotor 30 Minuten bei 4°C und 17 500 UpM (38 000 × g) zentrifugiert, wobei der Überstand als roher Enzymextrakt erhalten wurde. Die Umsetzung wurde in einer Lösung (enthaltend 20 mM N-Ac-D-Aminosäure, gezeigt in Tabelle 3, 1 mM CoCl₂, 50 mM Phosphatpuffer; pH 7,0) durchgeführt, um die Enzymaktivität für jedes Substrat zu testen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Die Figuren in der Tabelle bezeichnen die Menge (mM) von D-Aminosäuren, die aus den entsprechenden N-Acetyl-D-Aminosäuren hegestellt wurden. Die D-Aminoacylase-Aktivität wurde in allen getesteten Stämmen nachgewiesen, die D-Aminosäure aus der entsprechenden N-Acetyl-D-Aminosäure produzierten.
Beispiel 4
(1) Pilzstem und Kolbenkultur-Verfahren
YM-Medium (50 ml) (enthaltend 0,3% Hefextrakt (Kyokuto Seiyaku), 0,3% Malzextrakt (Kyokuto Seiyaku), 0,5% Polypepton (Nihon Seiyaku), 2,0% Glucose (Wako Pure Chemical); pH 6,0) wurde in einen geschliffenen 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, autoklaviert und als das Wachstumsmedium verwendet, um D- Aminoacylase durch den Hypomyces mycophilus IFO 6785-Stamm zu produzieren. Der Pilzstamm, der zuvor in YM-Agar-Medium (enthaltend 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 0,5% Polypepton, 2,0% Glucose (Wako Pure Chemical) und 1,5% Agar (Wako Pure Chemical); pH 6,0) auf der Platte gezüchtet worden war, wurde in etwa 5 cm quadratischen Abschnitten ausgeschnitten, wobei ein sterilisiertes Operationsmesser verwendet wurde, in das vorstehend beschriebene Medium in dem Kolben überimpft und 96 Stunden bei 25°C auf einem Rotationsschüttler bei 145 UpM inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen 5 Minuten bei 4°C durch Zentrifugation (mit einer TOMY SEIKO MRX-150-Zentrifuge unter Verwendung eines TMA-3-Rotors) bei 12 000 UpM (12 000 × g) gesammelt. Die so gesammelten Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und 5 Minuten erneut zentrifugiert, wobei der gleiche Rotor bei 12 000 UpM (12 000 × g) verwendet wurde.
(2) Testverfahren für D-Aminoacylase-Aktivität
Die vorstehend erhaltenen Zellen wurden zweimal jeweils 5 Minuten lang in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 0,01 2-ME (β-Mercaptoethanol) und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) aufgeschlossen, wobei ein Mini Bead Beater 8 (BIOSPEC PRODUCTS) verwendet wurde, dann 5 Minuten bei 15 000 UpM (18 000 × g) mit einer MRX-150-Zentrifuge zentrifugiert, wobei ein TMA-2-Rotor (TOMY SEIKO) verwendet wurde, um den Überstand zu erhalten, eine Rohextrakt-D-Aminoacylase-Lösung.
Die Enzymreaktion wurde 10 Minuten bei 30°C in einem Reaktionssystem (Gesamtvolumen 1,0 ml) durchgeführt, das 20 mM N-Acetyl-D-Tryptophan (Sigma), 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und eine angemessene Menge des Enzyms enthielt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe einer TCA-Reaktions-Terminierungslösung (0,5 ml) gemäß Tsai et al. (bestehend aus 110 mM Trichloressigsäure, 220 mM Natriumacetat und 330 mM Essigsäure) beendet.
Die Enzymaktivität wurde durch Bestimmung der Menge produzierte Aminosäure getestet, wobei das TNBS-Verfahren und die HPLC-Methode verwendet wurden. Bei dem TNBS-Verfahren wurden 100 mM Na₂B₄O₇ (0,5 ml) zu einer Probenlösung zugegeben, die Aminosäure (0,5 ml) enthielt, dann wurden 20 μ1 110 mM TNBS (Trinitrobenzen-sulfonsäure) zugegeben und das resultierende Gemisch wurde schnell gerührt. Nach 5 Minuten wurden 1,5 mM Na₂SO₃ (2 ml) zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, um die Farbreaktion zu beenden und die Absorption bei 420 nm wurde gemessen. Die HPLC wurde durchgeführt, indem eine Probenlösung, die Aminosäure enthielt, einer Hochdurchsatz-Flüssig-Chromatographie unterzogen wurde, wobei eine ODS-Säule (Säule, Wakosil II 5C18 (4,6 dia. × 250mm) (Wako Pure Chemical); Elutionsmittel, CH₃CN/50 mM KH₂PO₄ × H₃PO₄ (pH 2,5) = 2:8; Nachweis, A280 nm und Flussrate, 1,0 ml/min), verwendet wurde. Die Verzögerungszeiten betrugen 3,5 Minuten für D-Tryptophan und 9,8 Minuten für N-Acetyl-D-Tryptophan. Unter Verwendung von D-Tryptophan als der Teststandard wurde eine Einheit (oder U) des Enzyms als die Menge des Enzyms definiert, die erforderlich ist, um während einer Minute bei 30°C 1 μmol D-Tryptophan zu produzieren.
Es wurde gefunden, dass Hypomyces mycophilus IFO 6785 eine relativ hohe D-Aminoacylase-Aktivität besitzt.
Beispiel 5
Aufreinigung von D-Aminoacylase, die vom Hypomyces mycophilus IFO 6785-Stamm abstammt.
1. Bedingungen für die D-Aminoacylase-Herstellung
Dieser Pilzstamm wurde 36 Stunden bei 25°C in einem geschliffenen Erlenmeyerkolben auf einem Rotationsschüttler (145 UpM) in dem YM-Flüssigmedium (50 ml) gezüchtet, das in Beispiel 4 beschrieben wurde, ergänzt mit oder ohne N-Acetyl-DL-Valin, N-Acetyl-DL-Tryptophan, N-Acetyl-DL-Methionin, DL-Valin, DL-Tryptophan oder DL-Methionin (jeweils 0,1%) als Enzym-Induktor. Nach der Inkubation wurde eine Rohextrakt-Enzym-Lösung hergestellt und auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 4 mit HPLC auf Enzymaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Die Ergebnisse zeigen, dass D-Aminoacylase kein induzierbares Enzym sondern ein konstitutives Enzym in diesem Pilzstamm ist.
2. Züchtungsverfahren unter Verwendung eines Glasfermenters
Dieser Pilzstamm wurde in 20 Litern eines Flüssigmediums (enthaltend 0,3% Hefeextrakt (Kyokuto Seiyaku), 0,3% Malzextrakt (Kyokuto Seiyaku), 1,0% Polypepton (Wako Pure Chemical), 2,0% Glucose (Wako Pure Chemical) und 0,01 Silikon FS028; pH 6,0) gezüchtet, dann 44 Stunden ohne Druck bei 25° C, 200 UpM, 1 v.v.m. in einen 30-Liter Glas-Fermenter gegeben.
Die verwendete Vorkultur wurde anhand des Kolbenzüchtungs-Verfahrens in Beispiel 4 erhalten.
Nach der Züchtung wurde die Kultur sofort in Eiswasser gekühlt und durch Ansaugen unter Verwendung des Nr. 5A-Filterpapiers (Toyo Roshi) filtriert, um die Pilzzellen zu sammeln. Die so gesammelten Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, erneut durch die Ansaug-Filtration gewonnen und bis zur Verwendung bei –90°C aufbewahrt.
3. Aufreinigung von D-Aminoacylase
(1) Zell-Aufschließen, Entfernen von Nucleinsäure und Aussalzen mit Ammoniumsulfat.
Gefrorene Zellen (etwa 100 g) wurden in doppelschichtige Plastiktaschen mit Reisverschlüssen eingewickelt und in einer Aluminiumwanne pulverisiert, wobei ein Stampfer verwendet wurde. Pulverisierte Zellen wurden zu 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) enthaltend 1 μM Leupeptin, 1 μM Pepstatin A, 1 mM PMSF und 0,01% 2-ME gegeben, um eine Zellsuspension zu erhalten. Die Suspension wurde dann einer fortlaufenden Zerreibung mit einem Dyno-Walzwerk vom Typ KDL (Wiley A. Bachofen, Basel. Schweiz) unterzogen, wobei 0,2 bis 0,5 mm Glaskügelchen verwendet wurden.
Der resultierende Zellzerrieb wurde 30 Minuten bei 4°C mit 8.000 UpM (6.000 × g) zentrifugiert (mit einer Hitachi Koki-Zentrifuge 20PR-52D, wobei ein RPR-9-Rotor verwendet wurde), um nicht aufgebrochene Zellen und Zelltrümmer zu sedimentieren. Der so erhaltene Überstand wurde getestet, um die Protein-Konzentration gemäß dem Verfahren zu bestimmen, das in Beispiel 4 beschrieben wurde. Als ein Ergebnis, da die Gesamt-Proteinmenge 61.500 mg betrug, wurde ein Zehntel des Gewichts Protaminsulfat als eine 3%ige Lösung (in dem gleichen Puffer, der für das Zerreiben verwendet wurde) bei niedriger Temperatur unter Rühren tropfenweise zu dem Überstand zugegeben und das Gemisch wurde zwei zusätzliche Stunden gerührt. Das resultierende Gemisch wurde 20 Minuten bei 4°C mit 6.000 UpM (3.000 × g) zentrifugiert (mit einer Hitachi Koki-Zentrifuge 20PR-52D, wobei ein RPR-9-Rotor verwendet wurde), um Mikrosomen und Nucleinsäuren zu sedimentieren.
Der Überstand wurde gegen 17 1 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), enthaltend 77% gesättigtes Ammoniumsulfat, 0,1 mM PMSF, 0,1 μM Leupeptin, 0,1 μM Pepstatin A und 0,01% 2-ME unter Rühren über Nacht umgekehrt dialysiert. Da dies D-Aminoacylase nicht vollständig aussalzte, wurde Ammoniumsulfat bei niedriger Temperatur unter Rühren im Überschuss direkt zu dem Dialysat zugegeben. Das Präzipitat wurde 20 Minuten bei 4°C mit 10 000 UpM (16 000 × g) durch Zentrifugation (mit einer Tomy Seiko RS-20BH-Zentrifuge, wobei ein BH-9-Rotor verwendet wurde) gesammelt, dann in einer kleinen Menge 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), enthaltend 0,1 mM PMSF, 0,1 μM Leupeptin, 0,1 μM Pepstatin A und 0,01% 2-ME suspendiert. Die Suspension wurde gegen den gleichen Puffer (10 l) 4 Stunden dialysiert und dann gegen den gleichen frisch ausgetauschten Puffer (10 l) über Nacht.
(2) DEAE-Sepharose FF 5,0/25 Anionen-Austausch-Chromatographie
Das vorstehend beschriebene Enzym, das auf diese Weise hergestellt wurde, wurde durch Anionen-Austausch-Chromatographie weiter aufgereinigt. Und zwar wurde die Rohextrakt-Enzymlösung an eine XK50-Säu1e (5,0 dia. × 25 cm, 500 ml), bepackt mit DEAE-Sepharose^TM FF (beides von Amersham Pharmacia Biotech) adsorbiert, die mit 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), enthaltend 0,01% 2-ME, equilibriert worden war. Nachdem die Säule mit 3 Volumen des gleichen Puffers gewaschen worden war, wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 M bis 0,5 M in 7 Volumen des gleichen Puffers eluiert. Die Menge an Protein in jeder Fraktion wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt (1).
Die D-Aminoacylase-Aktivität wurde durch Durchführen der Enzym-Reaktion in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 20 mM N-Acetyl-D-Tryptophan (Gesamtvolumen von 100 μl) 30 Minuten bei 30°C getestet. Ein gleiches Volumen von 100 mM Na₂B₄O₇-NaOH-Lösung, enthaltend 4 mM TNBS wurde zu dem vorstehenden Reaktionsgemisch zugegeben. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen, um die Menge an freiem D-Tryptophan zu bestimmen.
D-Aminoacylase wurde mit einem Puffer eluiert, der von 0,20 bis 0,25 M NaCl enthielt. Die Fraktionen, die die D-Aminoacylase-Aktivität enthielten, wurden kombiniert und unter Verwendung einer UF-Membran (Amicon, YM-10 76 mm dia.) 5-fach konzentriert. Ammoniumsulfat wurde bis zu 70%iger Sättigung zu dem Konzentrat zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht stehen gelassen, um die Fällung zu vervollständigen. Das Gemisch wurde dann 10 Minuten bei 4°C und mit 12 000 UpM (18 000 × g) zentrifugiert (mit einer Hitachi Koki Himac CR26H-Zentrifuge, wobei ein RR18A-Rotor verwendet wurde), um das Präzipitat zu gewinnen. Das gewonnene Präzipitat wurde in 10 ml 200 mM KPB (pH 8,5), enthaltend 0,01% 2-ME und 0,2 M Na₂SO₄ suspendiert, gegen den gleichen Puffer (2 l) über Nacht dialysiert. Die Dialyse wurde dann erneut gegen den gleichen, aber frisch ausgetauschten Puffer (2 l) 4 Stunden durchgeführt.
(3) Phenyl-Sepharose^TM HP 2,6/10 hydrophobe Chromatographie
Das Enzym, das in (2) erhalten wurde, wurde durch hydrophobe Chromatographie weiter aufgereinigt. Im Speziellen wurde das Enzym durch eine Phenyl-Sepharose^TM Hi-Load^TM HP 2,6/10-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, 2,6 dia. × 10 cm, 50 ml) adsorbiert, die mit 200 mM KPB (pH 8,5), enthaltend 0,01% 2-ME und 0,3 M Na₂SO₄ equilibriert worden war. Nachdem die Säule mit 4 Volumen des gleichen Puffers gewaschen worden war, wurde das Enzym eluiert, indem die Konzentration an Na₂SO₄ in dem vorstehend beschriebenen Puffer (Puffer A) von 0,3 M auf 0 M linear erniedrigt wurde, das heißt, die Konzentration an 10 mM KPB (pH 8,5), enthaltend 0,01% 2-ME von 0 auf 100% in Puffer A linear erhöht wurde. Die Menge an Protein in jeder Fraktion wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt. Die D-Aminoacylase-Aktivität wurde auf die gleiche Art getestet, wie in (2) beschrieben (2).
Ammoniumsulfat wurde zu den Fraktionen, die die D-Aminoacylase-Aktivität enthielten, bis auf 70%ige Sättigung zugegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden sanft gerührt, wobei Präzipitate gebildet wurden, die 10 Minuten bei 4°C mit 12 000 UpM (18 000 × g) durch Zentrifugation (mit einer Hitachi Koki Himac CR26H-Zentrifuge, wobei ein RR18A-Rotor verwendet wurde) gewonnen wurden. Das so gewonnene Präzipitat wurde in etwa 3 ml 10 mM Tris-HCl (pH 9,5), enthaltend 0,01% 2-ME und 0,3 M NaCl gelöst.
(4) Superdex^TM 200 Hi-Load^TM 1,6/60-Gelfiltrations-Chromatogaphie
Die Enzymlösung, die in (3) erhalten wurde, wurde durch Gel-Filtrations-Chromatographie weiter gereinigt. Spezifisch wurde das Enzym auf eine Superdex^TM 200 Hi-Load^TM 1,6/60-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, 1,6 dia. × 60 cm, 120 ml) gegeben, die mit 10 mM Tris-HCl (pH 9,5), enthaltend 0,01% 2-ME und 0,3 M NaCl equilibriert worden war und mit dem gleichen Puffer (240 ml) bei einer Flussrate von 1 ml/min eluiert. Die Menge an Protein in jeder Fraktion wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt. Die D-Aminoacylase-Aktivität wurde auf die gleiche Art und Weise wie in (2) beschrieben getestet (3).
Die Fraktionen, die D-Aminoacylase-Aktivität enthielten, wurden unter Verwendung einer UF-Membran (Amicon, YM-10, 43 mm dia.) konzentriert, mit 10 mM Tris-HCl (pH 9,5), enthaltend 0,01% 2-ME, verdünnt und erneut konzentriert. Die gleiche Prozedur wurde zweimal wiederholt, um die Probe zu entsalzen.
(5) Mono Q^TM HR 5/5-Anionen-Austausch-Chromatographie
Das vorstehend aufgereinigte Enzym wurde durch Anionen-Austausch-Chromatographie weiter aufgereinigt. Spezifisch wurde das Enzym an eine Mono Q^TM Hr 5/5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, 0,5 dia. × 5 cm, 1,0 ml) adsorbiert, die mit 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), enthaltend 0,01% 2-ME, equilibriert worden war. Nachdem die Säule mit 3 Volumen des gleichen Puffers gewaschen worden war, wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 M bis 0,6 M in 21 Volumen des gleichen Puffers eluiert. Die Menge an Protein in jeder Fraktion wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt.
Die D-Aminoacylase-Aktivität wurde auf die gleiche Art und Weise wie in (2) beschrieben getestet. Ein Teil der Fraktion, die D-Aminoacylase-Aktivität besitzt, wurde der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen.
(6) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Elektrophorese wurde unter Verwendung eines Phast-Systems^TM (Amersham Pharmacia Biotech) entsprechend dem Verfahren von Laemmli (Laemmli, U. K.: Nature, 227, S. 680) durchgeführt. Ein Phast-Gel^TM Homo 12,5 (Amersham Pharmacia Biotech) wurde als Gel verwendet. Die Probe zur Elektrophorese wurde durch Mischen der Enzymlösung mit einem gleichen Volumen der zu behandelnden Probenlösung (125 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), enthaltend 4% Natriumdodezylsulfat (SDS), 20% Glycerin, 10% 2-ME und 0,005% Bromphenolblau (BPB)); Erhitzen des Gemischs auf 100°C für etwa 5 Minuten in einem Heizblock; dann Abkühlen auf Raumtemperatur, hergestellt. Portionen (2 μl) wurden der Elektrophorese unterzogen. Das Protein wurde mit einem Färbeverfahren mit CBB-R nachgewiesen. Als ein Ergebnis wurde eine einzige einzelne Bande nachgewiesen, von der vermutet wird, dass es sich um die gewünschte D-Aminoacylase handelt.
Beispiel 6
Eigenschaft von D-Aminoacylase, die von dem Stamm Hypomyces mycophilus IFO 6785 abstammt.
1. Bestimmung des Molekulargewichts
Das Molekulargewicht wurde durch (1) Gel-Filtration und (2) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt.
(1) Gel-Filtration
D-Aminoacylase, die von dem Stamm Hypomyces mycophilus IFO 6785 abstammt, die in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 5 aufgereinigt und der Gel-Filtration unterzogen, wie in den Beispielen 5-3 (4) beschrieben. MW-Marker-Proteine (HPLC) (Oriental Yeast), bestehend aus Glutamat-Dehydrogenase (290.000), Lactat-Dehydrogenase (142.000), Enolase (67.000), Myokinase (32.000) und Cytochrom C (12.400) wurden als Molekulargewichtsmarker verwendet. Als ein Ergebnis wurde das Molekulargewicht dieses Enzyms auf etwa 56.000 bestimmt (4).
(2) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
D-Aminoacylase, die von dem Stamm Hypomyces mycophilus IFO 6785 in Beispiel 2 abstammt, wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 5 aufgereinigt und wie in den Beispielen 5-3 (6) beschrieben einer Elektrophorese unterzogen. Ein Elektrophorese-Kalibrierungs-Kit^TM (Amersham Pharmacia Biotech), bestehend aus Phosphorylase b (94.000), Rinder-Serum-Albumin (67.000), Ovalbumin (43.000), Carboanhydrase (30.000), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (20.100) und α-Lactoalbumin (14.400) stellten die Molekulargewichts-Marker bereit. Als ein Ergebnis wurde das Molekulargewicht dieses Enzyms als etwa 64.000 angegeben (5).
2. Substrat-Spezifität
Die Substrat-Spezifität des Enzyms wurde als Prozent der spezifischen Aktivität mit der für N-Acetyl-D-Methionin verglichen, die als 100% angenommen wurde. N-Chloracetyl-D-Phenylalanin, N-Acetyl-D-Valin, N-Acetyl-D-Phenylalanin, N-Acetyl-D-Tryptophan, N-Acetyl-D-Leucin, N-Acetyl-L-Valin, N-Acetyl-L-Phenylalanin, N-Acetyl-L-Tryptophan und N-Acetyl-L-Leucin-Substrate wurden für den Vergleich verwendet. Die Enzym-Reaktion wurde in 50 mM Tris-HCL (pH 7,5), enthaltend 1 μl der Enzymlösung und 20 mM von jedem Substrat (Gesamtvolumen 1,0 ml) 20 Minuten bei 30°C durchgeführt und durch Zugabe von 0,5 ml einer TCA-Reaktions-Terminierungslösung gemäß Tsai et al. (bestehend aus 110 mM Trichloressigsäure, 220 mM Natriumacetat und 330 mM Essigsäure) beendet. Die Enzym-Aktivität wurde unter Verwendung des TNBS-Verfahrens getestet, wie in Beispiel 4 (2) beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Wie in der Tabelle angezeigt, war dieses Enzym insbesondere aktiv für N-Acetyl-D-Phenylalanin und N-Chloracetyl-D-Phenylalanin, sehr aktiv für N-Acetyl-D-Tryptophan, N-Acetyl-D-Methionin und N-Acetyl-D-Leucin und etwas aktiv für N-Acetyl-D-Valin, jedoch inaktiv für N-Acetyl- L-Phenylalanin, N-Acetyl-L-Tryptophan, N-Acetyl-L-Methionin, N-Acetyl-L-Valin und N-Acetyl-L-Leucin.
3. Optimaler pH-Wert
Der Enzymtest wurde 5 Minuten bei 30°C gemäß dem Verfahren durchgeführt, das in Beispiel 4 (2) beschrieben ist, wobei der pH-Wert des Enzym-Reaktionssystems von pH 4,0 bis pH 11, 0 variiert. Die Menge an Enzym wurde wie in Beispiel 4 (2) beschrieben durch HPLC bestimmt. Die verwendeten Puffer waren 50 mM AcONa × AcOH-Puffer, für pH 4, 0 bis pH 6, 0, 50 mM K₂HPO₄ × KH₂PO₄-Puffer für pH 5, 5 bis 8, 0, 50 mM Tris-HCl-Puffer für pH 7,0 bis 9,0 und 50 mM Glycin × NaOH-Puffer für pH 8,0 bis 11,0. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass der optimale pH-Wert für die Reaktion dieses Enzyms im Bereich von 7,5 bis 8,0 liegt und dass das Enzym nicht weniger als 80% seiner Aktivität innerhalb des pH-Bereiches von 6,5 bis 9,0 zeigt.
4. Optimale Temperatur
Der Enzymtest wurde 5 Minuten gemäß dem in Beispiel 4 (2) beschriebenen Verfahren durchgeführt, während die Temperatur des Enzym-Reaktionssystems von 20°C bis 55°C variiert wurde. Das Enzym wurde wie in Beispiel 4 (2) beschrieben durch HPLC bestimmt. Um eine Temperatur-abhängige pH-Wert-Veränderung zu verhindern, wurde 50 mM K₂HPO₄ × KH₂PO₄-Puffer (pH 7,5) verwendet. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass die optimale Temperatur für die Umsetzung durch dieses Enzym etwa 45°C betrug.
5. pH-Stabilität
Die Enzymlösung wurde 50-fach mit jedem pH-Puffer verdünnt, 30 Minuten bei 30°C gehalten, durch und durch auf Eis gekühlt und dann gemäß dem in Beispiel 4 (2) beschriebenen Verfahren nach verbleibender Enzym-Aktivität getestet. Das Enzym wurde wie in Beispiel 4 (2) beschrieben durch HPLC bestimmt. Um den Einfluss von Puffer-Bestandteilen zu minimieren, wurde Britton and Robinson's-Puffer (Basal Methods of Protein and Enzyme Experiments, 2. Rev. Hrsg., Buichi Horio Ausg., 1994), enthaltend 0,01% 2-ME verwendet, wobei der pH-Wert von 5,0 bis 11,0 mit 0,5-Schritt-Intervallen verändert wurde. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt und ergaben, dass dieses Enzym bei pH 9,5 am stabilsten war, wobei nicht weniger als 80% seiner Aktivität innerhalb des pH-Bereiches von pH 7,5 bis 10,5 zum Ausdruck kamen.
6. Hitzestabilität
sDie Enzymlösung wurde mit dem Puffer verdünnt, 30 Minuten bei jeder Temperatur von 15–60°C gehalten, durch und durch auf Eis gekühlt, und dann gemäß dem in Beispiel 4 (2) beschriebenen Verfahren auf verbleibende Enzym-Aktivität getestet. Das Enzym wurde wie in Beispiel 4 (2) beschrieben durch HPLC bestimmt. Britton and Robinson's-Puffer (pH 9,5), enthaltend 0,01% 2-ME wurde als Puffer verwendet. Die verdünnte Enzymlösung wurde entweder nicht behandelt (gehalten bei 4°C) oder mit jeder Temperatur von 15°C bis 65°C in 5-Grad-Schritten behandelt. Die Ergebnisse, die in 9 dargestellt sind, zeigen, dass dieses Enzym bei Erhitzen auf 40°C bis 45°C aktiviert war, jedoch schnell inaktiviert wurde, wenn auf 50°C oder höher erhitzt wurde. Das Enzym war auch wirkungsvoll aktiviert, wenn es 30 Minuten bei 40°C erhitzt wurde. Sowohl längere wie auch kürzere Heizperioden waren weniger wirkungsvoll und nach Aktivierung behielt das Enzym seine Aktivität für etwa 3 Tage, wenn es bei 4°C aufbewahrt wurde.
7. Auswirkungen verschiedener Metallsalze und Reagenzien
Die Enzymlösung wurde mit Britton and Robinson's-Puffer (pH 9,5), enthaltend 1 mM DDT verdünnt, durch 30 Minuten Erhitzen bei 40°C aktiviert, mit dem gleichen Puffer, enthaltend verschiedene Metallsalze und Reagenzien verdünnt und 30 Minuten bei 40°C gehalten. Nach ausreichendem Abkühlen wurde das Gemisch gemäß dem in Beispiel 4 (2) beschriebenen Verfahren auf verbleibende Enzym-Aktivität getestet. Die Menge an Enzym wurde wie in Beispiel 4 (2) beschrieben durch HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 gezeigt.
Tabelle 6
Tabelle 7
Diese Daten zeigen, dass dieses Enzym durch Metall-Ionen wie Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ und Hg²⁺ gehemmt wurde, zeigen jedoch auch zuvor unbekannte Eigenschaften, wie durch EDTA nicht gehemmt zu werden und durch ICH₂CONH₂ aktiviert zu werden.
8. Bestimmung der internen Sequenz
Eine Lösung, die das gereinigte Enzym enthielt (1 nmol) wurde durch Ultrafiltration auf 50 μl konzentriert, 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), enthaltend 8 M Harnstoff (150 μl) wurden zu der konzentrierten Lösung zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C gehalten. Nachdem 200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) zugegeben worden waren, wurde das Gemisch mit Lysyl-Endopeptidase (5 pmol) bei 30°C über Nacht gespalten. Die gespaltenen Produkte wurden durch Hochdruck-Flüssig-Chromatographie fraktioniert, wobei eine ODS-Säule (Säule, TSK-Gel-ODS-120T (4,6 dia. × 250 mm) (Tosoh); Elutionsmittel, Puffer A (0,1% TFA) und Puffer B (80% CH₃CN, enthaltend 0,095 TFA), Nachweis 214 nm; Flussrate, 1,0 ml/min; eluiert durch einen programmierten Gradienten) verwendet wurde und Fraktionen wurden gewonnen.
Die resultierenden Fraktionen wurden mit einem Zentrifugal-Verdampfer (UNISCIENCE, UNIVAP) konzentriert und mit einem Protein-Sequenzierautomaten (A477, Applied Biosystems) sequenziert. Die so bestimmten teilweisen Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID-Nrn: 1 bis 5 gezeigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pilz-D-Aminoacylase, welche die nachstehenden physikochemischen Eigenschaften (a) bis (f) hat; (a) Funktion: Das Enzym wirkt auf N-Acetyl-D-Aminosäuren, wobei die entsprechenden D-Aminosäuren produziert werden; (b) Molekulargewicht: Das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms wird mit der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf etwa 64.000 Daltons und mit der Gelfiltrationschromatographie auf etwa 56.000 Daltons bestimmt; (c) Substratspezifität: Das Enzym wirkt auf N-Acetyl-D-Tryptophan, N-Acetyl-D-Phenylalanin, N-Acetyl-D-Valin, N-Acetyl-D-Leucin und N-Acetyl-D-Methionin, aber nicht auf N-Acetyl-L-Tryptophan, N-Acetyl-L-Phenylalanin, N-Acetyl-Valin, N-Acetyl-L-Leucin oder N-Acetyl-L-Methionin; (d) Hitzestabilität: Beim Erhitzen bei pH 9,5 für 30 Minuten ist das Enzym bei 45°C stabil, wird aber bei mehr als 60°C inaktiviert; (e) Optimale Temperatur für die Aktivität: Für die Reaktion bei pH 7,5 ist die Enzymaktivität bei etwa 45°C optimal; und (f) Stabilisator: Die Enzymaktivität wird durch Reduktionsmittel stabilisiert, und durch ICH₂CONH₂ weiter aktiviert.
D-Aminoacylase nach Anspruch 1, wobei der Pilz zu der Gattung Hypomyces gehört.
D-Aminoacylase nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Pilz zu der Art Hypomyces mycophilus gehört.
D-Aminoacylase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Pilz Hypomyces mycophilus ATCC 76474 oder der IFO 6785-Stamm ist.
D-Aminoacylase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die D-Aminoacylase umfasst: (i) Aminosäuresequenzen, beschrieben in SEQ ID Nr.: 1 bis 5; oder (ii) Aminosäuresequenzen, beschrieben in SEQ ID Nr.: 1 bis 5, in denen eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ausgetauscht oder eingeführt wurden, und wobei sie die D-Aminoacylaseaktivität haben.
Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, wobei das Verfahren das Umsetzen der D-Aminoacylase nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder des Pilzes, welcher die D-Aminoacylase produziert, mit N-Acyl-DL-Aminosäure oder ihrem Salz der Formel (I) umfasst:
wobei die Reste R₁ und R₂ gleich oder verschieden sein können und jeder Rest ein Wasserstoffatom oder ein substituierter oder unsubstituierter Kohlenwasserstoffrest ist, mit der Maßgabe, dass der Rest R₂ kein Wasserstoffatom ist, und X ein Wasserstoffatom, eine NH₄-Gruppe oder ein Metallion ist.
Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren nach Anspruch 6, wobei die Reste R₁ und R₂ in der vorstehend beschriebenen Formel (I) gleich oder verschieden sein können und jeder Rest ein substituierter oder unsubstituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder Aralkylrest ist.
Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren nach Anspruch 7, wobei der Rest R₁ eine Indolyl-, Benzyl-, Thiomethylethyl-, Isopropyl- oder 2-Methylpropylgruppe ist und der Rest R₂ eine Methyl-, Chlormethyl-, Phenyl- oder Aminomethylgruppe ist.
Verfahren zur Herstellung der D-Aminoacylase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren das Züchten eines Pilzes umfasst.