JPS60241888A - 新規ヒダントイナ−ゼ - Google Patents
新規ヒダントイナ−ゼInfo
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- JPS60241888A JPS60241888A JP9957884A JP9957884A JPS60241888A JP S60241888 A JPS60241888 A JP S60241888A JP 9957884 A JP9957884 A JP 9957884A JP 9957884 A JP9957884 A JP 9957884A JP S60241888 A JPS60241888 A JP S60241888A
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- enzyme
- carbamoyl
- acid
- buffer
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規なヒダントイナーゼに関する。
更に詳しくは、５−置換ヒダントインを開裂加水分解し
てＮ−カルバモイル−し−アミノ酸を生成する活性をＷ
ｊる新規ヒダントイナーゼに関する。
てＮ−カルバモイル−し−アミノ酸を生成する活性をＷ
ｊる新規ヒダントイナーゼに関する。
従来、５−置換ヒダントインに作用するヒダントイナー
ゼとしては、各種動物の肝臓や腎臓、ヴ科植物や微生物
罠存在し、ジヒドロウラシルまたはジヒドロチミンを開
裂加水分解して、それぞれＮ−カーシバモイル−β−ア
ラニンまたはＮ−カルバモイル−β−アミノ−イソ酪酸
に変換するとともに、５−置換ヒダントイン類にも作用
し、立体特異的に開裂加水分解して、光学活性Ｎ−カル
バモイル−Ｄ−アミノ酸類に′＆挾する作用をも有する
ジヒドロビリミジナーゼ（ＥＣ３，５，２，２）が知ら
れている（％開昭５３−１３６５８３ ）。
ゼとしては、各種動物の肝臓や腎臓、ヴ科植物や微生物
罠存在し、ジヒドロウラシルまたはジヒドロチミンを開
裂加水分解して、それぞれＮ−カーシバモイル−β−ア
ラニンまたはＮ−カルバモイル−β−アミノ−イソ酪酸
に変換するとともに、５−置換ヒダントイン類にも作用
し、立体特異的に開裂加水分解して、光学活性Ｎ−カル
バモイル−Ｄ−アミノ酸類に′＆挾する作用をも有する
ジヒドロビリミジナーゼ（ＥＣ３，５，２，２）が知ら
れている（％開昭５３−１３６５８３ ）。
一方、５−置換ヒダントインからＮ−カルバモイル−Ｌ
−アミノ酸を生成する酵素としてはＬ−５−カルぜキシ
メチルヒタゝントインからＮ−カルバモイル−Ｌ−アス
パラギン酸を生成するカルボキシメチルヒダントイナー
ゼ（ＥＣ３，５，２゜４）が知られている（酵素ハンド
ブック朝倉書店１９８２年発行、ｐ５９７）。
−アミノ酸を生成する酵素としてはＬ−５−カルぜキシ
メチルヒタゝントインからＮ−カルバモイル−Ｌ−アス
パラギン酸を生成するカルボキシメチルヒダントイナー
ゼ（ＥＣ３，５，２゜４）が知られている（酵素ハンド
ブック朝倉書店１９８２年発行、ｐ５９７）。
５−１ｆ洟ヒダントインからＬ−アミノ酸を生成させる
方法としては、特公昭４２−１６８５０号公報には谷種
微生物の陶体又は培養液、破砕液を用いて、Ｌ−アミノ
酸を生成させる方法、特公昭４５−８６３３号公報には
Ｌ −Ｑジンを製造する方法、さらに特公昭５４−２２
７４号公報峻び特公昭５４−８７４９号公報にはフラポ
バクテリムアミノｒネスを作用させて、５−置換ヒダン
トインからＬ−フェニルアラニン及びＬ−トリシトファ
ンを製造する方法が開示されている。本発明者らも、５
置侯ヒダントインに、アリスロバクターＭ ＤＩ −２
００菌株を作用させて、Ｌ−アミ７′酸を製造する方法
なすでに提案した＜ ｔＶｆ顧昭５９−７０９０６号明
細−磐）。これらの方法は医薬、化学工業用原料、食品
添加物として有用な１．−アミノ酸の製造に極めて有効
であり、実用効果が期待される。
方法としては、特公昭４２−１６８５０号公報には谷種
微生物の陶体又は培養液、破砕液を用いて、Ｌ−アミノ
酸を生成させる方法、特公昭４５−８６３３号公報には
Ｌ −Ｑジンを製造する方法、さらに特公昭５４−２２
７４号公報峻び特公昭５４−８７４９号公報にはフラポ
バクテリムアミノｒネスを作用させて、５−置換ヒダン
トインからＬ−フェニルアラニン及びＬ−トリシトファ
ンを製造する方法が開示されている。本発明者らも、５
置侯ヒダントインに、アリスロバクターＭ ＤＩ −２
００菌株を作用させて、Ｌ−アミ７′酸を製造する方法
なすでに提案した＜ ｔＶｆ顧昭５９−７０９０６号明
細−磐）。これらの方法は医薬、化学工業用原料、食品
添加物として有用な１．−アミノ酸の製造に極めて有効
であり、実用効果が期待される。
しかしながら、これらの１．−アミノ酸の製造法におい
て、５−置換ヒダントインを開裂加水分解する酵素につ
いては、明らかにされていない。このような酵素が人手
できれば有用なＬ−アミノ酸の製造が経済的に行なえ、
工業的利用価１１６は大きい、そこで、本発明者らは、
５−１ｉｆｔ換ヒダントインから、相当するＬ−アミノ
酸を生成する反応に関与する微生物酵素について研究を
行なった結宋、アリスロバクター属の菌株が、５−＋ｉ
ｉｍヒダントインを開裂加水分解して、Ｎ−カルバモイ
ル−■。
て、５−置換ヒダントインを開裂加水分解する酵素につ
いては、明らかにされていない。このような酵素が人手
できれば有用なＬ−アミノ酸の製造が経済的に行なえ、
工業的利用価１１６は大きい、そこで、本発明者らは、
５−１ｉｆｔ換ヒダントインから、相当するＬ−アミノ
酸を生成する反応に関与する微生物酵素について研究を
行なった結宋、アリスロバクター属の菌株が、５−＋ｉ
ｉｍヒダントインを開裂加水分解して、Ｎ−カルバモイ
ル−■。
−アミノ酸に変換する酵素を効率良（多普に生戸ｐする
ことを見い出し、本発明を完成するに到った。
ことを見い出し、本発明を完成するに到った。
（−ＩＪち本発明は、下記の理化学的性質を有し、且つ
５−１ｆ換ヒダントインを開裂加水分解してＮ−カルバ
モイルーＬ−アミノ酸を生ｂｙする活性を有する＃ｒ規
ヒダントイナーゼである。
５−１ｆ換ヒダントインを開裂加水分解してＮ−カルバ
モイルーＬ−アミノ酸を生ｂｙする活性を有する＃ｒ規
ヒダントイナーゼである。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
先ず、本酵素の理化学的性質を以下に記載する。
ｉｌ１作用及び基質特異性
本酵素は、５−１を換ヒダントインのＬ休校び０体の開
裂加水分解をし、それぞれ相当するＮ−カルバモイル−
Ｌ−アミノ酸及びＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変
換する。５−１１４ヒダントインのうち、１蓋換基に芳
香環を！する５−ベンジルヒダントインや５−インｒリ
ルメチルヒダントイン等にと（Ｋよく作用する。
裂加水分解をし、それぞれ相当するＮ−カルバモイル−
Ｌ−アミノ酸及びＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変
換する。５−１１４ヒダントインのうち、１蓋換基に芳
香環を！する５−ベンジルヒダントインや５−インｒリ
ルメチルヒダントイン等にと（Ｋよく作用する。
しかしながら、５−カルｆキシメチルヒダントイン（Ｄ
Ｌ−アスパラヤン酸ヒダントイン）やＤＬ−グルタミン
酸ヒダントイン及びヒダントインには作用しない。従っ
て、公知のカルボキシメチルヒダントイナーゼとは異な
る新規のヒダントイナーゼである。
Ｌ−アスパラヤン酸ヒダントイン）やＤＬ−グルタミン
酸ヒダントイン及びヒダントインには作用しない。従っ
て、公知のカルボキシメチルヒダントイナーゼとは異な
る新規のヒダントイナーゼである。
またジヒドロウラシルやジヒドロチミンには、はとんど
作用せず、ジヒドロピリミジナーゼとは異なる。
作用せず、ジヒドロピリミジナーゼとは異なる。
（２）至適−至適−は緩衝液としてアンモニア緩衝ｉ（
０，０５Ｍアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液、ｐ
ｉ−（８，０〜１０．０ ）を用い、５−ベンジルヒダ
ントインを基質とし、温度６５℃で３０分間反応させ、
生成したＮ−カルバモイル−ＤＬ−フェニルアラニンを
測定した場合、ＰＩ（８，０−９，０である。また緩衝
液として、酢酸緩衝液（０，０５Ｍ酢酸−酢酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ４，０−５，５）とリン酸緩衝液（０，
０５Ｍリン酸−カリウム−リン酸二ナトリウム緩衝液ｐ
ｉ（５，５〜８．０）を用い、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−
フェニルアラニン又はＮ−カルバモイル−Ｄ−フェニル
アラニンヲ基質として、５−ベンジルヒダントイン生成
を測定した場合の至適ＰＩ（５，０〜７．０である。本
酵素は、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸及びＮ−カル
バモイル−Ｄ−アミノ酸から５−置換ヒダントインな生
成する反応即ち逆反応作用を有する。
０，０５Ｍアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液、ｐ
ｉ−（８，０〜１０．０ ）を用い、５−ベンジルヒダ
ントインを基質とし、温度６５℃で３０分間反応させ、
生成したＮ−カルバモイル−ＤＬ−フェニルアラニンを
測定した場合、ＰＩ（８，０−９，０である。また緩衝
液として、酢酸緩衝液（０，０５Ｍ酢酸−酢酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ４，０−５，５）とリン酸緩衝液（０，
０５Ｍリン酸−カリウム−リン酸二ナトリウム緩衝液ｐ
ｉ（５，５〜８．０）を用い、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−
フェニルアラニン又はＮ−カルバモイル−Ｄ−フェニル
アラニンヲ基質として、５−ベンジルヒダントイン生成
を測定した場合の至適ＰＩ（５，０〜７．０である。本
酵素は、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸及びＮ−カル
バモイル−Ｄ−アミノ酸から５−置換ヒダントインな生
成する反応即ち逆反応作用を有する。
（３）力価の測定法 ５−ベンジルヒダントイン２．５
ｍｙを含有し、ｐＨ８，０に１１Ｍ１整した０、０２
Ｍ ）リスー塩酸バッファー帆８ｍｌに、１０ ｍＭ塩
化コバルトＱ、ｌＩＲ／、酵素液０．１ｍｌを加え、３
５−０で３０分反応を行わせる。３０分後に０．Ｉ Ｎ
の塩酸１ゴを加えて反応を停止する。本反応を薄１−プ
レートにスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水−４：
に１の展開溶媒で展開する。乾燥後、１０ ’１ ｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドのアセトン溶液（１，
５Ｎ塩酸含有）で発色させ、デンジトメ］・リーにより
、Ｎ−カルバモイルフェニルアラニンの生成量を定１す
る。毎分１．０μモルのＮ−カルバモイルフェニルアラ
ニンを生成させるヒダントイナーゼの量を１単位とし、
試料のヒダントイナーゼ力価を算出する。
ｍｙを含有し、ｐＨ８，０に１１Ｍ１整した０、０２
Ｍ ）リスー塩酸バッファー帆８ｍｌに、１０ ｍＭ塩
化コバルトＱ、ｌＩＲ／、酵素液０．１ｍｌを加え、３
５−０で３０分反応を行わせる。３０分後に０．Ｉ Ｎ
の塩酸１ゴを加えて反応を停止する。本反応を薄１−プ
レートにスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水−４：
に１の展開溶媒で展開する。乾燥後、１０ ’１ ｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドのアセトン溶液（１，
５Ｎ塩酸含有）で発色させ、デンジトメ］・リーにより
、Ｎ−カルバモイルフェニルアラニンの生成量を定１す
る。毎分１．０μモルのＮ−カルバモイルフェニルアラ
ニンを生成させるヒダントイナーゼの量を１単位とし、
試料のヒダントイナーゼ力価を算出する。
（４）安定−の範囲 緩衝液として、酢酸緩衝液（０，
０５Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム…４．０〜５．５）、リン
酸緩衝液（０，０５Ｍリン酸−カリウムーリン酸＝ナト
リウム緩衝液ｐＨ５，５〜８．０）、アンモニア緩衝液
（０，０５Ｍアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液ｐ
Ｈ８，０〜１０．０）、ホウ酸緩衝液（０，０５Ｍホウ
酸−ホウ酸ナトリウムＰＨ９，５〜１１．５ ）を用い
て、酵素液を各−で、３５−Ｃ。
０５Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム…４．０〜５．５）、リン
酸緩衝液（０，０５Ｍリン酸−カリウムーリン酸＝ナト
リウム緩衝液ｐＨ５，５〜８．０）、アンモニア緩衝液
（０，０５Ｍアンモニア水−塩化アンモニウム緩衝液ｐ
Ｈ８，０〜１０．０）、ホウ酸緩衝液（０，０５Ｍホウ
酸−ホウ酸ナトリウムＰＨ９，５〜１１．５ ）を用い
て、酵素液を各−で、３５−Ｃ。
６０分インキュベート後、残存力画を測定することによ
ってめた安定ＰＨ範囲は、５．０〜１０．０である。
ってめた安定ＰＨ範囲は、５．０〜１０．０である。
（５）作用適温の範囲 ｐＨ８，０で１０〜６０分間作
用させた場合、６０〜４０′Ｃの範囲が最適である。
用させた場合、６０〜４０′Ｃの範囲が最適である。
ｉ６） ｐ１４ 、温度等による失活の条件 ｌ）Ｈ４
，０以下及び−４１１以上で３５℃、６０分インキュベ
ートすると、完全に失活する。ｐＨ３，０において６０
゛Ｃで２０分間熱処理することにより完全に失活する。
，０以下及び−４１１以上で３５℃、６０分インキュベ
ートすると、完全に失活する。ｐＨ３，０において６０
゛Ｃで２０分間熱処理することにより完全に失活する。
（力阻害、活性化及び安定化
■阻害
阻害剤無添加時の酵素活性値を１００とし、それぞれ、
塩化ニッケル、塩化鋼、ヨーｒ酢酸、ＰＣＭＢ、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸、窒化ナトリウム、ヒＰロキシル
アミン塩酸を添加し、ｐＨ８，０、温度６０°０ ３０
分間反応した場合の残存活性を表に示す。なお、本活性
測定においてコバルトイオンは添加していない。
塩化ニッケル、塩化鋼、ヨーｒ酢酸、ＰＣＭＢ、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸、窒化ナトリウム、ヒＰロキシル
アミン塩酸を添加し、ｐＨ８，０、温度６０°０ ３０
分間反応した場合の残存活性を表に示す。なお、本活性
測定においてコバルトイオンは添加していない。
表より、明らかな如（、’ ＰＣＭＢの他に、エチレン
ジアミンテトラ酢酸により、本酵素は顕著に阻害され、
金属酵素と考えられる。
ジアミンテトラ酢酸により、本酵素は顕著に阻害され、
金属酵素と考えられる。
■活性化
本酵素は、０．１〜１０ｍＭのコバルトイオン、マンガ
ンイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン
のような金属イオンの存在下で反応させると、無添加の
場合に比べ、活性が促進される。
ンイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン
のような金属イオンの存在下で反応させると、無添加の
場合に比べ、活性が促進される。
Ｏ安定化
本酵素は、０．１〜ｌ Ｑ ｍＭのコバルトイオンが共
存すると熱安定性が向ヒし、４０℃で１時間、ＰＨ８で
インキュベートすると、無添加の酵素の残存活性は３０
〜４０チとなるが、ｉ ｍＭコバルトイオン共存ドでは
活性低下は見られない。
存すると熱安定性が向ヒし、４０℃で１時間、ＰＨ８で
インキュベートすると、無添加の酵素の残存活性は３０
〜４０チとなるが、ｉ ｍＭコバルトイオン共存ドでは
活性低下は見られない。
（８）ｎ製方法
培養物を遠心分離して湿潤菌体を集菌シフ、この菌体を
０．０２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（−８，０１塩化マ
ンガン１ｍＭ含有）に懸濁し、超音波処理により、函体
ケ破砕し、遠心分離にて同形分を除き、粗酵素液を得る
。
０．０２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（−８，０１塩化マ
ンガン１ｍＭ含有）に懸濁し、超音波処理により、函体
ケ破砕し、遠心分離にて同形分を除き、粗酵素液を得る
。
次いで、その粗酵素液に、３％ゾロタミン硫酸水浴液（
、Ｈ７，０）を加え、生じた沈殿を遠心分離で除き、次
いでこの上清液に硫酸アンモニウムを０．３０飽和にな
るまで加え、生じた沈殿を遠心分離で除（。得られた上
清液に史に硫酸アンモニウムを０．６０飽和になるまで
加え、生じた沈殿を分離して、０．０２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐｉ（８，０、塩化マンガン１ｍＭ含有）に俗
解し、この浴液を同緩衝液で２４時間透析する。
、Ｈ７，０）を加え、生じた沈殿を遠心分離で除き、次
いでこの上清液に硫酸アンモニウムを０．３０飽和にな
るまで加え、生じた沈殿を遠心分離で除（。得られた上
清液に史に硫酸アンモニウムを０．６０飽和になるまで
加え、生じた沈殿を分離して、０．０２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐｉ（８，０、塩化マンガン１ｍＭ含有）に俗
解し、この浴液を同緩衝液で２４時間透析する。
以ヒのようにして得た硫安分画を、上記緩衝液で平衡化
した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム（ＭＯＮＯＱフ
ァマシア製）による液体クロマトグラフィーＫかけ、酵
素をカラムに吸着させる。次いで、塩化ナトリウム濃度
を０〜１Ｍに直線的に増加させた上記緩衝液を流して、
流出液をフラクションコレクターで分画し、活性区分を
集める。
した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム（ＭＯＮＯＱフ
ァマシア製）による液体クロマトグラフィーＫかけ、酵
素をカラムに吸着させる。次いで、塩化ナトリウム濃度
を０〜１Ｍに直線的に増加させた上記緩衝液を流して、
流出液をフラクションコレクターで分画し、活性区分を
集める。
次いでその活性区分を、０．０５Ｍ ） ＋）ス塩酸緩
衝液（０，２Ｍ塩化ナトリウム、ｉｍＭ塩化マンガン含
有）で平衡化したデルろ適用カラム（Ｇ３０００ｓｗ
ｘ ２東洋ゴ達工業社表）にかけ、同組成の緩衝液で苗
出し、活性区分を集める。この活性区分を再度、デルろ
適用カラムにかけて、クロマトグラフィーを行い、活性
区分を精製標品とする。
衝液（０，２Ｍ塩化ナトリウム、ｉｍＭ塩化マンガン含
有）で平衡化したデルろ適用カラム（Ｇ３０００ｓｗ
ｘ ２東洋ゴ達工業社表）にかけ、同組成の緩衝液で苗
出し、活性区分を集める。この活性区分を再度、デルろ
適用カラムにかけて、クロマトグラフィーを行い、活性
区分を精製標品とする。
（９）分子量
本酵素の分子量は高速液体クロマトグラフィー（Ｇ ５
０００ ｓＷ ｘ ２東洋督達工業製）によるデルろ過
失で測定した結果、約２０万であり、エチレンジアミン
テトラ酢酸処理して後測定すると、約１０万である。こ
れら分子−の異なる酵素は、分子材の異なること以外は
、その理化学的性質において同様である。
０００ ｓＷ ｘ ２東洋督達工業製）によるデルろ過
失で測定した結果、約２０万であり、エチレンジアミン
テトラ酢酸処理して後測定すると、約１０万である。こ
れら分子−の異なる酵素は、分子材の異なること以外は
、その理化学的性質において同様である。
（１０等゛畦点 ＭＯＮＯＰ （ファマシア製）を用い
た、クロマトフオーカシング法により測定し た結果４〜４．５であった。
た、クロマトフオーカシング法により測定し た結果４〜４．５であった。
本酵素は、壊トの性質から新規ヒダントイナーゼと認め
られ、本酵素の性質を活用すれば、極めテ自用なＮ−カ
ルバモイル−Ｌ−アミノ酸製造が可能となる。
られ、本酵素の性質を活用すれば、極めテ自用なＮ−カ
ルバモイル−Ｌ−アミノ酸製造が可能となる。
灰に本酵素を製造するための具体的手段を以下に述べる
。本酵素を製造する方法としては如何なる方法でも良く
、例えば以下の方法が挙げられる。
。本酵素を製造する方法としては如何なる方法でも良く
、例えば以下の方法が挙げられる。
先ず、本酵素を製造するにあたり使用される菌としては
、アリスロバクター属に属し、上目己ヒダントイナーゼ
生産能を■する繭であれば如何なる菌でもよく、またこ
れらの面の変信もしくは変異株でも良い。そして、アリ
マロバクター蛎に鴫し、新規ヒダントイナーゼ生産症を
４４−する菌の具体例として、例えばアリスロバクター
属（Ａｒｔｈｒｏ−ｂａｃｔｅｒＳＰ ） ＤＫ −２
００が挙げられる。
、アリスロバクター属に属し、上目己ヒダントイナーゼ
生産能を■する繭であれば如何なる菌でもよく、またこ
れらの面の変信もしくは変異株でも良い。そして、アリ
マロバクター蛎に鴫し、新規ヒダントイナーゼ生産症を
４４−する菌の具体例として、例えばアリスロバクター
属（Ａｒｔｈｒｏ−ｂａｃｔｅｒＳＰ ） ＤＫ −２
００が挙げられる。
上記アリスロバクターＤＫ −２００は本発明者らが、
土壌中より新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質
は、以下に示す通りである。
土壌中より新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質
は、以下に示す通りである。
アリスロバクターＤＫ −２００の菌学的性質ｆａｌ形
態的顕微鏡的観察 （１）細胞の形及び大きさ二〇、３〜０．５μ×０．８
〜５．０μｍの桿菌である。
態的顕微鏡的観察 （１）細胞の形及び大きさ二〇、３〜０．５μ×０．８
〜５．０μｍの桿菌である。
（２）細胞の多形性の有無：多形性が認められる（３）
運動性の有無 ：運動性なしく轍毛は認められない。） （４）胞子の有無 ：なし く５）ダラム染色 ：陰性〜弱陽性だがグラム陽性粒子
を有する （６）抗酸性 ：陰性 ｆｂｌ各培地での生育状態 （１）肉汁摩大平板培賽 ：コロニーの形状は円形で、
隆起は凸状であり、周辺は全縁状 であり、コロニーの色は淡白色である。
運動性の有無 ：運動性なしく轍毛は認められない。） （４）胞子の有無 ：なし く５）ダラム染色 ：陰性〜弱陽性だがグラム陽性粒子
を有する （６）抗酸性 ：陰性 ｆｂｌ各培地での生育状態 （１）肉汁摩大平板培賽 ：コロニーの形状は円形で、
隆起は凸状であり、周辺は全縁状 であり、コロニーの色は淡白色である。
（２）肉汁寒天斜面培養：適度の生育状態で糸状の生育
を示す。光沢がある （３）肉汁液体培養 ：混濁の程度は均一で、液面での
生育は時になし。沈殿がある （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：ｔｉ化する。
を示す。光沢がある （３）肉汁液体培養 ：混濁の程度は均一で、液面での
生育は時になし。沈殿がある （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：ｔｉ化する。
（５）リドマスミルク培養：中性で液体しない。
ｌｅｔ生理的性質
（１）硝酸塩の還元 ：４元しない。
（２）脱窒反応 ：陽性
（３１Ｍ Ｒテスト ニ陰性
＋４１ Ｖ Ｐテスト ：陰性
（５）インドールの生成：生成しない。
（６）硫化水素の生成 ：生成しない。
（カデンプン加水分解：加水分解しない。
（８）クエン酸の利用 二両方とも利用しない。
（ＫｏｓθＶの培地及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地
使用 （９）無機窒素源の利用：利用する。（硝酸塩及びアン
モニウム塩） （１１色素の生成 ：生成しない （１υウレアーゼ ：陰性 ０３オキシダーゼ ：陰性 （１３１カタラーゼ ：陽性 ０→酸素に対する態度：好気性 （１９生胃の範囲 ：温度： １７．８〜３６．２”Ｃ
… ：５〜１０ ｆ１６１ｏ−Ｆテスト 二酸化 ０ｎ糖類からの酸及びガスの生成の有無：糖類 酸 が
ス ト−アラビノース − − Ｄ−キシロース ＋ − Ｄ−グルコース 士 − Ｄ−マンノース 士 − Ｄ−フラクトース 士 − Ｄ−がラクトース 十 − 麦芽糖 士 − ショ糖 士 − 乳 糖 士 − トレハロース 士 − Ｄ−ソルビット ± − Ｄ−マンニット 十 − インジット ± − グリセリン 十 − （１＆細胞壁中の二塩基性アミノ酸：リジン（メンジア
ミノピメリン酸及びア ラビノースは含まない） １１９ ＤＮＡのＧＣ含量 ＋２１ ＤＮＡ分解性 二階性 （２υ力ゼイン分解性 ：陽性 １２３耐塩性 ： ＮａＣｌ２ ％ 生育ＮａＣｌ３チ
生育弱い （７！漕炭化水素の資化性 ｐ−オキシ安息香酸 − グルコン酸 − 乳 酸 − グルコース ＋ ショ閘 十 キシロース ＋ ラクトース − マンニット ＋ なお、上記、アリスロバクターＤＫ −２００は工業技
術院微生物工業技術研究所に倣工研菌寄第７４７２号（
Ｆ’ｇＲＭ Ｐ −７４７２）として寄託されている。
使用 （９）無機窒素源の利用：利用する。（硝酸塩及びアン
モニウム塩） （１１色素の生成 ：生成しない （１υウレアーゼ ：陰性 ０３オキシダーゼ ：陰性 （１３１カタラーゼ ：陽性 ０→酸素に対する態度：好気性 （１９生胃の範囲 ：温度： １７．８〜３６．２”Ｃ
… ：５〜１０ ｆ１６１ｏ−Ｆテスト 二酸化 ０ｎ糖類からの酸及びガスの生成の有無：糖類 酸 が
ス ト−アラビノース − − Ｄ−キシロース ＋ − Ｄ−グルコース 士 − Ｄ−マンノース 士 − Ｄ−フラクトース 士 − Ｄ−がラクトース 十 − 麦芽糖 士 − ショ糖 士 − 乳 糖 士 − トレハロース 士 − Ｄ−ソルビット ± − Ｄ−マンニット 十 − インジット ± − グリセリン 十 − （１＆細胞壁中の二塩基性アミノ酸：リジン（メンジア
ミノピメリン酸及びア ラビノースは含まない） １１９ ＤＮＡのＧＣ含量 ＋２１ ＤＮＡ分解性 二階性 （２υ力ゼイン分解性 ：陽性 １２３耐塩性 ： ＮａＣｌ２ ％ 生育ＮａＣｌ３チ
生育弱い （７！漕炭化水素の資化性 ｐ−オキシ安息香酸 − グルコン酸 − 乳 酸 − グルコース ＋ ショ閘 十 キシロース ＋ ラクトース − マンニット ＋ なお、上記、アリスロバクターＤＫ −２００は工業技
術院微生物工業技術研究所に倣工研菌寄第７４７２号（
Ｆ’ｇＲＭ Ｐ −７４７２）として寄託されている。
以上の菌学的性質からアリスロバクタ−ＤＫ −２００
の分類学上の位置について、パージエイズ・マニュアル
・オプ・デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版（
１９７４年）の分類と対比した結果１記菌は、多形性が
あり、グラム陽性粒子を細胞内に有し、細胞壁にリジン
を含有するがメソジアミノピメリン酸、アラビノースを
含まないこと等からアリスロパクター属に横するものと
判定される。更に既知菌のいずれとも性質の一致を見な
いことから、アリスロバクター属に嘴する新菌種の菌と
判定される。
の分類学上の位置について、パージエイズ・マニュアル
・オプ・デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版（
１９７４年）の分類と対比した結果１記菌は、多形性が
あり、グラム陽性粒子を細胞内に有し、細胞壁にリジン
を含有するがメソジアミノピメリン酸、アラビノースを
含まないこと等からアリスロパクター属に横するものと
判定される。更に既知菌のいずれとも性質の一致を見な
いことから、アリスロバクター属に嘴する新菌種の菌と
判定される。
次に本酵素を生産するには、通常の通気液体培養法を採
用するのが望ましい。本酵素を製造するにあたり用いら
れる培地としては、通常の細−〇培養に用いられる培地
が用いられる。そして例えハ、酵母エキス、ペノトン、
肉エキス、コーンスチーアリカー、アミノ酸類、硫安、
硝酸アンモニウム等の１櫨以上の有機もしくは無機の窒
素源に、例えば、リン酸、硫酸マグネシウム等の無機塩
類を１種以−ヒ添加し、必快により、炭素源例えば糖類
、ビタミン等ケ適宜添加したものが好適に用いられる。
用するのが望ましい。本酵素を製造するにあたり用いら
れる培地としては、通常の細−〇培養に用いられる培地
が用いられる。そして例えハ、酵母エキス、ペノトン、
肉エキス、コーンスチーアリカー、アミノ酸類、硫安、
硝酸アンモニウム等の１櫨以上の有機もしくは無機の窒
素源に、例えば、リン酸、硫酸マグネシウム等の無機塩
類を１種以−ヒ添加し、必快により、炭素源例えば糖類
、ビタミン等ケ適宜添加したものが好適に用いられる。
（にＮ−カルバモイル−Ｌ−トリシトファンなどを少量
添加すれば酵素活性が増強される。
添加すれば酵素活性が増強される。
なお初発−１は４〜１１、温度１５〜４０゛Ｃの条件下
で、５〜１２０時間培養する。
で、５〜１２０時間培養する。
培養終了後、培養物より酵素を採取するには、通常の酵
素採取手段を用いることができる。しかし、本酵素は、
菌体内に存在する酵素であるため、培養物より例えば、
ろ過、遠心分離等の操作により菌体を分離したのち菌体
より本酵素を採取するのが好ましい。菌体の破壊手段と
しては、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等
の破壊手段を用いる方法、す・戸チームのＱ口き細胞壁
浴解酵木を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、摩耗剤を
用いて菌体をすりつぶす方法、浸透圧ショックを適用す
る方法、有機浴剤や界面活性剤により静置させる方法を
用いる。このようにして、菌体を破壊したものあるいは
溶菌させたものより、例えば、ろ過、遠心分離等の適当
な処理操作より固形物を除去して菌体抽出液を得るか、
又は水、緩衝液、有機溶剤で抽出し、これをそのまま粗
酵素液として得るか、あるいは、その抽出液に必要によ
り、凍結乾燥法、アルコール沈殿法、アセトン沈殿法等
を適宜選択して実施することにより、粗酵素粉末を得る
。
素採取手段を用いることができる。しかし、本酵素は、
菌体内に存在する酵素であるため、培養物より例えば、
ろ過、遠心分離等の操作により菌体を分離したのち菌体
より本酵素を採取するのが好ましい。菌体の破壊手段と
しては、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等
の破壊手段を用いる方法、す・戸チームのＱ口き細胞壁
浴解酵木を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、摩耗剤を
用いて菌体をすりつぶす方法、浸透圧ショックを適用す
る方法、有機浴剤や界面活性剤により静置させる方法を
用いる。このようにして、菌体を破壊したものあるいは
溶菌させたものより、例えば、ろ過、遠心分離等の適当
な処理操作より固形物を除去して菌体抽出液を得るか、
又は水、緩衝液、有機溶剤で抽出し、これをそのまま粗
酵素液として得るか、あるいは、その抽出液に必要によ
り、凍結乾燥法、アルコール沈殿法、アセトン沈殿法等
を適宜選択して実施することにより、粗酵素粉末を得る
。
上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末より更に精製標品を得
るには、例えば、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ハ
イドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、セファデッ
クスやバイオケ９ル等を用いるゲルろ過失、アフイニテ
イクロマト法等を適宜選択し、組み合わせを実施するこ
と罠より、精製された本酵素を得ることが出来る。
るには、例えば、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ハ
イドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、セファデッ
クスやバイオケ９ル等を用いるゲルろ過失、アフイニテ
イクロマト法等を適宜選択し、組み合わせを実施するこ
と罠より、精製された本酵素を得ることが出来る。
以下実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ヒダントイナーゼの製造例
ポリペプトン１．ＯＬ酵母エキス１．０．９ 、グルコ
ース１．０．９．塩化ナトリウム１．０ｇ、Ｎ−カルバ
モイルトリプトファン０．２ｇを水道水に溶解し、この
ＰＨを７．５に調整し、全竜を２００ｍｅとしたもの５
０Ｃ１＋／の坂ロフラスコに１００ｘ／ｆつ２本分注し
た。この培地を温１ｆ１２０℃で１５分間殺菌後、アリ
スロバクターＤＫ −２００（微工研菌与第７４７２号
）を接種し、温度３０℃で２０時間振盪培養（１００ａ
、ｐｌｍの往復）した。
ース１．０．９．塩化ナトリウム１．０ｇ、Ｎ−カルバ
モイルトリプトファン０．２ｇを水道水に溶解し、この
ＰＨを７．５に調整し、全竜を２００ｍｅとしたもの５
０Ｃ１＋／の坂ロフラスコに１００ｘ／ｆつ２本分注し
た。この培地を温１ｆ１２０℃で１５分間殺菌後、アリ
スロバクターＤＫ −２００（微工研菌与第７４７２号
）を接種し、温度３０℃で２０時間振盪培養（１００ａ
、ｐｌｍの往復）した。
培養終了後培養液２００ｍ１を遠心分離して得られた菌
体を生理食塩水で１回洗浄後、０．０２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０、塩化マンガン１ ｍＭ含有１：懸
濁し、液量な２０ゴにした。この菌体懸濁液を１（）＋
／ずつに分け、２０ ｘ Ｈｚの超音波破砕機で、それ
ぞれ３分間１回処理して、遠心分離し、固形分を除去し
、粗酵素液を得た。その粗酵素液を集めて、上記トリス
−塩酸緩衝液で６０罰とした後、３％グロタミン億酸水
溶液１１１１１を攪拌しながら加え、６０分間攪拌を続
けた。遠心分離によって沈殿を除去し、上清液を得た。
体を生理食塩水で１回洗浄後、０．０２Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０、塩化マンガン１ ｍＭ含有１：懸
濁し、液量な２０ゴにした。この菌体懸濁液を１（）＋
／ずつに分け、２０ ｘ Ｈｚの超音波破砕機で、それ
ぞれ３分間１回処理して、遠心分離し、固形分を除去し
、粗酵素液を得た。その粗酵素液を集めて、上記トリス
−塩酸緩衝液で６０罰とした後、３％グロタミン億酸水
溶液１１１１１を攪拌しながら加え、６０分間攪拌を続
けた。遠心分離によって沈殿を除去し、上清液を得た。
その上清液に、硫酸アンモニウムを帆６０飽和になるま
で加え、生じた沈殿を遠心分離で除く。得られた上清液
に更に硫酸アンモニウムを０．６０飽和になるまで加え
、遠心分離により沈殿を得る。この沈殿を、０．０２
Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ”８．Ｌ塩化マンガンｌ
ｍＭ金含有Ｋ溶解し、この溶液を同緩衝液で２４時間透
析し、１０ｍ１の酵素液を得た。
で加え、生じた沈殿を遠心分離で除く。得られた上清液
に更に硫酸アンモニウムを０．６０飽和になるまで加え
、遠心分離により沈殿を得る。この沈殿を、０．０２
Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ”８．Ｌ塩化マンガンｌ
ｍＭ金含有Ｋ溶解し、この溶液を同緩衝液で２４時間透
析し、１０ｍ１の酵素液を得た。
以上のようにして硫安分画液５耐を、０．０２Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐ）（８，０、塩化マンガン１ｍＭ含有
）で平衡化した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム（Ｍ
ｏｎｏ Ｑファマシア社製）に吸着させる。次いで、高
速液体クロマトグラフィーにより、その緩衝液を用いて
充分に洗浄し、食塩濃度を０〜１．０Ｍまで連続的に上
昇させる方法により溶出を行ないフラクションコレクタ
ーで分画し、活性区分を得た。本高速液体クロマトグラ
フィーを２回行なうことにより、１０ｍ／の億安分画液
からの陰イオン交換樹脂精製酵素液が得られた。この酵
素液圧０．８０飽和硫酸アンモニウムを加えて塩析し、
濃縮酵素液を２’ｔｌ得た。
−塩酸緩衝液（ｐ）（８，０、塩化マンガン１ｍＭ含有
）で平衡化した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム（Ｍ
ｏｎｏ Ｑファマシア社製）に吸着させる。次いで、高
速液体クロマトグラフィーにより、その緩衝液を用いて
充分に洗浄し、食塩濃度を０〜１．０Ｍまで連続的に上
昇させる方法により溶出を行ないフラクションコレクタ
ーで分画し、活性区分を得た。本高速液体クロマトグラ
フィーを２回行なうことにより、１０ｍ／の億安分画液
からの陰イオン交換樹脂精製酵素液が得られた。この酵
素液圧０．８０飽和硫酸アンモニウムを加えて塩析し、
濃縮酵素液を２’ｔｌ得た。
次いで、０．２Ｍ塩化す） ＩＪウム、１１ｎＭ塩化マ
ンがンを含有した０、０５Ｍ）ＩＪス塩酸緩衝液で平衡
化したデルろ適用カラム（Ｇ ３０００ ｓｗ ｘ ’
２、東洋曹達製）Ｋかけ、高速液体クロマトグラフィー
により、同緩衝液で溶出し、活性区分を果めた。
ンがンを含有した０、０５Ｍ）ＩＪス塩酸緩衝液で平衡
化したデルろ適用カラム（Ｇ ３０００ ｓｗ ｘ ’
２、東洋曹達製）Ｋかけ、高速液体クロマトグラフィー
により、同緩衝液で溶出し、活性区分を果めた。
この活性区分を再度、同じデルろ適用カラムにかけ、高
速液体クロマトグラフィーにより集めた活性区分を精製
酵素液とした。本酵素液の蛋白濃度を、プロティン・ア
ッセイ（バイオラッド社製）により測定し、活性を測定
したところ、比活性３４．２単位／〜であった。
速液体クロマトグラフィーにより集めた活性区分を精製
酵素液とした。本酵素液の蛋白濃度を、プロティン・ア
ッセイ（バイオラッド社製）により測定し、活性を測定
したところ、比活性３４．２単位／〜であった。
本酵素液０．５単位を用い、５−ペンシルヒダントイン
２〜．０．０２Ｍ）リスー塩酸バッファー（ｐＨ８）、
１ｍＭ塩化コバルトを含む１ａｔの浴液中、３５’０，
１５時間反応させた。旅沸により反応を停止して後生成
したＮ−カルバモイル−フェニルアラニンを薄層クロマ
トグラフィー罠より、ｎ−ブタノール：酢酸：水−４：
１：１で展開し、ｐ−ツメチルアミノベンズアルデヒド
試薬で発色させ、デンシトメトリーにより電縫したとこ
ろ、２、ｌｌＲ９／ｍ／のＮ−カルバモイルフェニルア
ラニンが生成していた。この反応液にＮ−カルバモイル
−Ｌ−アミノ酸に特異的に反応してＬ−アミノ酸を生成
するシューｒモナスＤＫ −９１０微工研菌寄第７４７
３号（ＦＥＢＭ Ｐ−７４７３）の酵素を０．０５Ｍト
リス・塩酸緩＃液（ｐＨ８，０）中、３５℃、１５時間
反応させた。生成したし一フェニルアラニンを、ラクト
バチルス、アラビノデスＡＴＣ’Ｃ８０１４を用いるバ
イオアッセイ法により測定したところ、０．８３〜のし
一フェニルアラニンが生成していた（モル収率４９．８
％対Ｎ−カルバモイルフェニルアラニン）。
２〜．０．０２Ｍ）リスー塩酸バッファー（ｐＨ８）、
１ｍＭ塩化コバルトを含む１ａｔの浴液中、３５’０，
１５時間反応させた。旅沸により反応を停止して後生成
したＮ−カルバモイル−フェニルアラニンを薄層クロマ
トグラフィー罠より、ｎ−ブタノール：酢酸：水−４：
１：１で展開し、ｐ−ツメチルアミノベンズアルデヒド
試薬で発色させ、デンシトメトリーにより電縫したとこ
ろ、２、ｌｌＲ９／ｍ／のＮ−カルバモイルフェニルア
ラニンが生成していた。この反応液にＮ−カルバモイル
−Ｌ−アミノ酸に特異的に反応してＬ−アミノ酸を生成
するシューｒモナスＤＫ −９１０微工研菌寄第７４７
３号（ＦＥＢＭ Ｐ−７４７３）の酵素を０．０５Ｍト
リス・塩酸緩＃液（ｐＨ８，０）中、３５℃、１５時間
反応させた。生成したし一フェニルアラニンを、ラクト
バチルス、アラビノデスＡＴＣ’Ｃ８０１４を用いるバ
イオアッセイ法により測定したところ、０．８３〜のし
一フェニルアラニンが生成していた（モル収率４９．８
％対Ｎ−カルバモイルフェニルアラニン）。
実施例２
本発明ヒダントイナーゼの利用例
実施例１と同様にして得た酵素液を用い、５−ベンジル
ヒダントインのかわりに、５−インドリルメチルヒダン
トインな用いて、実施例１と同様にして反応させた。生
成したＮ−カルバモイル−トリプトファンを実施例１と
同様にして薄層クロマトグラフィーにより定１したとこ
ろ２−１ Ｒ９／ ｍｅのＮ−カルバモイルトリプトフ
ァンが生成していた。この反応液に実施例１と同様にし
て、シューｐモナスＤＫ −９１０微工研菌寄第７４７
３号（ＦＥＲＭ Ｐ −７４７ろ）の酵素を反応させた
。生成したＬ−）リデトファンをバイオアッセイ法によ
り、測定したところ、０．８６＃ｖのＬ−トリプトファ
ンが生成していた（モル収率４９．６％ｑＮ−カルバモ
イルトリプトファン）。
ヒダントインのかわりに、５−インドリルメチルヒダン
トインな用いて、実施例１と同様にして反応させた。生
成したＮ−カルバモイル−トリプトファンを実施例１と
同様にして薄層クロマトグラフィーにより定１したとこ
ろ２−１ Ｒ９／ ｍｅのＮ−カルバモイルトリプトフ
ァンが生成していた。この反応液に実施例１と同様にし
て、シューｐモナスＤＫ −９１０微工研菌寄第７４７
３号（ＦＥＲＭ Ｐ −７４７ろ）の酵素を反応させた
。生成したＬ−）リデトファンをバイオアッセイ法によ
り、測定したところ、０．８６＃ｖのＬ−トリプトファ
ンが生成していた（モル収率４９．６％ｑＮ−カルバモ
イルトリプトファン）。
有機合成化学的に製造される５−＃換ヒダントインから
、本酵素によって常温常圧の温和な条件下で、効率よ（
、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸を製造することが可
能である。さらに、本酵素はＮ−カルバモイル−Ｌ−ア
ミン酸加水分解酵素との併用もしくは逐次反応により医
薬・食品添加物等として有用なＬ−アミノ酸の製造に有
効である。
、本酵素によって常温常圧の温和な条件下で、効率よ（
、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸を製造することが可
能である。さらに、本酵素はＮ−カルバモイル−Ｌ−ア
ミン酸加水分解酵素との併用もしくは逐次反応により医
薬・食品添加物等として有用なＬ−アミノ酸の製造に有
効である。
特許出願人 電気化学工業株式会社
（２５）
第１頁の続き
０発 明 者 大 峯 弘 師 町田市旭町３内
Claims (1)
- 下記の理化学的性質を有し且つ５−ｆｉｔ換ヒダントイ
ンを開裂加水分解してＮ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸
を生成する活性を有する新規ヒダントイナーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9957884A JPS60241888A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 新規ヒダントイナ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9957884A JPS60241888A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 新規ヒダントイナ−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60241888A true JPS60241888A (ja) | 1985-11-30 |
| JPH05993B2 JPH05993B2 (ja) | 1993-01-07 |
Family
ID=14250982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9957884A Granted JPS60241888A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 新規ヒダントイナ−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60241888A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0219034A2 (de) * | 1985-10-09 | 1987-04-22 | BASF Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung von mesophilen Mikroorganismen, die eine bei höherer Temperatur aktive D-Hydantoinase enthalten |
| EP1568778A1 (en) * | 1992-06-30 | 2005-08-31 | Smithkline Beecham Plc | Hydantoinase from agrobacterium |
-
1984
- 1984-05-17 JP JP9957884A patent/JPS60241888A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0219034A2 (de) * | 1985-10-09 | 1987-04-22 | BASF Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung von mesophilen Mikroorganismen, die eine bei höherer Temperatur aktive D-Hydantoinase enthalten |
| US4912044A (en) * | 1985-10-09 | 1990-03-27 | Basf Aktiengesellschaft | Preparation of mesophilic microorganisms which contain a D-hydantoinase which is active at elevated temperature |
| EP1568778A1 (en) * | 1992-06-30 | 2005-08-31 | Smithkline Beecham Plc | Hydantoinase from agrobacterium |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05993B2 (ja) | 1993-01-07 |
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