JP3118573B1 - キチナーゼ及びその製造法 - Google Patents
キチナーゼ及びその製造法Info
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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Abstract
【要約】
【課題】有用な機能を有する新規なキチナーゼ及びその
製造法を提供すること。 【解決手段】下記の理化学的性質を有することを特徴と
するキチナーゼ。 （１）作用：キチンのβ−１，４結合をランダムに切断
して、Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を生
成する、（２）至適ｐＨ：６．５〜１０．４、（３）安
定ｐＨ：７．０〜９．０、（４）至適温度：３７℃、
（５）作用温度範囲：４〜６０℃、（６）熱安定性：４
０℃、ｐＨ８．０で、３０分間加温後、６０％以上の活
性が保持される。海洋低温細菌ビブリオ（Vibrio）属に
属する、キチンに作用してＮ−アセチルグルコサミンオ
リゴマーを生成するキチナーゼ生産菌を培養し、その培
養物からキチナーゼを採取することを特徴とするキチナ
ーゼの製造法。
製造法を提供すること。 【解決手段】下記の理化学的性質を有することを特徴と
するキチナーゼ。 （１）作用：キチンのβ−１，４結合をランダムに切断
して、Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を生
成する、（２）至適ｐＨ：６．５〜１０．４、（３）安
定ｐＨ：７．０〜９．０、（４）至適温度：３７℃、
（５）作用温度範囲：４〜６０℃、（６）熱安定性：４
０℃、ｐＨ８．０で、３０分間加温後、６０％以上の活
性が保持される。海洋低温細菌ビブリオ（Vibrio）属に
属する、キチンに作用してＮ−アセチルグルコサミンオ
リゴマーを生成するキチナーゼ生産菌を培養し、その培
養物からキチナーゼを採取することを特徴とするキチナ
ーゼの製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なキチナーゼ
及びその製造法に関する。
及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キチンは、Ｎ−アセチルグルコサミンを
単位とする多糖であり、菌界、植物界、動物界にわたっ
て存在している。その年間生産量はセルロースに匹敵
し、最も豊富なバイオマス資源の１つとされる。
単位とする多糖であり、菌界、植物界、動物界にわたっ
て存在している。その年間生産量はセルロースに匹敵
し、最も豊富なバイオマス資源の１つとされる。
【０００３】近年、その脱アセチル化物であるキトサン
とともに、キチンを加水分解して得られる各種の鎖長の
化合物は、医療、食品、化粧品、農業、衣料等、広い分
野で利用されるようになってきた。特に、キチンから得
られるＮ−アセチルグルコサミンの低分子オリゴマー
は、免疫機能亢進、抗菌性、抗ウィルス性等、有用な生
理活性を持つことが知られている。
とともに、キチンを加水分解して得られる各種の鎖長の
化合物は、医療、食品、化粧品、農業、衣料等、広い分
野で利用されるようになってきた。特に、キチンから得
られるＮ−アセチルグルコサミンの低分子オリゴマー
は、免疫機能亢進、抗菌性、抗ウィルス性等、有用な生
理活性を持つことが知られている。
【０００４】従来、Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴ
マーは、カニ、エビ等の甲殻を水酸化ナトリウム溶液内
で熱処理しタンパク質を除去後、塩酸で灰分を除いて得
られるキチンを原料とし、これを限定塩酸加水分解法に
よって低分子化して、製造されることが多い。また、最
近フッ化水素を用いる方法も提案されている。
マーは、カニ、エビ等の甲殻を水酸化ナトリウム溶液内
で熱処理しタンパク質を除去後、塩酸で灰分を除いて得
られるキチンを原料とし、これを限定塩酸加水分解法に
よって低分子化して、製造されることが多い。また、最
近フッ化水素を用いる方法も提案されている。
【０００５】しかし、いずれの方法においても、装置や
廃水の処理にコストを要するという欠点を有する。さら
に必要とする結合の切断を起こしやすく、副生物による
製造効率の低さを避け得ない。
廃水の処理にコストを要するという欠点を有する。さら
に必要とする結合の切断を起こしやすく、副生物による
製造効率の低さを避け得ない。
【０００６】一方、キチン分解酵素のキチナーゼは、基
質特異性によりキチンの目的とする箇所のみに作用する
ため副生物が少なく、又温和な反応条件を有するため、
コストの軽減も期待される。そこで、工業的に利用でき
るキチナーゼの生産が求められている。現在、バチルス
（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、ストレプト
マイセス（Streptomyces）属の微生物由来のキチナーゼ
が市販されているが、学術研究での使用を目的としてお
り高価である。また、これらのキチナーゼは、至適ｐＨ
が酸性側にあり、中性より高いｐＨ域での使用には不適
格であり、又その作用温度域が狭い。また、ビブリオ
（Vibrio）属の微生物がキチナーゼを生産することが報
告されているが、全て中温性のビブリオ属微生物であり
（Akira Ohtakara, Masaru Mitsutomi and Yasushi Uch
ida, J. Ferment. Technol., 57, 169-177(1979)）、低
温細菌のビブリオ属微生物がキチナーゼを生産すること
は知られていない。
質特異性によりキチンの目的とする箇所のみに作用する
ため副生物が少なく、又温和な反応条件を有するため、
コストの軽減も期待される。そこで、工業的に利用でき
るキチナーゼの生産が求められている。現在、バチルス
（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、ストレプト
マイセス（Streptomyces）属の微生物由来のキチナーゼ
が市販されているが、学術研究での使用を目的としてお
り高価である。また、これらのキチナーゼは、至適ｐＨ
が酸性側にあり、中性より高いｐＨ域での使用には不適
格であり、又その作用温度域が狭い。また、ビブリオ
（Vibrio）属の微生物がキチナーゼを生産することが報
告されているが、全て中温性のビブリオ属微生物であり
（Akira Ohtakara, Masaru Mitsutomi and Yasushi Uch
ida, J. Ferment. Technol., 57, 169-177(1979)）、低
温細菌のビブリオ属微生物がキチナーゼを生産すること
は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、有用
な機能を有する新規なキチナーゼ及びその製造法を提供
することにある。
な機能を有する新規なキチナーゼ及びその製造法を提供
することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、海洋では大
量のキチンが生産され、微生物によって分解され、海洋
の生態系を支えていることから、海洋細菌によるキチナ
ーゼ生産に着目し鋭意研究した結果、海洋低温細菌ビブ
リオ（Vibrio）属の菌株が工業的使用に有利な機能を持
つ新規なキチナーゼを、高効率に生産する事を見出し、
これに基づき本発明を完成するに至った。
量のキチンが生産され、微生物によって分解され、海洋
の生態系を支えていることから、海洋細菌によるキチナ
ーゼ生産に着目し鋭意研究した結果、海洋低温細菌ビブ
リオ（Vibrio）属の菌株が工業的使用に有利な機能を持
つ新規なキチナーゼを、高効率に生産する事を見出し、
これに基づき本発明を完成するに至った。
【０００９】即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有
することを特徴とするキチナーゼに係る。 （１）作用：キチンのβ−１，４結合をランダムに切断
して、Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を生
成する。Ｎ−アセチルグルコサミンの単量体は生成しな
い。 （２）至適ｐＨ：６．５〜１０．４。 （３）安定ｐＨ：７．０〜９．０。 （４）至適温度：３７℃。 （５）作用温度範囲：４〜６０℃。 （６）熱安定性：４０℃、ｐＨ８．０で、３０分間加温
後、６０％以上の活性が保持される。
することを特徴とするキチナーゼに係る。 （１）作用：キチンのβ−１，４結合をランダムに切断
して、Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を生
成する。Ｎ−アセチルグルコサミンの単量体は生成しな
い。 （２）至適ｐＨ：６．５〜１０．４。 （３）安定ｐＨ：７．０〜９．０。 （４）至適温度：３７℃。 （５）作用温度範囲：４〜６０℃。 （６）熱安定性：４０℃、ｐＨ８．０で、３０分間加温
後、６０％以上の活性が保持される。
【００１０】また、本発明は、海洋低温細菌ビブリオ
（Vibrio）属に属する、キチンに作用してＮ−アセチル
グルコサミンオリゴマーを生成するキチナーゼ生産菌を
培養し、その培養物からキチナーゼを採取することを特
徴とするキチナーゼの製造法にも係る。
（Vibrio）属に属する、キチンに作用してＮ−アセチル
グルコサミンオリゴマーを生成するキチナーゼ生産菌を
培養し、その培養物からキチナーゼを採取することを特
徴とするキチナーゼの製造法にも係る。
【００１１】本発明の新規酵素であるキチナーゼは、キ
チンに作用しそれを低分子化するために使用でき、特に
Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマーの工業的生産に好
適に使用できる。
チンに作用しそれを低分子化するために使用でき、特に
Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマーの工業的生産に好
適に使用できる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明の新規キチナーゼは、キチ
ンのβ−１，４結合をランダムに切断して、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンの４量体、２量体を主成分とするオリゴ
マーを生成するという作用を有している。
ンのβ−１，４結合をランダムに切断して、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンの４量体、２量体を主成分とするオリゴ
マーを生成するという作用を有している。
【００１３】また、本発明の新規キチナーゼは、作用温
度範囲が４〜６０℃と広いという特徴を有している。即
ち、本発明のキチナーゼは、低温酵素としての性質を有
すると共に、中温菌由来の公知のキチナーゼよりも高い
温度域まで活性を示す性質を有するという、ユニークな
温度特性によって、特徴付けられる。
度範囲が４〜６０℃と広いという特徴を有している。即
ち、本発明のキチナーゼは、低温酵素としての性質を有
すると共に、中温菌由来の公知のキチナーゼよりも高い
温度域まで活性を示す性質を有するという、ユニークな
温度特性によって、特徴付けられる。
【００１４】本発明のキチナーゼの理化学的性質は、次
の通りである。 （１）作用：キチンのβ−１，４結合をランダムに切断
して、Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を生
成する。通常は、本酵素により、キチンが分解されて、
Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を主成分と
するオリゴマーが生成されるが、作用時間が短い場合等
には、６量体以上の多量体も一部生成する。また、Ｎ−
アセチルグルコサミンの単量体は生成しない。 （２）至適ｐＨ：６．５〜１０．４。至適ｐＨは、図１
の酵素の相対活性とｐＨとの関係を示すグラフから明ら
かな通りである。また、図１より、最高活性は、ｐＨ
７．８で発揮されることが明らかである。 （３）安定ｐＨ：７．０〜９．０。例えば、ｐＨ７．
８、３０℃で、３０分間加熱後、９０％以上の活性が保
持される。 （４）至適温度：３７℃。至適温度は、図２の酵素の相
対活性と反応温度との関係を示すグラフから明らかな通
りである。 （５）作用温度範囲：４〜６０℃。作用温度範囲は、図
２の酵素の相対活性と反応温度との関係を示すグラフか
ら明らかな通りである。即ち、本発明のキチナーゼは、
低温酵素としての性質を有すると共に、従来公知の中温
菌由来のキチナーゼよりも高い温度域まで活性を示す性
質も有する。 （６）熱安定性：４０℃、ｐＨ８．０で、３０分間加温
後、６０％以上の活性が保持される。熱安定性は、図３
の酵素の残存活性と温度との関係を示すグラフから明ら
かな通り、ｐＨ８．０で、３０分間加温乃至加熱したと
きの残存活性は、２０℃以下では１００％、３０℃では
９０％以上、４０℃では６０％以上である。また、本酵
素の熱安定性は、基質との共存下においては顕著に向上
する。
の通りである。 （１）作用：キチンのβ−１，４結合をランダムに切断
して、Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を生
成する。通常は、本酵素により、キチンが分解されて、
Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を主成分と
するオリゴマーが生成されるが、作用時間が短い場合等
には、６量体以上の多量体も一部生成する。また、Ｎ−
アセチルグルコサミンの単量体は生成しない。 （２）至適ｐＨ：６．５〜１０．４。至適ｐＨは、図１
の酵素の相対活性とｐＨとの関係を示すグラフから明ら
かな通りである。また、図１より、最高活性は、ｐＨ
７．８で発揮されることが明らかである。 （３）安定ｐＨ：７．０〜９．０。例えば、ｐＨ７．
８、３０℃で、３０分間加熱後、９０％以上の活性が保
持される。 （４）至適温度：３７℃。至適温度は、図２の酵素の相
対活性と反応温度との関係を示すグラフから明らかな通
りである。 （５）作用温度範囲：４〜６０℃。作用温度範囲は、図
２の酵素の相対活性と反応温度との関係を示すグラフか
ら明らかな通りである。即ち、本発明のキチナーゼは、
低温酵素としての性質を有すると共に、従来公知の中温
菌由来のキチナーゼよりも高い温度域まで活性を示す性
質も有する。 （６）熱安定性：４０℃、ｐＨ８．０で、３０分間加温
後、６０％以上の活性が保持される。熱安定性は、図３
の酵素の残存活性と温度との関係を示すグラフから明ら
かな通り、ｐＨ８．０で、３０分間加温乃至加熱したと
きの残存活性は、２０℃以下では１００％、３０℃では
９０％以上、４０℃では６０％以上である。また、本酵
素の熱安定性は、基質との共存下においては顕著に向上
する。
【００１５】本発明キチナーゼの基質としては、粉末キ
チン等の固体のキチンを不均一反応系で良く分解する
が、コロイダルキチンのような再生キチンやキチンの水
溶性誘導体であるグリコールキチン等では反応速度が高
くなる。
チン等の固体のキチンを不均一反応系で良く分解する
が、コロイダルキチンのような再生キチンやキチンの水
溶性誘導体であるグリコールキチン等では反応速度が高
くなる。
【００１６】キチナーゼの酵素活性は、以下の方法によ
り測定した。
り測定した。
【００１７】キチン（片倉チッカリン（株）製）を塩酸
に溶解し、水中で再析出させた後ろ別、洗浄してコロイ
ダルキチンを調製した。サンプル管に、基質としてコロ
イダルキチン２０mg、酵素溶液１ml、０．４Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８．７）０．２mlを入れ、密閉して３７℃
で、２時間振とうする。反応終了後、遠心分離によっ
て、生成したＮ−アセチルグルコサミンの４量体、２量
体を主成分とするオリゴマーを含む上清を得、この上清
０．４mlを試験管に移し、市販β−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼによって単量体であるＮ−アセチルグルコ
サミンにまで分解する。β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼとして、市販セルラーゼである「セルロシンＡ
Ｐ」（商品名、上田化学（株）製、１％）を用いてもよ
い。生成したＮ−アセチルグルコサミンを、モルガン−
エルソン法（阿武喜美子、瀬野信子、生物化学実験、１
１巻、糖質実験法、p.22-23(1968)、共立出版）で比色
定量する。
に溶解し、水中で再析出させた後ろ別、洗浄してコロイ
ダルキチンを調製した。サンプル管に、基質としてコロ
イダルキチン２０mg、酵素溶液１ml、０．４Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８．７）０．２mlを入れ、密閉して３７℃
で、２時間振とうする。反応終了後、遠心分離によっ
て、生成したＮ−アセチルグルコサミンの４量体、２量
体を主成分とするオリゴマーを含む上清を得、この上清
０．４mlを試験管に移し、市販β−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼによって単量体であるＮ−アセチルグルコ
サミンにまで分解する。β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼとして、市販セルラーゼである「セルロシンＡ
Ｐ」（商品名、上田化学（株）製、１％）を用いてもよ
い。生成したＮ−アセチルグルコサミンを、モルガン−
エルソン法（阿武喜美子、瀬野信子、生物化学実験、１
１巻、糖質実験法、p.22-23(1968)、共立出版）で比色
定量する。
【００１８】酵素（キチナーゼ）の１単位（ユニット）
は、１分間に１μmolのＮ−アセチルグルコサミンに相
当する上記オリゴマーを生成する酵素量を表す。
は、１分間に１μmolのＮ−アセチルグルコサミンに相
当する上記オリゴマーを生成する酵素量を表す。
【００１９】本発明の新規キチナーゼは、海洋低温細菌
ビブリオ（Vibrio）属に属する、キチンに作用してＮ−
アセチルグルコサミンオリゴマーを生成するキチナーゼ
生産菌を培養し、その培養物からキチナーゼを採取する
ことにより、好適に製造できる。
ビブリオ（Vibrio）属に属する、キチンに作用してＮ−
アセチルグルコサミンオリゴマーを生成するキチナーゼ
生産菌を培養し、その培養物からキチナーゼを採取する
ことにより、好適に製造できる。
【００２０】上記のキチナーゼの製造法に用いられる微
生物は、海洋低温細菌ビブリオ属に属し、該キチナーゼ
の生産能を有するものであれば、いずれも使用すること
ができる。例えば、本発明者らが房総沖日本海溝の深層
水から分離した海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７６９）を例示することができる。
生物は、海洋低温細菌ビブリオ属に属し、該キチナーゼ
の生産能を有するものであれば、いずれも使用すること
ができる。例えば、本発明者らが房総沖日本海溝の深層
水から分離した海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７６９）を例示することができる。
【００２１】この海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株は、受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６９として、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６９として、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００２２】キチナーゼ生産性海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５
菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６９）の菌学的性質は、下
記の通りである。
菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６９）の菌学的性質は、下
記の通りである。
【００２３】１．形態的性質 （１）細胞形態 ：稈状（rod） （２）鞭毛形態 ：極べん毛 （３）グラム染色：陰性。
【００２４】２．生理的性質 （１）増殖温度 ４℃：＋ ２５℃：＋ ３０℃：＋ （２）Ｏ−Ｆテスト：Fermentative （３）塩類要求性 ：＋ （４）色素生産 ：− （５）オキシダーゼ：＋ （６）カタラーゼ ：＋。
【００２５】３．分離源：房総沖日本海溝の水深６００
０ｍの海水。
０ｍの海水。
【００２６】上記菌学的性質の試験方法は、主として絵
面良男：沿岸環境調査マニュアルII〔水質・微生物
篇〕、日本海洋学会編、恒星社厚生閣、p.357-364(199
0)に従った。また、駒形和男：微生物の分類と同定
（下）、（改訂版、長谷川武治編著）、学会出版センタ
ー、p.99-161(1985)を参考にした。
面良男：沿岸環境調査マニュアルII〔水質・微生物
篇〕、日本海洋学会編、恒星社厚生閣、p.357-364(199
0)に従った。また、駒形和男：微生物の分類と同定
（下）、（改訂版、長谷川武治編著）、学会出版センタ
ー、p.99-161(1985)を参考にした。
【００２７】以上の菌学的性質を、絵面と清水の海洋細
菌の簡易同定図式（沿岸環境調査マニュアルII〔水質・
微生物篇〕、日本海洋学会編、恒星社厚生閣、p.357-36
4(1990)）に基づき、Bergey's Manual of Systematic B
acteriology, vol.1(Noel.R.Krieg, John.G.Holt編、Wi
lliams & Wilkins, Baltimor, 1984)及びBergey's Manu
al of Determinative Bacteriology(第９版、John.G.Ho
lt, Noel.R.Krieg,Peter.H.A.Sneath,James.T.Staley
編、Williams & Wilkins,Baltimor, 1994)を参考にして
対比した結果、本海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５７６９）は、ビブリオ（Vibrio）属に属す
る細菌と同定された。
菌の簡易同定図式（沿岸環境調査マニュアルII〔水質・
微生物篇〕、日本海洋学会編、恒星社厚生閣、p.357-36
4(1990)）に基づき、Bergey's Manual of Systematic B
acteriology, vol.1(Noel.R.Krieg, John.G.Holt編、Wi
lliams & Wilkins, Baltimor, 1984)及びBergey's Manu
al of Determinative Bacteriology(第９版、John.G.Ho
lt, Noel.R.Krieg,Peter.H.A.Sneath,James.T.Staley
編、Williams & Wilkins,Baltimor, 1994)を参考にして
対比した結果、本海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５７６９）は、ビブリオ（Vibrio）属に属す
る細菌と同定された。
【００２８】この海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５７６９）を用いて、キチナーゼを生産する
には、当該菌体を適当な培地に接種し、好ましくは誘導
物質の存在下で常法に従って培養すればよい。この誘導
物質としては、キチン、コロイダルキチンのような再生
キチン、キチン分解物、グリコールキチンのようなキチ
ン誘導体等が挙げられ、これらを単独で又はこれらのう
ち２種以上を組み合わせたものを使用できる。誘導物質
は、通常、０．１g/リットル以上、好ましくは１〜５０g/リッ
トルの濃度で加える。
Ｍ ＢＰ−５７６９）を用いて、キチナーゼを生産する
には、当該菌体を適当な培地に接種し、好ましくは誘導
物質の存在下で常法に従って培養すればよい。この誘導
物質としては、キチン、コロイダルキチンのような再生
キチン、キチン分解物、グリコールキチンのようなキチ
ン誘導体等が挙げられ、これらを単独で又はこれらのう
ち２種以上を組み合わせたものを使用できる。誘導物質
は、通常、０．１g/リットル以上、好ましくは１〜５０g/リッ
トルの濃度で加える。
【００２９】培地は格別である必要はなく、通常の培地
が用いられる。例えば、炭素源としてグルコース、マル
トース、キシロース、スクロース、ペプトン等が例示で
き、窒素源としては、イーストエキス、ペプトン、肉エ
キス、アミノ酸溶液等の有機窒素、又は硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム等の無機窒素が例示できる。ま
た、誘導物質を炭素源、窒素源としてもよい。無機塩と
しては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カルシウム等を適宜組み合わせて使用でき
る。上記培地のｐＨは、適当な酸又は塩基を加えること
により、６．５から８．５の範囲内に調整され、オート
クレーブにより殺菌される。
が用いられる。例えば、炭素源としてグルコース、マル
トース、キシロース、スクロース、ペプトン等が例示で
き、窒素源としては、イーストエキス、ペプトン、肉エ
キス、アミノ酸溶液等の有機窒素、又は硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム等の無機窒素が例示できる。ま
た、誘導物質を炭素源、窒素源としてもよい。無機塩と
しては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カルシウム等を適宜組み合わせて使用でき
る。上記培地のｐＨは、適当な酸又は塩基を加えること
により、６．５から８．５の範囲内に調整され、オート
クレーブにより殺菌される。
【００３０】培養条件は、温度が５〜３５℃、好ましく
は２０から２８℃で、２０〜７２時間程度、好気的に振
とう又は撹拌しながら培養を行うのが好適である。ま
た、本菌の培養は、静置でも行われる。
は２０から２８℃で、２０〜７２時間程度、好気的に振
とう又は撹拌しながら培養を行うのが好適である。ま
た、本菌の培養は、静置でも行われる。
【００３１】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。上清そのものを粗酵素液として利用でき
るが、硫酸アンモニウム塩析により目的の酵素を析出、
濃縮、採取することができる。
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。上清そのものを粗酵素液として利用でき
るが、硫酸アンモニウム塩析により目的の酵素を析出、
濃縮、採取することができる。
【００３２】培養上清、あるいは塩析して得られた沈殿
を再溶解した粗酵素液から、キチナーゼをさらに精製す
る必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵
素の精製手段である、塩析、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲルろ過法、吸着クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、調製用電気泳動法等を適宜組み合わせ
ることによって、精製を行うことができる。
を再溶解した粗酵素液から、キチナーゼをさらに精製す
る必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵
素の精製手段である、塩析、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲルろ過法、吸着クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、調製用電気泳動法等を適宜組み合わせ
ることによって、精製を行うことができる。
【００３３】かくして、本発明の新規キチナーゼを収得
できる。
できる。
【００３４】
【実施例】以下、実施例及び試験例を挙げて、本発明を
より一層具体的に説明する。
より一層具体的に説明する。
【００３５】実施例１ 「シリコ栓」（商品名、信越ポリマー）付き試験管中の
１/２ＴＺ培地（Akihiko.Maruyama, Naoki.Mita, and T
akanori.Higashihara, J. Oceanogr. 49, 353-376,199
3）５mlに、冷蔵保存された菌株Ｐ２Ｋ−５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７６９）２００μlを植菌し、２５℃で終夜振
とう培養した。１/２ＴＺ培地の成分組成は、ポリペプ
トン（Daigo社製）２．５g/リットル、イーストエキス（Dif
co社製）０．５g/リットル、「HEPES」（商品名、Dojin社
製）４．７７g/リットル、塩化ナトリウム２１．５３３g/リッ
トル、硫酸ナトリウム３．６０７g/リットル、塩化カリウム
０．６０９g/リットル、炭酸水素ナトリウム０．１７６g/リッ
トル、臭化カリウム０．０８８g/リットル、ホウ酸０．０２３
g/リットル、フッ化ナトリウム０．００３g/リットル、塩化マグ
ネシウム・６水塩９．７４７g/リットル、塩化カルシウム・
２水塩１．３６８g/リットル及び塩化ストロンチウム・６水
塩０．０２２g/リットルである。
１/２ＴＺ培地（Akihiko.Maruyama, Naoki.Mita, and T
akanori.Higashihara, J. Oceanogr. 49, 353-376,199
3）５mlに、冷蔵保存された菌株Ｐ２Ｋ−５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７６９）２００μlを植菌し、２５℃で終夜振
とう培養した。１/２ＴＺ培地の成分組成は、ポリペプ
トン（Daigo社製）２．５g/リットル、イーストエキス（Dif
co社製）０．５g/リットル、「HEPES」（商品名、Dojin社
製）４．７７g/リットル、塩化ナトリウム２１．５３３g/リッ
トル、硫酸ナトリウム３．６０７g/リットル、塩化カリウム
０．６０９g/リットル、炭酸水素ナトリウム０．１７６g/リッ
トル、臭化カリウム０．０８８g/リットル、ホウ酸０．０２３
g/リットル、フッ化ナトリウム０．００３g/リットル、塩化マグ
ネシウム・６水塩９．７４７g/リットル、塩化カルシウム・
２水塩１．３６８g/リットル及び塩化ストロンチウム・６水
塩０．０２２g/リットルである。
【００３６】その後、本培養液１mlを「Marine broth」
（商品名、Difco社製）１００mlに加え、さらに２４時
間振とう培養した。該培養液２５mlを、キチン粉末２０
gを含む１/２ＴＺ培地１リットルに添加し、２５℃で４８時
間、好気的に振とう培養した。その後、８０００×ｇで
２０分間遠心分離にかけ上清を得た。上清をさらに硫酸
アンモニウム８０％飽和とし、生成した沈殿を遠心分離
によって集め、再溶解して、比活性０．０００７８ユニ
ット／mg-protein、総活性２．３０ユニットを含む粗酵
素液を得た。
（商品名、Difco社製）１００mlに加え、さらに２４時
間振とう培養した。該培養液２５mlを、キチン粉末２０
gを含む１/２ＴＺ培地１リットルに添加し、２５℃で４８時
間、好気的に振とう培養した。その後、８０００×ｇで
２０分間遠心分離にかけ上清を得た。上清をさらに硫酸
アンモニウム８０％飽和とし、生成した沈殿を遠心分離
によって集め、再溶解して、比活性０．０００７８ユニ
ット／mg-protein、総活性２．３０ユニットを含む粗酵
素液を得た。
【００３７】この粗酵素液を、予め１．５Ｍ硫酸アンモ
ニウムを含むリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で
平衡化した５０mlの「Butyl Sepharose 4FF」（商品
名、疎水クロマトグラフィー担体、ファルマシア製）カ
ラムに通し、目的とする酵素を吸着させた。カラムを同
様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階的に硫酸アンモニ
ウムの濃度を変化させて目的酵素を溶出し、総活性１．
０４ユニット、比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inを有する酵素画分を得た。
ニウムを含むリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で
平衡化した５０mlの「Butyl Sepharose 4FF」（商品
名、疎水クロマトグラフィー担体、ファルマシア製）カ
ラムに通し、目的とする酵素を吸着させた。カラムを同
様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階的に硫酸アンモニ
ウムの濃度を変化させて目的酵素を溶出し、総活性１．
０４ユニット、比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inを有する酵素画分を得た。
【００３８】さらに上記の活性画分を、予め１０mMのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１０mMの「TSKg
el SuperQ-トヨパール650M」（商品名、イオン交換クロ
マトグラフィー担体、東ソー（株）製）カラムに通し、
目的とする酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩
衝液で洗浄した後、段階的にリン酸緩衝液中のＮａＣｌ
濃度を変化させて目的酵素を溶出し、総活性０．５１ユ
ニット、比活性０．０７８ユニット／mg-proteinを有す
る酵素標品を得た。
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１０mMの「TSKg
el SuperQ-トヨパール650M」（商品名、イオン交換クロ
マトグラフィー担体、東ソー（株）製）カラムに通し、
目的とする酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩
衝液で洗浄した後、段階的にリン酸緩衝液中のＮａＣｌ
濃度を変化させて目的酵素を溶出し、総活性０．５１ユ
ニット、比活性０．０７８ユニット／mg-proteinを有す
る酵素標品を得た。
【００３９】試験例１ 実施例１に示された「Butyl Sepharose 4FF」カラムを
通して得られた比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inの酵素（キチナーゼ）画分を用いて、活性に対するｐ
Ｈの影響を調べた。
通して得られた比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inの酵素（キチナーゼ）画分を用いて、活性に対するｐ
Ｈの影響を調べた。
【００４０】サンプル管に、基質コロイダルキチン２０
mg、酵素溶液１ml（０．００１４ユニット）を入れた
後、０．２mlの０．４Ｍリン酸緩衝液を用いて各ｐＨに
調整し、３０℃で２時間反応した後、遠心分離によって
生成したＮ−アセチルグルコサミンのオリゴマーを含む
上清を得た。該上清０．４mlを試験管に移し、１％の
「セルロシンＡＰ」（商品名、上田化学（株）製）０．
１mlを加えて３７℃で３０分振とうし、生成したＮ−ア
セチルグルコサミンをモルガン−エルソン法により比色
定量した。
mg、酵素溶液１ml（０．００１４ユニット）を入れた
後、０．２mlの０．４Ｍリン酸緩衝液を用いて各ｐＨに
調整し、３０℃で２時間反応した後、遠心分離によって
生成したＮ−アセチルグルコサミンのオリゴマーを含む
上清を得た。該上清０．４mlを試験管に移し、１％の
「セルロシンＡＰ」（商品名、上田化学（株）製）０．
１mlを加えて３７℃で３０分振とうし、生成したＮ−ア
セチルグルコサミンをモルガン−エルソン法により比色
定量した。
【００４１】上記で得られたキチナーゼの相対活性とｐ
Ｈとの関係を、図１に示す。
Ｈとの関係を、図１に示す。
【００４２】試験例２ 実施例１に示された「Butyl Sepharose 4FF」カラムを
通して得られた比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inの酵素（キチナーゼ）画分を用いて、キチナーゼ活性
と反応温度の関係を以下のようにして調べた。
通して得られた比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inの酵素（キチナーゼ）画分を用いて、キチナーゼ活性
と反応温度の関係を以下のようにして調べた。
【００４３】サンプル管に、基質コロイダルキチン２０
mg、酵素溶液１ml（比活性０．００１４ユニット）を入
れ、０．２mlの０．４Ｍリン酸緩衝液を用いてｐＨ７．
８に調整し、各温度で２時間反応した後、遠心分離によ
って生成したＮ−アセチルグルコサミンのオリゴマーを
含む上清を得た。該上清０．４mlを試験管に移し、１％
の「セルロシンＡＰ」（商品名、上田化学（株）製）
０．１mlを加えて３７℃で３０分振とうし、生成したＮ
−アセチルグルコサミンをモルガン−エルソン法により
比色定量した。
mg、酵素溶液１ml（比活性０．００１４ユニット）を入
れ、０．２mlの０．４Ｍリン酸緩衝液を用いてｐＨ７．
８に調整し、各温度で２時間反応した後、遠心分離によ
って生成したＮ−アセチルグルコサミンのオリゴマーを
含む上清を得た。該上清０．４mlを試験管に移し、１％
の「セルロシンＡＰ」（商品名、上田化学（株）製）
０．１mlを加えて３７℃で３０分振とうし、生成したＮ
−アセチルグルコサミンをモルガン−エルソン法により
比色定量した。
【００４４】上記で得られたキチナーゼの相対活性と反
応温度との関係を、図２に示す。
応温度との関係を、図２に示す。
【００４５】試験例３ 実施例１に示された「Butyl Sepharose 4FF」カラムを
通して得られた比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inの酵素（キチナーゼ）画分を用いて、キチナーゼの熱
安定性を以下の方法で調べた。
通して得られた比活性０．００７７ユニット／mg-prote
inの酵素（キチナーゼ）画分を用いて、キチナーゼの熱
安定性を以下の方法で調べた。
【００４６】サンプル管に酵素溶液1 ml（０．００１４
ユニット）を入れ、０．２mlの０．４Ｍリン酸緩衝液を
用いてｐＨ８．０に調整し、３０分間各温度に保った
後、基質のコロイダルキチン２０mgを加えて３０℃で２
時間振とうした。その後、遠心分離によって生成したＮ
−アセチルグルコサミンのオリゴマーを含む上清を得
た。該上清０．４mlを試験管に移し、１％の「セルロシ
ンＡＰ」（商品名、上田化学（株）製）０．１mlを加え
て３７℃で３０分振とうし、生成したＮ−アセチルグル
コサミンをモルガン−エルソン法により比色定量した。
ユニット）を入れ、０．２mlの０．４Ｍリン酸緩衝液を
用いてｐＨ８．０に調整し、３０分間各温度に保った
後、基質のコロイダルキチン２０mgを加えて３０℃で２
時間振とうした。その後、遠心分離によって生成したＮ
−アセチルグルコサミンのオリゴマーを含む上清を得
た。該上清０．４mlを試験管に移し、１％の「セルロシ
ンＡＰ」（商品名、上田化学（株）製）０．１mlを加え
て３７℃で３０分振とうし、生成したＮ−アセチルグル
コサミンをモルガン−エルソン法により比色定量した。
【００４７】サンプル管に、当初より酵素溶液と共にコ
ロイダルキチンを入れ、３０℃、２時間反応させた場合
の酵素活性に対する、各温度での残存活性を図３に示
す。
ロイダルキチンを入れ、３０℃、２時間反応させた場合
の酵素活性に対する、各温度での残存活性を図３に示
す。
【００４８】
【発明の効果】本発明によれば、キチンを分解してＮ−
アセチルグルコサミンの４量体、２量体を主成分とする
オリゴマーを生成できるという有用な機能を有し、しか
も低温でも高温でも高い活性を示し、即ち作用温度範囲
が広く、幅広い条件下で使用することができる新規なキ
チナーゼが提供されるという顕著な効果が得られる。ま
た、本発明によれば、工業的に効率よく利用できる該キ
チナーゼを生産できる製造法も提供されるという顕著な
効果が得られる。
アセチルグルコサミンの４量体、２量体を主成分とする
オリゴマーを生成できるという有用な機能を有し、しか
も低温でも高温でも高い活性を示し、即ち作用温度範囲
が広く、幅広い条件下で使用することができる新規なキ
チナーゼが提供されるという顕著な効果が得られる。ま
た、本発明によれば、工業的に効率よく利用できる該キ
チナーゼを生産できる製造法も提供されるという顕著な
効果が得られる。
【００４９】本発明のキチナーゼを使用することによ
り、抗菌性、抗ウィルス性、抗腫瘍性、免疫機能亢進等
の有用な生理活性を有する上記オリゴマーを、処理に多
大な費用や労力を要するアルカリ、酸等の化学製品を使
用することなく、かつ純粋、簡便に製造する技術をも提
供される。
り、抗菌性、抗ウィルス性、抗腫瘍性、免疫機能亢進等
の有用な生理活性を有する上記オリゴマーを、処理に多
大な費用や労力を要するアルカリ、酸等の化学製品を使
用することなく、かつ純粋、簡便に製造する技術をも提
供される。
【図１】図１は、海洋低温細菌ビブリオ（Vibrio）属Ｐ
２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６９）由来のキチ
ナーゼのコロイダルキチンに対する相対活性とｐＨとの
関係を示すグラフである。
２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６９）由来のキチ
ナーゼのコロイダルキチンに対する相対活性とｐＨとの
関係を示すグラフである。
【図２】図２は、当該キチナーゼの相対活性と反応温度
との関係を示すグラフである。
との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、当該キチナーゼの残存活性と温度との
関係を示すグラフである。
関係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:63） (72)発明者 東原 孝規 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (56)参考文献 特開 平６−113846（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有することを特徴と
するキチナーゼ。 （１）作用：キチンのβ−１，４結合をランダムに切断
して、Ｎ−アセチルグルコサミンの４量体、２量体を生
成する。Ｎ−アセチルグルコサミンの単量体は生成しな
い。 （２）至適ｐＨ：６．５〜１０．４。 （３）安定ｐＨ：７．０〜９．０。 （４）至適温度：３７℃。 （５）作用温度範囲：４〜６０℃。 （６）熱安定性：４０℃、ｐＨ８．０で、３０分間加温
後、６０％以上の活性が保持される。 - 【請求項２】海洋低温細菌ビブリオ（Vibrio）属に属す
る、キチンに作用してＮ−アセチルグルコサミンオリゴ
マーを生成するキチナーゼ生産菌を培養し、その培養物
からキチナーゼを採取することを特徴とするキチナーゼ
の製造法。 - 【請求項３】キチナーゼ生産菌が、海洋低温細菌ビブリ
オ属Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６９）であ
る請求項２に記載のキチナーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11304814A JP3118573B1 (ja) | 1999-10-27 | 1999-10-27 | キチナーゼ及びその製造法 |
| EP00307917A EP1096007A1 (en) | 1999-10-27 | 2000-09-13 | Chitinase and method for preparing the same |
| US09/661,808 US6352850B1 (en) | 1999-10-27 | 2000-09-14 | Chitinase and method for preparing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11304814A JP3118573B1 (ja) | 1999-10-27 | 1999-10-27 | キチナーゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3118573B1 true JP3118573B1 (ja) | 2000-12-18 |
| JP2001120266A JP2001120266A (ja) | 2001-05-08 |
Family
ID=17937582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11304814A Expired - Lifetime JP3118573B1 (ja) | 1999-10-27 | 1999-10-27 | キチナーゼ及びその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6352850B1 (ja) |
| EP (1) | EP1096007A1 (ja) |
| JP (1) | JP3118573B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2008079501A (ja) * | 2005-03-14 | 2008-04-10 | Yamaguchi Univ | カイコキチナーゼおよびそれを含有してなる昆虫防除剤。 |
| PL235436B1 (pl) | 2014-11-28 | 2020-08-10 | Univ Jagielloński | Kompleks białkowy zawierający białko G i chitynazę A, sposób wyodrębniania z roztworu wodnego chitynazy A oraz jego zastosowania |
| KR102027295B1 (ko) * | 2017-08-08 | 2019-11-04 | 전남대학교산학협력단 | 키티나아제를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주 및 이의 용도 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6054681A (ja) * | 1983-09-05 | 1985-03-29 | Minoru Yabuki | キチナ−ゼ及びその製造法 |
| US4686185A (en) * | 1984-08-02 | 1987-08-11 | Wakunaga Kono Kabushiki Kaisha | Microorganism of new species of genus Streptomyces and use thereof for production of chitinase |
| US5587292A (en) * | 1987-05-22 | 1996-12-24 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Diagnosis of fungal infections with a chitinase |
| JPH0667317B2 (ja) * | 1988-09-21 | 1994-08-31 | 財団法人野田産業科学研究所 | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット |
| JPH06113846A (ja) * | 1991-03-20 | 1994-04-26 | Mercian Corp | キチナーゼ |
| US5914239A (en) * | 1995-11-15 | 1999-06-22 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Diagnosis of fungal infections, and a chitin-binding lectin useful in such diagnoses |
| JP2824508B2 (ja) * | 1996-03-04 | 1998-11-11 | 工業技術院長 | Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸デアセチラーゼ |
-
1999
- 1999-10-27 JP JP11304814A patent/JP3118573B1/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-09-13 EP EP00307917A patent/EP1096007A1/en not_active Withdrawn
- 2000-09-14 US US09/661,808 patent/US6352850B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001120266A (ja) | 2001-05-08 |
| US6352850B1 (en) | 2002-03-05 |
| EP1096007A1 (en) | 2001-05-02 |
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