JP3002140B2 - 新規なキチナーゼとその製造法 - Google Patents
新規なキチナーゼとその製造法Info
- Publication number
- JP3002140B2 JP3002140B2 JP8237103A JP23710396A JP3002140B2 JP 3002140 B2 JP3002140 B2 JP 3002140B2 JP 8237103 A JP8237103 A JP 8237103A JP 23710396 A JP23710396 A JP 23710396A JP 3002140 B2 JP3002140 B2 JP 3002140B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- positive
- chitinase
- chitin
- strain
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なキチナーゼ
とその製造法に関するものである。
とその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】キチンは、セルロースに次いで豊富なバ
イオマス資源であり、その有効利用は以前から強く求め
られている。また、キチンの部分分解物であるキトオリ
ゴ糖は、食品分野では低う触性、非消化性甘味料とし
て、或いはテクスチャー改良剤としての利用が計られて
おり、医療品分野においては、細胞免疫強化作用やビフ
ィダス因子としての利用に期待が集まっている。キトオ
リゴ糖は、通常キチンを濃塩酸を使用して、長期間処理
することにより製造されているが、分解産物の中和や、
それに続く脱塩操作等、煩瑣な工程を必要とする。この
ため、温和でかつ簡単な作業で分解物の得られる、キチ
ナーゼの利用が望まれている。キチナーゼは、カビ、放
線菌、動植物体によっても生産されるが、細菌による製
造法としては、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属
細菌を用いる方法（Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３２，Ｐ．２５（１９８６））、
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌を利用する方法
（特開平４−２３７４９１、特開平１−２４７０８１、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏ
ｌ．１６，ｐ．３９（１９７０）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５３，ｐ．１５３７（１９８
９））等が知られている。
イオマス資源であり、その有効利用は以前から強く求め
られている。また、キチンの部分分解物であるキトオリ
ゴ糖は、食品分野では低う触性、非消化性甘味料とし
て、或いはテクスチャー改良剤としての利用が計られて
おり、医療品分野においては、細胞免疫強化作用やビフ
ィダス因子としての利用に期待が集まっている。キトオ
リゴ糖は、通常キチンを濃塩酸を使用して、長期間処理
することにより製造されているが、分解産物の中和や、
それに続く脱塩操作等、煩瑣な工程を必要とする。この
ため、温和でかつ簡単な作業で分解物の得られる、キチ
ナーゼの利用が望まれている。キチナーゼは、カビ、放
線菌、動植物体によっても生産されるが、細菌による製
造法としては、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属
細菌を用いる方法（Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３２，Ｐ．２５（１９８６））、
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌を利用する方法
（特開平４−２３７４９１、特開平１−２４７０８１、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏ
ｌ．１６，ｐ．３９（１９７０）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５３，ｐ．１５３７（１９８
９））等が知られている。
【０００３】これらの細菌を用いるキチナーゼ生産法に
おいては、一般に誘導基質として、脱灰キチンをコロイ
ダル化或いは微粉末化して、培地に添加する必要があ
る。このコロイダル化は、脱灰キチンを濃鉱酸に浸漬し
て磨砕した後、残存する酸を除去するため、キチンを大
量の水で、十分に洗浄しなければならない。また微粉末
化は、バールミル等により行われるが、処理量に制限が
あり、かつ長時間を要するため、蟹海老殻そのまま誘導
基質に使用できる、キチナーゼの製造法の出現が強く望
まれていた。
おいては、一般に誘導基質として、脱灰キチンをコロイ
ダル化或いは微粉末化して、培地に添加する必要があ
る。このコロイダル化は、脱灰キチンを濃鉱酸に浸漬し
て磨砕した後、残存する酸を除去するため、キチンを大
量の水で、十分に洗浄しなければならない。また微粉末
化は、バールミル等により行われるが、処理量に制限が
あり、かつ長時間を要するため、蟹海老殻そのまま誘導
基質に使用できる、キチナーゼの製造法の出現が強く望
まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】蟹海老殻にはキチン、
蛋白質、炭酸カルシウム等の物質が含まれており、微細
化、除蛋白質及び脱塩等の操作によって、生物転換及び
その他の用途に適用するキチンが得られる。キチン及び
その関連物質が多種生理活性及び農化用途を持つため、
最近特に注目を浴びている。キチナーゼはキトオリゴ糖
の生産に適用し、特に微生物起源のは主である。微生物
によりキチナーゼを生産する際、主に、キチン、コロイ
ダルキチン或いはその他キチン関連物質が誘導基質とし
て用いられる。蟹海老殻そのままを誘導基質として、し
かも耐アルカリ性キチナーゼ生産菌であるの報告につい
ては、今までまだ報告されていない。蟹海老殻の様な水
産廃棄物をキチナーゼ生産菌の誘導基質に利用する利点
は、酵素の生産費を低くすることができることである。
また、耐アルカリ性キチナーゼ生産菌の利点は、アルカ
リに浸した蟹海老殻（蟹海老殻が加工過程に臭くなるこ
とを防ぐため）をもそのまま誘導基質として利用するこ
とができることである。そうすると、酵素生産に必要な
費用を節約することができるだけでなく、これら水産加
工廃棄物の処理についての問題も解決することができ
る。本発明者は自然中に存在するキチナーゼ生産菌をス
クリーニングした結果、台湾土壌からＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓに属するキチナーゼ生産菌を分離した。この菌株
によってキチナーゼを生産する際には、誘導基質とし
て、コロイダルキチンやキチンだけでなく、蟹海老殻そ
のままが利用できる。しかも、後者の誘導効果は前者の
ものより良いという結果が得られる。一方、酸或いは／
及びアルカリ処理した蟹海老殻或いは廃酸及びアルカリ
液をも誘導基質に適用する。得られた培養液は細菌及び
植物病原菌（カビ）に対して、強い抗菌効果が認められ
た。また、今まで方向された微生物起源キチナーゼはリ
ゾチーム活性を持たないものがほとんどであり、しか
し、本株菌で生産するキチナーゼは両酵素活性を持ち、
即ち、所謂双機能キチナーゼ／リゾチーム（Ｂｉｆｕｎ
ｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ／ｌｙｓｏｚｙｍ
ｅ）である。以上説明したように、本発明は、特別な処
理を施した誘導基質を必要とせず、蟹海老殻または酸／
アルカリ処理した残さ及び廃液を含む酵素生産培地か
ら、効率よくキチナーゼを生産する能力を有する菌株
と、その菌株の生産する新規なキチナーゼ、並びに該菌
株を使用する、キチナーゼの製造方法を、提供するもの
であって、これによって、工業規模におけるキチナーゼ
の生産は、格段の改善が可能となったのである。
蛋白質、炭酸カルシウム等の物質が含まれており、微細
化、除蛋白質及び脱塩等の操作によって、生物転換及び
その他の用途に適用するキチンが得られる。キチン及び
その関連物質が多種生理活性及び農化用途を持つため、
最近特に注目を浴びている。キチナーゼはキトオリゴ糖
の生産に適用し、特に微生物起源のは主である。微生物
によりキチナーゼを生産する際、主に、キチン、コロイ
ダルキチン或いはその他キチン関連物質が誘導基質とし
て用いられる。蟹海老殻そのままを誘導基質として、し
かも耐アルカリ性キチナーゼ生産菌であるの報告につい
ては、今までまだ報告されていない。蟹海老殻の様な水
産廃棄物をキチナーゼ生産菌の誘導基質に利用する利点
は、酵素の生産費を低くすることができることである。
また、耐アルカリ性キチナーゼ生産菌の利点は、アルカ
リに浸した蟹海老殻（蟹海老殻が加工過程に臭くなるこ
とを防ぐため）をもそのまま誘導基質として利用するこ
とができることである。そうすると、酵素生産に必要な
費用を節約することができるだけでなく、これら水産加
工廃棄物の処理についての問題も解決することができ
る。本発明者は自然中に存在するキチナーゼ生産菌をス
クリーニングした結果、台湾土壌からＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓに属するキチナーゼ生産菌を分離した。この菌株
によってキチナーゼを生産する際には、誘導基質とし
て、コロイダルキチンやキチンだけでなく、蟹海老殻そ
のままが利用できる。しかも、後者の誘導効果は前者の
ものより良いという結果が得られる。一方、酸或いは／
及びアルカリ処理した蟹海老殻或いは廃酸及びアルカリ
液をも誘導基質に適用する。得られた培養液は細菌及び
植物病原菌（カビ）に対して、強い抗菌効果が認められ
た。また、今まで方向された微生物起源キチナーゼはリ
ゾチーム活性を持たないものがほとんどであり、しか
し、本株菌で生産するキチナーゼは両酵素活性を持ち、
即ち、所謂双機能キチナーゼ／リゾチーム（Ｂｉｆｕｎ
ｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ／ｌｙｓｏｚｙｍ
ｅ）である。以上説明したように、本発明は、特別な処
理を施した誘導基質を必要とせず、蟹海老殻または酸／
アルカリ処理した残さ及び廃液を含む酵素生産培地か
ら、効率よくキチナーゼを生産する能力を有する菌株
と、その菌株の生産する新規なキチナーゼ、並びに該菌
株を使用する、キチナーゼの製造方法を、提供するもの
であって、これによって、工業規模におけるキチナーゼ
の生産は、格段の改善が可能となったのである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】請求項１の発明は、新菌
株 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ
−１８７ 株としている。
株 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ
−１８７ 株としている。
【０００６】請求項２の発明は、新菌株 Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ−１８７ 株の生
産する新規なキチナーゼとしている。
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ−１８７ 株の生
産する新規なキチナーゼとしている。
【０００７】請求項３の発明は、新菌株 Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ−１８７株 （生
工研菌寄ＦＥＲＭ Ｐ−１５６９８ ）またその変異株
を、ＳＣＳＰ またその廃酸／アルカリ処理液を含む培
地に培養し、培地中に請求項２の新規なキチナーゼを生
産する、キチナーゼの製造方法としている。
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ−１８７株 （生
工研菌寄ＦＥＲＭ Ｐ−１５６９８ ）またその変異株
を、ＳＣＳＰ またその廃酸／アルカリ処理液を含む培
地に培養し、培地中に請求項２の新規なキチナーゼを生
産する、キチナーゼの製造方法としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のキチナーゼ生産菌 Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ−１８７
株は、台湾新竹市の土壌より、新たに分離されたもので
あって、以下に示す菌学的特質を有する。
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ−１８７
株は、台湾新竹市の土壌より、新たに分離されたもので
あって、以下に示す菌学的特質を有する。
【０００９】Ａ．形態学的性質 グラム染色は陰性で、運動性を有し、単鞭毛の桿菌であ
る。
る。
【００１０】Ｂ．培養的性質 本菌株は、通常の細菌用培地に、２５〜４１℃、１〜３
日の培養で、よく増殖する。
日の培養で、よく増殖する。
【００１１】Ｃ．生理学的性質 １．インドールの生成： 陰性 ２．蛍光物質の生成： 陽性 ３．カゼインの加水分解： 陽性 ４．ゼラチンの加水分解： 陽性 ５．界面活性剤の加水分解： 陽性 ６．クエン酸の資化： 陽性 ７．メロン酸の資化： 陽性 ８．チロシンの資化： 陽性 ９．ウレアーゼ： 陽性 １０．カタラーゼ： 陽性 １１．アルギニン ジハイドロラーゼ 陽性 １２．レシチナーゼ： 陽性 １３．糖の利用性： 陽性： アラビノース、葡萄糖、キシロース 陰性： セロビオース、フラクトース、イノシトー、マ
ルトース
ルトース
【００１２】以上の性質から、本菌株はシュドモナス属
に属する細菌と判定し、シュドモナス アエルギノサ
Ｋ−１８７ と命名して、工業技術院生物工業技術研究
所に寄託し、その受託番号は生工研菌寄ＦＥＲＭ Ｐ−
１５６９８ である。本菌株は、他の一般の細菌に見ら
れるように、その性状は変化することがあり、例えば、
紫外線、Ｘ線の照射、化学薬品類による処理等の人工的
変異手段によって、変異株を生ずる。このような変異株
も、本菌と同様の性質を有する酵素を生産する限り、本
発明の目的に使用することができる。
に属する細菌と判定し、シュドモナス アエルギノサ
Ｋ−１８７ と命名して、工業技術院生物工業技術研究
所に寄託し、その受託番号は生工研菌寄ＦＥＲＭ Ｐ−
１５６９８ である。本菌株は、他の一般の細菌に見ら
れるように、その性状は変化することがあり、例えば、
紫外線、Ｘ線の照射、化学薬品類による処理等の人工的
変異手段によって、変異株を生ずる。このような変異株
も、本菌と同様の性質を有する酵素を生産する限り、本
発明の目的に使用することができる。
【００１３】本菌株の分離は以下のようにして行った。
即ち、土壌試料を、３％蟹海老殻と、０．１％Ｋ２ＨＰ
Ｏ４と、０．０５％ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ とを含む
液体培地に添加し、３０℃で、７日間振盪培養した後、
菌が生育したものについて、上記と同様の培地に再び振
盪培養して、生育した菌を、３％粉末キチン、０．１％
Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％ＭｇＳＯ４、０．１％ＮａＮＯ
３を含む培地に寒天を２％ 添加した平板培地に塗布
し、３７℃で４８時間培養し、生育したコロニーを採集
した。
即ち、土壌試料を、３％蟹海老殻と、０．１％Ｋ２ＨＰ
Ｏ４と、０．０５％ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ とを含む
液体培地に添加し、３０℃で、７日間振盪培養した後、
菌が生育したものについて、上記と同様の培地に再び振
盪培養して、生育した菌を、３％粉末キチン、０．１％
Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％ＭｇＳＯ４、０．１％ＮａＮＯ
３を含む培地に寒天を２％ 添加した平板培地に塗布
し、３７℃で４８時間培養し、生育したコロニーを採集
した。
【００１４】本発明で用いる微生物は、上記方法により
分離されたものに限らず、シュドモナス アエルギノサ
に属し、キチン分解能を有するものであれば、自然界か
ら分離した菌、寄託機関の保存菌株、あるいはキチン分
解能を高めるために変異させた菌株等、いずれの菌株で
あってもよい。
分離されたものに限らず、シュドモナス アエルギノサ
に属し、キチン分解能を有するものであれば、自然界か
ら分離した菌、寄託機関の保存菌株、あるいはキチン分
解能を高めるために変異させた菌株等、いずれの菌株で
あってもよい。
【００１５】Ｄ．微生物の培養 本菌株の培養には、通常の細菌の培養方法が利用可能で
あるが、培地としては、キチンと、その他の栄養源とを
含む液体培地が好ましく採用される。キチンとしては、
蟹海老殻が好ましく用いられる。その他の栄養源として
は、例えば窒素源、無機塩等が用いられる。窒素源とし
ては、硫安を ０．０１〜０．０５％添加することが好
ましく、無機塩としては、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４
７Ｈ２Ｏを添加するのが好ましい。培地のｐＨは、７〜
９ に調整することが好ましい。培養温度は、通常２５
〜４５℃が適当である。培養時間は通常１〜３日間であ
るが、好ましくは、１〜２日間が適当である。通気振盪
培養等の方法で培養すると、培養物中に、キチナーゼが
生成蓄積する。キチナーゼを培養物中より分離精製する
には、通常の酵素精製に用いられる手段が利用可能であ
る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過法等の各種クロマトグラフィ
ー、硫安等の無機塩或いは有機溶媒等による、分画沈殿
等が上げられる。これらの操作によって精製されたキチ
ナーゼは、次項以下に述べる理化学的性質を有してい
る。
あるが、培地としては、キチンと、その他の栄養源とを
含む液体培地が好ましく採用される。キチンとしては、
蟹海老殻が好ましく用いられる。その他の栄養源として
は、例えば窒素源、無機塩等が用いられる。窒素源とし
ては、硫安を ０．０１〜０．０５％添加することが好
ましく、無機塩としては、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４
７Ｈ２Ｏを添加するのが好ましい。培地のｐＨは、７〜
９ に調整することが好ましい。培養温度は、通常２５
〜４５℃が適当である。培養時間は通常１〜３日間であ
るが、好ましくは、１〜２日間が適当である。通気振盪
培養等の方法で培養すると、培養物中に、キチナーゼが
生成蓄積する。キチナーゼを培養物中より分離精製する
には、通常の酵素精製に用いられる手段が利用可能であ
る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過法等の各種クロマトグラフィ
ー、硫安等の無機塩或いは有機溶媒等による、分画沈殿
等が上げられる。これらの操作によって精製されたキチ
ナーゼは、次項以下に述べる理化学的性質を有してい
る。
【００１６】Ｅ．酵素活性の測定法 １．キチナーゼ活性の測定法： 粉末キチン（和光純薬
工業製）を、濃塩酸に溶解させる。これを大量の水に注
いで再び沈殿させ、次いでミキサで均一に分散させて、
コロイダルキチンを調整する。０．２％−コロイダルキ
チンを含む５０ｍＭ−燐酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌ
に、酵素液０．５ｍｌを加えて、３７℃で１０分間反応
させる。次いで、反応液に、シャール試薬（Λｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３５，ｐ．１１５
４（１９７１））２ｍｌを添加し、沸騰湯浴中で、１５
分間過熱する。冷却後、遠心分離して不純物を除却
し、４２０ｎｍ の吸光度を測定する。この吸光度か
ら、生成した還元糖量を、Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グル
コサミンを用いた標準曲線より求める。１ 分間に１ｕ
ｍｏｌのＮ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコサミンを生成す
る酵素量を、酵素活性１単位（Ｕ）とする。
工業製）を、濃塩酸に溶解させる。これを大量の水に注
いで再び沈殿させ、次いでミキサで均一に分散させて、
コロイダルキチンを調整する。０．２％−コロイダルキ
チンを含む５０ｍＭ−燐酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌ
に、酵素液０．５ｍｌを加えて、３７℃で１０分間反応
させる。次いで、反応液に、シャール試薬（Λｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３５，ｐ．１１５
４（１９７１））２ｍｌを添加し、沸騰湯浴中で、１５
分間過熱する。冷却後、遠心分離して不純物を除却
し、４２０ｎｍ の吸光度を測定する。この吸光度か
ら、生成した還元糖量を、Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グル
コサミンを用いた標準曲線より求める。１ 分間に１ｕ
ｍｏｌのＮ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコサミンを生成す
る酵素量を、酵素活性１単位（Ｕ）とする。
【００１７】Ｆ．酵素の性質 １．作用： キチン、コロイダルキチン、エチレングリ
コールキチン、細菌細胞（例えばＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）等に作用し、Ｂ−グ
リコシド結合を加水分解する。即ち、精製して得られた
キチナーゼ ＦＩ及びＦＩＩは、キチナーゼ及びリゾチ
ーム両活性を持ち双機能キチナーゼ／リゾチーム（ｂｉ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ／ｌｙｓｏ
ｚｙｍｅ）である。澱粉、キシラン、カゼイン等には作
用しない。 ２．至適 ｐＨ 及び安定 ｐＨ 範囲： コロイダル
キチンを基質として、３７℃で反応を行った場合、ＦＩ
及びＦＩＩの至適 ｐＨ はそれぞれ８ 及び７ 付近
であった。３７℃で、３０分間の処理に対して、ＦＩ及
びＦＩＩはそれぞれが ｐＨ６ 〜９及び５〜１０の範
囲では９０％以上の残存活性を示した。ｐＨ と酵素活
性の関係を図１（ＦＩ）及び図２（ＦＩＩ）に、ｐＨ
安定性を図３（ＦＩ）及び図４（ＦＩＩ）に示した。 ３．至適温度及び熱安定性： コロイダルキチンを基質
とした場合、ｐＨ７でＦＩ及びＦＩＩの至適温度はそれ
ぞれが５０℃ 及び４０℃付近であった。また、ｐＨ
７、３０分間の処理に対して、ＦＩ及びＦＩＩはそれぞ
れが、５０℃及び６０℃以下安定であった。温度と酵素
の関係を図５（ＦＩ）及び図６（ＦＩＩ）に、熱安定性
を図７（ＦＩ）及び図８（ＦＩＩ）に示した。 ４．抗菌作用： 精製したキチナーゼＦＩ及びＦＩＩ
は、大腸菌を始め、多種類の細菌に対して、抗菌作用を
認めた。 ５．分子量： ＦＩ及びＦＩＩの分子量を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ 法によって測定した結果、それぞれが３０，０
００及び３２，０００、ＨＰＬＣ を用いたゲル濾過法
によって測定した結果、それぞれが６０，０００及び３
０，０００であった。
コールキチン、細菌細胞（例えばＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）等に作用し、Ｂ−グ
リコシド結合を加水分解する。即ち、精製して得られた
キチナーゼ ＦＩ及びＦＩＩは、キチナーゼ及びリゾチ
ーム両活性を持ち双機能キチナーゼ／リゾチーム（ｂｉ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ／ｌｙｓｏ
ｚｙｍｅ）である。澱粉、キシラン、カゼイン等には作
用しない。 ２．至適 ｐＨ 及び安定 ｐＨ 範囲： コロイダル
キチンを基質として、３７℃で反応を行った場合、ＦＩ
及びＦＩＩの至適 ｐＨ はそれぞれ８ 及び７ 付近
であった。３７℃で、３０分間の処理に対して、ＦＩ及
びＦＩＩはそれぞれが ｐＨ６ 〜９及び５〜１０の範
囲では９０％以上の残存活性を示した。ｐＨ と酵素活
性の関係を図１（ＦＩ）及び図２（ＦＩＩ）に、ｐＨ
安定性を図３（ＦＩ）及び図４（ＦＩＩ）に示した。 ３．至適温度及び熱安定性： コロイダルキチンを基質
とした場合、ｐＨ７でＦＩ及びＦＩＩの至適温度はそれ
ぞれが５０℃ 及び４０℃付近であった。また、ｐＨ
７、３０分間の処理に対して、ＦＩ及びＦＩＩはそれぞ
れが、５０℃及び６０℃以下安定であった。温度と酵素
の関係を図５（ＦＩ）及び図６（ＦＩＩ）に、熱安定性
を図７（ＦＩ）及び図８（ＦＩＩ）に示した。 ４．抗菌作用： 精製したキチナーゼＦＩ及びＦＩＩ
は、大腸菌を始め、多種類の細菌に対して、抗菌作用を
認めた。 ５．分子量： ＦＩ及びＦＩＩの分子量を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ 法によって測定した結果、それぞれが３０，０
００及び３２，０００、ＨＰＬＣ を用いたゲル濾過法
によって測定した結果、それぞれが６０，０００及び３
０，０００であった。
【００１８】以上の化学的諸性質は、既に報告されたキ
チナーゼ、例えばセラチア属、ストレプトマイセス属、
或いはバチルス属等の種のものと対比して、粉末ないし
コロイダルキチン、エチレンクリコルキチン、及び菌細
胞に対する分解性、ｐＨ安定性や作用範囲、及び抗菌作
用の点などで異なっており、特に、本菌株の生産するこ
のキチナーゼＦＩ及びＦＩＩは、今まで最初に報告され
た微生物の生産するリゾチーム活性を持つ、所謂双機能
キチナーゼ／リゾチームであり、本発明のキチナーゼ
は、新規な酵素である。
チナーゼ、例えばセラチア属、ストレプトマイセス属、
或いはバチルス属等の種のものと対比して、粉末ないし
コロイダルキチン、エチレンクリコルキチン、及び菌細
胞に対する分解性、ｐＨ安定性や作用範囲、及び抗菌作
用の点などで異なっており、特に、本菌株の生産するこ
のキチナーゼＦＩ及びＦＩＩは、今まで最初に報告され
た微生物の生産するリゾチーム活性を持つ、所謂双機能
キチナーゼ／リゾチームであり、本発明のキチナーゼ
は、新規な酵素である。
【００１９】
実施例１ 蟹海老殻（澱粉：台湾蘇澳圓丁会社製）３
％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ
０．０５％、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ）、硫安０．１％、ＺｎＳＯ４０．１％ を含む液体
培地１７５ｍｌ（ｐＨ９）を、２５０ｍｌ 容三角フラ
スコに入れ、常法により滅菌し、シュドモナスアエルギ
ノサＫ−１８７（生工研菌寄ＦＥＲＭＰ−１５６９８
、以下Ｋ１８７株と略称）を接種した。４５℃にて２
１日間振盪培養した後、培養液を遠心分離して除菌し、
キチナーゼ含有上澄液１５０ｍｌが得られた。上澄液の
キチナーゼ活性は、０．７単位／ｍｌであった（図
９）。
％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ
０．０５％、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ）、硫安０．１％、ＺｎＳＯ４０．１％ を含む液体
培地１７５ｍｌ（ｐＨ９）を、２５０ｍｌ 容三角フラ
スコに入れ、常法により滅菌し、シュドモナスアエルギ
ノサＫ−１８７（生工研菌寄ＦＥＲＭＰ−１５６９８
、以下Ｋ１８７株と略称）を接種した。４５℃にて２
１日間振盪培養した後、培養液を遠心分離して除菌し、
キチナーゼ含有上澄液１５０ｍｌが得られた。上澄液の
キチナーゼ活性は、０．７単位／ｍｌであった（図
９）。
【００２０】実施例２ 粉末キチン０．４％、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．０５％、
グリセロール、魚エキス（魚精：台湾蘇澳圓丁会社製）
０．１％を含む液体培地１７５ｍｌ（ｐＨ９）を、２５
０ ｍｌ容三角フラスコに入れ、常法により滅菌し、Ｋ
−１８７株を接種した。４５℃にて２日間振盪培養した
後、培養液を遠心分離して除菌し、キチナーゼ含有上澄
液１５０ｍｌが得られた。上澄液のキチナーゼ活性は、
０．３単位／ｍｌであった。
Ｏ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．０５％、
グリセロール、魚エキス（魚精：台湾蘇澳圓丁会社製）
０．１％を含む液体培地１７５ｍｌ（ｐＨ９）を、２５
０ ｍｌ容三角フラスコに入れ、常法により滅菌し、Ｋ
−１８７株を接種した。４５℃にて２日間振盪培養した
後、培養液を遠心分離して除菌し、キチナーゼ含有上澄
液１５０ｍｌが得られた。上澄液のキチナーゼ活性は、
０．３単位／ｍｌであった。
【００２１】実施例３ 蟹海老殻を２Ｎ ＨＣＩ（固液
体比率は１対８，ｗ／ｖ）に、室温で２日間浸した後、
濾過法によって固液体を分離し、固形物（酸処理蟹海老
殻）の重量回収率は約８０％であった。 蟹海老殻３
％、またはそれを酸処理して得られた固形物ないし酸処
理廃棄液を主要炭素源として、それぞれをＫ２ＨＰＯ４
０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＣＭＣ
０．１％、硫安０．１％、ＺｎＳＯ４０．１％を含む
液体培地１７５ｍｌ（ｐＨ７）を、２５０ ｍｌ容三角
フラスコに入れ、常法により滅菌し、Ｋ−１８７株を接
種した。３７℃にて１〜６日間振盪培養した後、培養液
を遠心分離して除菌し、キチナーゼ含有上澄液１５０ｍ
ｌが得られた。上澄液のキチナーゼ活性は、表１に示す
ように、酸処理蟹海老殻を主要炭素源とした場合に、比
較的高いキチナーゼ活性が得られた。
体比率は１対８，ｗ／ｖ）に、室温で２日間浸した後、
濾過法によって固液体を分離し、固形物（酸処理蟹海老
殻）の重量回収率は約８０％であった。 蟹海老殻３
％、またはそれを酸処理して得られた固形物ないし酸処
理廃棄液を主要炭素源として、それぞれをＫ２ＨＰＯ４
０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＣＭＣ
０．１％、硫安０．１％、ＺｎＳＯ４０．１％を含む
液体培地１７５ｍｌ（ｐＨ７）を、２５０ ｍｌ容三角
フラスコに入れ、常法により滅菌し、Ｋ−１８７株を接
種した。３７℃にて１〜６日間振盪培養した後、培養液
を遠心分離して除菌し、キチナーゼ含有上澄液１５０ｍ
ｌが得られた。上澄液のキチナーゼ活性は、表１に示す
ように、酸処理蟹海老殻を主要炭素源とした場合に、比
較的高いキチナーゼ活性が得られた。
【表１】
【００２２】実施例４ 蟹海老殻を２Ｎ ＮａＯＨ（固
液体比率は３対４０，ｗ／ｖ）に、１００℃で３０分間
浸した後、濾過法によって固液体を分離し、固形物（ア
ルカリ処理蟹海老殻）の重量回収率は約８５％であっ
た。 蟹海老殻４％、またはそれをアルカリ処理して得
られた固形物を主要炭素源として、それぞれをＫ２ＨＰ
Ｏ４０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０．０５％、ＣＭ
Ｃ０．１％、硫安０．１％、ＺｎＳＯ４ ０．１％を含
む液体培地１７５ｍｌ（ｐＨ７）を、２５０ ｍｌ容三
角フラスコに入れ、常法により滅菌し、Ｋ−１８７株を
接種した。３７℃にて３日間振盪培養した後、培養液を
遠心分離して除菌し、キチナーゼ含有上澄液１５０ｍｌ
が得られた。蟹海老殻を主要炭素源とした時のキチナー
ゼ活性は、０．５単位／ｍｌで、アルカリ処理蟹海老殻
を主要炭素源とした場合のキチナーゼ活性は、１．４単
位／ｍｌであった。
液体比率は３対４０，ｗ／ｖ）に、１００℃で３０分間
浸した後、濾過法によって固液体を分離し、固形物（ア
ルカリ処理蟹海老殻）の重量回収率は約８５％であっ
た。 蟹海老殻４％、またはそれをアルカリ処理して得
られた固形物を主要炭素源として、それぞれをＫ２ＨＰ
Ｏ４０．１％、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ０．０５％、ＣＭ
Ｃ０．１％、硫安０．１％、ＺｎＳＯ４ ０．１％を含
む液体培地１７５ｍｌ（ｐＨ７）を、２５０ ｍｌ容三
角フラスコに入れ、常法により滅菌し、Ｋ−１８７株を
接種した。３７℃にて３日間振盪培養した後、培養液を
遠心分離して除菌し、キチナーゼ含有上澄液１５０ｍｌ
が得られた。蟹海老殻を主要炭素源とした時のキチナー
ゼ活性は、０．５単位／ｍｌで、アルカリ処理蟹海老殻
を主要炭素源とした場合のキチナーゼ活性は、１．４単
位／ｍｌであった。
【００２３】実施例５ 実施例１により得られた上澄液
に、８０％飽和の硫安を添加して、塩析を行った。沈殿
画分を１０，０００Ｘｇ，２０分間 の遠心分離によっ
て回収し、５０ｍＭ燐酸緩衝液（０．２Ｍ 食塩を含
む、ｐＨ６）に溶解して透析した。透析内液を同じ緩衝
液で平衡したＤＥＡＥ セファロースカラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉｃ，ＵＳＡ）に通液し、吸着画分を０．２〜１
Ｍ 食塩を含む同じ緩衝液で溶出させ、この画分を食塩
を含まない同じ緩衝液に透析して、エコノーパクＱカラ
ム（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）に通液し、非吸着活性画分
をキチナーゼＦＩとし、食塩を含む同じ緩衝液で溶出し
た活性画分をキチナーゼＦＩＩとした。両酵素の回収率
を表２に示す。
に、８０％飽和の硫安を添加して、塩析を行った。沈殿
画分を１０，０００Ｘｇ，２０分間 の遠心分離によっ
て回収し、５０ｍＭ燐酸緩衝液（０．２Ｍ 食塩を含
む、ｐＨ６）に溶解して透析した。透析内液を同じ緩衝
液で平衡したＤＥＡＥ セファロースカラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉｃ，ＵＳＡ）に通液し、吸着画分を０．２〜１
Ｍ 食塩を含む同じ緩衝液で溶出させ、この画分を食塩
を含まない同じ緩衝液に透析して、エコノーパクＱカラ
ム（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）に通液し、非吸着活性画分
をキチナーゼＦＩとし、食塩を含む同じ緩衝液で溶出し
た活性画分をキチナーゼＦＩＩとした。両酵素の回収率
を表２に示す。
【表２】
【００２４】実施例６ 枯草菌、大腸菌等の試験菌をＮ
Ａ（ニユトリアント ブロス）に１６時間振盪培養した
後、１００ｕｌの菌液をＮＡ（ニユトリアント アガ
ー）の平板培地に均一塗布し、その上に、キチナーゼＦ
ＩまたＦＩＩを含んだ濾紙デスクを置き、３７℃で１〜
２日間培養してから、その抑制ゾンを観察した。キチナ
ーゼＦＩ及びＦＩＩには、枯草菌、大腸菌に対して、抗
菌活性が認められた。
Ａ（ニユトリアント ブロス）に１６時間振盪培養した
後、１００ｕｌの菌液をＮＡ（ニユトリアント アガ
ー）の平板培地に均一塗布し、その上に、キチナーゼＦ
ＩまたＦＩＩを含んだ濾紙デスクを置き、３７℃で１〜
２日間培養してから、その抑制ゾンを観察した。キチナ
ーゼＦＩ及びＦＩＩには、枯草菌、大腸菌に対して、抗
菌活性が認められた。
【００１５】
【発明の効果】以上の説明のとおり、誘導基質として蟹
海老廃棄物のみの使用により、新規なキチナーゼを生産
する。新奇なシュドモナス アエルギノサ 新菌株が分
離され、この菌株によって高産率で生産された酵素は、
溶菌活性及び抗菌作用を持ち、産業上低コストで有用な
酵素を生産し得ることが確認された。
海老廃棄物のみの使用により、新規なキチナーゼを生産
する。新奇なシュドモナス アエルギノサ 新菌株が分
離され、この菌株によって高産率で生産された酵素は、
溶菌活性及び抗菌作用を持ち、産業上低コストで有用な
酵素を生産し得ることが確認された。
【図１】本発明の酵素（ＦＩ）の、ｐＨと酵素活性の関
係を示す説明図である。
係を示す説明図である。
【図２】本発明の酵素（ＦＩＩ）の、ｐＨと酵素活性の
関係を示す説明図である。
関係を示す説明図である。
【図３】本発明の酵素（ＦＩ）の、ｐＨ安定性と酵素活
性の関係を示す説明図である。
性の関係を示す説明図である。
【図４】本発明の酵素（ＦＩＩ）の、ｐＨ安定性と酵素
活性の関係を示す説明図である。
活性の関係を示す説明図である。
【図５】本発明の酵素（ＦＩ）の、温度と酵素活性の関
係を示す説明図である。
係を示す説明図である。
【図６】本発明の酵素（ＦＩＩ）の、温度と酵素活性の
関係を示す説明図である。
関係を示す説明図である。
【図７】本発明の酵素（ＦＩ）の、熱安定性の説明図で
ある。
ある。
【図８】本発明の酵素（ＦＩＩ）の、熱安定性の説明図
である。
である。
【図９】本発明の菌株の、培養中における、キチナーゼ
活性の生成状況と、ｐＨの変化を示す説明図である。
活性の生成状況と、ｐＨの変化を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:385）
Claims (3)
- 【請求項１】 グラム染色が陰性で、運動性を有し、単
鞭毛の桿菌であり、細菌用培地に、２５〜４１℃、１〜
３日の培養で、より増殖し、 インドールの生地： 陰性 蛍光物質の生成： 陽性 カゼインの加水分解： 陽性 ゼラチンの加水分解： 陽性 界面活性剤の加水分解： 陽性 クエン酸の資化： 陽性 メロン酸の資化： 陽性 メロシンの質化： 陽性 チロシンの質化： 陽性 ウレアーゼ： 陽性 カタラーゼ： 陽性 アルギニン ジハイドロラーゼ 陽性 レシチナーゼ： 陽性 糖の利用性： 陽性： アラビノース、葡萄糖、キシロース 陰性： セロビオース、フラクトース、イノシトール、マルトース の菌類学的性質を有する新菌株 Pseudomonas aeruginos
a k-187株。 - 【請求項２】 キチン、コロイダルキチン、エチレング
リコールキチン、細菌細胞等に作用し、B-グリコシド結
合を加水分解し、澱粉、キシラン、カゼイン等には作用
せず、至適pHは７または８付近であり、SDS-PAGE法によ
って測定した分子量が30,000又は32,000、HPLCを用いた
ゲル濾過法によって測定した分子量が60,000又は30,000
である請求項１記載の新菌株Pseudomonas aeruginosa K
-187株の生産する新規なキチナーゼ。 - 【請求項３】 新菌株Pseudomonas aeruginosa K-187株
またその変異株を、SCSPまたはその廃酸/アルカリ処理
液を含む培地に培養し、培地中に請求項２の新規なキチ
ナーゼを生産する、キチナーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8237103A JP3002140B2 (ja) | 1996-08-06 | 1996-08-06 | 新規なキチナーゼとその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8237103A JP3002140B2 (ja) | 1996-08-06 | 1996-08-06 | 新規なキチナーゼとその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066568A JPH1066568A (ja) | 1998-03-10 |
| JP3002140B2 true JP3002140B2 (ja) | 2000-01-24 |
Family
ID=17010463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8237103A Expired - Lifetime JP3002140B2 (ja) | 1996-08-06 | 1996-08-06 | 新規なキチナーゼとその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3002140B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9915419D0 (en) * | 1999-07-01 | 1999-09-01 | Cortecs Uk Ltd | Antigens |
| TWI744700B (zh) * | 2019-09-25 | 2021-11-01 | 淡江大學 | 生產外切型幾丁質酶之菌株、純化外切型幾丁質酶之方法及所獲得的外切型幾丁質酶以及其菌株生產n-乙醯葡萄糖胺之方法 |
-
1996
- 1996-08-06 JP JP8237103A patent/JP3002140B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH1066568A (ja) | 1998-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0502496B1 (en) | Novel heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same | |
| JPH04349884A (ja) | デアセチラーゼの製造方法 | |
| JP3002140B2 (ja) | 新規なキチナーゼとその製造法 | |
| JP4073787B2 (ja) | 硫酸化フコグルクロノマンナン | |
| JP3235904B2 (ja) | 耐熱性マンノースイソメラーゼ及びその製造法並びにこれを用いたマンノースの製造法 | |
| JP5685398B2 (ja) | ポリガラクツロナーゼ | |
| JPH0523183A (ja) | 新規なα−ガラクトシダーゼ及びそれを用いた糖類の製造法 | |
| JP3118573B1 (ja) | キチナーゼ及びその製造法 | |
| JP2000125857A (ja) | α−Ｌ−フコシダーゼ、その製造方法、菌株および用途 | |
| US5731184A (en) | Process for producing N-acetyl-D-glucosamine deacetylase | |
| JPH04237491A (ja) | 新規なキチナーゼとその製造法 | |
| JP3621985B2 (ja) | 新規β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ及びその製造方法 | |
| JPH0380079A (ja) | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 | |
| JP3117691B1 (ja) | 新規ヘパリチナーゼ及びその製造法 | |
| JPS60184384A (ja) | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 | |
| JP3858065B2 (ja) | 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 | |
| EP0320685B1 (en) | A process for the obtention of thermostable alpha-amylases by culturing superproductive microorganisms at high temperatures | |
| JPH099962A (ja) | アルギン酸分解酵素とその製造法ならびにアルギン酸分解法 | |
| JP3110425B2 (ja) | 新規ヘパリチナーゼ及びその製造法 | |
| JP3110426B2 (ja) | 新規ヘパリチナーゼ及びその製造法 | |
| JP2894292B2 (ja) | ガラクタナーゼｓ−２及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−２ | |
| JPH054067B2 (ja) | ||
| JPH0523175A (ja) | バチルス・ステアロサーモフイラス ＪＤ−７２株及びこの菌株を用いたα−ガラクトシダーゼの製造法 | |
| JPS6363382A (ja) | キトサナ−ゼの製造法 | |
| JPS60241888A (ja) | 新規ヒダントイナ−ゼ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19991005 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081112 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081112 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091112 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111112 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131112 Year of fee payment: 14 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |