JPS62118882A - Ｌ−アルギニンオキシダ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｌ−アルギニンオキシダーゼ及びその製造法
に関する。

従来、Ｌ−アルギニンオキシダーゼは、例えば、アース
ロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌によ
って生産されることが僅かに報告されているに過ぎない
（日本農芸化学会、昭和５６年度大会、講演要旨集、第
４６７頁、昭和５６年３月１０日発行）。

Ｌ−アルギニンオキシダーゼは、夫々水及び酸素１分子
ずつの存在下で、１分子のＬ−アルギニンを酸化し、α
−ケト−δ−グアニジノ吉草酸、アンモニア及び過酸化
水素を夫々１分子ずつ生成させる酵素であり、本酵素は
、体液、飲食物等り一アルギニン含有物中のＬ−アルギ
ニンの定量用酵素として極めて有用なものである。

そこで本発明者等は、上記とは別に、広く自然界よ’７
Ｌ−フルギニンオキシダーゼを生産し得る微生物の検索
を行った結果、土壌中より新たに分離したシュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属する１菌株が、
該酵素を菌体内に効率よく生産すること等の知見を得、
本発明を完成した。

すなわち本発明は、下記の理化学的性質を有するＬ−ア
ルギニンオキシダーゼ。

０作　用： 夫々水及び酸素１分子ずつの存在下に１分子のＩ、−フ
ルギニンヲ酸化し、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸、
アンモニア及び過酸化水素を夫々１分子ずつ生成する。

■基質特異性： Ｌ−アルギニンに対しては、極めて高い基質特異性を有
し、また、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−フ
ェニルアラニンに対しても僅かに作用する。

■至適ｐＨ： Ｌ−アルギニンを基質とした場合、夫々０．１Ｍの酢酸
緩衝液及びリン酸緩衝液中での至適ｐＨは、６．０であ
る。

■安定ｐＨ： ｐＨ４，０〜６．０である。

■作用適温の範囲： ３５〜４５０℃の範囲にある。

■ｐＨ１温度等による失活の条件： ｐＨ３より酸性側及びｐＨ７よりアルカリ側で夫々失活
する。

温度６５℃から失活し始め、温度７０’Ｃでほとんど失
活する。

■阻害及び安定性： ２価及び３価の鉄イオン並びにＮ−ブロムコハク酸イミ
ドにより著しく阻害され、また、２価の亜鉛及び水銀イ
オンによっても阻害される。

■分子量： ０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５％ポリア
クリルアミド電気泳動により測定した結果、約５０．０
００である。

であり、また本発明は、シュードモナス属に属し、Ｌ−
アルギニンオキシダーゼ生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物より該酵素を採取することを特徴とする
Ｌ−アルギニンオキシダーゼの製造法である。

以下、本発明を具体的に説明する。

先ス、本発明に用いられる菌は、シー−トモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属しいＬ−アルギニンオキシ
ダーゼを生産する微生物であれば如何なる菌でもよく、
また、これらの菌の変種もしくは変異株でも良い。

そして、上記微生物の具体例としては、例えば、シュー
ドモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａ
ｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　Ａ　−２６等が挙げら
れ、該菌株は、土壌中より新たに検索して得た菌で、そ
の菌学的性質は、以下に示すとおりである。

シュードモナス・フルオレッセンスＡ−２６の菌学的性
質 ａ、形態顕微鏡的観察（肉汁寒天斜面培地で温度３０’
Ｃ１２４時間培養） ■細胞の形及び大きさ： ０．５μｍＸ１〜２μｍの短桿菌である。

■細胞の多形性の有無：認められない。

■運動性の有無：　１〜数本の極鞭毛を有し、運動性を
有する。

■胞子の有無：形成せず。

■ダラム染色性：陰性。

■抗酸性：陰性。

ｂ、各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養：温度３０’Ｃで４８時間の静置培
養により肌色のコロニー。拡散性色素は生成しない。

■肉汁寒天斜面培養：■肉汁寒天平板培養の記載に同じ
。

■肉汁液体培養：生育良好。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを、液化する。

■リドマスミルク：青＜変色スる。

Ｃ１生理的性質 ■硝酸塩の還元：還元する。

■脱窒反応：陰性。

■ＭＲテスト：陰性。

■ｖｐテスト：陰性。

■インドールの生成：陰性。

■硫化水素の生成：陰性。

■デンプンの加水分解：陰性。

■クエン酸の利用：クリステンセン（Ｃｈｒｉｓ　−ｔ
ｅｎｓｅｎ　）培地では利用するが、フーザー（Ｋｏｓ
ｅｒ）培地では生育不良で利用性は弱い。

■無機窒素の利用：アンモニア及び硝酸塩を、共に僅か
に利用する。

■色素の生成：蛍光色素を生成する。

■ウレアーゼ：陽性。

■オキシダーゼ：陽性。

０カタラーゼ：陽性。

０生育の範囲：至適温度２０〜３７℃至適ｐＨ５〜８．
５ ０酸素に対する態度：好気性。

＠Ｏ−Ｆテスト二酸化性。

■糖類から酸及びガスの生成： 酸の生成　ガスの生成 （１）　Ｌ−アラビノース　　　キ　　　　　−（２）
Ｄ−キシロース　　　　＋　　　　　−（３）Ｄ−グル
コース　　　　＋　　　　　−（４）Ｄ−マンノース　
　　　＋　　　　　−（５）Ｄ−フラクトース　　　十
　　　　　−（６）Ｄ−ガラクトース　　　＋　　　　
　−（力麦芽糖　　　　　　−− （８）　シ　　　ヨ　　糖　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　−−（９）乳　　　糖　　　　　　　　　
　十　　　　　　　−（ＩＱトレハロース　　　　　− ＋ＩＩ）　Ｄ−ソルビット　　　　− （Ｉ功Ｄ−マンニット　　　　十　　　　　−４１３イ
ノジツト　　　　　　−　　　　　−（１４グリセリン
　　　　　　− （ｌ四デンプン　　　　　　　十　　　　　−ｄ、その
他の性質 ■ポリベーターヒドロキシ酪酸を菌体内に蓄債しない。

■アルギニンジヒドロラーゼを生成する。

■エラグヨーク反応：陽性。

上記シュードモナス・フルオレッセンスＡ〜２６の菌学
的諸性質をパージエイズ・マニュアル・オブ・システマ
ティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒ−ｇｅｙ’　ｓ　
Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１版（１９８４年）記載の分類と
対比すると重曹は、ダラム染色性が陰性、好気性の°無
胞子桿菌で槽毛を有して運動性があり、かっ、カタラー
ゼ陽性等であることよりシュードモナス属に属するもの
と認められ、また、ポリベーターヒドロキン酪酸ヲ菌体
中に蓄積しないこと、蛍光色素を生成すること、アルギ
ニンジヒドロラーゼを生成すること、エラグヨーク反応
が陽性であること、脱窒反応が陰性であること等よりシ
ュードモナス・フルオレッセンス・ビオパール１に属す
るものト分類すれた。

しかしながら、ソルビット、プロピオネイト、トレハロ
ース、サッカレイト、マロネイト及ヒメサコネイトでは
生育しないこと並びにエタノールでは生育すること等種
々の炭素源の利用の相違より、従来のンユードモナス・
フルオレッセンス・ビオパール］に属する菌株とは異な
り、新菌株と判断され、本新菌株をシュードモナス・フ
ルオレッセンスＡ−２６と命名した。

なお、上記ンユードモナス・フルオレッセンスＡ−２６
は、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第
８５０９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８５０９）として寄託され
ている。

次に、本発明におけるＬ−アルギニンオキシダーゼ生産
に使用される培地としては、窒素源、炭素源、無機物、
ビタミン等より選択されたものを適量含有する培地であ
れば合成もしくは天然培地等如何なるものでも使用可能
である。

上記窒素源としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、
トリプトース、肉エキス、アミノ酸、硫酸アンモニウム
、硝酸カリウム等のものが挙げられ、炭素源としては、
例えば、グルコース、ショ糖、キシロース等の糖質、ピ
ルビン酸等の有機酸等が挙げられる。また、無機物とし
ては、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫
酸マグネシウム、硫酸第１鉄等が用いられる。

本発明に用いられる菌の培養は、固体培養法でもよいが
、通常液体培養法を採用するのが有利であり、具体的に
は振盪培養、撹拌培養、通気培養等により好気性に培養
を行う。

培養温度は、例えば、２５〜３５℃好ましくは３４℃で
、培養時のｐＨは５〜８、好ましくはｐＨ５，０である
。

このような培養条件下に培養時間は、培養形態によって
も異なるが、例えば、１６〜９６時間程度培養すること
により培養物中に本酵素が生成蓄積する。

培養終了後、培養物よりＬ−アルギニンオキシダーゼを
採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることが
できる。

しかし、本酵素は、菌体内に存在する酵素であるため、
培養終了後培養物に例えば、トリトンＸ−１００等の界
面活性剤もしくはトルエン等を添加し、例えば、２４時
間程度振盪もしくは放置し、自己消化をおこなわせるこ
とによりＬ−アルギニンオキシダーゼを菌体外に排出さ
せることができる。

また、培養物より、例えば、濾過遠心分離等の操作によ
り菌体を分離したのち、菌体より本酵素を採取するのが
好ましく、この場合、菌体をそのま〜用いることもでき
るが、超音波破壊機、フレンチプレス、ダイノミル等の
種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチー
ムの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する
方法、摩耗剤を用いて菌体をすりつぶす方法あるいは浸
透圧ショックを適用する方法を用いる。

このようにして上記菌体もしくはこれを破壊したもの、
あるいは細胞壁を溶解したものより、例えば、濾過、遠
心分離等の適当な処理操作により固形物を除去して菌体
抽出液を得るか、または水、緩衝液もしくは適当な溶剤
で抽出し、これをそのま〜粗酵素として得るか、あるい
はまた該抽出液に必要によりプロタミン硫酸、ポリエチ
レンイミン等を添加して除核酸を行うか、更に凍結乾燥
法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法等を適宜選択し
て実施することにより粗酵素粉末を得る。

上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末より更に精製酵素標品
を得るには、例えば、セフアゾ・ノクスＧ　　　−２０
０等を用いるゲル濾過法、イオン交換体、ハイドロキシ
アパタイト等を用いる吸着溶出法、ショ糖密度勾配遠心
法等の沈降法、アフイニテイクロマト法、分子ふるい膜
もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、組
み合わせて実施することにより、精製された本酵素標品
を得ることができる。

以上の如くして得られた本酵素の理化学的性質を示すと
、以下のとおりである。

（１）作　用 下式に示される如く、夫々水及び酵素１分子ずつの存在
下に１分子のＬ−アルギニンを酸化し、α−ケト−δ−
グアニジノ吉草酸、アンモニア及び過酸化水素を夫々１
分子ずつ生成する。

ＨＣ−ＮＨ２ ■ ＯＯＨ 「 （ＣＨ２）　３　　　　　＋　ＮＨ３＋　Ｈ２０□Ｃ＝
Ｏ ■ ０ＯＨ （２）基質特異性 Ｌ−アルギニンに対しては、極めて高い基質特異性を有
し、また、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−フ
ェニルアラニンに対しても僅かに作用する。

（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 第１図に示すとおり、Ｌ−アルギニンを基質とした場合
、０．１Ｍ酢酸緩衝液及びＯ，ＩＭＩＪン酸緩衝波緩衝
液中適ｐＨは、６．０である。

また、安定ｐＨの範囲は、ｐＨ４，０〜６．０である。

なお、該範囲は、各ｐＨの緩衝液１：ｐＨ３〜５：　ｏ
、１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８：　ｏ、ＬＭリン酸緩衝
液〕中、温度６５℃で５分間処理したのち酵素活性を測
定して求めたものである。

（４）力値の測定法 ０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）０．３ｍ
ｌ、Ｏ，ＩＭＬ−アルギニンＯ，１ｍ／。

０．００５％の４−７ミノアンチピリン、０．０２％の
フェノール又はＮ、Ｎ−ジメチルアニリン、パーオキソ
ダーゼ４単位及び本酵素液５０μｔ（適当量に希釈もし
くは濃縮する。）を添加し、総量を３ｍｅとしたものを
温度３７℃で１０分間反応させたのち、生成する色素の
可視部吸収（５５０ｎｍ　）で測定し、予め測定した既
知過酸化水素量の吸光度値より過酸化水素の生成量を算
出し酵素単位を得る。その細波素電極を用いて酸素の吸
収を測定する方法も必要により使用できる。なお、酵素
活性１単位は、温度３７℃で１分間に１μｍｏｌの過酸
化水素を生成する酵素量である。

（５）作用適温の範囲 第２図に示すとおり、作用適温の範囲は、３５〜４５０
℃であり、該温度範囲は、各温度のＬ−アルギニンを基
質とした反応液に本酵素を添加し、１０分間作用させた
際の酵素活性を測定して求めたものである。

（６）　ｐ　Ｈ、温度などによる失活の条件第３図に示
すとおり、温度６５℃から失活していき、７０′Ｃでは
ほとんど失活する。

なお、該条件は、各温度の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，０）中において本酵素を１０分間処理した
際の残存する酵素活性を測定して求めたものである。ｐ
Ｈ３より酸性側及びｐＨ７よりアルカリ性側で夫々失活
する。

（７）阻害、活性化及び安定化 夫’＋０．１ｍＭのＦｅ”、Ｆｅ３＋及びｌ　ｍＭのＺ
ｕ”＋、Ｈｇｚ＋、Ｎ−ブロムコハク酸イミドの含有反
応溶液中、温度３０″Ｃて１０分間反応させた後の酵素
活性は、無処理を１００としたとき夫々４７．３０．８
１．７３及びＯである。

（８）精製方法 本酵素の分離、精製は、常法により行うことができ、例
えば、硫安による分画沈殿、ＤＥＡＥ−セルロース、Ｄ
ＥＡＥ−セファロースにヨル吸着溶出、セファロース６
Ｂによるゲル濾過等の精製手段を適宜組み合わせて用い
ることができる。

（９）分子量 ０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５％ポリア
クリルアミド電気泳動により測定した結果は、５０，０
００である。

ＣＩ［Ｉｌポリアクリルアミドディスクゲル電気泳動第
４図に示すとおりポアサイズ５％のアクリルアミドゲル
（ｐＨ９，４）を用いて常法によりポリアクリルアミド
ディスクゲル電気泳動を行った結果、単一なバンドであ
ることが確認された。

（１１）等電点 ディスクゲル焦点電気泳動法により測定した結果は、５
．６である。

以上の如く本発明によれば、従来シュードモナス属の細
菌としては、生産することが未公知であるし一アルギニ
オンオキンダーゼを、比較的短時間のうちに効率よく得
ることができるので、本発明は、産業上極めて有意義で
ある。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

実　　施　　例 リン酸１カリウム０．１％、リン酸２カリウム０．１％
、硫酸マグネシウム０．０５％、ポリペプトン２．０％
及びＬ−ロイシン１％を夫々含有する溶液２０　ｍｌ　
（ｐ、　Ｈ６、８）を、三角フラスコ（容量：　１５０
ｍ１）に分注したのち、これを常法により温度１２０″
Ｃで１０分間加熱滅菌して培地ヲ得、該培地にシュード
モナス・フルオレッセンスＡ−２６（ＦＥＲＭ　Ｐ−８
５０９）を接種し、温度３４℃で３０時間振盪培養して
培養物を得た。

次いで、上記培地組成溶液２０６をジャーファーメンタ
−（容ｆｆｉ：２０７Ｉ）に分注したのち、これを常法
により温度１２０’Ｃで１０分間加熱滅菌して培地を得
、これに上述の如くして得た培養物２０ｍ１を接種し、
温度３４℃で２１時間通気回転撹拌培養を行って培養物
を得た。

このようにして得た培養物よりｓ、ｏｏ。

ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間の遠心分離処理により分離した
菌体を、Ｏ，ＯＩＭ！Ｉン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
０）に懸濁して２０１とし、ダイノミル〔ダイノーミル
社製、ＫＤＬ型〕により菌体を破砕し、更に６　、　Ｏ
ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で３０分間の遠心分離処理により固形
物を除去して粗酵素液を得た。

次いで、該粗酵素液を、Ｏ，０１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（シグマ社製）に入れ、酵素を吸着させたのち、０
．０１　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０，０，４Ｍ食塩
含有）を使用して吸着された酵素を溶出し、活性画分を
得た。

そして、該活性画分に、硫酸アンモニウム（４５％飽和
）を添加し、沈殿した区分を採取し、これを０．ＯＩＭ
）！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）１，０００ｍｇに溶
解したのち、同緩衝液に対して充分透析を行った。

該透析液を、０．ＯＩＭ）！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
２）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ・６Ｂカ
ラム中に流し込み、酵素を吸着させたのち、０．０１Ｍ
トリス塩酸緩衝液及び０．６Ｍ食塩含有同緩衝液を用い
たグラジェント溶出を行ない吸着された酵素を溶出し、
得られた活性区分をメンブレンフィルター（アミコン社
製）ヲ用いて濃縮し、更に、セファロース６Ｂ（２，６
０ｍＸ１００ｃｍ）を使用してゲル濾過を行ない精製さ
れたＬ−アルギニンオキシダーゼ標品７５ｍｇ（収率１
９％、比活性３８単位／　ｍｇ蛋白質）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素の至適ｐＨ１第２図は、作用適温の範
囲、第３図は、温度による失活の条件、第４図は、ポリ
アクリルアミドディスクゲル電気泳動を夫々示す図であ
る。 特許出願人　財団法人野田産業科学研究所筒１図 ｐ）−１ シヴ　　ノ支、　（６Ｃ〕

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有するＬ−アルギニンオキ
   シダーゼ。 ［１］作用： 夫々水及び酸素１分子ずつの存在下に１分子のＬ−アル
   ギニンを酸化し、α−ケト−δ−グアニジノ吉草酸、ア
   ンモニア及び過酸化水素を夫々１分子ずつ生成する。 ［２］基質特異性： Ｌ−アルギニンに対しては、極めて高い基質特異性を有
   し、また、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−フ
   ェニルアラニンに対しても僅かに作用する。 ［３］至適ｐＨ： Ｌ−アルギニンを基質とした場合、夫々０．１Ｍの酢酸
   緩衝液及びリン酸緩衝液中での至適ｐＨは、６．０であ
   る。 ［４］安定ｐＨ： ｐＨ４．０〜６．０である。 ［５］作用適温の範囲： ３５〜４５０℃の範囲にある。 ［６］ｐＨ、温度等による失活の条件： ｐＨ３より酸性側及びｐＨ７よりアルカリ側で夫々失活
   する。 温度６５℃から失活し始め、温度７０℃でほとんど失活
   する。 ［７］阻害及び安定性： ２価及び３価の鉄イオン並びにＮ−ブロムコハク酸イミ
   ドにより著しく阻害され、また、２価の亜鉛及び水銀イ
   オンによっても阻害される。 ［８］分子量： ０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５％ポリア
   クリルアミド電気泳動により測定した結果、約５０，０
   ００である。
2. （２）シュードモナス属に属し、Ｌ−アルギニンオキシ
   ダーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物よ
   り該酵素を採取することを特徴とするＬ−アルギニンオ
   キシダーゼの製造法。