JP2001069975A - キトサナーゼ - Google Patents
キトサナーゼInfo
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- chitosan
- bacillus subtilis
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、キトサナーゼを効率よく生産する技
術を提供し、特にキトサンを加水分解して５糖ないし６
糖、或いはそれ以上のキトオリゴ糖に変換するキトサナ
ーゼを提供する。 【解決手段】キトサナーゼ生産能を有するバチルス・ズ
ブチリス、キトサナーゼ生産菌、該菌株を用いたキトサ
ナーゼの製造法、及びキトオリゴ糖の製造法。
術を提供し、特にキトサンを加水分解して５糖ないし６
糖、或いはそれ以上のキトオリゴ糖に変換するキトサナ
ーゼを提供する。 【解決手段】キトサナーゼ生産能を有するバチルス・ズ
ブチリス、キトサナーゼ生産菌、該菌株を用いたキトサ
ナーゼの製造法、及びキトオリゴ糖の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キトサナーゼ生産
能を有するバチルス・ズブチリス、キトサナーゼ生産
菌、該菌株を用いたキトサナーゼの製造法、及びキトオ
リゴ糖の製造法に関する。
能を有するバチルス・ズブチリス、キトサナーゼ生産
菌、該菌株を用いたキトサナーゼの製造法、及びキトオ
リゴ糖の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キトオリゴ糖は、コレステロール低下、
アトピー改善、血糖値低下、抗菌性等の作用を示すた
め、医薬品、食品、農業分野等で利用されている。特に
５糖、６糖以上のキトオリゴ糖は、その作用に優れてお
り注目されている。
アトピー改善、血糖値低下、抗菌性等の作用を示すた
め、医薬品、食品、農業分野等で利用されている。特に
５糖、６糖以上のキトオリゴ糖は、その作用に優れてお
り注目されている。
【０００３】従来、キトオリゴ糖は、キトサンを酸加水
分解する化学的方法とキトサンを酵素分解する酵素的方
法とにより製造されていた。
分解する化学的方法とキトサンを酵素分解する酵素的方
法とにより製造されていた。
【０００４】しかしながら、化学的方法では、５糖、６
糖以上のキトオリゴ糖の生産性が低い。
糖以上のキトオリゴ糖の生産性が低い。
【０００５】一方、酵素的方法としては、キトサンにキ
トサナーゼを作用させる方法が行われている。キトサナ
ーゼを生産する微生物としては、アルカリガネス（Alca
ligenes）MHK-1株（特開昭62-201571）、バチルス・パ
ミルス（Bacillus pumilus）BN-262（特開昭63-6338
2）、バチルス属No.7-M株（特公平2-29311）、シュード
モナス（Pseudomonas）H-14（特公平5-23740）等の菌株
が知られている。
トサナーゼを作用させる方法が行われている。キトサナ
ーゼを生産する微生物としては、アルカリガネス（Alca
ligenes）MHK-1株（特開昭62-201571）、バチルス・パ
ミルス（Bacillus pumilus）BN-262（特開昭63-6338
2）、バチルス属No.7-M株（特公平2-29311）、シュード
モナス（Pseudomonas）H-14（特公平5-23740）等の菌株
が知られている。
【０００６】しかしながら、キトサナーゼの生産効率に
おいて満足できるものではなかった。
おいて満足できるものではなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、キトサナー
ゼを効率よく生産する技術を提供することを目的とし、
特にキトサンを加水分解して５糖ないし６糖、或いはそ
れ以上のキトオリゴ糖に変換するキトサナーゼを提供す
ることを目的とする。
ゼを効率よく生産する技術を提供することを目的とし、
特にキトサンを加水分解して５糖ないし６糖、或いはそ
れ以上のキトオリゴ糖に変換するキトサナーゼを提供す
ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記従来技
術の問題点に鑑み鋭意検討を重ねた結果、バチルス・ズ
ブチリスに属する菌がキトサナーゼ生産能を有し、バチ
ルス・ズブチリスに由来するキトサナーゼが、キトサン
をキトオリゴ糖に効率よく変換しうることを見出した。
術の問題点に鑑み鋭意検討を重ねた結果、バチルス・ズ
ブチリスに属する菌がキトサナーゼ生産能を有し、バチ
ルス・ズブチリスに由来するキトサナーゼが、キトサン
をキトオリゴ糖に効率よく変換しうることを見出した。
【０００９】すなわち、本発明は、下記の１．〜５．を
提供するものである。 １． キトサナーゼ生産能を有するバチルス・ズブチリ
ス。 ２． バチルス・ズブチリス属に属するキトサナーゼ生
産菌。 ３． 請求項１に記載のバチルス・ズブチリスを培養
し、培養物からキトサナーゼを採取することを特徴とす
るキトサナーゼの製造方法。 ４． キトサンに作用し、５糖以上のキトオリゴ糖を優
先的に生産するキトサナーゼ。 ５． 請求項３に記載の方法で製造されたキトサナーゼ
または請求項４に記載のキトサナーゼをキトサンに作用
させてキトオリゴ糖を製造する方法。
提供するものである。 １． キトサナーゼ生産能を有するバチルス・ズブチリ
ス。 ２． バチルス・ズブチリス属に属するキトサナーゼ生
産菌。 ３． 請求項１に記載のバチルス・ズブチリスを培養
し、培養物からキトサナーゼを採取することを特徴とす
るキトサナーゼの製造方法。 ４． キトサンに作用し、５糖以上のキトオリゴ糖を優
先的に生産するキトサナーゼ。 ５． 請求項３に記載の方法で製造されたキトサナーゼ
または請求項４に記載のキトサナーゼをキトサンに作用
させてキトオリゴ糖を製造する方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のキトサナーゼ生産能を有
するバチルス・ズブチリスとしては特に限定されない
が、バチルス・ズブチリス12/21originalKOE株が好まし
く使用できる。
するバチルス・ズブチリスとしては特に限定されない
が、バチルス・ズブチリス12/21originalKOE株が好まし
く使用できる。
【００１１】バチルス・ズブチリス12/21originalKOE株
は、環境廃棄物工場の土壌から、キトサナーゼ生産能に
関するスクリーニングにより新規に見出されたものであ
り、１９９９年８月２７日に「12/21original KOE株」
として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、
下記の菌学的性質を有する。 １．形態的性質（肉汁寒天培地） ・菌形：桿菌 ・大きさ：0.5〜1.0×1.0〜3.0μｍ ・胞子の形成：陽性 ・胞子の形：楕円形 ・胞子嚢の形：非膨 ・運動性：陽性 ２．生理学的性質 ・グラム染色性：陽性 ・カタラーゼ：陽性 ・酸素に対する態度：好気性 ・嫌気下での生育：陰性 ・V-P反応：陰性 ・V-PブロスのpH：5.6 ・Ｄ−グルコースからの酸の生成：陽性 ・Ｄ−グルコースからのガスの生成：陰性 ・ゼラチンの分解：陽性 ・デンプンの分解：陽性 ・クエン酸塩の利用：陽性 ・プロピオン酸塩の利用：陰性 ・卵黄反応：陰性 ・硝酸塩の還元：陽性 ・pH6.8での生育（ニュートリエントブロス）：陽性 ・pH5.7での生育（ニュートリエントブロス）：陽性 ・5%NaCl存在下での生育：陽性 ・7%NaCl存在下での生育：陽性 ・10℃での生育：陰性 ・30℃での生育：陽性 ・50℃での生育：陽性 ・55℃での生育：陰性 ３．化学分類学的性質 ・菌体内DNAのGC含量：45モル%（HPLC法） 以上の菌学的性質を有する菌について、バージーズマニ
ュアル（Bergey's Manual of Systematic Bacterology,
Volume 2）及びザ・ジーナス・バチルス（TheGenus Ba
cillus, 1973, U.S. Department of Agriculture）によ
り同定を行なうと、本菌株はバチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilis）に属すると認められ、バチルス・ズ
ブチリス12/21originalKOE株と命名した。
は、環境廃棄物工場の土壌から、キトサナーゼ生産能に
関するスクリーニングにより新規に見出されたものであ
り、１９９９年８月２７日に「12/21original KOE株」
として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、
下記の菌学的性質を有する。 １．形態的性質（肉汁寒天培地） ・菌形：桿菌 ・大きさ：0.5〜1.0×1.0〜3.0μｍ ・胞子の形成：陽性 ・胞子の形：楕円形 ・胞子嚢の形：非膨 ・運動性：陽性 ２．生理学的性質 ・グラム染色性：陽性 ・カタラーゼ：陽性 ・酸素に対する態度：好気性 ・嫌気下での生育：陰性 ・V-P反応：陰性 ・V-PブロスのpH：5.6 ・Ｄ−グルコースからの酸の生成：陽性 ・Ｄ−グルコースからのガスの生成：陰性 ・ゼラチンの分解：陽性 ・デンプンの分解：陽性 ・クエン酸塩の利用：陽性 ・プロピオン酸塩の利用：陰性 ・卵黄反応：陰性 ・硝酸塩の還元：陽性 ・pH6.8での生育（ニュートリエントブロス）：陽性 ・pH5.7での生育（ニュートリエントブロス）：陽性 ・5%NaCl存在下での生育：陽性 ・7%NaCl存在下での生育：陽性 ・10℃での生育：陰性 ・30℃での生育：陽性 ・50℃での生育：陽性 ・55℃での生育：陰性 ３．化学分類学的性質 ・菌体内DNAのGC含量：45モル%（HPLC法） 以上の菌学的性質を有する菌について、バージーズマニ
ュアル（Bergey's Manual of Systematic Bacterology,
Volume 2）及びザ・ジーナス・バチルス（TheGenus Ba
cillus, 1973, U.S. Department of Agriculture）によ
り同定を行なうと、本菌株はバチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilis）に属すると認められ、バチルス・ズ
ブチリス12/21originalKOE株と命名した。
【００１２】本発明の培養においては通常の細菌の培養
法が一般に用いられる。培養のための栄養源としては下
記に示す如くいろいろなものを用いることができる。す
なわち、炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含有する培地
であれば、天然培地でも合成培地でも使用できる。炭素
源としては、グルコース、マンノース、ショ糖、ガラク
トース、フラクトース、デキストリン等が使用できる。
窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム、コーングルテンミール、コーンス
ティープリカー、ペプトン、ソイビーンミール、肉エキ
ス、酵母エキス、カザミノ酸、大豆粉などを使用でき
る。無機塩類としては、ナトリウム、カリウム、マグネ
シウム、カルシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅等の塩
類、例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸
銅、モリブデン酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カ
リウム等を使用できる。これらのほか、添加可能な栄養
因子としてはビタミン類、アミノ酸、核酸及びその塩類
などが例示される。
法が一般に用いられる。培養のための栄養源としては下
記に示す如くいろいろなものを用いることができる。す
なわち、炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含有する培地
であれば、天然培地でも合成培地でも使用できる。炭素
源としては、グルコース、マンノース、ショ糖、ガラク
トース、フラクトース、デキストリン等が使用できる。
窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム、コーングルテンミール、コーンス
ティープリカー、ペプトン、ソイビーンミール、肉エキ
ス、酵母エキス、カザミノ酸、大豆粉などを使用でき
る。無機塩類としては、ナトリウム、カリウム、マグネ
シウム、カルシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅等の塩
類、例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸
銅、モリブデン酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カ
リウム等を使用できる。これらのほか、添加可能な栄養
因子としてはビタミン類、アミノ酸、核酸及びその塩類
などが例示される。
【００１３】培養は、好気的条件、例えば振盪培養法、
通気撹拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養を組
み合わせることもできる。培養温度は、25〜37℃、特に
27〜32℃が好適で、培地の最初のpHは6.0〜7.0、好まし
くは6.5付近である。培養時間は、培地量、培養温度、
培養法、pH等に応じて適宜選択することができ、特に制
限されない。好ましくは20〜96時間、さらに好ましくは
40〜96時間である。通気攪拌培養等で培養物中にキトサ
ナーゼが分泌生産される。
通気撹拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養を組
み合わせることもできる。培養温度は、25〜37℃、特に
27〜32℃が好適で、培地の最初のpHは6.0〜7.0、好まし
くは6.5付近である。培養時間は、培地量、培養温度、
培養法、pH等に応じて適宜選択することができ、特に制
限されない。好ましくは20〜96時間、さらに好ましくは
40〜96時間である。通気攪拌培養等で培養物中にキトサ
ナーゼが分泌生産される。
【００１４】分泌されたキトサナーゼを含む培養物は、
濾過又は遠心分離等の操作で菌体を除いた培養液をその
まま粗キトサナーゼとして使用することができる。
濾過又は遠心分離等の操作で菌体を除いた培養液をその
まま粗キトサナーゼとして使用することができる。
【００１５】キトサナーゼの分離精製は、硫安による分
画沈殿、DEAE-セファロースCL-6Bによるカラムクロマト
グラフィー、セファアクリルによるゲル濾過等の公知の
酵素精製手段を用いることができ、高純度のキトサナー
ゼを得ることができる。
画沈殿、DEAE-セファロースCL-6Bによるカラムクロマト
グラフィー、セファアクリルによるゲル濾過等の公知の
酵素精製手段を用いることができ、高純度のキトサナー
ゼを得ることができる。
【００１６】本発明により製造されたキトサナーゼは、
下記の理化学的性質を備えている。 分子量：約29kDa［測定方法：SDS-PAGE電気泳動法］ 等電点：8.3（アクリルアミド等電点電気泳動法によ
る） 至適pH：6.8〜7.0 至適温度：45〜50℃ 温度安定性：40℃まで安定 ｐＨ安定性：5.5-7.0 基質特異性：脱アセチル化度の種々異なる市販のキトサ
ンやグリコールキトサン、グリコールキチン、コロイダ
ルキチンを０．２Ｗ／Ｖの基質濃度で活性比較した。
下記の理化学的性質を備えている。 分子量：約29kDa［測定方法：SDS-PAGE電気泳動法］ 等電点：8.3（アクリルアミド等電点電気泳動法によ
る） 至適pH：6.8〜7.0 至適温度：45〜50℃ 温度安定性：40℃まで安定 ｐＨ安定性：5.5-7.0 基質特異性：脱アセチル化度の種々異なる市販のキトサ
ンやグリコールキトサン、グリコールキチン、コロイダ
ルキチンを０．２Ｗ／Ｖの基質濃度で活性比較した。
【００１７】本酵素は、コロイダルキチン、グリコール
キチンと反応せず、脱アセチル化度の高いキトサンほど
良く作用を受けた。結果を表１に示す。
キチンと反応せず、脱アセチル化度の高いキトサンほど
良く作用を受けた。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】 キトサン加水分解における粘度と生成糖の関係：２種の
市販キトサンの０．２％溶液に対して本酵素を基質ｇ当
たり０．２単位作用させたときの粘度低下と生成糖の関
係を調べた。結果として、両基質はおよそ４５度の直線
関係を示したことから、本酵素はエンド型のキトサナー
ゼであると結論付けた。力価測定法：０．２５ｇのキト
サンを０．７５Ｎ酢酸４５ｍｌに添加し溶解した後、１
０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５．６に調製し、水で５０
ｍｌとする。この０．５％キトサン溶液（０．５ｍｌ）
に酵素溶液０．５ｍｌを正確に量って加え、４０℃±
０．５℃で１０分間反応させる。その後反応液にアセチ
ルアセトン溶液１ｍｌを加え、RondleとMorganの方法で
遊離したグルコサミン量を定量する。上記条件下におい
て、１分間に１マイクロモルのグルコサミンを遊離する
酵素量を１単位とする。ポリアクリルアミド電気泳動：
常法により１３％ポリアクリルアミド電気泳動を行うと
単一バンドを示した（図３）。
市販キトサンの０．２％溶液に対して本酵素を基質ｇ当
たり０．２単位作用させたときの粘度低下と生成糖の関
係を調べた。結果として、両基質はおよそ４５度の直線
関係を示したことから、本酵素はエンド型のキトサナー
ゼであると結論付けた。力価測定法：０．２５ｇのキト
サンを０．７５Ｎ酢酸４５ｍｌに添加し溶解した後、１
０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５．６に調製し、水で５０
ｍｌとする。この０．５％キトサン溶液（０．５ｍｌ）
に酵素溶液０．５ｍｌを正確に量って加え、４０℃±
０．５℃で１０分間反応させる。その後反応液にアセチ
ルアセトン溶液１ｍｌを加え、RondleとMorganの方法で
遊離したグルコサミン量を定量する。上記条件下におい
て、１分間に１マイクロモルのグルコサミンを遊離する
酵素量を１単位とする。ポリアクリルアミド電気泳動：
常法により１３％ポリアクリルアミド電気泳動を行うと
単一バンドを示した（図３）。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、バチルス・ズブチリス
からキトサナーゼを得ることができる。該キトサナーゼ
は、５糖以上のキトオリゴ糖を優先的に生成し、市販の
キトサナーゼよりも高い活性を有している。
からキトサナーゼを得ることができる。該キトサナーゼ
は、５糖以上のキトオリゴ糖を優先的に生成し、市販の
キトサナーゼよりも高い活性を有している。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて説明する。 製造例１キトサナーゼ生産能を有するバチルス・ズブチリスの分
離 環境廃棄物工場の土壌由来の微生物について、キトサン
を唯一の炭素源とする最小寒天培地を用いたスクリーニ
ングを行い生育するコロニーを採取し、該コロニーにつ
いて同様な操作を繰り返すことにより、キトサナーゼ生
産能を有する菌を分離した。得られた菌について各種の
形態学的性質、生理学的性質、化学分類学的性質を調
べ、バチルス・ズブチリス属に属する菌であると同定し
た。得られたキトサナーゼ高生産能を有する菌株は、１
９９９年８月２７日に「12/21original KOE株」として
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。 実施例１キトサナーゼ生産菌「12/21original KOE株」からのキ
トサナーゼの精製 コーングルテンミール５％、グルコース１％、ＫＮＯ3
０．２％、KH2PO4 ０．１％（ｐＨ６．５）を含む液体
培地５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコ分注し、１２
０℃、３０分間滅菌した。
離 環境廃棄物工場の土壌由来の微生物について、キトサン
を唯一の炭素源とする最小寒天培地を用いたスクリーニ
ングを行い生育するコロニーを採取し、該コロニーにつ
いて同様な操作を繰り返すことにより、キトサナーゼ生
産能を有する菌を分離した。得られた菌について各種の
形態学的性質、生理学的性質、化学分類学的性質を調
べ、バチルス・ズブチリス属に属する菌であると同定し
た。得られたキトサナーゼ高生産能を有する菌株は、１
９９９年８月２７日に「12/21original KOE株」として
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。 実施例１キトサナーゼ生産菌「12/21original KOE株」からのキ
トサナーゼの精製 コーングルテンミール５％、グルコース１％、ＫＮＯ3
０．２％、KH2PO4 ０．１％（ｐＨ６．５）を含む液体
培地５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコ分注し、１２
０℃、３０分間滅菌した。
【００２１】前培養として、上記坂口フラスコに「12/2
1original KOE株」１白金耳を植菌し、３０℃で２４時
間振とう培養を行った。この前培養液10mlを１２０℃、
３０分間滅菌処理を行った前記培地５Ｌに植菌し、通気
量１Ｌ／分、回転数３００ｒｐｍで３０℃、６５時間通
気攪拌培養を行った。培養後、７０００ｒｐｍ、１０分
遠心分離を行い、培養上清液を得た。次に上清液に対し
飽和量の硫安を加え塩析を行った。生じた沈殿物を７０
００ｒｐｍ、２分遠心分離して沈殿を捕集し、脱イオン
水３５０ｍｌに溶解し、溶解後セロファンチューブに入
れ、脱イオン水に対して十分に透析した。この透析され
た溶液を凍結乾燥して粗酵素サンプル１４．４ｇを得
た。そのキトサナーゼ活性は２１００Ｕ/gであった。 実施例２ 実施例１で得た粗酵素サンプルを２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解して１０，０００ｒｐｍ、１
０分遠心分離を行い、上清液を得た。該上清液を２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したDEAE S
epharose CL-6Bを充填したカラム（直径２．６ｃｍ×４
０ｃｍ）に通じてキトサナーゼを吸着させた後、０〜
０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で酵素タンパク質を
溶出した（図１）。図１の高活性のＰ１フラクションを
集め、コロジオンバッグによる濃縮及び透析を行った。
この濃縮液を再度DEAE Sepharose CL-6Bカラムに吸着さ
せ、０〜０．４ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で酵素タン
パク質を溶出した（図２）。図２の高活性のＰ１−１フ
ラクションのキトサナーゼ比活性は２６．３１単位／ｍ
ｇで、粗酵素サンプルの１２．５倍であった。このフラ
クションを濃縮及び透析し、セファアクリルＳ １００
ＨＲカラムによりクロマトグラフィーを行った。このフ
ラクションについてポリアクリルアミド電気泳動を行う
と、単一のバンドであった（図３）。 実施例３ 脱アセチル化度９３％のキトサン１０（２０ｇ）にイオ
ン交換水９５０ｍｌを加え、２Ｍ乳酸を加えて十分攪拌
混合してキトサンを溶解させ、キトサン基質溶液とし
た。キトサン基質溶液に対して実施例２で得られたキト
サナーゼをキトサンｇ当たり５単位添加して、４５℃で
１時間作用させた後、沸騰水浴中で２０分加熱し、反応
を停止させた。この反応液をアドバンテック濾紙Ｎｏ．
２で濾過し、凍結乾燥を行い、キトサン分解物１８ｇを
得た。得られたキトサン分解物をイオン交換水に溶解
し、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫゲル
ＮＨ２−６０；４．６×２５ｃｍ）により分析した結
果、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、６量体
以上の比は、３．５，９．６，１６．０，１７．２、１
５．４、３４．６であり、単量体は殆ど認められなかっ
た。
1original KOE株」１白金耳を植菌し、３０℃で２４時
間振とう培養を行った。この前培養液10mlを１２０℃、
３０分間滅菌処理を行った前記培地５Ｌに植菌し、通気
量１Ｌ／分、回転数３００ｒｐｍで３０℃、６５時間通
気攪拌培養を行った。培養後、７０００ｒｐｍ、１０分
遠心分離を行い、培養上清液を得た。次に上清液に対し
飽和量の硫安を加え塩析を行った。生じた沈殿物を７０
００ｒｐｍ、２分遠心分離して沈殿を捕集し、脱イオン
水３５０ｍｌに溶解し、溶解後セロファンチューブに入
れ、脱イオン水に対して十分に透析した。この透析され
た溶液を凍結乾燥して粗酵素サンプル１４．４ｇを得
た。そのキトサナーゼ活性は２１００Ｕ/gであった。 実施例２ 実施例１で得た粗酵素サンプルを２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解して１０，０００ｒｐｍ、１
０分遠心分離を行い、上清液を得た。該上清液を２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したDEAE S
epharose CL-6Bを充填したカラム（直径２．６ｃｍ×４
０ｃｍ）に通じてキトサナーゼを吸着させた後、０〜
０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で酵素タンパク質を
溶出した（図１）。図１の高活性のＰ１フラクションを
集め、コロジオンバッグによる濃縮及び透析を行った。
この濃縮液を再度DEAE Sepharose CL-6Bカラムに吸着さ
せ、０〜０．４ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で酵素タン
パク質を溶出した（図２）。図２の高活性のＰ１−１フ
ラクションのキトサナーゼ比活性は２６．３１単位／ｍ
ｇで、粗酵素サンプルの１２．５倍であった。このフラ
クションを濃縮及び透析し、セファアクリルＳ １００
ＨＲカラムによりクロマトグラフィーを行った。このフ
ラクションについてポリアクリルアミド電気泳動を行う
と、単一のバンドであった（図３）。 実施例３ 脱アセチル化度９３％のキトサン１０（２０ｇ）にイオ
ン交換水９５０ｍｌを加え、２Ｍ乳酸を加えて十分攪拌
混合してキトサンを溶解させ、キトサン基質溶液とし
た。キトサン基質溶液に対して実施例２で得られたキト
サナーゼをキトサンｇ当たり５単位添加して、４５℃で
１時間作用させた後、沸騰水浴中で２０分加熱し、反応
を停止させた。この反応液をアドバンテック濾紙Ｎｏ．
２で濾過し、凍結乾燥を行い、キトサン分解物１８ｇを
得た。得られたキトサン分解物をイオン交換水に溶解
し、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫゲル
ＮＨ２−６０；４．６×２５ｃｍ）により分析した結
果、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、６量体
以上の比は、３．５，９．６，１６．０，１７．２、１
５．４、３４．６であり、単量体は殆ど認められなかっ
た。
【図１】DEAE Sepharose CL-6Bを充填したカラムを用い
た第１回目のタンパク質の溶出パターンである。
た第１回目のタンパク質の溶出パターンである。
【図２】DEAE Sepharose CL-6Bを充填したカラムを用い
た第２回目のタンパク質の溶出パターンである。
た第２回目のタンパク質の溶出パターンである。
【図３】精製キトサナーゼのSDS-PAGEの結果を示す。な
お、レーン１は分子量マーカー、レーン２はKOE株の粗
培養液、レーン３はDEAE Sepharose CL-6Bカラムで２回
精製後の精製キトサナーゼである。
お、レーン１は分子量マーカー、レーン２はKOE株の粗
培養液、レーン３はDEAE Sepharose CL-6Bカラムで２回
精製後の精製キトサナーゼである。
【図４】本発明により得られたキトサナーゼの温度、ｐ
Ｈに対する活性（Ａ，Ｂ）及び安定性（Ｃ，Ｄ）を示す
図である。
Ｈに対する活性（Ａ，Ｂ）及び安定性（Ｃ，Ｄ）を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 吉田 直人 宮崎県宮崎市学園木花台西１丁目１番地 宮崎大学農学部内 (72)発明者 井上 順一 大阪府寝屋川市高柳１丁目２番６号 阪急 バイオインダストリー株式会社内 (72)発明者 仮屋 勲一 大阪府大阪市淀川区西中島３丁目９番13号 大北ビル５階 協和化成株式会社内 Ｆターム(参考） 4B050 DD02 FF05E FF11E LL01 LL02 LL05 4B064 AF04 AF22 AG01 CA02 CA21 DA03 DA10 DA16 4B065 AA15X BA22 CA21 CA31
Claims (5)
- 【請求項１】キトサナーゼ生産能を有するバチルス・ズ
ブチリス。 - 【請求項２】バチルス・ズブチリス属に属するキトサナ
ーゼ生産菌。 - 【請求項３】請求項１に記載のバチルス・ズブチリスを
培養し、培養物からキトサナーゼを採取することを特徴
とするキトサナーゼの製造方法。 - 【請求項４】キトサンに作用し、５糖以上のキトオリゴ
糖を優先的に生産するキトサナーゼ。 - 【請求項５】請求項３に記載の方法で製造されたキトサ
ナーゼまたは請求項４に記載のキトサナーゼをキトサン
に作用させてキトオリゴ糖を製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25071199A JP2001069975A (ja) | 1999-09-03 | 1999-09-03 | キトサナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25071199A JP2001069975A (ja) | 1999-09-03 | 1999-09-03 | キトサナーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001069975A true JP2001069975A (ja) | 2001-03-21 |
Family
ID=17211925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25071199A Pending JP2001069975A (ja) | 1999-09-03 | 1999-09-03 | キトサナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001069975A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101148646B (zh) * | 2007-09-06 | 2010-05-19 | 武汉东方天琪生物工程有限公司 | 一种高活力壳聚糖酶制剂的生产方法 |
| CN102373256A (zh) * | 2011-10-10 | 2012-03-14 | 武汉东方天琪生物工程有限公司 | 酶解半纤维素制备高纯度甘露低聚糖的生产方法 |
| CN102995402A (zh) * | 2012-11-17 | 2013-03-27 | 江志清 | 在织物上固化医药级壳寡糖的方法 |
| CN103938445A (zh) * | 2014-02-25 | 2014-07-23 | 江志清 | 用壳寡糖加工整理生态透氧抗菌口罩的方法 |
| CN108018245A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-05-11 | 中国科学院成都生物研究所 | 一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
-
1999
- 1999-09-03 JP JP25071199A patent/JP2001069975A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN102995402A (zh) * | 2012-11-17 | 2013-03-27 | 江志清 | 在织物上固化医药级壳寡糖的方法 |
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| CN108018245A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-05-11 | 中国科学院成都生物研究所 | 一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
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